WO2009096403A1 - 糖鎖分析による関節リウマチの検査方法 - Google Patents
糖鎖分析による関節リウマチの検査方法 Download PDFInfo
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- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
Definitions
- the present invention relates to a method for diagnosing rheumatoid arthritis using sugar chain analysis.
- RA Rheumatoid arthritis
- MMP matrix metalloproteinase
- cathepsin cathepsin
- peptidase etc.
- IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
- TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
- various satokines and enzyme inhibitors are also known to play an important role in the pathogenesis of RA (non-patented) References 3 and 4). While these proteins are involved in complexities with the knees and joints, they exacerbate the pathology from chronic inflammation to joint destruction.
- Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), anti-rheumatic drugs (DMARDs), biological drugs (anti-TNF receptors and IL-1 antagonists), etc. are used for drug treatment of RA patients (non-patented) Reference 5-7).
- NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
- DMARDs anti-rheumatic drugs
- IL-1 antagonists biological drugs
- RA is a serious disease as described above, the current diagnosis method of RA is based on the “ACR revised diagnostic criteria” of the American College of Rheumatology (ACR).
- the diagnostic criteria are: 1) Morning stiffness (mainly fingers) lasting over an hour; 2) 3 or more joint swellings; 3) swelling of the joints of the hand (wrist joint, metacarpophalangeal joint, proximal phalanx joint); 4) swelling of symmetrical joints (same joints on the left and right); 5) Abnormal findings in X-ray photographs of hands; 6) subcutaneous nodule, and 7) positive blood test for rheumatic reaction, Of these, RA is diagnosed if four or more items are satisfied.
- RF rheumatoid factor
- RF is an autoantibody against the Fc portion of IgG that frequently appears in the serum of RA patients.
- Healthy human RF is a reactive antibody that reacts with various proteins other than IgG, but RA derived from RA responds only to IgGFc other than this reactive antibody.
- monoreactive antibodies There are monoreactive antibodies. This monoreactive RF is about 100 times more responsive to IgG Fc than various reactive antibodies. Therefore, generally, the RF is measured as an index for determining RA patients.
- Anti-CCP antibody is detected in about 76% of RA patient serum, but about 4% is detected in patient serum that exhibits rheumatoid symptoms but is not determined to be RA (see Non-Patent Documents 9 and 10).
- Citrullinated proteins are detected in the synovium of RA patients, and it has been pointed out that epitopes containing citrulline are involved in the pathogenicity of RA (see Non-Patent Documents 11 and 12). The epitope is not well defined.
- a method for determining the urine of RA patients as RA using liquid chromatography with the presence of a chromatographic peak of an RA-specific component (see Patent Document 1), excising a sugar chain from a glycoprotein, The sugar chain is labeled and then purified to prepare a sample for sugar chain analysis. The prepared sample is analyzed by high performance liquid chromatography using an ODS-silica column, and the sugar chain composition of the sample is obtained.
- Methods for diagnosing RA based on composition changes see Patent Document 2 and the like have been proposed, but these methods are complicated in the preparation of analytical samples and are not satisfactory in terms of sensitivity and specificity. It was.
- anti-CCP antibodies are considered most promising in terms of specificity and sensitivity, but the specificity is still only about 76%. There is a strong need to develop new biomarkers that can be diagnosed early or with high specificity and sensitivity, or that can be prognostically, alone or in combination.
- the present inventors have already developed a fast and comprehensive glycan enrichment technology (Nishimura et al. (Nishimura, S, K Niikura, M Kurogochi, T Matsushita, M Fumoto, H Hinou, R Kamitani, H Nakagawa, K Deguchi, K Monde, and H Kondo) “High Throughput Protein Glycomics: Combined Chemoselective Glycoblotting with Marditov / Toff Mass Spectrometry” “High-Throughput Protein Glycomics: Combined Use of Chemoselective Glycoblotting and Maldi-Tof / TofmetryMass Spectro .
- the present invention (1) One selected from the group consisting of No. 1, 7, 8, 10, 11, 17, 18, 21, 24, 25, 27, 29, 31, 38, 41, 43, 45, 46 and 48 A method for diagnosing rheumatoid arthritis, using as an index the expression level of one or more sugar chains, (2) a method for diagnosing rheumatoid arthritis, using as an index the expression level of one or more sugar chains selected from the group consisting of No. 7, 18, 25, 29, 38, 31, 43 and 45; (3) The method according to the invention (1) or (2), wherein the selected sugar chain is No. 45; (4) The method according to any one of the above inventions (1) to (3), wherein the expression level of sugar chains in serum is used as an index, (5) One selected from the group consisting of No.
- a method for analyzing whether or not the expression level of the sugar chain is within the range of a normal person comprising the step of measuring the expression level of one or more sugar chains selected from the group consisting of: (13) In a sample collected from a subject, the expression level of one or more sugar chains selected from the group consisting of No. 7, 18, 25, 29, 31, 38, 41, 43 and 45 is measured.
- a method for analyzing whether or not the expression level of the sugar chain is within the range of a normal person comprising the step of: (14) The method according to the invention (12) or (13), wherein the selected sugar chain is No.
- a method of screening a rheumatoid arthritis sample (18) The method according to the invention (16) or (17), wherein the selected sugar chain is No. 45, and (19) any one of the inventions (16) to (18), wherein the sample is serum The method described in About.
- the present invention further includes (1) A method for diagnosing rheumatoid arthritis using as an index the sugar chain expression level of No. 45, wherein fucose in the sugar chain composition is added to the side chain, (2) No.
- sugar chain composition and sialyl Lewis x (NeuNAc ⁇ 2 ⁇ 3Gal ⁇ 1 ⁇ 4 (Fuc ⁇ 1 ⁇ 3) GlcNAc) or sialyl Lewis a (NeuNAc ⁇ 2 ⁇ 3Gal ⁇ 1 ⁇ 3 (Fuc ⁇ 1 ⁇ 4) GlcNAc) as an epitope
- sialyl Lewis x (NeuNAc ⁇ 2 ⁇ 3Gal ⁇ 1 ⁇ 4 (Fuc ⁇ 1 ⁇ 3) GlcNAc) or sialyl Lewis a (NeuNAc ⁇ 2 ⁇ 3Gal ⁇ 1 ⁇ 3 (Fuc ⁇ 1 ⁇ 4) GlcNAc) as an epitope
- Use of sugar chain as a marker for rheumatoid arthritis, (5) Hemopexin, haptoglobin, ceruloplasmin, clusterin, kininogen 1, ⁇ 1-antichymotrypsin, apolipoprotein H, ⁇ 2-HS glycoprotein, ⁇ 1
- the present invention relates to a method for diagnosing rheumatoid arthritis using the expression level of glycoprotein and plasma protease C1 inhibitor as an index.
- a diagnostic method that has superiority or complementary superiority in sensitivity and specificity, and enables early diagnosis of rheumatoid arthritis patients. Furthermore, introduction of early diagnosis makes it possible to perform appropriate medical treatment, and can be expected to contribute to the improvement of the therapeutic effect and prognosis of rheumatoid arthritis.
- whole N-type sugar chains in blood are collected from a subject's serum by a glycoblotting method, and a quantitative profile is obtained by MALDI-TOF MS.
- a known amount of oligosaccharide is added as an internal standard, the amount of other serum-derived sugar chains can be easily calculated from the area on the spectrum.
- the oligosaccharides to be detected are as shown in Table 1, for example.
- Man represents mannose
- GlcNAc represents N-acetylglucosamine
- Hex represents hexose
- HexNAc represents N-acetylhexosamine
- NeuAc represents N-acetylneuraminic acid.
- one or two or more sugar chain expression levels or the increase or decrease in the sugar chain expression level can be used to estimate the onset of rheumatoid arthritis, thereby obtaining a method useful for diagnosis and prognosis management / prediction of the disease.
- four types of sugar chains No. 7, 25, 29 and 38 having bisecting GlcNAc are found to increase in patients with rheumatoid arthritis.
- No. 43 having a trisialyl structure and No. 45 added with fucose are also markedly increased in patients with rheumatoid arthritis.
- FIG. 1 shows MALDI spectra of N-linked sugar chains of rheumatoid arthritis patients and healthy individuals. Moreover, the amount of sugar chain expression in healthy individuals and rheumatoid arthritis patients is shown in FIG. As the expression level of each sugar chain, the quantitative value of the sugar chain calculated from the area ratio on the spectrum with the known amount oligosaccharide added as an internal standard was used.
- FIG. 3 and 4 are box-and-whisker plots showing the distribution of glycan expression in each sample in healthy subjects and patients with rheumatoid arthritis, and were prepared using statistical analysis software Spotfire (SpotFire Decision Site for Functional Genomics, Spotfire, Inc.) did.
- FIG. 5 shows the existing RA biomarkers (RF, anti-CCP antibody and MMP3) and No. 45 ROC curve.
- ROC is an abbreviation for Receiver Operation Characteristic.
- the target marker is measured in two groups of a patient and a person who is not, and each measured value obtained is measured. In addition, sensitivity and specificity were calculated.
- “Sensitivity” means “a ratio at which a positive result is obtained for a person having a disease”
- specificity means “a ratio at which a negative result is obtained for a person who has no disease”. Plotting the value obtained by subtracting specificity from 1 (false positive, FP) on the horizontal axis and sensitivity (true positive, TP) on the vertical axis It is a ROC curve. The closer the curve is to the upper left corner, the less misdiagnosis and the higher the degree of authenticity, that is, the better the marker is. This is a quantified ROC curve AUC (area under the curve). The closer to the maximum value (1), the better the marker. The AUC of the ROC curve obtained for the three types of existing RA biomarkers tested and sugar chain No. 45 are shown in Table 2 below.
- sugar chain No. 45 is the most significantly able to distinguish healthy people from rheumatic patients (P ⁇ 0.0005), and the ROC curve is clearly superior to RF, which is a biomarker of existing rheumatoid arthritis. Compared to anti-CCP antibodies that have been found to be most useful, they were as useful as or better.
- HAP high serum protein
- LAP medium to low concentration protein
- the ROC curve of the chain (No. 45) is shown in FIG. 8, and the AUC of the ROC curve obtained for the sugar chain in which significant expression variation was observed is shown in Table 3 below.
- Table 4 below shows AUCs of ROC curves obtained for three types of existing RA biomarkers and sugar chain No. 45.
- glycan No. 45 is a glycan biomarker that can distinguish a healthy person and a rheumatic patient most significantly when whole serum, HAP, or LAP is used, and is particularly significant when LAP is used. It was found that the two could be distinguished.
- the ROC curve was clearly superior to RF, which is an existing biomarker for rheumatoid arthritis, and was as useful as or better than the anti-CCP antibodies that are currently most useful.
- a serum protein modified with sugar chain No. 45 which can distinguish a healthy person and a rheumatic patient most significantly, was identified from the serum of a healthy person.
- Serum proteins were reductively alkylated, digested with trypsin, and applied to a concanavalin A column.
- the non-adsorbed fraction of concanavalin A column was applied to a Japanese elder collectin column and eluted with lactose.
- the fraction adsorbed on the Japanese elder collectin column was fractionated with a reverse phase HPLC column, and the sugar chain was released by N-glycosidase F treatment.
- the protein modified to sugar chain No. 45 capable of distinguishing between a healthy person and a rheumatic patient as described above is useful as a biomarker for rheumatoid arthritis.
- MALDI-TOF / TOF (MS / MS) analysis was performed using ions corresponding to 45 as parent ions.
- An example of a fragment pattern obtained as a result of the MALDI-TOF / TOF analysis observed in healthy subjects and RA patients is shown in FIG. Y ions characteristic of the structure of the reducing end are well observed, and the fragment peak indicated by (2) in the figure is a characteristic detected only when fucose is bound to the reducing end of the sugar chain.
- the fragment shown in (3) is a fragment that appears more frequently when fucose is bound to a branched side chain of a sugar chain. As shown in FIG.
- sugar chain No. 45 is a mixture of structural isomers having different binding sites of fucose, and the abundance ratio of the structural isomers is significantly different between patients with rheumatoid arthritis and healthy individuals, and fucose residues are bound to branched side chains in RA patients. Things have been found to increase significantly. This is data that cannot be detected by measurement using only the total mass of the existing sugar chain, and is a biomarker candidate of a structural isomer that has been revealed for the first time by using MS / MS.
- the general formula of the structure of No. 45 is represented by the following (I) and (II).
- Structural isomers may be present in the places where the underlined parts are drawn. That is, NeuAc binds to Gal with either ⁇ 2-3 or ⁇ 2-6 linkage, and Gal binds to GlcNAc with ⁇ 1-3 or ⁇ 1-4 linkage. Fuc binds to the branched side chain GlcNAc with ⁇ 1-3 or ⁇ 1-4 linkage, or ⁇ 1-6 to the reducing end GlcNAc. However, Fuc is bound to only one of the four binding sites. Not all structures exist in nature, but the total number of structural isomers according to the above is 1024 (23x23x4x2).
- Glycan profiles after digestion of ⁇ 2,3-sialidase were obtained for sera of rheumatoid arthritis and healthy individuals.
- 10 ⁇ L of 200 mM acetate buffer (pH 4 and 5) is added to 20 ⁇ L of a sample whose sugar chain has already been released from serum to adjust the pH to 5, and then neuraminidase ( ⁇ 2,3-Neuraminidase, Macrobdella decora, E. coli recombination) manufactured by Calbiochem is used. 2 ⁇ L was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction, a sugar chain profile (FIG. 11) was obtained by the GlycoBlotting method. As a result, sugar chain no. 45, a compound in which one sialic acid was cleaved was observed as a main product, and it became clear that at least one sialic acid had an ⁇ 2,3 bond.
- FIG. 2 shows MALDI-TOF MS spectra of N-linked sugar chains obtained from sera of rheumatoid arthritis patients and healthy individuals.
- the upper row is a healthy person, and the lower row is a sugar chain derived from serum of a patient with rheumatoid arthritis.
- the sugar chain expression level in a healthy person (Ctrl) and a rheumatoid arthritis patient (RA) is shown.
- the vertical axis represents the absolute concentration of the expressed sugar chain, and the horizontal axis represents each sugar chain number. It is a box-and-whisker diagram comparing the sugar chain expression distribution in each of the sugar chains of No.
- the numbers in each graph represent sugar chain numbers.
- the vertical axis represents the sugar chain expression level ( ⁇ M). It is a box-and-whisker diagram comparing the sugar chain expression distribution in each of the sugar chains of No. 31, 38, 43, and 45 and all sugar chains in a rheumatoid arthritis patient (RA) and a healthy person (control).
- the numbers in each graph represent sugar chain numbers.
- the vertical axis represents the sugar chain expression level ( ⁇ M).
- the ROC Receiveiver Operation Characteristic
- the numbers in each graph represent sugar chain numbers.
- the vertical axis represents the relative amount ratio (%).
- It is a box-and-whisker diagram comparing the sugar chain expression distribution in LAP of a healthy person (Ctrl) and a rheumatoid arthritis patient (RA) between a rheumatoid arthritis patient (RA) and a healthy person (control), respectively.
- the numbers in each graph represent sugar chain numbers.
- the vertical axis represents the relative amount ratio (%).
- An ROC No. 45 ROC (Receiver Operation Characteristic) curve in LAP is shown.
- An example of identification by MALDI-TOF / TOF of a protein (hemopexin) having sugar chain No. 45 is shown.
- Asparagine (N) to which the sugar chain was bound is converted to aspartic acid (D).
- Sugar chain Nos. Of normal and rheumatic patients.
- the fragment ion structures of (1), (2) and (3) are the reducing end reagent (1), reagent + N-acetylglucosamine + fucose (2) and reagent + N ⁇ .
- Acetylglucosamine + N-acetylglucosamine (3) is shown. This is a sugar chain profile after ⁇ 2,3-sialidase treatment, and sialic acid cleavage is observed after treatment.
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Abstract
関節リウマチの新しい診断方法を提供する。血清（全血清、ＨＡＰまたはＬＡＰ）中の糖鎖発現量の定量的発現プロファイルをもとに関節リウマチとの関連性を解析して、関節リウマチの罹患に伴って変動する糖鎖および糖タンパク質を見出し、新たなバイオマーカーとなる血清糖鎖および糖タンパク質を提供した。
Description
本発明は、糖鎖分析を用いた関節リウマチの診断方法に関する。
関節リウマチ（ＲＡ）は関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。ＲＡは、初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。軟骨組織のプロテオグリカンとコラーゲンを分解する多数のタンパク質分解酵素（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ペプチダーゼ等）の濃度上昇がそのような組織において見られることが知られている（非特許文献１、２参照）。さらに、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、種々のサトカイン及び酵素阻害因子もまたＲＡの病因に重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献３，４参照）。
これらのタンパク質は膝、関節部と複雑に関与しながら、慢性的炎症から関節の破壊に至るまで病状を増悪化する。ＲＡ患者の薬物治療には、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）及び生物学的薬剤（抗ＴＮＦレセプター及びＩＬ－１拮抗剤）等が用いられている（非特許文献５－７参照）。しかしながら、懸命の治療にもかかわらず、多くのＲＡ患者の病状は回復せず痛みを感じ続け、骨破壊を受け続ける。期発見と早期治療がＲＡ患者の生活の質を改良する上からも重要である。
これらのタンパク質は膝、関節部と複雑に関与しながら、慢性的炎症から関節の破壊に至るまで病状を増悪化する。ＲＡ患者の薬物治療には、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）及び生物学的薬剤（抗ＴＮＦレセプター及びＩＬ－１拮抗剤）等が用いられている（非特許文献５－７参照）。しかしながら、懸命の治療にもかかわらず、多くのＲＡ患者の病状は回復せず痛みを感じ続け、骨破壊を受け続ける。期発見と早期治療がＲＡ患者の生活の質を改良する上からも重要である。
ＲＡは上記したように重篤にいたる疾患でありながら、現在のＲＡの診断方法は、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の「ＡＣＲ改訂診断基準」に基づくものである。該診断基準は、
１）１時間以上続く朝のこわばり（主に手指）；
２）３箇所以上の関節腫れ；
３）手の関節（手関節、中手指節関節、近位指節間接）の腫れ；
４）対称性の関節（左右同じ関節）の腫れ；
５）手のエックス線写真の異常所見；
６）皮下結節、及び
７）血液検査でリウマチ反応が陽性、
であって、このうち、４項目以上満たせばＲＡと診断される。
１）１時間以上続く朝のこわばり（主に手指）；
２）３箇所以上の関節腫れ；
３）手の関節（手関節、中手指節関節、近位指節間接）の腫れ；
４）対称性の関節（左右同じ関節）の腫れ；
５）手のエックス線写真の異常所見；
６）皮下結節、及び
７）血液検査でリウマチ反応が陽性、
であって、このうち、４項目以上満たせばＲＡと診断される。
ここで前記７）の血液検査は、血清中のリウマチ因子（ＲＦ）が主として測定される。ＲＦは、ＲＡ患者の血清中に高頻度で出現するＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体である。健常人のＲＦはＩｇＧ以外の種々のタンパクにも反応する、反応性の多様な抗体(polyactive antibody)であるが、ＲＡ患者由来のＲＦはこの反応性の多様な抗体以外にＩｇＧＦｃのみに反応する、単一反応性の抗体(monoactive antibody)が存在する。この単一反応性のＲＦは、反応性の多様な抗体に比べ、ＩｇＧＦｃに対する反応が約１００倍高い。このため、一般には該ＲＦがＲＡ患者の判定の指標として測定される。
しかし、ＲＡ患者でも常にＲＦが検出されない血清反応陰性ＲＡも存在し、また健常人でも陽性反応（２％程度）を呈しうることが知られている。リウマチ因子以外の自己抗体の検出の早期診断における有用性も報告されており、そのような自己抗体としては、例えば、抗Ｓａ蛋白抗体、抗核周辺因子(perinuclear factor)抗体、抗ケラチン抗体、抗フィラグリン抗体、抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）抗体などが知られている(非特許文献８参照)。抗ＣＣＰ抗体はＲＡ患者血清の約７６％から検出されるが、リウマチ様症状を呈するがＲＡとは判定されない患者血清でも約４％検出される (非特許文献９および１０参照)。ＲＡ患者の滑膜にはシトルリン化されたタンパクが検出されることから、シトルリンを含むエピトープのＲＡの病原性への関与が指摘されている（非特許文献１１および１２参照）が、シトルリンを含むエピトープは十分に明らかにされていない。
他にもＲＡ患者の尿を、液体クロマトグラフィーを用いてＲＡ特有成分のクロマトピークの存在を以ってＲＡであると判定する方法（特許文献１参照）、糖タンパク質から糖鎖を切り出し、該糖鎖を標識した後精製して糖鎖分析用試料を調製し、その調製した試料をＯＤＳ－シリカカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析し、試料の糖鎖組成を求めることにより、糖鎖組成変化に基づきＲＡを診断する方法（特許文献２参照）等が提案されているが、これらの方法は分析用試料の調製が煩雑であり、かつ感度・特異度の点で満足すべきものではなかった。
デー・エー等(De A, et al.), J.Rheumatol., 2002, Vol.29, p.46-51
マルチナス等(Martinus A.M. et al.), Arthritis Research (2002), 4(2), p.87-93
ジェラルド等(Gerard A. Schellekens, et al.), J. Clin.Invest, (1998), 101(1), p.273-281
ツィジエ等(ZhiJie Zhou, and Henri-Andre Menard), Current Opinion in Rheumatology (2002) 14(3), p.250-253
ウォルター等(Walter J van Venrooij and Ger J.M. Pruijn), Arthritis Research, (2000), 2(4), p.249-251
クリスチン等(Christine Masson-Bessie, et al.), J. Immunol., (2001), 166(6), p.4177-4184
上述の診断法の中で、抗ＣＣＰ抗体は特異度、感度の点から最も有望視されているが、なお特異度は約７６％にとどまる。単独で、または併用により鋭敏にかつ特異性および感度の高い早期診断の可能な、あるいは、予後予測可能な新たなバイオマーカーを開発することが強く求められている。
本発明者は既に開発された高速網羅的糖鎖エンリッチ技術〔西村等(Nishimura, S, K Niikura, M Kurogochi, T Matsushita, M Fumoto, H Hinou, R Kamitani, H Nakagawa, K Deguchi, N Miura, K Monde, and H Kondo)「ハイスループット・プロテイングライコミクス：化学選択的グリコブロッティングとマルディトフ／トフ質量分析との併用」“High-Throughput Protein Glycomics: Combined Use of Chemoselective Glycoblotting and Maldi-Tof/Tof Mass Spectrometry.” Angew Chem Int Ed Engl 44, no.1 (2004): 91-96〕に基づき調製された血清中糖鎖をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ等の質量分析技術により各罹患状態の患者血清を大規模解析した。そして各患者の血清中糖鎖の定量的発現プロファイルをもとに各罹患状態を結びつけ、変動する糖鎖を見出し、新たなバイオマーカーとなる血清糖鎖あるいは、変動する糖鎖を有する糖タンパク質あるいは変動する糖鎖の生合成経路に関わる分子群を同定し、感度、特異度の高い診断法を確立するに至った。
本発明は、
（１）No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（２）No.７、１８、２５、２９、３８、３１、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（３）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１）または（2）に記載の方法、
（４）糖鎖の血清中発現量を指標とする、上記発明（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５）No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、
（６）No.７、１８、２５、２９、３１、３８、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、
（７）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（５）または（6）に記載の使用、
（８）被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する方法であって、糖鎖を含有する試料を被験動物から採取する工程、および前記試料中におけるNo.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として前記被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する工程を具備する上記方法、
（９）被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する方法であって、糖鎖を含有する試料を被験動物から採取する工程、および前記試料中におけるNo.７、１８、２５、２９、３１、３８、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として前記被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する工程を具備する上記方法、
（１０）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（８）または（９）に記載の方法、
（１１）試料が血清である上記発明（８）から（１０）のいずれかに記載の方法、
（１２）被験者から採取した試料において、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を測定する工程を包含する、該糖鎖の発現量が正常人の範囲内にあるかどうかを解析する方法、
（１３）被験者から採取した試料において、No.７、１８、２５、２９、３１、３８、４１、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を測定する工程を包含する、該糖鎖の発現量が正常人の範囲内にあるかどうかを解析する方法、
（１４）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１２）または（１３）に記載の方法、
（１５）試料が血清である上記発明（１２）から（１４）のいずれかに記載の方法、
（１６）（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。
（１７）（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.７、１８、２５、２９、３８、３１、４３および４５よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。
（１８）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１６）または（１７）に記載の方法、および
（１９）サンプルが血清である上記発明（１６）から（１８）のいずれかに記載の方法、
に関する。
本発明はさらに、
（１）当該糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、No.４５の糖鎖発現量を指標とする関節リウマチの診断方法、
（２）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（３）当該糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、No.４５の糖鎖の関節リウマチマーカーとしての使用、
（４）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、
（５）No.４５の糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１－アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２－ＨＳグリコプロテイン、α１－アシドグリコプロテイン１、α１－アシドグリコプロテイン２、ジンクα２－グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（６）No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１－アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２－ＨＳグリコプロテイン、α１－アシドグリコプロテイン１、α１－アシドグリコプロテイン２、ジンクα２－グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、および、
（７）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１－アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２－ＨＳグリコプロテイン、α１－アシドグリコプロテイン１、α１－アシドグリコプロテイン２、ジンクα２－グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、に関する。
（１）No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（２）No.７、１８、２５、２９、３８、３１、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（３）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１）または（2）に記載の方法、
（４）糖鎖の血清中発現量を指標とする、上記発明（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５）No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、
（６）No.７、１８、２５、２９、３１、３８、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、
（７）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（５）または（6）に記載の使用、
（８）被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する方法であって、糖鎖を含有する試料を被験動物から採取する工程、および前記試料中におけるNo.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として前記被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する工程を具備する上記方法、
（９）被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する方法であって、糖鎖を含有する試料を被験動物から採取する工程、および前記試料中におけるNo.７、１８、２５、２９、３１、３８、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として前記被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する工程を具備する上記方法、
（１０）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（８）または（９）に記載の方法、
（１１）試料が血清である上記発明（８）から（１０）のいずれかに記載の方法、
（１２）被験者から採取した試料において、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を測定する工程を包含する、該糖鎖の発現量が正常人の範囲内にあるかどうかを解析する方法、
（１３）被験者から採取した試料において、No.７、１８、２５、２９、３１、３８、４１、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を測定する工程を包含する、該糖鎖の発現量が正常人の範囲内にあるかどうかを解析する方法、
（１４）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１２）または（１３）に記載の方法、
（１５）試料が血清である上記発明（１２）から（１４）のいずれかに記載の方法、
（１６）（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。
（１７）（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.７、１８、２５、２９、３８、３１、４３および４５よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。
（１８）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１６）または（１７）に記載の方法、および
（１９）サンプルが血清である上記発明（１６）から（１８）のいずれかに記載の方法、
に関する。
本発明はさらに、
（１）当該糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、No.４５の糖鎖発現量を指標とする関節リウマチの診断方法、
（２）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（３）当該糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、No.４５の糖鎖の関節リウマチマーカーとしての使用、
（４）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、
（５）No.４５の糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１－アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２－ＨＳグリコプロテイン、α１－アシドグリコプロテイン１、α１－アシドグリコプロテイン２、ジンクα２－グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、
（６）No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１－アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２－ＨＳグリコプロテイン、α１－アシドグリコプロテイン１、α１－アシドグリコプロテイン２、ジンクα２－グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、および、
（７）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１－アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２－ＨＳグリコプロテイン、α１－アシドグリコプロテイン１、α１－アシドグリコプロテイン２、ジンクα２－グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、に関する。
本発明によれば、感度ならびに特異度において従来法を上回る、あるいは相補的な優位性を有した診断法が提供され、関節リウマチ患者の早期診断が可能となる。更には、早期診断の導入により、適確な医療処置を施すことが可能となり、関節リウマチの治療効果および予後の改善に貢献することが期待できる。
本発明によれば、被験者血清からグリコブロッティング(Glycoblotting)法により血中の全Ｎ－型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより定量的プロファイルを取得する。このとき、内部標準として既知量のオリゴ糖を添加しておけば、そのスペクトル上の面積より、他の血清由来糖鎖量を容易に算出できる。検出されるオリゴ糖は例えば表１に示すとおりである。
その後、一つまたは二つ以上の糖鎖発現量または糖鎖発現量の増減から関節リウマチの罹患を推定し、同疾患の診断および予後の管理・予測に有用な方法を得ることができる。
例えば、バイセクティングGlcNAcを持つ４種類の糖鎖（No.７、２５、２９および３８）については、関節リウマチ患者において増加する傾向が見出される。トリシアリル構造を有するNo.４３およびフコースの付加したNo.４５についても関節リウマチ患者において顕著な増加がみられる。また血清中のＮ-結合型糖鎖総量および主要な糖鎖であるNo.３１に関してもリウマチ患者において有意な発現量の増加を認める。一方、No.５の糖鎖が関節リウマチによって増加する傾向のあることは既に報告されているが、No.５にガラクトースが結合したNo.１８は健常人よりもむしろ減少する傾向が見られる。
特にNo.４５は最も有意に健常人とリウマチ患者を識別可能(P<0.0005)で、ＲＯＣカーブは既存の関節リウマチのバイオマーカーであるＲＦよりも明らかに優れており、現在最も有用性が認められている抗ＣＣＰ抗体と比較しても同程度またはそれ以上に有用である。
例えば、バイセクティングGlcNAcを持つ４種類の糖鎖（No.７、２５、２９および３８）については、関節リウマチ患者において増加する傾向が見出される。トリシアリル構造を有するNo.４３およびフコースの付加したNo.４５についても関節リウマチ患者において顕著な増加がみられる。また血清中のＮ-結合型糖鎖総量および主要な糖鎖であるNo.３１に関してもリウマチ患者において有意な発現量の増加を認める。一方、No.５の糖鎖が関節リウマチによって増加する傾向のあることは既に報告されているが、No.５にガラクトースが結合したNo.１８は健常人よりもむしろ減少する傾向が見られる。
特にNo.４５は最も有意に健常人とリウマチ患者を識別可能(P<0.0005)で、ＲＯＣカーブは既存の関節リウマチのバイオマーカーであるＲＦよりも明らかに優れており、現在最も有用性が認められている抗ＣＣＰ抗体と比較しても同程度またはそれ以上に有用である。
関節リウマチ患者１４名および健常人１１名の血清の糖鎖について解析をおこなった。今回用いた血清はすべて性別が女性で、ともに平均年齢が５６歳であった。西村らのグリコブロッティング(GlycoBlotting)法により血中の全Ｎ-結合型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより定量的プロファイルを取得した。
関節リウマチ患者および健常人のＮ－結合型糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを図１に示す。また、健常人および関節リウマチ患者における糖鎖発現量を図２に示す。各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した糖鎖の定量値を用いた。関節リウマチ患者ではNo.７、２５、２９、３１、３８、４３および４５の各糖鎖において発現量の有意な増加が、No.１８の糖鎖においては発現量の有意な減少がそれぞれ認められた。また、血清のＮ－結合型糖鎖の総量についても、関節リウマチ患者における有意な増加が認められた。
関節リウマチ患者および健常人のＮ－結合型糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを図１に示す。また、健常人および関節リウマチ患者における糖鎖発現量を図２に示す。各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した糖鎖の定量値を用いた。関節リウマチ患者ではNo.７、２５、２９、３１、３８、４３および４５の各糖鎖において発現量の有意な増加が、No.１８の糖鎖においては発現量の有意な減少がそれぞれ認められた。また、血清のＮ－結合型糖鎖の総量についても、関節リウマチ患者における有意な増加が認められた。
図３、４は健常人および関節リウマチ患者において、各検体における糖鎖発現分布を示す箱ひげ図であって、統計解析ソフト・スポットファイアー（SpotFire Decision Site for Functional Genomics, Spotfire, Inc.）により作成した。
図５には、既存のＲＡバイオマーカー（ＲＦ、抗ＣＣＰ抗体およびＭＭＰ３）およびNo.４５のＲＯＣ曲線を示す。
ここで、ＲＯＣとは、受信者動作特性（Receiver Operation Characteristic）の略であって、本実施例では患者とそうでない者の２群で、対象となるマーカーを測定し、得られた測定値ごとに、感度、特異度を算出した。「感度」とは「疾患を持っている者について陽性の結果が得られる割合」を、「特異度」とは「疾患を持っていない者について陰性の結果が得られる割合」を、意味する。横軸に「１から特異度を減じた値（偽陽性：false positive，ＦＰ）」を、縦軸に「感度(真陽性true positive, ＴＰ)」をプロットし、点を繋いで得られる曲線がＲＯＣ曲線である。左上の隅に曲線が近いほど、誤診が少なくかつ真性度の高い、即ち診断効率の高い優れたマーカーと判断される。これを定量化したものがＲＯＣ曲線のＡＵＣ(曲線下面積)で、最大値（１）に近いほど優れたマーカーといえる。試験した既存のＲＡバイオマーカー三種および糖鎖No.４５について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表２に示す。
図５には、既存のＲＡバイオマーカー（ＲＦ、抗ＣＣＰ抗体およびＭＭＰ３）およびNo.４５のＲＯＣ曲線を示す。
ここで、ＲＯＣとは、受信者動作特性（Receiver Operation Characteristic）の略であって、本実施例では患者とそうでない者の２群で、対象となるマーカーを測定し、得られた測定値ごとに、感度、特異度を算出した。「感度」とは「疾患を持っている者について陽性の結果が得られる割合」を、「特異度」とは「疾患を持っていない者について陰性の結果が得られる割合」を、意味する。横軸に「１から特異度を減じた値（偽陽性：false positive，ＦＰ）」を、縦軸に「感度(真陽性true positive, ＴＰ)」をプロットし、点を繋いで得られる曲線がＲＯＣ曲線である。左上の隅に曲線が近いほど、誤診が少なくかつ真性度の高い、即ち診断効率の高い優れたマーカーと判断される。これを定量化したものがＲＯＣ曲線のＡＵＣ(曲線下面積)で、最大値（１）に近いほど優れたマーカーといえる。試験した既存のＲＡバイオマーカー三種および糖鎖No.４５について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表２に示す。
血清中に高濃度に含まれる6種類のタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン、アンチトリプシン、ハプトグロビン）に対する抗体カラムを用いて、血清の高濃度タンパク質を含む画分（ＨＡＰ）、およびＨＡＰを除去した中～低濃度タンパク質を含む画分（ＬＡＰ）を調製し、グリコブロッティング(GlycoBlotting)法によりそれぞれのＮ-結合型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより定量的グライコームプロファイルを健常人と関節リウマチ患者で比較した。
各糖鎖の発現量は、スペクトル上に認められた個々の糖鎖のシグナルの面積を検出された全ての糖鎖のシグナルの面積の和で除した面積比より算出した相対値を用いて比較した。両側t検定で、健常と関節リウマチ患者の個々の糖鎖の発現量を比較した結果、関節リウマチ患者ＨＡＰではNo.２５、４１、および４５の各糖鎖において発現量の有意（ｐ＜０．０１）な増加が、１０、１８、２７の糖鎖においては発現量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。ＬＡＰではNo.４５、４６、４８の各糖鎖において発現量の有意な（ｐ＜０．０１）増加が、No.１、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４の糖鎖においては発現量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。有意な発現変動が認められた糖鎖について、健常人および関節リウマチ患者間の糖鎖発現分布を示す箱ひげ図を図６、７に、ＬＡＰで最も有意に罹患に伴い発現量が変動した糖鎖（No.４５）のＲＯＣ曲線を図８に、有意な発現変動が認められた糖鎖について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表３に示す。また、既存のＲＡバイオマーカー３種および糖鎖No.４５について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表４に示す。
各糖鎖の発現量は、スペクトル上に認められた個々の糖鎖のシグナルの面積を検出された全ての糖鎖のシグナルの面積の和で除した面積比より算出した相対値を用いて比較した。両側t検定で、健常と関節リウマチ患者の個々の糖鎖の発現量を比較した結果、関節リウマチ患者ＨＡＰではNo.２５、４１、および４５の各糖鎖において発現量の有意（ｐ＜０．０１）な増加が、１０、１８、２７の糖鎖においては発現量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。ＬＡＰではNo.４５、４６、４８の各糖鎖において発現量の有意な（ｐ＜０．０１）増加が、No.１、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４の糖鎖においては発現量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。有意な発現変動が認められた糖鎖について、健常人および関節リウマチ患者間の糖鎖発現分布を示す箱ひげ図を図６、７に、ＬＡＰで最も有意に罹患に伴い発現量が変動した糖鎖（No.４５）のＲＯＣ曲線を図８に、有意な発現変動が認められた糖鎖について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表３に示す。また、既存のＲＡバイオマーカー３種および糖鎖No.４５について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表４に示す。
健常人とリウマチ患者を最も有意に識別可能な糖鎖No.４５によって修飾されている血清タンパク質を健常人血清から同定した。
血清タンパク質を還元アルキル化後、トリプシン消化し、コンカナバリンＡカラムにアプライした。コンカナバリンＡカラム非吸着画分をニホンニワトコレクチンカラムにアプライし、ラクトースで溶出した。ニホンニワトコレクチンカラム吸着画分を逆相ＨＰＬＣカラムで分画し、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理で糖鎖を遊離させた。Ｎ－グリコシダーゼＦ処理前後のサンプルをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを用い解析し、糖鎖No.４５の質量分のシフトが認められたペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを得、ＭＡＳＣＯＴで検索した。
糖鎖No.４５を有するタンパク質の同定例を図９に示した。同定した糖鎖No.４５を有するタンパク質および同タンパク質のトリプシン消化物ペプチド配列を下表５に示す。
血清タンパク質を還元アルキル化後、トリプシン消化し、コンカナバリンＡカラムにアプライした。コンカナバリンＡカラム非吸着画分をニホンニワトコレクチンカラムにアプライし、ラクトースで溶出した。ニホンニワトコレクチンカラム吸着画分を逆相ＨＰＬＣカラムで分画し、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理で糖鎖を遊離させた。Ｎ－グリコシダーゼＦ処理前後のサンプルをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを用い解析し、糖鎖No.４５の質量分のシフトが認められたペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを得、ＭＡＳＣＯＴで検索した。
糖鎖No.４５を有するタンパク質の同定例を図９に示した。同定した糖鎖No.４５を有するタンパク質および同タンパク質のトリプシン消化物ペプチド配列を下表５に示す。
関節リウマチ患者１４名および健常人１１名の血清の糖鎖の中で最も有意に関節リウマチ患者と健常人を識別可能であった糖鎖Ｎｏ.４５は、(Hex)3 (HexNAc)3 (Deoxyhexose)1 (NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2の糖組成を有する（表１）が、本糖組成を有する構造には、フコース（Deoxyhexose）の結合位置の多様性等のために複数の構造異性体が存在する。関節リウマチのバイオマーカーとして有用なＮｏ．４５の構造を特定するために、より詳細な構造解析を行った。
実施例１で調製した関節リウマチ患者１４名および健常人１１名のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ解析用試料を用い、糖鎖Ｎｏ．４５に相当するイオンを親イオンとしてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ（ＭＳ／ＭＳ）解析を行った。健常人およびＲＡ患者で認められたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ解析の結果得られたフラグメントパターンの例を図１０に示した。還元末端の構造に特徴的なＹイオンが良好に観察されており、図中（２）で示したフラングメントピークは、フコースが糖鎖の還元末端に結合した場合にのみ検出される特徴的なフラグメントであり、（３）で示したフラグメントはフコースが糖鎖の分岐側鎖に結合した場合により高頻度に出現するフラグメントである。図１０に示す通り、フラグメントピーク（２）と（３）の相対的強度は、健常人とＲＡ患者間で異なる傾向が認められたことから、Ｎｏ．４５で表される糖鎖の中でフコース残基の結合位置の分布に健常人とＲＡ患者間に違いがあることが示唆された。フコース残基の結合位置の分布を健常、ＲＡ患者の２群間で定量的に評価するため、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルよりフラグメントピーク（２）と（３）を含む３つのＹイオンを抽出し、フコース残基の結合位置によらず一定のフラグメントを与えるフラグメントピーク（１）の値に対する相対値として規格化して表５に示した。値として規格化したピーク強度（normalized intensity、表６－１）と規格化したピーク面積(normalized area、表６－２)を用いた。
実施例１で調製した関節リウマチ患者１４名および健常人１１名のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ解析用試料を用い、糖鎖Ｎｏ．４５に相当するイオンを親イオンとしてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ（ＭＳ／ＭＳ）解析を行った。健常人およびＲＡ患者で認められたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ解析の結果得られたフラグメントパターンの例を図１０に示した。還元末端の構造に特徴的なＹイオンが良好に観察されており、図中（２）で示したフラングメントピークは、フコースが糖鎖の還元末端に結合した場合にのみ検出される特徴的なフラグメントであり、（３）で示したフラグメントはフコースが糖鎖の分岐側鎖に結合した場合により高頻度に出現するフラグメントである。図１０に示す通り、フラグメントピーク（２）と（３）の相対的強度は、健常人とＲＡ患者間で異なる傾向が認められたことから、Ｎｏ．４５で表される糖鎖の中でフコース残基の結合位置の分布に健常人とＲＡ患者間に違いがあることが示唆された。フコース残基の結合位置の分布を健常、ＲＡ患者の２群間で定量的に評価するため、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルよりフラグメントピーク（２）と（３）を含む３つのＹイオンを抽出し、フコース残基の結合位置によらず一定のフラグメントを与えるフラグメントピーク（１）の値に対する相対値として規格化して表５に示した。値として規格化したピーク強度（normalized intensity、表６－１）と規格化したピーク面積(normalized area、表６－２)を用いた。
（ＭＳ／ＭＳスペクトルより４つのＹイオンについて抽出し、詳細な解析を行った結果であり、データは全て分子量４３３のフラグメントピーク（図１０の（１））の値を１とするように規格化した。値として規格化したピーク強度（normalized intensity、表６－１）と規格化したピーク面積(normalized area、表６－２)を用いた。)
それぞれの値を使って、関節リウマチ患者と健常人のデータの間に分散の差が無いかＦ検定を用いて検定したところ、２群の間に分散の差はないと言えた。そこで、等分散を仮定した両側t検定で、前述の４つのＹイオンに関して差があるか検定したところ、フラグメントピーク（２）とフラグメントピーク（３）の両者において有意差が認められた。この結果から、糖鎖Ｎｏ．４５はフコースの結合部位の異なった構造異性体の混合物であり、その構造異性体の存在比は、関節リウマチ患者と健常人で有意に異なり、ＲＡ患者ではフコース残基が分岐側鎖に結合したものが顕著に増加することが判明した。これは既存の糖鎖の全質量のみを利用して行う測定では検出されないデータであり、ＭＳ／ＭＳを用いることによってはじめて明らかになった構造異性体のバイオマーカー候補である。
それぞれの値を使って、関節リウマチ患者と健常人のデータの間に分散の差が無いかＦ検定を用いて検定したところ、２群の間に分散の差はないと言えた。そこで、等分散を仮定した両側t検定で、前述の４つのＹイオンに関して差があるか検定したところ、フラグメントピーク（２）とフラグメントピーク（３）の両者において有意差が認められた。この結果から、糖鎖Ｎｏ．４５はフコースの結合部位の異なった構造異性体の混合物であり、その構造異性体の存在比は、関節リウマチ患者と健常人で有意に異なり、ＲＡ患者ではフコース残基が分岐側鎖に結合したものが顕著に増加することが判明した。これは既存の糖鎖の全質量のみを利用して行う測定では検出されないデータであり、ＭＳ／ＭＳを用いることによってはじめて明らかになった構造異性体のバイオマーカー候補である。
なお、No.４５の構造の一般式は、下記(I)および(II)で表される。
図中下線部を引いた箇所に構造異性体が存在し得る。すなわち、NeuAcはα2-3またはα2-6結合のいずれかでGalに結合し、Galはβ1-3またはβ1-4結合でGlcNAcに結合する。Fucは分岐側鎖のGlcNAcにα1-3またはα1-4結合で、あるいは還元末端のGlcNAcにα1-6結合する。ただし、Fucの数は4か所の結合部位のうち1ヵ所のみに結合している。全ての構造が天然に存在するわけではないが、上記による構造異性体の総数は1024(23x23x4x2)。
関節リウマチおよび健常人の血清についてα２，３－シアリダーゼ消化後の糖鎖プロファイルを取得した。すでに血清より糖鎖を遊離したサンプル２０μＬに２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４および５）を１０μＬ加えｐＨを５に調製し、カルビオケム社製のノイラミニダーゼ(α2,3-Neuraminidase, Macrobdella decora,大腸菌組み替え)を２μＬ加え３７℃で１６時間反応を行った。反応後、グリコブロッティング(GlycoBlotting)法により糖鎖プロファイル（図１１）を取得した。その結果、糖鎖Ｎｏ．４５よりシアル酸が一つ切断された化合物が主生成物として観測され、少なくとも一つのシアル酸がα２，３結合していることが明らかとなった。
本発明に従って糖鎖分析を行い、特定の糖鎖の増減を検討することで、感度ならびに特異度において従来法を上回る、あるいは相補的な優位性を有した関節リウマチの診断が可能となる。
Claims (10)
- No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法。
- No.４５の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法。
- No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、請求項１または２記載の診断方法。
- No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の発現量を指標とする、請求項１から３のいずれかに記載の診断方法。
- 糖鎖の血清中発現量を指標とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用。
- No.４５の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用。
- No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、請求項６または７に記載の使用。
- No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の、請求項６から８のいずれかに記載の使用。
- （ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。
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