DE2933832C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Glycoproteine, insbesondere Dihydro­ xyboryl/Glycoprotein-Komplexe sowie ein Verfahren und ein Reagens zum Nachweis, zur Abtrennung oder Ermittlung von Glycoproteinen unter Verwendung solcher Komplexe.

Glycoproteine sind konjugierte Proteine, bei denen eine der prosthetischen Gruppe(n) aus einem Kohlenhydratderivat besteht. Sie kommen weit verbreitet in der Natur vor und erfüllen die verschiedensten Aufgaben. So kommen beispielsweise Glycoproteine in Blut und Absonderungen, in Zellmembranen und in Bindegewebe vor. Glycoproteine können auch industriell wertvolle Verbindungen sein, so wird beispielsweise alkalische Phosphatase für Immunotests und zu diagnostischen Zwecken verwendet.

Von Interesse sind die in Erythrocyten vorkommenden Glycoproteine, insbesondere die drei mit der Sammelbezeichnung HbA₁ versehenen Neben-(minor)Glycohämoglobine. Es hat sich gezeigt, daß die Konzentrationen dieser drei Glycoproteine bei an Diabetes mellitus leidenden Menschen und Tieren oder schwangeren bzw. trächtigen Frauen bzw. Tieren erhöht sind (vgl. L.A. Trivelli und Mitarbeiter in "New England Journal of Medicine", Band 284, Seite 353 (1971), König und Cerami in "Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America", Band 72, Seite 3687 (1975) und König und Mitarbeiter in "Diabetes", Band 25, Seite 1 (1976)). Der Grund für die Erhöhung der HbA₁-Konzentration beruht vermutlich auf einer persistierenden Hyperglykämie, die bei nicht-eingestellten Diabetikern auftritt. Dies führt zu einer Modifizierung des Hämoglobins A mit konstanter Geschwindigkeit während der Lebensdauer des HbA₁ produzierenden roten Blutkörperchens. Bei dem nicht-eingestellten Diabetiker kann der HbA₁-Spiegel auf das 3- oder 4-fache erhöht sein. So beträgt beispielsweise bei einem Gesunden die HbA₁- (glycosiliertes Hämoglobin-)Konzentration 6 bis 9% des Gesamthämoglobins, bei Diabetikern kann der HbA₁-Spiegel auf bis zu 20% (des Gesamthämoglobins) erhöht sein. So stellt die Ermittlung des HbA₁-Gehalts von Hämoglobin ein höchst geeignetes Mittel zum Nachweis der Schwere der Glucoseintoleranz bei Diabetikern dar. Infolge der verzögerten Änderung des HbA₁-Spiegels spiegelt die HbA₁-Konzentration bei Diabetikern den mittleren Blutglucosespiegel für den vorhergehenden Monat und dergleichen wider.

HbA₁_c stellt den Hauptbestandteil von HbA₁ (Glycohämoglobin) dar, es kommt in normalen Erwachsenenerythrocyten in einer Menge von 4 bis 7% vor. Die Aminosäuresequenz entspricht dem Hämoglobin A, der einzige Unterschied besteht im Vorhandensein einer Hexose an der Aminogruppe des endständigen Valins der β-Kette. Die Bildung der Verbindung erfolgt auf nicht-enzymatischem Wege. Zunächst bildet sich langsam zwischen der endständigen Aminogruppe und dem freien Zucker eine Schiff'sche Base, worauf eine Amadori-Umlagerung erfolgt:

In dem Formelschema bedeuten R' eine Proteinkette und R Wasserstoff oder PO₃H₂. Die Eigenschaften von HbA₁_c und der anderen HbA₁-Komponenten sind von den Eigenschaften von normalem Hämoglobin nur geringfügig verschieden.

Verfahren zur Bestimmung der HbA₁-Konzentration in Hämoglobin sind in der Regel zeitraubend und langwierig und darüber hinaus gegenüber geringfügigen Schwankungen des pH-Werts und der Ionenstärke empfindlich. Es besteht folglich ein Bedarf nach einem raschen und einfach durchzuführenden genauen Test. Kynoch und Lehmann haben in "The Lancet", 2. Juli 1977, ein Verfahren zur Bestimmung der HbA₁-Komponente von Hämoglobin beschrieben. Dieses Verfahren besteht in einer chromatographischen Trennung der HbA₁-Komponente von den HbA- und HbA₂-Komponenten mit Hilfe eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes (einer Maschenweite von 200 bis 400 mesh). Es wird eine Fließgeschwindigkeit von 150 ml/h empfohlen, so daß der Test in 2,5 h durchgeführt werden kann. Obwohl andere Versionen dieses Verfahrens unter Verwendung von Ionen­ austauscherharzen raschere Ergebnisse liefern können, erfordern nichtsdestotrotz sämtliche Verfahren, die von der Verwendung von Ionenaustauscherharzen abhängig sind, eine genaue Steuerung des pH-Werts und der Ionenstärke.

Es wurde nun ein Verfahren zur Abtrennung von Glycoproteinen von sonstigen Proteinen gefunden, das sich besonder gut zur Verwendung bei Schnelltests der HbA₁-Komponenten von Hämoglobin eignet. Es hat sich gezeigt, daß man mit Hilfe des neuen Verfahrens diesen Test sehr rasch durchführen kann. Darüber hinaus eröffnet die Erfindung einen größeren Spielraum bezüglich pH-Wert und Ionenstärke, ohne daß die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit beeinträchtigt werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Abtrennen von Glycoproteinen aus einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man mit der Probe ein Dihydroxyborylreagens unter Bedingungen, die eine Komplexbildung zwischen dem Glycoprotein und der Dihydroxyborylgruppe zulassen, in Berührung bringt, die komplexgebundene Substanz vom Rest der Probe trennt und gegebenenfalls die abgetrennte, komplexgebundene Substanz unter Bedingungen, die eine Rückgewinnung des Glycoproteins gestatten, reagieren läßt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Ermittlung der Glycoproteinmenge in einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die geschilderte Abtrennung durchführt und die Menge des abgetrennten oder rückgewonnenen Glycoproteins bestimmt.

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung abgetrennten Glycoproteine bilden mit der Dihydroxyboryleinheit eines unlöslich gemachten Reagens unter geeigneten Bedingungen Komplexe. Wenn die Kohlenhydrat-prosthetische Gruppe des Glycoproteins eine 1,2-Diolfunktion aufweist, bildet sich der Komplex vermutlich durch doppelte Kondensation wie folgt:

Bei einer solchen Reaktion können jedoch auch andere als 1,2-Gruppen, insbesondere 1,3- und 1,4-Gruppen, teilnehmen. Folglich dürfte es zur Komplexbildung für das Glycoprotein nicht erforderlich sein, vic-Dioleinheiten aufweisen zu müssen.

Das die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe bzw. den Dihydroxyborylliganden aufweisende Reagens kann aus einer polymeren Matrix oder einem sonstigen geeigneten festen oder flüssigen Träger mit einem daran gebundenen oder damit assoziierten, vorzugsweise kovalent daran gebundenen Phenylboron-, Bor- oder sonstigen Boronsäureliganden erhalten werden. Die Bindung des Liganden ist hierbei derart, daß die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe zur Komplexbildung zur Verfügung steht. Das Reagens kann in flüssiger Form vorliegen, so daß zur Trennung des komplexgebundenen Glycoproteins eine Verteilung durchgeführt werden kann. So erhält man beispielsweise ein wäßriges zweiphasiges System unter Verwendung von 10% (w/w) Polyäthylenglycol (vgl. Albertsson und Mitarbeiter in "J. Steroid Biochem.", Band 4, Seite 537, (1973)). Das die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe enthaltende Reagens kann aus dem Liganden in einer der beiden Schichten eines solchen zweiphasigen Systems bestehen, so daß eine Verteilung des Glycoproteins bewirkt wird.

Die polymere Matrix kann aus einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymeren, insbesondere einem hydrophilen Material, wie einem Polyacrylamid oder einem Agarose/ Polyacrylamid-Mischpolymerisat, Agarose, oder einem Polymerisat mit freien Hydroxylgruppen, wie Cellulose, einem Cellulosederivat, Stärke, Dextran oder einem vernetzten Dextran, beispielsweise einem unter der Handelsbezeichnung Sephadex vertriebenen vernetzten Dextran, einem Protein, wie Wolle, oder Polyvinylalkohol, bestehen. Das polymere Material kann gegebenenfalls vernetzt oder chemisch modifiziert sein. Andere verwendbare polymere Materialien sind die unter den Handelsbezeichnungen Sepharose vertriebene Agarose, das unter der Handelsbezeichnung Sephacryl vertriebene Mischpolymerisat aus Dextran und Acrylamid oder das unter der Handelsbezeichnung Spheron vertriebene vernetzte Hydroxyäthylmethacrylat, ferner mikroteilchenförmige kugelige Affinitätsträger (vgl. US-PS 41 43 302), Nylon, Polyester, wie Polyäthylenterephthalat, Celluloseacetat, substituierte vernetzte Polystyrole, z. B. chlormethyliertes Polystyrol, Metalloxide, poröse, mit hydrophilen organischen Polymerisaten beschichtete keramische Materialien, Glas oder sonstige geeignete Materialien.

Die Matrix bzw. der Träger kann die Form von Perlen oder lagenförmigen Gebilden, z. B. Geweben oder sonstigen üblichen gegossenen oder extrudierten Gebilden, aufweisen. Um der Matrix eine ausreichende mechanische Festigkeit zu verleihen, kann sie in einem Gelschlauch, in einer Säule, in einem flachen Bett oder in einem formbaren Behälter gehalten oder in Streifen aus beliebigen Materialien einschließlich von "Peilstäben" (dip-sticks) ausgeformt sein. Das Verfahren läßt sich unter Verwendung einer Säule oder in sonstiger Weise kontinuierlich oder chargenweise durchführen.

Phenylboron-, Bor- oder sonstige Boronsäuren, wie Äthanboronsäure, 1-Propanboronsäure oder 3-Methyl-1-butanboronsäure, lassen sich auf mechanischem, physikalischem oder chemischem Wege an die polymere Matrix oder einen sonstigen geeigneten festen oder flüssigen Träger binden. Der Ligand kann physikalisch durch elektrostatische Kräfte, z. B. durch Wasserstoff(brücken)bindungen, gehalten werden. Andererseits und vorzugsweise kann der Ligand mit Hilfe einer direkten kovalenten Bindung an die Matrix gebunden sein. Ferner kann er an ein anderes Molekül oder an andere Moleküle oder Molekülaggregate hohen oder niedrigen Molekulargewichts, z. B. ganze Zellen, Bruchstücke derselben oder Organellen oder Viren gebunden und mit dem "Wirt" zusammen entweder auf mechanischem Wege (einschließlich eines Einschlusses), physikalischem oder chemischem Wege an die polymere Matrix gebunden werden. In der Regel ist es erforderlich, daß die Phenylboron-, Bor- oder sonstige Boronsäure derart an die Matrix gebunden ist, daß sie während der folgenden Reaktion(en) unter Freilassung der Boronsäurehydroxylgruppen nicht abgelöst werden. Erforderlichenfalls kann die Matrix oder der Dihydroxyborylligand vor dem Kuppeln der beiden aktiviert werden.

Beispiele für eine Aktivierung der polymeren Matrix vor der anschließenden Dihydroxyborylligandenkupplung bildet die Verwendung der in der Literatur beschriebenen folgenden Substanzen und Techniken. Die Methoden werden gemäß den funktionellen Gruppen an der Matrix ausgelistet:

1. -OH-Gruppe, z. B. Polysaccharide:

a)Cyanogenhalogenide b)Triazine c)Perjodatoxidation d)p-Benzochinon e)Bisoxirane f)Divinylsulfon g)Epichlorhydrin h)Chloressigsäure und Halogenacetylhalogenide i)p-Nitrobenzylchloride.

2. -NH₂-Gruppen, z. B. Polyacrylamide:

a)Aminoäthylierung b)Desamidierung zu COOH c)Hydrazid d)Glutaraldehyd

3. Si-OH-Gruppen, z. B. Glas:

a)Silanisierung

4. COOH-Gruppen, z. B. Carboxymethylcellulose oder 2(b) oben:

a)N-Hydroxysuccinimidester b)Goldstein-4-Zentrenreaktion

Die betreffenden Methoden sind in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben.

Eine direkte oder indirekte Kupplung des Dihydroxyborylliganden an die polymere Matrix erfolgt nach den im folgenden aufgeführten Reaktionen. Die betreffenden Reaktionen sind in der Literatur beschrieben und machen von geeigneten funktionellen Gruppen am Liganden und der Matrix Gebrauch.

a)Cyanogenhalogenide b)Carbodiimidkondensation (1) H₂O-löslich (2) H₂O-unlöslich c)Bernsteinsäureanhydrid d)bifunktionelle Reagentien e)Divinylsulfon f)Arylhalogenide g)Alkylhalogenide h)N-(substituiertes) Hydroxybernsteinsäureimid-Reaktion i)Isothiocyanat j)Diazotierung, z. B.

k)Thiolierung l)Epichlorhydrin m)Perjodatoxidation n)gemischte Anhydridbildung o)reduktive Alkylierung p)Acylazidbildung. a

Bei indirekter Kupplung können "Abstandhalter" zwischen dem Dihydroxyborylliganden und der Matrix oder dem Träger vorliegen. Hierbei handelt es sich um hydrophile Monomere oder Polymere (Polyäthylenglycol), hydrophobe Monomere oder Polymere (Polymethylen- oder Polyäthylenimin) oder aromatische Brücken oder sonstige Kombinationen.

Ein Dihydroxyborylreagens erhält man auch durch Polymerisieren eines Boronsäurederivats, z. B. von Dihydroxyboryl­ phenylacrylamid.

Der Einsatz des Dihydroxyborylreagens im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung erfolgt durch Darüberleiten oder Hindurchleiten einer geeigneten, ein Glycoprotein enthaltenden Probe über bzw. durch das Reagens oder durch Verteilen. Das Reagens kann beispielsweise eine polymere Matrix oder einen Träger in Form von Pellets oder Zylindern enthalten und in dieser Form in eine Säule gepackt werden. In diesem Falle wird dann eine glycoproteinhaltige geeignete Lösung durch die Säule laufen gelassen. Andererseits kann die Probe oder Lösung durch das Reagens mit einer Matrix in Form einer porösen Folie passieren gelassen werden. Weiterhin kann die Matrix in Form eines "Peilstabes" oder als Teilchen in einem porösen Beutel ähnlich einem Teebeutel vorliegen. Die Komplexbildung des Glycoproteins mit dem Reagens wird in der Regel durch Erhöhen des pH-Werts der Lösung verbessert.

Um während des gesamten Verfahrens aseptische Bedingungen aufrechzuerhalten, hat es sich manchmal als zweckmäßig erwiesen, dem System eine geringe Menge antimikrobielles Mittel, z. B. ein Lösungsmittel, ein Antibiotikum oder ein Gift, zuzusetzen. Ferner können dem Glycoproteingemisch andere Biochemikalien, z B. KCN bei der Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin, zugesetzt werden.

Wenn die Matrix bzw. der Träger in Form magnetischer Teilchen vorliegt, kann die Trennung mit Hilfe eines Magneten erfolgen.

Nicht-Glycoproteinmaterialien können aus einer Säule unter Verwendung einer geeigneten Waschlösung, z B. eines Puffers oder Lösungsmittels, eines sonstigen biochemischen Reagens oder auf elektrophoretischem Wege eluiert werden. In der Regel muß hierbei darauf geachtet werden, daß durch diese Maßnahme das spezifisch gebundene Glycoprotein, das mit dem Reagens in der Säule oder in dem "Peilstab" reagiert hat, nicht desorbiert wird.

Eine Rückgewinnung des Glycoproteins erreicht man gegebenenfalls unter Anwendung üblicher chemischer oder physikalischer Desorptionsverfahren, beispielsweise durch Darüberleiten oder Hindurchleiten der eine Desorption verursachenden Substanz(en) über bzw. durch das Reagens oder durch Herbeiführen von Änderungen des pH-Werts oder sonstiger Bedingungen, die vorher die Adsorption erleichtert haben. Beispiele für geeignete Desorptionsmaßnahmen sind eine Ligandenkonkurrenz, eine Inhibitorkonkurrenz spezifischer oder nicht-spezifischer Natur (z. B. Einführen von Sorbit oder Zuckern oder sonstiger Diole oder Alkohole, die das gebundene Glycoprotein verdrängen), Änderungen des Lösungsmittels, des Puffers und/oder des pH-Werts und Änderungen in der Ligandenkonzentration.

Die Desorption des Komplexes aus polymerer Matrix und Borsäure, beispielsweise Phenylboronsäure, erfolgt vorzugsweise derart, daß die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe nicht von der Matrix entfernt wird, so daß diese wieder verwendbar ist.

Die Bestimmung des rückgewonnen Glycoproteins kann nach üblichen biochemischen Verfahren oder durch Berechnen der prozentualen Menge an insgesamt eingesetztem Protein mit Hilfe von Adsorptionsmessungen bei bestimmten Wellenlängen erfolgen. Das Glycoprotein kann in noch komplexgebundenem Zustand geschätzt werden.

Reaktionsfähige Dihydroxyborylreagentien werden in der Literatur beschrieben (vgl. beispielsweise C.H. Elliger und Mitarbeiter in "J. Chromatography", Band 104, Seite 57-61 (1975)). Beispiele hierfür sind N-(m-Dihydroxyborylphenyl)-carbamyl­ methylcellulose, Borsäuregel, {2-(Diäthyl)-[p-(trihydroxyborato)- benzyl]-ammonio)-äthyl}-Sephadex und sonstige modifizierte Polymerisate.

Die Erfindung betrifft ferner durch Reagierenlassen eines vorzugsweise unbeweglich gemachten Dihydroxyborylreagens der beschriebenen Art mit einem Glycoprotein gebildete Komplexe.

Wie bereits erwähnt, eignet sich das Verfahren gemäß der Erfindung in besonders geeigneter Weise zur Trennung glycosylierter Hämoglobine HbA₁_c von den nicht-glycosylierten Hämoglobinen, wie HbA und HbA₂ . Folglich eignet sich das Verfahren zur Schnellbestimmung des Gehalts von lysiertem Humanblut an glycosyliertem Hämoglobin zur Überwachung der Behandlung von Diabetikern.

Die bei der Durchführung solcher Maßnahmen einzuhaltenden Stufen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

• 1. Binden von glycosyliertem Hämoglobin aus lysiertem Blut an ein unbeweglich gemachtes oder trennbares Dihydroxyborylreagens.
• 2. Abtrennung der nicht-glycosylierten Hämoglobine durch Waschen oder Entfernen des erhaltenen Komplexes, beispielsweise durch Entfernen der "Peilstäbe" oder durch Verteilen.
• 3. Schätzen bzw. Berechnen des glycosylierten Hämoglobins entweder in situ an oder in dem Reagens oder nach Entfernung von dem Reagens.

Das Verfahren kann beispielsweise in einer einfachen Form zum Testen einer Standardmenge lysierten Bluts durch Einbringen eines Reagens in Form eines an einen "Peilstab" gebundenen Dihydroxyborylliganden in das lysierte Blut herangezogen werden. Auf dem "Peilstab" bildet sich der glycosylierte Hämoglobinkomplex und wird nach beendeter Aufnahme aus dem lysierten Blut entfernt. Der nun rotgefärbte "Peilstab" wird nach dem Waschen mit einem Puffer mit einer vorgeeichten Standardfarbkarte verglichen, wobei man den prozentualen Gehalt des lysierten Bluts an glycosyliertem Hämoglobin angeben kann.

Gegebenenfalls können die glycosylierten Hämoglobine nach einem der geschilderten Gewinnungsverfahren, beispielsweise durch konkurrierende Inhibierung unter Verwendung eines Zuckers, wie d-Glucose, von dem Reagens freigesetzt werden. Danach kann die prozentuale Menge an rückgewonnenem glycosyliertem Hämoglobin, beispielsweise durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 413 nm, geschätzt oder bestimmt werden.

Ein geeignetes Reagens zur Bestimmung des Gehalts einer Blutprobe an glycosyliertem Hämoglobin enthält folgende Bestandteile: (1) einen Reaktionspartner für das in der lysierten Probe enthaltene glycosylierte Hämoglobin mit einer an einen Träger gebundenen Dihydroxyborylgruppe und (2) einen Puffer, der den pH-Wert der lysierten Blutprobe in einem Bereich von 7,5 bis 9 zu halten vermag.

Vorzugsweise besitzt der Puffer in Lösung eine Ionenstärke von 0,1 bis 0,5.

Bevorzugte Reagentien enthalten ferner als dritten Bestandteil ein Lysiermittel für die Blutprobe, beispielsweise eine Lösung mit 0,1% Saponin, und vorzugsweise enthält das Lysiermittel zusätzlich noch Kaliumcyanid zur leichteren kolorimetrischen Bestimmung von Hämoglobin und/oder glycosyliertem Hämoglobin.

Zur Desorption des glycosylierten Hämoglobins von dem Reagens zur quantitativen Isolierung bzw. Bestimmung und/oder zur Wiederverwendung des Reagens kann man als Eluiermittel einen Puffer eines pH-Werts von unter 7,5, einen Puffer eines pH-Werts von 7,5 bis 9 mit Borsäure oder eine Alkyl- oder Arylboronsäure in einer Menge von 0,05 bis 1 M oder vorzugsweise mit 0,05 bis 1, in der Regel 0,5 m Diolzucker, z. B. Glucose, Sorbit oder Ribose, verwenden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

a) Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung von glycosylierten Hämoglobinen in lysiertem Humanblut.

In einem Abzug wird nach dem im folgenden geschilderten Verfahren Phenylboronsäure an ein Polysaccharid, beispielsweise an Agarose in Perlenform (Sepharose 4B) gebunden.

20 ml (etwa 20 g Nettogewicht) Sepharose werden gewaschen und auf eine Temperatur von 4°C gekühlt, worauf 20 ml eines kalten 2m-Bicarbonat/Carbonat-Puffers eines pH-Werts von 11 zugegeben werden. Danach wird das Gemisch schwach gerührt. Danach wird das Sepharosegemisch langsam mit einer gekühlten Lösung von 2 g Cyanogenbromid in 4 ml N-Methylpyrrolidon versetzt. Das Gemisch wird nach Zugabe der letzten Menge der Cyanogenbromidlösung 8 min lang gerührt, worauf die erhaltene Aufschlämmung filtriert und rasch mit eiskaltem 8% (v/v) Aceton und eiskaltem 0,1m-Bicarbonatpuffer eines pH-Werts von 9 gewaschen wird. Nach Entfernung des überschüssigen Puffers von der gewaschenen Aufschlämmung wird diese in eine Lösung von 1 g m-Aminophenylboronsäure in 20 ml 0,1m-Bicarbonatpuffer eines pH-Werts von 9 eingetragen und darin 18 h lang bei einer Temperatur von 0° bis 4°C inkubiert. Danach wird die nicht-gebundene Phenylboronsäure weggewaschen. Die polymere Matrix wird in eine 1 ml fassende Chromatographiersäule gefüllt und darin so lange mit Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7 gewaschen, bis der gesamte nicht-umgesetzte Phenylboronsäureligand entfernt ist. Dies wird durch Überwachen der Waschlösung mit UV-Licht ermittelt.

b) Einem gesunden Individuum werden in Äthylendiamin­ tetraessigsäure in einer geeigneten Flasche 5 ml Blut entnommen, worauf das Blut schwach mit der Äthylendiamintetraessigsäure gemischt wird. 0,5 ml des hierbei erhaltenen anitkoagulierten Bluts werden in ein konisches 10 ml fassendes Zentrifugierröhrchen gefüllt und mit isotonischer Kochsalzlösung auf 10 ml aufgefüllt. Danach wird das Ganze 5 min lang bei 3000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Das aus roten Blutkörperchen bestehende Pellet wird mit Hilfe von 0,8 ml einer Lysierlösung mit 0,1% Saponin und 0,5% KCN lysiert. Nach einminütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das lysierte Blut mit Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7 mit 0,65 g KCN pro 1 l Puffer auf 10 ml aufgefüllt und 5 min bei 3000 Upm zentrifugiert. Hierauf wird die überstehende Flüssigkeit abgetrennt. 2 ml derselben werden über die in der geschilderten Weise hergestellte Phenylboronsäuresäule mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/h laufen gelassen. Das Eluat wird in 25 ml fassenden volumetrischen Kolben gesammelt, worauf die Säule so lange mit Natriumphosphatpuffer gewaschen wird, bis in der Waschflüssigkeit kein Hämoglobin mehr nachgewiesen werden kann. Die Desorption der Säule erfolgt mit Hilfe des 0,5m-d-Glucose enthaltenden Natriumphosphatpuffers. Das erhaltene Desorbat wird in 10-ml-volumetrische Kolben gesammelt. Zur Wiederverwendung wird die Säule in Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7 auf den Gleichgewichtszustand eingestellt.

Die Adsorption A bei einer Wellenlänge von 413 nm (für Hämoglobin spezifisch) wird für beide Lösungen ermittelt, worauf folgende Berechnungen durchgeführt werden:

Ergebnisse:

Desorbat (10 ml)0,018 Eluat (25 ml)0,092

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht, daß die Phenylboronsäuresäule in dem Beispiel 1 beschriebenen System für glycosyliertes Hämoglobin spezifisch ist.

Von einem anderen gesunden Individuum gesammeltes Blut wird in genau der im Beispiel 1 geschilderten Weise behandelt, worauf der prozentuale Gehalt an glycosyliertem Hämoglobin bestimmt wird.

Blut desselben Individuums wird ferner nach dem von P.A.M. Kynoch und H. Lehmann in "The Lancet", 2. Juli 1977, Seite 16, beschriebenen Verfahren unter Verwendung des Austauscherharzes Amberlite Resin cg50 Type II (200 mesh) anstelle des Bio-rex-70-Kationenaustauscherharzes auf seinen Gehalt an glycosyliertem Hämoglobin hin untersucht.

Ergebnisse:

Phenylboronsäure-Verfahren des Beispiels 15,34% glycosyliertes Hämoglobin Verfahren nach Kynoch und Lehmann5,45% glycosyliertes Hämoglobin

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Spezifität der unbeweglich gemachten Phenylboronsäure für glycosyliertes Hämoglobin unter Verwendung vorher gereinigter Zubereitungen.

Blut eines gesunden Individuums wird nach dem von Kynoch und Lehmann aaO beschriebenen Verfahren auf seinen Gehalt an glycosyliertem Hämoglobin untersucht. Bei diesem Verfahren wird Hämoglobin in zwei unterschiedliche Fraktionen, nämlich (1) Hb glycosyliert und (2) Hb A + A₂, getrennt. Beide Fraktionen werden nach diesem Verfahren dargestellt und in dem im Beispiel 1 beschriebenen Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7 gesammelt. Jede Fraktion wird entsprechend Beispiel 1 über die Phenylboronsäuresäule laufen gelassen. Die prozentuale Rückgewinnung an beiden Bestandteilen beträgt:

Hb A + A₂ (nicht-glycosyliert) 0,457% Hb A glycosyliert44,79%

Eine 100%ige Rückgewinnung des glycosylierten Hb A wird nicht erreicht, was zeigt, daß die Säule gesättigt ist.

Die Bindung von nicht-glycosyliertem Hämoglobin ist vernachlässigbar.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Retention eines Glycoproteins in Form eines spezifischen Schwangerschaftsproteins 1(sp₁) auf einer Phenylboronsäure/Sepharose-Säule.

(a) 1 g CNBr-aktiviertes Agarosegel in Perlenform wird 15 min lang auf einem Glasfilter mit 10^-3m-HCl-Lösung (200 ml) gequollen und gewaschen. Ferner werden etwa 10 mg Meta­ aminophenylboronsäure in 0,1m-NaHCO₃-Pufferlösung mit 0,5m-NaCl (5 ml) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit dem Gel in einem Teströhrchen gemischt wird. Die erhaltene Mischung wird 2 h lang bei einer Temperatur von 4°C Ende-über-Ende rotieren gelassen (man kann auch andere schwache Rührmaßnahmen anwenden, Magnetrührer sollten jedoch nur mit größter Sorgfalt zum Einsatz gelangen, um ein Brechen der Gelperlen zu vermeiden). Nicht-gebundenes Material wird mit dem Kupplungspuffer weggewaschen, etwa noch vorhandene aktive Gruppen werden während 1 bis 2 h mit 1M-Äthanolamin bei einem pH-Wert von 8 reagieren gelassen. Es werden drei Waschzyklen durchgeführt, jeder Zyklus besteht im Waschen bei einem pH-Wert von 4 mit Hilfe eines 0,1m-Acetatpuffers mit 1m-NaCl und in einem Waschen bei einem pH-Wert von 8 mittels eines 0,1m-Boratpuffers mit 1m-NaCl.

(b) Die Säule wird durch Waschen mit einem Phosphatpuffer eines pH-Werts von 7 in den Gleichgewichtszustand gebracht, worauf ene Reaktion mit einer Plasmaprotein, insbesondere sp₁ (spezifisches Schwangerschaftsprotein 1) enthaltenden Lösung ablaufen gelassen wird.

Das gesamte sp₁ wird zurückgehalten (wie die Polyacrylamidgel­ elektrophorese und eine Radialimmunodiffusion zeigen) und mit Sorbit (20 mM in 0,1m-Phosphatpuffer: 14 ml) eluiert.

sp₁ eingesetzt:60 mg sp₁ eluiert:60 mg.

Beispiel 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Trennung der alkalischen Glycoproteinphosphatase von Kälbereingeweidemucosa.

Eine gemäß Beispiel 4(a) hergestellte Säule wird mit einem Phosphatpuffer (oder HEPES) eines pH-Werts von 8 bis 8,4 gewaschen.

Eine Proteine aus Kälbereingeweidemucosa, insbesondere alkalische Phosphatase (etwa 100 IE Enzym) enthaltende Lösung und 1m-NaCl werden auf die Säule aufgegeben. Die gesamte alkalische Phosphatase wird in der Säule festgehalten. Nach dem Waschen zur Entfernung von nicht-gebundenem Protein wird das Enzym mit Hilfe von Sorbit (20 mM) eines pH-Werts von 8 bis 8,4 (HEPES-Puffer) entfernt. Etwa 90 bis 100% der enzymatischen Aktivität lassen sich wiedergewinnen.

Beispiel 6

Durch Waschen von 10 ml Agarosegelperlen (Sepharose 6B) mit destilliertem Wasser auf einer Glasfritte und Entfernen des in den Zwischenräumen befindlichen Wassers durch Vakuumfiltration wird ein Reaktionspartner vorbereitet. Das Gel wird in 6 ml einer 1m-Natriumhydroxidlösung mit 2 mg/ml Natriumborhydrid und 5 ml 1,4-Butandioldiglycidyläther suspendiert, worauf die Reaktionsteilnehmer unter schwachem Rühren bei Raumtemperatur über Nacht reagieren gelassen werden. Danach wird das Gel gründlich mit destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 5°C gewaschen. Die Umsetzung läßt sich wie folgt darstellen:

Das aktivierte Produkt wird danach einige Monate lang in der Kälte gelagert, ohne daß sich die Zahl der Oxirangruppen merklich vermindert. Bei kürzerer Reaktionsdauer oder einer niedrigeren Konzentration an dem Bisepoxid bilden sich weniger Oxirangruppen.

Andere zur Aktivierung ebenso gut verwendbare Alkandiol­ diglycidyläther sind 1,3-Propandioldiglycidyläther, 1,5- Pentandioldiglycidyläther, 1,6-Hexandioldiglycidyläther, 2,5-Hexandioldiglycidyläther und andere Alkandioldiglycidyläther oder aliphatische Diepoxide mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Die Kupplung des aktivierten Produkts mit einer Dihydroxyboryleinheit oder einem Dihydroxyborylliganden erfolgt durch Vermischen des Produkts mit einem alkalischen Medium (0,2m-Natriumcarbonat eines pH-Werts von 11 bis 12) mit 50 bis 500 mg m-Aminophenylboronsäure. Höhere Konzentrationen an dem Liganden in dem Reagens erreicht man durch 24-stündiges Verrühren bei einer Temperatur von 40°C. Danach wird das Gel mit reichlich destilliertem Wasser gewaschen und bei einer Temperatur von 4°C gelagert. Das Reagens besitzt folgende Formel:

Das erhaltene Reagens ist besser als andere, da es aufgrund seiner Herstellung keine anderen geladenen Gruppen enthält. Solche anderen geladenen Gruppen können in dem Mittel zu unerwünschten Ionenaustauscheigenschaften führen. Aus einer Analyse der Waschflüssigkeit läßt sich abschätzen, daß an das Agarosegel etwa 20 mg/ml Phenylboronsäure gebunden sind.

Anstelle der m-Aminophenylboronsäure können auch andere aminosubstituierte Alkyl- oder Arylboronsäuren zum Einsatz gelangen.

Eine gemäß Beispiel 1 entnommene und behandelte Blutprobe (bei der Behandlung wird allerdings die Lysierlösung mit dem Phosphatpuffer vereinigt) enthält im Überstehenden bei einem pH-Wert von 6,7 schätzungsweise 10 bis 12% Hämoglobin.

0,5 ml der Blutprobe werden über eine Säule mit 2 ml des in der geschilderten Weise hergestellten Reagens mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/h laufen gelassen, worauf die Säule mit 0,1m-Phosphatpuffer eluiert wird.

Es werden mehrere Säulen hergestellt, die jeweils 2 ml des in der geschilderten Weise hergestellten Reagens enthalten. Über die verschiedenen Säulen wird jeweils mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/h 0,5 ml der Blutprobe fließen gelassen. Danach wird jede Säule bei unterschiedlichen pH-Werten mit einem 0,1m-Phosphatpuffer eluiert, um die prozentuale Menge an gebundenem Hämoglobin zu bestimmen. Die Bestimmung erfolgt durch Absorptionsmessungen bei 413 nm bzw. 540 nm. Hierbei werden folgende Ergebnisse erhalten:

Ferner wird der Einfluß einer höheren Salzkonzentration des Puffers ermittelt, indem Puffer zum Einsatz gelangen, die zusätzlich 0,5m-KCl enthalten.

Den Ergebnissen ist zu entnehmen, daß das Reagens über einen breiten Bereich von Ionenstärken (sowohl in An- als auch in Abwesenheit von zusätzlichem Salz) einen sehr zuverlässigen Test bei pH-Werten zwischen etwa 8 und 9 ermöglicht. Bei einer Ionenstärke von 0,1m ist die Bindung bei pH-Werten zwischen etwa 7,5 und 9 konstant. Selbst bei relativ hohen Hämoglobinkonzentrationen in der auf diese Säulen aufgegebenen Probe ist keine Sättigung der Säulen feststellbar. Der Auftrag von weniger als etwa 2 mg Hämoglobin pro Säule liefert jedoch ungünstige Ergebnisse. Eine Änderung der Fließgeschwindigkeit von 5 bis 30 ml/h und der Temperatur von 4° bis 23°C beeinflußt die prozentuale Bindung nicht.

Die im vorliegenden Falle hergestellten Säulen binden auch Glucose. Diese kann somit als konkurrierender Ligand in einem geeigneten Puffer zur Desorption des glycosylierten Hämoglobins verwendet werden. Ferner können die Säulen auch mit einem 0,1m-Phosphatpuffer eines pH-Werts von 8,5 mit 0,1m-Borsäure desorbiert werden.

Claims (7)

1. Verfahren zum Trennen von Glycoproteinen von in einem Gemisch mit diesen vorliegenden nicht-glycosylierten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man das betreffende Gemisch mit einem Reagens mit an einem Träger gebundener Dihydroxyborylgruppe zur Bildung eines Glycoprotein/Dihydroxyboryl- Komplexes in Berührung bringt und danach den Komplex von dem Gemisch trennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens mit an den Träger kovalent gebundener Dihydroxyborylgruppe verwendet.

3. Verfahren zum Nachweis von glycosyliertem Hämoglobin in Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Blutprobe lysiert, aus der lysierten Probe Zellbruchstücke abtrennt, die lysierte Probe mit einem selektiven Reagens mit an einen Träger kovalent gebundener Dihydroxyborylgruppe zur Bildung eines Komplexes der Dihydroxyborylgruppe mit dem glycosylierten Hämoglobin in der Probe in Berührung bringt, den gebildeten Komplex aus der Probe abtrennt und die Menge an glycosyliertem Hämoglobin in dem Komplex bestimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge des glycosylierten Hämoglobins kolorimetrisch bestimmt.

5. Reagens zur Bestimmung des Gehaltes einer Blutprobe an glycosyliertem Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß es (1) aus einem Reaktionspartner für das glycosylierte Hämoglobin mit einer an einen Träger gebundenen Dihydroxyborylgruppe und (2) einem zur Einstellung des pH-Werts der Blutprobe auf einen Wert von etwa 7,5 bis 9 fähigen Puffer besteht.

6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als weiteren Bestandteil ein Mittel zum Lysieren der Blutprobe enthält.

7. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Reaktionspartner für das glycosylierte Hämoglobin Agarose in feinteiliger Form mit daran kovalent gebundener Dihydroxyborylgruppe enthält.