FR2520877A1

FR2520877A1 - Procede pour la determination des composes a liaisons gluco associes aux tumeurs

Info

Publication number: FR2520877A1
Application number: FR8201495A
Authority: FR
Inventors: Masakazu Adachi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-01-29
Filing date: 1982-01-29
Publication date: 1983-08-05
Also published as: FR2520877B1

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR DETERMINER LA TENEUR EN COMPOSES A LIAISONS GLUCO ASSOCIES AUX TUMEURS TAG DANS UN ECHANTILLON D'HUMEUR DE L'ORGANISME. SELON L'INVENTION, ON FAIT REAGIR LE TAG DANS UN ECHANTILLON D'HUMEUR DE L'ORGANISME AVEC UNE LECTINE FIXANT LA N-ACETYL-D-GALACTOSAMINE AG OU UNE LECTINE FIXANT LE L-FUCOSE POUR FORMER UN COMPLEXE TAG-LECTINE ET ON MESURE LA QUANTITE DE COMPLEXE TAG-LECTINE OU DE LECTINE N'AYANT PAS REAGI. APPLICATION: DIAGNOSTIC DU CANCER.

Description

La présente invention concerne un procédé pour déterminer les composés h liaisons gluco associés aux tumeurs (ciaprès dénommés TAG) dans les humeurs de l'organisme chez les mammifères, plus particulièrement les TAG comprenant les glicoprotéines > les glucopeptides, les glucolipides et/ou les sucres ayant un certain motif terminal spécifique qui augmente avec la prolifération des cellules indifférenciées, en particulier des cellules tumorales ou cancéreuses.

On connatt des procédés pour le diagnostic du cancer par mesure d'une glucoprotéine spécifique qui est produite spécifi- quement par les patients atteints de cancer. La plupart de ces procédés utilisent l'antigénicité de la fraction protéique de la glucoprotéine; par exemple, on connatt un procédé pour le diagnostic du cancer primitif du foie par mesure des al-fétoprotéines et un procédé pour le diagnostic du cancer d'un organe digestif, en particulier le cancer du rectum, par détermination de l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), voir Igaku no Ayumi (Progrès en Médecine), 106, 5, cinquième édition spéciale du samedi, pages 2235-250 (1978). Mais ces procédés de diagnostic sont d'une utilisation relativement limitée.

D'autres recherches ont révélé que les humeurs de l'organisme d'un patient atteint de cancer contiennent un TAG produit par des cellules indifférenciées (principalement les cellules cancéreuses) et libéré dans l'humeur, et que ce TAC diffère considérablement des sucres produits par les cellules différenciées (principalement les cellules normales) et libérés dans l'humeur, en ce qui concerne la structure des chaînes de sucres, la longueur des chaînes de sucres et le type des résidus de sucres qui le @ons- tituent.On a également trouvé un procédé pour déterminer la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de ltorganisme, qui consiste à faire réagir le TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme avec une lectine qui peut fixer de manière spécifique le motif terminal galactoe@.(BI#3 ou el-,lr) -N-acétylglucosamine et/ou le motif terminal galactose-(l- > 3 ou ssl-f4)-N-acétylgalactosamine (brevet britannique 2 043 390A, demande de brevet des Etats-Unis d'mérique Serial n 187 890, déposée le 17 septembre 1980).

Eù égard au souhait accru de disposer de procédés de mesure de la teneur en TAG et de procédés de diagnostic qui soient d'une application moins limitée et qui aient une sensibilité améliotée, la demanderesse a mené des études approfondies et découvert que les TAG comprennent des glucoprotéines, des glucopeptides, des glucolipides et/ou des sucres ayant un motif terminal N-acétyl- D-galactosamine (ci-après dénommé AG) ou un motif terminal
L-fucose, qu'il est fixé de manière spécifique sur certains types de lectines (dans ce qui suit une lectine qui peut fixer de manière spécifique un motif terminal AG est dénommée lectine fixant 1'AG et celle qui peut fixer de manière spécifique le motif terminal
L-fucose est dénommée lectine fixant le L-fucose) et que, par consdquent, par réaction du TAG présent dans l'humeur de l'orga niasse avec une lectine fixant 1'AG ou une lectine fixant le
L-fucose (ces deux lectines sont parfois dénommées ci-après lectines spécifiques), on peut déceler des cellules cancéreuses, contrtler leur degré de prolifération et connattre leur profil de croissance pour le diagnostic du cancer. La présente invention repose sur cette découverte.

L'invention a donc principalement pour objet un nouveau procedd pour la détermination de la teneur en TAG dans les humeurs de l'organisme. L'invention propose donc un procédé pour déterminer la teneur en TAG dans un échantillon d'une humeur de l'organisme qui consiste b faire réagir lesTAG dans un échantillon d'humeur de l'organise avec une lectine fixant l'AG ou une lectine fixant le L-fucose pour former un complexe TAG-lectine et b mesurer la quantité de complexe TAG-lectine ou de lectine n'ayant pas réagi.

L'invention est décrite plus en détail ci-après en référence aux dessins annexés dans lesquels
les figures 1 et 2 représentent chacune une courbe étalonnée obtenue selon un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention utilisant le procédé de réaction compétitive (exemples (viii) et (ix))
- les figures 3 et 3a représentent des courbes d'étalon nage d'un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention utilisant le procédé de réaction compétitive de l'exemple 2(ii),
- la figure 4 représente graphiquement les teneurs en
TAG chez des personnes saines et des patients atteints de divers cancers, déterminées par le procédé de l'invention utilisant le procédé de réaction compétitive de l'exemple 2(iii),
- la figure 5 représente graphiquement les teneurs en
TAG chez des personnes saines et chez des patients atteints de divers cancers selon l'exemple 3(il),
- la figure 6 est une courbe d'étalonnage d'un autre mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention utilisant le procédé "de mise en sandwich" de l'exemple 3(iii),
- la figure 7 représente une courbe d'étalonnage obtenue selon le procédé de l'exemple 3(iv) utilisant la MSP comme substance étalon,
- les figures 8a, 8b et 8c représentent graphiquement les teneurs en TAG dans des échantillons, déterminées en utilisant la courbe d'étalonnage de la figure 7,
- les figures 9 et 9a représentent des courbes d'étalonnage d'un autre mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention utilisant un procédé de réaction compétitive de l'exemple 4(i),
- la figure 10 représente une courbe d'étalonnage d'un autre mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention utilisant un procédé "de mise en sandwich" de l'exemple 4tir),
- la figure 11 représente graphiquement les teneurs en
TAG chez des personnes saines et des patients atteints de divers cancers, déterminées en utilisant le procédé compétitif de l'exemple 4(iii),
- la figure 12 représente graphiquement les teneurs en
TAC chez des personnes saines et chez des patients atteints de divers cancers, déterminées en utilisant le procédé de l'exemple 4(iv),
- la figure 13 représente une courbe d'étalonnage obtenue selon le procédé de l'exemple 4(v), et
- la figure 14 représente graphiquement les teneurs en
TAG dens des échantillons, déterminées en utilisant la courbe d'étalon nage de la figure 13.

Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser diverses humeurs de l'organisme parmi lesquelles le sang, le suc cellulaire, la lymphe, le liquide thoracique, le liquide abdominal, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal et la salive Parmi ceux-ci, on préfère en particulier l'utilisation du sang sous la forme de sérum outre plasma sanguin.La quantité d'humeur a utiliser pour la détermination varie d'environ 0,01 & environ 10 ml, de préférence de 0,1 à 0,2 ml
Selon l'invention on isole le TAG de l'humeur, on fait réagir une lectine spécifique de l'invention et on mesure la quantité de lectine spécifique liée au TAG ou la quantité de lectine spéci- fique résiduelle, ou bien on marque une lectine spécifique et on l'ajoute directement à l'humeur de l'organisme et on isole la lectine spécifique marquée fixée au TAG ou la lectine spécifique marquée n'ayant pas réagi et on mesure la quantité de ladite lectine spdci- fique marquée liée au TAG ou de ladite lectine spécifique marquée n'ayant pas réagi.On peut déterminer par l'un ou l'autre procédé la teneur on TAG dans l'humeur de ltorganisme.

On peut isoler les TAG de l'humeur de ltorganisme par l'une quelconque des techniques d'extraction de séparation utilisées de manière classique pour obtenir les glucoprotéines, les glucopeptides, les glucolipides et/ou les sucres ayant un motif terminal AG ou un motif terminal L-fucose; parmi ces procédés, on citera le relargage, la précipitation, ltextraction, la centrifugation, la dialyse,le passage auKtamis moléculaires et l'inactivation des enzymes. Ces procédés peuvent être utilisés en combinaison.Plus particulièrement, on peut préparer la fraction désirée en ajoutant au sérum ou au plasma de l'acide sulfosalicylique, de l'acide trichîoroacétique ou du sulfate de zinc, ou en chauffant le sérum ou le plasma, en séparant par filtration le précipité résultant pour éliminer lalbuxine, l'immunoglobuline, etc. > et en dialysant ensuite le résidu.

Dans les cas où l'on utilise une lectine spécifique marque, on peut utiliser comme échantillons d'essais(ci-apres dénommés "échantillons") des échantillons recueillis de l'humeur de l'organisme, sauf pour le sang. Hais,pour éviter la dénaturation des échantillons et accélérer la réaction avec la lectine spécifique, on ajoute de préférence comme protéinoeprotectricesdes protéines contenant des sucres inférieurs, tels que la sérum albumine de boeuf (SAB). On obtient un meilleur résultat en ajoutant une quantité convenable de protéine protectrice & l'échantillon après en avoir séparé l'albumine, l'immunoglobuline, etc.Lorsque humeur de l'organisme est le sang, on peut utiliser comme échantillon le sérum obtenu par une technique classique de récolte du sérum, ou le plasma obtenu par une technique de récolte du plasma utilisant un anticoagulant, tel que 1'hdparine, 1'EDTA, l'acide citrique, etc.

L'échantillon particulièrement préféré est un plasma recueilli et préparé en utilisant l'héparine comme anticoagulant. Si la teneur en TAG est relativement élevée comme chez un patient atteint d'ascites, ces échantillons peuvent hêtre dilués,si ai nécessaire,avec une solution tampon appropriée.

On peut utiliser selon l'invention n'importe quelle lectine fixant 1'AG ou le L-fucose si elle est capable de se fixer spécifiquement sur les glucoprotéines, les glucopeptides, les glucolipides et/ou les sucres ayant un motif terminal AC ou un motif terminal L-fucose. Des exemples appropriée de lectines fixant 1'AG comprennent la lectine de Dolichos biflorus, la lectine de Maclura tomifera, la lectine d'Helix pomatia, la lectine de Phaseolus limensis, la lectine de Glycine max (soja) et la lectine de Bauhinia purpurea. Des exemples appropriés de lectines fixant le L fucose comprennent la lectine de Lotus tetragonolobus [rt. J. Enp.Pathi, 34, page 94 (1953)) et la lectine d'Ulex europeus [Boyd., W.C. et Sharpleigh. E., Blood, 9, page 1195 (1954)].

Diverses enzymes, substances fluorescentes et substances radioactives peuvent être utilisées pour marquer la lectine selon ltinvention. Des exemples caractéristiques d'enzymes comprennent la glucoamylase, la glucose-oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la ss-galactosidase, un fragment actif de l'hémoocta peptide, etc.; des exemples de substances fluorescentes comprennent la fluorescéine, l'isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine, le chlorure de 5-diméthylamino-1-naphtalènesulfonyle (chlorure de dansyle), etc.; et les substances radioactives comprennent par exemple l'iode radioactif (par exemple 125I, 131I, etc.), le tritium radioactif, etc.

Comme décrit ci-après, on peut marquer la lectine spécifique A utiliser selon l'invention avec ces marqueurs par une technique utilisée de manière classique pour marquer des protéines connues, telles que les antigènes ou les anticorps, avec des enzymes, des substances fluorescentes ou des substances radioactives.

Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante : on mélange d'abord une quantité prédéterminée de l'humeur de l'organisme ou d'une fraction de TAG avec une lectine marquée ou non et on chauffe le mélange A une température inférieure b 45 C, de préférence entre 4 et 400C, plus particulièrement entre 20 et 40 C. On peut isoler la lectine spécifique marquée ou non fixée au TAG ou la lectine spécifique marquée ou non n'ayant pas réagi résultante par une technique classique d'isolement, telle que chromatographie, électrophorèse, relargage, fractionnement, dialyse, filtration sur gel, adsorption ou leurs combinaisons.On peut également utiliser comme moyens de séparation le gel do glose, le gel d'agarose ou le gel de polyacrylamide, voir la demande de brevet japonais (OPI) n 151 263/80 (le terme "OPI" s'entend ici pour désigner une demande de brevet japonais non examinée publiée).

Plus particulièrement, on peut isoler la lectine spéci- fique marquée ou non n'ayant pas réagi en ajoutent & la liqueur de réaction une quantité convenable d'un précipitant de la lectine spécifique fixée & la glucoprotéine, tel que polyéthylèneglycol, sulfate d'ammonium saturé ou "Rivanol" (acrinol), puis en centrifuge geant ou en séparant d'une autre manière la lectine spécifique marquée ou non fixée au TAG. Des conditions appropriées pour la centrifugation peuvent etre utilisées selon le précipitant utilisé; si l'on utilise comme précipitant le polyéthylèneglocol, la centrifugation est effectuée de préférence a environ 1.000 G pendant 30 à 60 min.

On peut facilement séparer la lectine spécifique marquée ou non fixée au TAG de la lectine spécifique marquée ou non n 'ayant pas réagi en utilisant la différence de vitesse de diffusion sur un gel de gélose, un gel d'agarose ou un gel de polyacrylamide.

En particulier, si l'on place le mélange de réaction sur un gel, la lectine spécifique fixée au TAG ne diffuse pas et reste & la surface du gel, tandis que la lectine spécifique n'ayant pas réagi diffuse a travers le gel. La lectine spécifique fixée au TAG peut donc être facilement séparée de la lectine spécifique n'ayant pas réagi.

On peut préparer le gel ci-dessus mentionné de manière classique. Par exemple, on ajoute une quantité appropriée de gélose, d'agarose ou de polyacrylamide à un diluant, tel que l'eau distillée, ou l'acide citrique dilué ou la solution tamponnée (pH environ 7,5) tris-acide chlorhydrique, et on chauffe le mélange à 60-800C en agitant doucement pour former une solution, que l'on place dans un récipient convenable tel qu'un tube à essais et on laisse refroidir jusqu'à ce que la solution coagule en une gelée. On choisit la concnetration du gel selon la dimension (par exemple poids moléculaire > structure stéréospécifique) de le lectine de l'invention n'ayant pas réagi et de la lectine spécifique marquée fixée au TAG.Le gel a généralement une concentration de 0,4 à 2,0% en poids, de préférence de 0,7 à 1,0% en poids. Si nécessaire ou si on le désire, le gel peut contenir un conservateur. Le gel ainsi préparé peut avoir une surface plane, mais on préfère une surface concave puisque le complexe résultant ne doit pas coller à la paroi interne du récipient.

On peut calculer la teneur en TAG de l'humeur de l'orga- nisme d'après la quantité de la lectine spécifique marquée ou non fixée au TAC ou de la lectine spécifique marquée ou non n'ayant pas réagi, isolée, telle qu'elle est mesurée par une technique classique.

On peut utiliser diverses techniques pour mesurer la quantité de la lectine spécifique non marquée qui n'a pas été consommée dans la réaction. De préférence, on ajoute & la liqueur de réaction une substance qui réagit de manière spécifique avec la lectine spécifique en provoquant une agglutination ou une précipi- tation et l'on observe visuellement ou on mesure par analyse photométrique le changement spécifique résultant.Plus particulièrement, on dilue en série la liqueur de réaction,chaque fois par la méthode de double dilution,avec un diluant tel que tampon au phosphate 0,15M ou sérum physiologique, on place une quantité prédéterminée de la dilution sur une plaque en V ou une lame de verre en U ou un petit tube à essais, etc., et on ajoute une substance qui provoque une réaction d'agglutination spécifique avec la lectine spécifique, on agite le mélange et on laisse reposer 9 une température inférieure à 45"C, de préférence entre 4 et 400C, pendant une durée de 30 min ou plus, de préférence entre 60 et 90 min et on détermine le degré final ou maximal de dilution auquel se produit l'agglutination. Le degré maximal de dilution est défini comme l'indice d'agglutination.Toutes les lectines spécifiques qui peuvent être utilisées selon l'invention ont sensiblement le même indice d'agglutination.

Un exemple de substance qui provoque la réaction d'agglutination spécifique avec la lectine spécifique est une glucoproteine ayant un motif AG terminal ou un motif L-fucose terminal.

Pour la lectine fixant 1'AG, on peut utiliser le "Sephadex", un latex, des perles de verre, etc. recouverts avec des glucoprotéines ayant un motif AG terminal, telles que les cytolipines K et R de la membrane d'érythrocyte humain, le glucopeptide type A sulfaté de la membrane muqueuse gastrique de porc, le dérivé asialo de la substance active type A du sang humain, la mucine type A de membrane submandibulaire de porc, l'asialo-GMI et l'antigène de Follisman.

Pour la lectine fixant le 1-fucose, on peut utiliser des 'Zsephadex' un latex, des perles de verre, etc. revêtus avec des glucoprotéines ayant un motif terminal L-fucose, telles que les substances actives type Le et Le b du sang humain, la glucoprotéine type A sulfatée de membrane muqueuse gastrique de porc, la glucoprotéine sulfatée de substance active type H(O) de la mcmbrane muqueuse gastrique de porc et l'antigène H1 d'érythrocyte humain.

Lorsque lton utilise la lectine spécifique arquée, on peut mesurer la teneur en TAG par une technique convenable choisie selon l'agent marquant de la lectine spécifique. Par exemple, si la lectine spécifique est marquée par une enzyme, on peut déterminer la teneur en TAG en mesurant l'activité enzymatique en utilisant un substrat approprié de l'enzyme pour un système colorimétrique ou un système analytique par fluorescence. Si l'agent marquant est une substance fluorescente, on peut déterminer la teneur en TAG en mesurant l'intensité de fluorescence et,si l'agent marquant est une substance radioactive, on peut déterminer la teneur en TAG par mesure de la radioactivité. De cette manière, on peut mesurer la quantité de lectine spécifique marquée fixée au TAC ou de lectine spécifique marquée n'ayant pas réagi.

Un mode de mise en oeuvre particulièrement convenable du procédé de détermination selon l'invention consiste à utiliser un nécessaire pour la détermination de la teneur en TAG dans les humeurs de l'organisme, tel que plasma sanguin ou sérum. Pour les buts de l'invention, on peut utiliser un nécessaire contenant la lectine spécifique qui peut être fixée de manière spécifique sur le TAG. On peut ajouter à la lectine spécifique utilisée comme réactif un stabilisant et/ou un conservateur, tel que glycérol ou protéine de sérum de boeuf. La lectine spécifique peut être un produit lyophilisé, ou bien le nécessaire peut contenir un solvant soluble dans l'eau ou miscible avec l'eau.En outre, le réactif a base de lectine spécifique peut contenir une solution tampon pour maintenir son pH après reconstitution et/ou un conservateur et/ou un stabilisant pour empêcher une détérioration prématurée de l'échantillon. La solution tampon n'est pas essentielle pour le nécessaire, mais,si on l'utilise, on l'ajuste de préférence à pH 6-7,8.

L'agent de reconstitution contient de préférence de l'eau, mais tout ou partie de l'eau peut être remplacée par un solvant miscible avec l'eau. Les solvants miscibles avec l'eau sont bien connus de l'homme de l'art et des exemples appropriés comprennent, sans limitation, le glycérol, les alcools, les glycols et éthers de glycol. La quan tité de la lectine spécifique contenue dans le solvant ou diluant est choisie de maniere convenable selon l'indice d'agglutination (qui est défini comme la dilution finale ou maximale d'échantillons dilués en série deux fois!. le type de l'agent marquant ou la substance à déterminer, etc. Ordinairement, la lectine spécifique est présente en quantité d'environ 0,01 à environ 100 7/mol, de préfé- rence de 0,03 à 40 7/ml. La solution ci-dessus de la lectine spéci- fique marquée ou non peut encore etre diluée.

Les objets de l'invention peuvent être atteints de manière plus avantageuse par un procédé compétitif ou un procédé de "mise en sandwich" comme décrit ci-dessous.

(1) On met en réaction compétitive le TAC à déterminer dans une humeur de l'organisme (ci-après parfois dénomméesuhstance à déterminer) et une quantité donnée de TAG insolubilisé ou d'une substance semblable au TAG avec la lectine spécifique qui agite marquée avec un agent marquant (ci-après dénommée lectine spécifique marquée) et on sépare le TAG insolubilisé ou la substance semblable au TAG insolubilisée fixée å la lectine spécifique marquée de la lectine spécifique marquée n'ayant pas réagi et on mesure l'activité de l'agent marquant sur l'une ou l'autre substance pour déterminer la teneur en TAG.. (2) On met en réaction compétitive la substance à déterminer et une quantité donnée de TAG ou de substance semblable au TAG qui a été marquée avec un agent marquant (ci-après dénommée TAG marqué et substance semblable au TAG marquée1 respectivement) avec une quantité donnée de la lectine spécifique ou de la lectine spécifique insolubilisée et on sépare le TAG marqué ou la substance semblable au TAG marquée fixée à la lectine spécifique ou A la lectine spécifique insolubilisée du TAG marqué non fixé ou de la substance semblable au TAG marquée non fixée et on détermine l'activite de l'agent de marquage sur l'une ou l'autre substance pour déterminer la teneur en TAC.

(3) On fait réagir la substance à déterminer avec la lectine spécifique insolubilisée pour former un complexe de TAC et de la lectine spécifique insolubilisée, on fait réagir le complexe avec une quantité donnée de la lectine spécifique marquée et on sépare le complexe fixé A la lectine spécifique marquée de la lectine spécifique marquée non fixde et on mesure l'activité de l'agent de marquage sur l'une ou l'autre substance pour déterminer la teneur en TAG.

Dans la présente description, le terme "substance semblable au TAC" désigne un dérivé de sucre ayant un motif AC terminal ou un motif L-fucose terminal; on citera à titre d'exemples les sucres ayant un motif AG.terminal tels que le glucopeptide type A sulfaté de la muqueuse gastrique de porc, les cytolipines K et R de la membrane d'érythrocyte humain le dérivé asialo de la substance active type A du sang humain, la mucine type A de la membrane submandibilaire de porc, l'asialo-GMl et l'antigène de Follisman et/ou les dérivés de sucres ayant un motif L-fucose terminal tels que les substances actives type Lea et Leb du sang humain, la glucoprotéine sulfatée type A de la muqueuse gastrique de porc, la glucoprotéine sulfatée substance active type H(O) de la muqueuse gastrique de porc et l'antigène H1 d'érythrocyte humain.

On peut préparer le TAG insolubilisé, la substance semblable au TAG insolubilisée et la lectine spécifique insolubilisée par réaction chimique ou physique du TAG, de la substance semblable au TAC ou de la lectine spécifique avec un support insoluble. On citera comme supports insolubles la cellulose en poudre, le "Sephadex", le 'Sepharose", le polystyrène, le papier-filtre, la carboxyméthylcellulose, les resines échangeuses d'ions, le dextranne > les films de matière plastique, les tubes de matière plastique, le "Nylon", les perles de verre, la soie, les c opolymères polyamine-éther méthylvinylique-acide maleique, les copolymères d'aminoacides, les copolymères éthylène-acide maléique, etc. Linsolubilisation peut être effectuée par les procédés suivants : un procédé de formation de liaison covalente [c'est- -dire un procédé diazo, un procédé au peptide (par exemple un procédé à l'amide d'acide un procédé à la résine carboxy-chlorure, un procédé à la résine de carbodlimide, un procédé au dérivé d'anhydride maléfique, un procédé au dérivé isocyanate, un procédé au polysaccharide activé par le bromure de cyanogene, un procédé au carbonate de cellulose, un procédé utilisant un agent de condensation, etc. , un procédé d'alkylation, un procédé de fixation sur support utilisant un agent réticulant tel que glutaraldéhyde, hexamethylènediamine, etc.; un procédé de fixation sur support selon la réaction de Ugi, etc.; un procédé de fixation d'ions utilisant un support tel qu'une résine échangeuse d'ions; et un procédé d'adsorption physique utilisant du verre poreux tel que des perles de verre comme support. On préfère le procédé au polyssecharide active par le bromure de cyanogène et le procédé de fixation sur support utilisant un agent réticulant parmi les procédés de formation de liaison covalente.Selon le procédé au polysaccharide activé par le bromure de cyanogène, on peut obtenir le TAG insolubilisé, la substance semblable au TAG insolubilisée ou la lectine spécifique insolubilisée par réaction du TAG, etc. avec 10 à 1.000 fois sa quantité d'un support activé par le bromure de cyanogène dans un solvant convenable à 0-400C, de préférence à 20-30 C, pendant 2 à 4 h.

Le TAG insolubilisé, la substance semblable au TAG inso lubilisée et la lectine spécifique insolubilisée peuvent également être préparés par un procédé de polymérisation amorcé par les radiations. Autrement dit, on prepare une dispersion aqueuse d'un monomère polymérisable contenant le TAG, la substance semblable au
TAG ou la lectine spécifique et on irradie par la lumière ou par des radiations ionisantes pour polymériser ledit monomère et former une matrice polymere du TAG, de la substance semblable au TAG ou de la lectine spécifique.On prépare cette dispersion aqueuse en dispersant un monomère polymérisable hydrophobe (A) dans une solution aqueuse b 0,1-59. en poids d'un polymère hydrosoluble (B), en dispersant un monomère polymérisable hydrophile (C) dans une soîtition muqueuse, ou en dispersant un mélange du monomère polymérisable hydrophobe (A) avec un monomère polymérisable hydrophile (C) dans une solution aqueuse de sérum physiologique à 3-20Z en poids ou en dispersant le monomère polymérisable hydrophobe (A) dans une solution aqueuse contenant 0,01 à 5% en poids d'un tensio-actif (D).Lorsque l'on irradie par la lumière ou les radiations ionisantes la dispersion ainsi prépare, le monomère polymérisable présent comme phase dispersée est polymérisé pour former une matrice polymère du TAC, de la substance semblable au TAG ou de la lectine spécifique. Si on le désire, la matrice peut être mise sous forme de feuilles ou de particules par des moyens convenables.

A titre d'exemples particuliers de monomèrespolymérisables hydrophobes(A), on peut citer le méthacrylate de glycidyle, le diméthacrylate d'éthylèneglycol, le diméthacrylate de diéthylèneglycol, le d iméthacrylate de triéthylèneglycol, le triméthacrylate de triméthylolpropane, le diméthacrylate de propylèneglycol-200, le diméthacrylate de dipropylèneglycol, le diméthacrylate de 1,4 butylbneglycol, le diméthacrylace de l,6-hexaneglycol, le diméthacry late de méthoxydiéthylèneglycol, le méthacrylate de méthyle, le méthacrylate d'éthyle, le méthacrylate de butyle et les acrylates correspondants.En genéral, on peut utiliser n'importe quel monomère insoluble dans l'eau qui puisse étre polymérisé par irradiation par la lumière ou les radiations ionisantes.

A titre d'exemples de mononomères polymérisables hydrophiles (C), on peut citer le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de méthoxytétraéthylèneglycol, le méthacrylate de méthoxypolyéthylèneglycol-400, le méthacrylate de méthoxypolyéthylène- glycol-1000, le diméthacrylate de polyéthyleneglycol-400, le dimétha- crylate de polyéthylèneglycol-600, l'acide néthacrylique, l'acrylamide, la N-vinyl-2-pyrrolidone, etc. et les acrylates correspondants.

En général, on peut utiliser n'importe quel monomère soluble dans l'eau qui puisse être polymérisé par irradiation par la lumière ou les radiations ionisantes.

A titre d'exemples de polymères hydrosolubles (B), on peut citer la polyvinylpyrrolidone, l'acide polyméthacrylique, l'acide polyacrylique, l'alcool polyvinylique, l'hydroxypropylcellulose, la gomme arabique, etc.

A titre d'exemples de tensio-actifs (D), on peut citer le laurylsulfate de sodium, l'oléate de potassium, ltoléate de sodium, le monolaurate de sorbitanne, le monostéarate de sorbitanne, le monooléate de sorbitanne > le monooléate de propylèneglycol, l'acide oléique, le dodecylbenzenesulfonate de sodium. Cependant, on peut utiliser n importe quel tensio-actif qui puisse retenir dans sa structure micellaire le monomère polymérisable ou le TAC > la substance semblable au TAG ou la lectine spécifique dissoute dans le monomère polymérisable.

On peut préparer le TAG marqué par une substance radioactive, la substance semblable au TAG marquée par une substance radioactive et la lectine spécifique marquée par une substance radioactive en introduisant dans le TAG, la substance semblable au
TAG ou la lectine spécifique un atome d'iode radioactif tel que 125I ou 131I. L'introduction d'iode radioactif est effectuée par des procédés ordinaires d'ioduration, par exemple un procédé d'ioduration oxydante utilisant la chloramine T, voir Nature: 194 page 495 (1962); Biochem. J., 89, page 114 (1963). Autrement dit, cette ioduration est effectuée dans un olvant convenable, par exemple une solution tampon à pH 6-8, de préférence une solution tampon au phosphate 0,2 M (pH 7), au voisinage de la température ambiante pendant 5 à 60 s en présence de chloramine T.On utilise de préférence l'iode radioactif et la chloramine T en quantités de î a 5 mCi et 10 a 100 nanonoles, respectivement, par nanomole de tyrosine contenue dans le TAG, la substance semblable au TAG ou la lectine spécifique. On isole et on sépare de manière classique le TAG, la substance semblable au TAG ou la lectine spécifique ainsi marqués et on les conserve, si nécessaire, sous la forme lyophilisée.

On peut préparer le TAG marqué par une enzyme, la substance semblable au TAG marquée par une enzyme et la lectine spécifique marquée par une enzyme par un procédé connu de couplage, voir, par exemple, B.F. Erlanger et coll., Acta. Endocrinol. Suppl., 168, page 206 (1972) et M.H. Karol et coll., Proc, Nat. Acad. Sci.

USA, 57, page 713 (1967). Autrement dit, on fait réagir le TAG, la substance semblable au TAG ou la lectine spécifique avec une enzyme dans une solution tampon à pH 4-6, par exemple une solution tampon a l'acétate 1 mM (pH 4,4),à la température ambiante pendant 2 5 h en présence d'un agent oxydant tel que NaI04, puis on réduit par NaBH4 ou les.analogues. L'enzyme est utilisée en quantité d'environ 1 à 3 moles par mole de TAG ou les analogues. L'agent oxydant est utilisé en quantité de 100 à 300 moles par mole de TAG ou analogues et l'agent réducteur en quantité de 1 a 2 moles.

On prépare le TAG marqué par une substance fluorescente, la substance semblable au TAG marquée par une substance fluorescente .et la lectine spécifique marquée par une substance fluorescente Çn faisant réagir le TAG, la substance semblable au TAG ou la lectine spécifique avec une substance fluorescente connue telle qu'isothiocyanate de fluorescéine (ITCF) ou isothiocyanate de tétramdthyl- rhodamine (ITCR) dans l'eau ou dans une solution de sérum physiologique à pH 6-8 entre 0 C et la température ambiante, de préférence a la température ambiante, pendant 30 min à 3 h, voir le procédé b l'anticorps fluorescent Ikagaku Jikkenho Koza, n 4, pages 263-270).

On utilise de préférence la substance fluorescente en quantité de 1150 du TAG ou analogues.

Le procédé de détermination selon l'invention par le procédé compétitif ou le procédé de "mise en sandwich" est décrit ci-dessous.

Dans les deux procédés, les réactions sont effectuées dans un solvant convenable à 45"C ou moins, de préférence à 4-400C, mieux encore de 20 à 400C. On préfère comme solvants ceux qui n'ont pas d'effet nuisible sur la réaction du TAG ou de la substance semblable au TAG avec la lectine spécifique, tels que l'eau, le sérum physiologique et les solutions tampons à pli 6-7,8, par exemple solution tampon tris 0,1-0,3 M-acide chlorhydrique (pH environ 7,5), solution tampon au phosphate O,lM (pH environ 7,4), etc. Les réactions sont effectuées pendant 5 à 40 h, de préférence 15 à 25 h.

On peut séparer le TAG (ou la substance semblable au TAG) fixé à la lectine spécifique de la lectine spécifique non fixée ou du TAG (ou de la substance semblable au TAG) non fixé par un procédé connu. Si l'on utilise le TAC (ou la substance semblable au TAG) insolubilisé ou la lectine spécifique insolubilisde, on sépare simplement la phase solide de la phase liquide par centrifugation, filtration ou decantation. Dans d'autres cas, on peut utiliser la chromatographie, l'électrophorèse, le relargage, le fractiolmement, la dialyse, la filtration sur gel, l'adsorption ou leurs combinaisons, ou un procédé de séparation utilisant le gel de gélose, le gel d'agarose ou le gel de polyacrylamide comme décrit dans la demande de brevet japonais (OPI) n 151 263/80.

On peut mesurer l'activité de l'agent de marquage pour le produit ainsi séparé par un procédé convenable choisi parmi les techniques déjà décrites, selon le type de l'agent de marquage.

L'activité mesurée peut etre utilisée pour déterminer la teneur en
TAG de l'échantillon.

Comme on l'a décrit ci-dessus, la présente invention réalise une détermination avantageuse de la teneur en TAG dans les humeurs de l'organisme. On peut utiliser la teneur en TAG déterminée pour le diagnostic du cancer à n'importe quel stade et l'invention est particulièrement utile pour la découverte du cancer à un stade initial.En outre, le procédé de l'invention permet de déterminer les composés 3 liaison glucosidique de sorte que, en comparaison avec les procédés classiques, dont la plupart utilisent des anticorps pour mesurer la fraction protéique (al-fétoprotéine, antigène carcinoembryonnaire, etc.), le procédé peut être utilisé pour le diagnostic d'une gamme plus large de cancers comprenant la lymphadénose maligne, le lyhome malin, le chorio-épithéliome malin, le cancer du foie, le cancer de la vésicule biliaire, le cancer du pancréas, le cancer du poumon, le cancer des voies biliaires, le cancer de la thyroïde, le myélome multiple, le cancer de l'estomac, le cancer du sein, le carcinome du côlon, le cancer du rectum, le cancer de l'ovaire, le cancer de la bouche, le cancer de la langue, le cancer du larynx, le cancer de la prostate, le liposarcome, le mélanome malin, le cancer de l'utérus et le sarcome primitif de l'estomac. Le procédé a une spécificité dépendant de la lectine spécifique utilisée; si l'on utilise la lectine fixant 1'AG, l'invention est particulièrement utile dans le diagnostic des cancers dérivés de cellules indifféren ciées, tels que lymphadénose maligne, lymphome malin et chorioépithéliome malin.En outre, le procédé de diagnostic des cancers utilisant la lectine fixant 1'AG ou la lectine fixant le L-fucose selon l'invention est avantageux du fait qu'il présente une réactivité croisée considérablement diminuée avec les maladies autres que les cancers, par exemple induration hépatique, hépatite, ulcère peptique, diabète sucré, colite, etc., par rapport atiprocédés classiques de diagnostic pour les cancers par la détermination des aL-fétoprotéinesX de l'antigène carcino-embryonnaire, etc. Les procédés classiques de diagnostic donnent souvent des résultats positifs pour des maladies hépatiques, en particulier l'induration hépatique, l'hépatite aiguë et l'hépatite chronique, etc. et provoquent une grande confusion dans les diagnostics des cancers.D'autre part, le procédé de diagnostic selon l'invention présente une faible réactivité croisée avec les maladies hépatiques et permet donc un diagnostic précis des cancers.

En outre, le procédé de l'invention permet de déterminer des sucres et dérivés de sucres (par exemple glucopeptides, glucoprotéines, glucolipides, glucoterpènes et glucostéroldes) ayant le motif terminal AG ou le motif terminal L-fucose.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.

EXEMPLE 1 (i) Activation de la peroxydase
On dissout 5 mg de peroxydase du raifort dans 1 ml de solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,3 M. On ajoute à la solution résultante 0,1 ml de solution éthanolique de fluorodinitrobenzène 0,1 M, puis,après avoir agité doucement pendant 1 h à la température ambiante, on ajoute à la solution résultante 0,1 ml d'une solution de NaI04 0,06 M puis on agite doucement pendant 30 min à la température ambiante. On ajoute encore au mélange de réaction 1 ml d'êthylèneglycol 0,16 M et on agite doucement la solution résultante à la température ambiante pendant 1 h.Ensuite, on dialyse la solution contre une solution tampon 0,01 M d'acide carboniquebicarbonate de sodium (pH 9,5) à 40C pendant un jour et une nuit entiers.

(ii) Procédé de marquage de la lectine par la peroxydase (lectine de
Dolichos-peroxydase)
On dissout 5 mg de lectine de Dolichos dans 3 ml de peroxydase activée obtenue sous (i) et on agite doucement à la température ambiante pendant 2-3 h pour faire réagir. On ajoute 5 mg de NaBH4 et on fait réagir à 4"C pendant 3 h. On dialyse ensuite cette solution contre une solution tampon 0,1 M de tris-acide chlorhydrique (pH 7,4) pendant un jour et une nuit et on soumet à la chromatographie sur colonne de gel de "Sephadex G 150" (éluant solution tampon 0,1 M tris-acide chlorhydrique, plI 7,4) pour effectuer la filtration sur gel. On mesure sur chaque fraction D à \ = 280 et 403 nm et on recueille les fractions ayant les pic pour D280 et D403.

(iii) Procédé pour le marquage de la lectine par la peroxydase (lectine
de Lotus tetragonolobus-peroxydase)
On dissout 5 mg de lectine de Lotus tetragonolobus dans 3 ml de la peroxydase activée obtenue sous (i) et on agite doucement la solution à la température ambiante pendant 2 à 3 h. On ajoute à la solution 5 mg de NaBH4 et on la maintient à 4 C pendant 3 h. On dialyse la liqueur réactionnelle contre une solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 M (pH 7,4) pendant un jour et une nuit entiers, et on la soumet à la filtratinn sur gel par chromatographie sur colonne de gel de "Sephadex G 150" (éluant : solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 M, pH 7,4). On mesure sur chaque fraction
D280 et D403 et l'on recueille les fractions ayant les pi.cs pour
D280 et D403.

(iv) Procédé pour préparer la lectine insolubilisée
On met en suspension 15 g d'agarose activée par CNBr dans 3 litres d'acide chlorhydrique 0,001 N et, après avoir laissé reposer pendant 30 min on lave sur un verre fritté avec 1 litre de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5). On obtient ainsi un total d'environ 50 ml d'agarose activée. On met en suspension dans 200 ml de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M pil 8,5) et on ajoute 5 ml d'une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,i) contenant 50 mg de lectine de Dolichos,puis on fait réagir à la température ambiante pendant 2 h en agitant de temps en temps.

Lorsque le réaction est terminée, on lave la solution sur un verre fritté et on ajoute le produit de réaction à 200 ml d'une solution de monoéthanolamine 1 M (pH 8,5) et on fait réagir pendant 2 h à la température ambiante. On lave ensuite le produit de réaction sur un verre fritté. Dans les modes opératoires ci-dessus > le lavage est effectué en utilisant 1 litre d'une solution tampon d'acide acétique 0,1 M (contenant NaCl 0,5 M) et 1 litre d'une solution tampon d'acide borique 0,1 M (contenant NaCl 0,5 M) alternativement trois fois.

(v) Procédé pour préparer la lectine insolubilisée
On met en suspension 15 g d'agarose active par CNBr dans 3 litres d'acide chlorhydrique 0,01 N et, après avoir laissé reposer pendant 30 min, on lave avec 1 litre de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5) sur un verre fritté. On obtient ainsi un total d'environ 50 ml d'agarose activée. On met en suspension dans 200 ml de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5j et on ajoute 5 rnl d'une solution tampon au phosphate 0,01 M (pH 7,7) contenant 50 mg de lectine de Lotus tetragonolobus, puis on fait réagir à la température ambiante pendant 2 h en agitant de temps en temps.

Lorsque la réaction est terminée, on lave la solution réactionnelle sur un verre fritté et on ajoute le produit de réaction à 200 ml d'une solution de monoéthamolamine 1 M (pH 8,5) et on fait réagir pendant 2 h à la température a.r.biante. On lave ensuite le produit de réaction sur un verre fritté. Dans les modes opératoires ci-dessus, on effectue le lavage alternativement trois fois en utilisant 1 litre d'une solution tampon d'acide acétique 0,1 M (contenant NaCI 0,5 M) et 1 litre de solution tampon à l'acide borique 0,1 M (contenant
NaCI 0,5 M).

(vi) Procédé pour la préparation d'une substance semblable au TAG :
On met en suspension 1 g de glucoprotéine sulfatée de muqueuse gastrique de porc (ci-après en abrégé MGP) dans 100 ml de solution tampon au phosphate 0,05 M (pH 7,0) et on ajoute goutte à goutte une solution aqueuse de NaOH 1 N pour ajuster le pH à 11.

Après agitation pendant 30 min à la température ambiante, on centri- fuge le mélange pendant 10 min à 3000 tr/min et on ajuste le liquide surnageant à pH 7,0 par HCl 1 N,puis on centrifuge à nouveau pendant 10 min à 3000 tr/min. On dialyse le liquide surnageant contre 10 litres d'une solution tampon au phosphate 0,01 M (pH 7,0) pendant une nuit pour obtenir la substance semblable au TAG pure (MGP pure).

(vii) Procédé pour la préparation de la substance semblable au TAG marqué.

(a) Marquage par une enzyme (MGP-peroxydase)
On dissout 4 mg de peroxydase du raifort (POXR) O,l/uM dans 1 ml d'eau distillée. On ajoute 0,2 ml de solution de NaIO4 0,1 M et, après agitation à la température ambiante pendant 20 min, on dialyse la solution contre une solution tampon d'acide acétique 1 mM (pH 4,4) pendant un jour et une nuit pour éliminer le NaIO4 n'ayant pas réagi. On ajoute à cette solution de réaction dialysée environ 60 l d'une solution tampon de bicarbonate 0,2 M (pH 9,5' pour ajuster le pH de la solution à 9,0.Ensuite, on ajoute immediatement à cette solution 0,6 ml de MGP (e 10 mg/ml) dissoute dans une solution tampon de bicarbonate 0,01 M (pH 9,5), on mélange pendant 2 h à la température ambiante et on ajoute 0,1 ml d'une solution de NaBH4 à 4 mg/ml dans l'eau distillée,puis on laisse reposer à 4 C pendant 2 h. On dialyse ensuite cette solution contre une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,2) pendant un jour et une nuit entiers, et on purifie en utilisant du "Sephadex G-200" (1,5 x 150 cm) pour obtenir la MGP-peroxydase (MGP-POX) pure. On recueille l'effluent du gel par portions de 5 ml dont on mesure l'absorption à D280 et
D403. @@
(b) Marquage par un i@@t@@@ (@@@I-MGP)
On marque la MGP par 1251 selon un procédé d'ioduration oxydante utilisant la chloramine T.

On dissout 10 y de MSP dans 50, l d'une solution tampon de phosphate 0,2 M (pH 7,0) et on y ajoute 10 l de Na123I (exempt de support; Société New England Nuclear Co) à 1 Ci et 50 γ/100 l de solution de chloramine T dans une solution tampon de phosphate 0,2 M et, après avoir mélangé à la température ambiante pendant 30 s, on ajoute 100 γ/100 l de solution de Na2S2O5 dans une solution tampon de phosphate 0, 2 M. On ajoute ensuite I mg de Na I et on mélange. On purifie la 125I-MGP ainsi obtenue sur "Sephadex G-50" (1 x 30 cm). La solution 125I-MGP ainsi préparée a une radioactivité d'environ l-21uCi/y.

(viii) Procédé de détermination
On mélange 0,1 ml de 125I-MGP (100 mg 0,17 Ci correspondant a environ 2,4 . 105 coups/min) obtenue sous (vii), 0,1 ml de la MGP étalon pure (0,1 γ/ml, 0,2 γ/ml, 0,5 γ/ml, 1 γ/ml, 2,5 γ/ml, 5 y/ml, 10 y/ml) obtenue en (vi), 0, 1 ml de lectine de Dolichos (10 y/ml) et 0,2 ml d'une solution tampon d'acide phosphorique 0,05 M (NaCl 0,15 M; 0, 1% de SAB; 0,02% de NaN3) dans un tube à essais de 10 x 75 mm et on fait incuber à 25 C pendant 1 h. Lorsque la réaction est terminée, on ajoute 0,1 ml de sérum de lapin snti-lectine de Dolichos (anti-DBA, fabriqué par la Société E.Y.Laboratory; solution diluée 10 fois) à la 125I-MGP fixée au DBA et à la 125I-MGP non fixée au DBA et, après incubation à 25 C pendant 1 h, on centrifuge la solution réaction nelle à 40C pendant 30 min à 3000 tr/min. On mesure la radioactivité du précipité (125I-MGP fixée a la DBA) pour tracer une courbe d'étalonnage (figure 1). Comme il est évident d'après les résultats ainsi obtenus, le % fixé (fixé/total, B/T) est ordinairement de 20 à 25 et l'on obtient une inhibition de 50% à une concentral@ " @@ 0,06 y/ml.

(ix) Procédé de détermination
On mélange 0,1 ml de 125I-MGP (100 ng 0,17/uCi correspondant à environ 2,4 . 10S coups/min) obtenue en (vii), 0,1 ml de la MGP étalon pure (0,1 γ/ml, 0,2 γ/ml, 0,5 γ/ml, 1 γ/ml, 2,5 γ/ml, 5 γ/ml, 10 y/ml) obtenue en (vi), 0,1 ml de lectine de Lotus tetragonolobus (10 y/ml) et 0,2 ml d'une solution tampon d'acide phosphorique 0,05 M (NaCl 0,15 M; 0,1% de SAB; 0,02% de NaN3) dans un tube à essais de 10 x 75 mm, et on fait incuber 3 250C pendant 1 h.Lorsque la réaction est terminée, on ajoute 0,1 ml de sérum de lapin anti-lectine de Lotus tetragonolobus (fabriqué par la
Société E.Y. Laboratory; solution diluée 10 fois) à la 125I-MGP fixée à la lectine de Lotus tetragonolobus et à la 125I-MGP non fixés à la lectine de Lotus tetragonolobus et, après incubation à 25 C pendant 1 h, on centrifuge la solution de réaction à 4 C pendant 30 min à 3000 tr/min. On mesure la radioactivité du précipité (125I-MGP fixée à la lectine de Lotus tetragonolobus) pour tracer une courbe étalon (figure 2). Comme il est évident d'après les résultats ainsi obtenus, le pourcentage fixé (B/T) est ordinairement de 20 à 25% et l'on obtient une inhibition de 50% à une concentration de 0,6 y/ml.

(x) Préparation de la substance semblable au TAG insolubilisée
(préparation d'une feuille de MGP insolubilisée)
On ajoute un excès de MGP a 100 ml d'une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,0) pour préparer une suspension. On ajoute une solution de NaOH 0,01 N pour ajuster le pli de la suspension à environ 11, puis on centrifuge à 3000 tr/min pendant 20 min pour recueillir le liquide surnageant. On ajoute goutte à goutte à ce liquide surnageant HCl 0,03 N pour ajuster le pH à 7,0 et on centrifuge à nouveau à 3000 tr/min pendant 20 min. On dialyse le liquide surnageant contre une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,0) pour préparer une solution de MGP. On mesure une teneur en hexose de la solution de 5 à 7 mg/ml selon un procédé au phéonl- acide sulfurique en utilisant le glucose comme étalon et une teneur en protéine de 1-2 mg/ml en utilisant la SAB comme étalon. On soumet la solution de MGP à la polymérisation amorcée par les radiations ci-après.

On mélange le méthacrylate d'hydroxyéthyle (HEMA) (utilisé comme monomère) avec la solution de MGP décrite ci-dessus dans un rapport de mélange de 33:67 et on place le mélange résul- tant dans un tube à essais de 1 cmx x 15 à 20 cm et on lyophilise rapidement à -70 C ou moins. On irradie ensuite par les rayons y à une dose de 1 . 106 rad pour polymériser ie menomère. On obtient une tige de polymtre que l'on découpe en disques ayant chacun une épaisseur de 10 .

(xi) Préparation de la substance semblable au TAG insolubilsée
On met en suspension 15 g (poids sec) de "Sepharose 4B" activée par CNBr (àbriquée par la Société Pharmacia AB) dans 3 litres d'acide chlorhydrique 0,001 N et, après avoir laissé reposer pendant 30 min, on leve sur un verre fritté avec 1 litre de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5) pour obtenir environ 50 ml de "Sepharose" activée. On met celle-ci en suspension dans 200 ml de solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5) et on ajoute 5 ml d'une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,7) contenant 50 mg de MSP,puis on fait reagir à la température ambiante pendant 2 h en agitant de temps en temps.

Lorsque la réaction est terminée, on lave le mélange de réaction sur un verre fritte et on ajoute le produit de réaction à 200 ml d'une solution de monoéthanolamine 1 M (pH 8,5) puis on fait réagir à la température ambiante pendant 2 h. On lave ensuite le mélange de réaction sur un verre fritté alternativement trois fois avec 1 litre d'une solution tampon d'acide acétique 0,1 M (contenant NaCl 0,5 M) et 1 litre d'une solution tampon d'acide borique 0,1 M (contenant NaCI 0,5 M).

(xii) Procédé pour la préparation d'une substance semblable au TAG
insolubilisée (préparation de perles-MGP)
Cn lave 10.000 perles de polystyrène d'un diamètre de 6,4 mm fabriquées par la Société Precision Plastic Co., Ltd. aux
Etats-Unis d'Amérique avec une solution diluée de savon synthétique (Mamaiemon, fabriqué par la Sociéte Lion Co., Ltd.) à une concentration de 1,5 ml/1 d'eau distillée,et ensuite par l'eau distillée.

Ensuite apns les avoir trempes dans une solution aqueuse de NaOH 0,5 M pendant 3 jours, on lave vigoureusement les perles jusqu'≈ce que le pH de l'eau de lavage soit d'environ 6. On ajoute les 10.000 perles ainsi lavées dans 2,5 litres de solution de MGP à 35% en poids par volume dans un tampon à 11acide acétique 50 mM ajusté à pli 4,5 par NaOH 10 N, on ajoute en les faisant tourner à environ 10 tr/min pendant 24 h, on filtre et on lave quatre fois avec 8 litres d'eau distillée. Ensuite, on ajoute les perles à 2,5 litres de solution de glutaraldéhyde à une concentration finale de 1% en volume dans le tampon au phosphate de sodium 50 mM (pH 7), on fait tourner à 10 tr/min pendant 2 h, on filtre et on lave à l'eau distillée de la même manière que ci-dessus.On ajoute les 10.000 perles ainsi traitées à 2,5 litres de solution de glycine 1 M dans le tampon au phosphate de sodium 50 mM (pH 7,0), on fait tourner à 10 tr/min pendant 2 h, on filtre et on lave à l'eau distillée comme ci-dessus, puis on sèche à 37 C pendant une nuit pour obtenir des perles-MGP. On détermine la surface spécifique des perles par le procédé à l'orcinol-H2S04 (M. Schonenberger et coll., Z. Physiol.

Chem., 309, page 345 (1957) et on trouve un poids de 2,7 ± 0,2 y de MGP/perle.

EXEMPLE 2 (i) Préparation des échantillons d'essais
On prélève des échantillons de sang de 5 ml chacun sur des patients atteints de divers cancers, des patients atteints de maladies non malignes et des personnes saines au moyen de seringues traitées avec 500 unités d'héparine et on centrifuge les échantillons à 2000 tr/min pendant.

10 min, et on sépare les échantillons d'essais du liquide surnageant.

(ii) Mesure
A 0,1 ml de chacun des échantillons d'essais préparés en (i), on ajoute un égal volume de solution de peroxydase de lectine de Dolichos à 10 y/ml dans 0,2 ml de solution tampon au phosphate 0,15 M et on ajoute une feuille de NCP insolubilisée, et on agite bien le mélange et on laisse reposer à 20-37 C pendant 24 h. Après avoir lavé vigoureusement la feuille de MSP insolubilisée dans la liqueur de réaction, on mesure l'activité de la peroxydase de lectine de Dolichos fixée à la feuille à partir de D492 par le procédé de détermination de l'activité enzymatique utilisant H202 comme substrat et l'orthophénylènediamine comme agent colorant.On obtient une courbe d'étalonnage en remplaçant les échantillons d'essais par une substance étalon (MGP) à diverses concentrations : les courbes obtenues sont représentées dans les figures 3 et 3a ci-après, où les valeurs de complexe TAG-lectine de Dolichos (TAC-D) sont indiquées en teneurs en
MGP exprimées en hexose et en teneurs en MGP exprimées en N-acétyl- galactosamine, respectivement.

(iii) Résultats : On obtient les résultats en utilisant une courbe d'étalonnage représentée aux figures 3 et 3a.

Comme l'indique la figure 4, toutes les personnes saines ont une valeur TAG-D d'environ 0,1 nanomole/ml.

EXEMPLE 3 (i) Préparation du gel d'agarose
On met en suspension de l'agarose (produit de la Société Iwai Xagaku Co., Ltd.) dans une solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,5) pour obtenir une concentration de i% en poids.

On chauffe la suspension à 70-800C pour former une solution à laquelle on ajoute 0,01% en pords-velume dethimérosal. On distribue la solution à raison de 1 ml dans des tubes essais et on laisse reposer à la température ambiante pour préparer des gels d'agarose ayant une concentration de 1Z en poids.

tii) Hesure
On place deux échantillons. d'essais (de 200 l chacun) dans deux tubes essais dans lesquels on ajoute 50/ ul de lectine de Dolichos marquée par la peroxydase (3,5 γ/ml de lectine dans une solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 M ayant un pH d'environ 7,5). On agite légèrement chaque mélange et on laisse reposer à 20-300C pendant 1 h.

On ajoute à un échantillon (échantillon A) 250 l de solution A 8% en poids par volume de polyéthylèneglycol CPM 6000) dans une solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 M, et à l'autre échantillon (échantillon B) 250/ul de solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 M et on agite légèrement chaque mélange.

On laisse reposer les deux échantillons à 20-300C pendant 30-60 min et on centrifuge avec un rotor oscillant à 1000 G pendant 40 a 60 min.

On décante le liquide surnageant (50 ml) dans 2 ml de sérum physiologique et on agite vigoureusement le mélange. On ajoute à chaque mélange 500 l d'une solution de substrat de la peroxydase (ciaprès dénommée liqueur de substrat) et on laisse reposer le mélange dans une pièce obscure 9 20-30 C pendant 30 min. On prépare la liqueur de substrat en ajoutant de llorthophdnylenediamine et du peroxyde d'hydrogène aqueux à une solution tampon citrate-phasphate 0,1 M pour obtenir des concentrations finales respectives de 6% et 0,1%.

On maintient de préférence la liqueur de substrat à 400C jusqu'à l'utilisation. On arrête la réaction enzymatique en ajoutant 1 ml d'acide chlorhydrique 2 N. On évalue la variation de couleur en mesurant l'absorption à 492 nm dans un spectrophotomètre. On porte sur 1 'axe des ordonnées comme quantité de lectine fixée au TAG la valeur (c) obtenue en soustrayant l'absorption (a) de l'échantillon A de l'absorption (b) de l'échantillon B. Le résultat obtenu est représenté dans la figure 5, où les cercles indiquent les personnes saines, les points marqués (1) et (2) les patients atteints de cancers du foie et le point marqué (3) indique les patients atteints de lymphadénose maligne.Les échantillons ayant une valeur (c) supérieure à celle des personnes saines signifient une teneur plus élevée en TAG dans le plasma et suggèrent que des cellules cancéreuses ont été produites chez les hôtes.

(iii) Procédé de "mise en sandwich"
On ajoute 200 y de DBA-agarose à 100/ul d'une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0) contenant en dissolution 1 à 10 γ/ml de MGP, et on effectue l'incubation à 250C pendant 1 h en agitant. Après avoir lavé la solution réactionnelle trois fois avec une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0), on ajoute 6 y de
DBA marquée par la peroxydase obtenue à l'exemple l(ii) et 100 γ/ml d'une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0), puis on fait incuber à 25 C pendant 1 h en agitant. Après centrifugation à 3000 tr/min pendant 10 min, on recueille le précipité et on le lave trois fois avec une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0).

On dissout 60 mg d'orthophénylènediamine dans 20 ml de tampon de Mcllevein 0,2 M (pH 5,8) et on ajoute H202 à la solution résultante jusau'à une concentration finale de 0,02% en volume et on agite le mélange pour former un agent colorant.

On place dans un tube à essais 2 ml de solution de sérum physiologique et 500 l de l'agent colorant, ainsi que la perle lavée, puis on fait incuber à la température ambiante pendant 30 min. On arrete ensuite la réaction enzymatique avec 1 ml de HC1 3 N. On mesure l'absorption à 492 nm. Les résultats ainsi obtenus sont indiqués dans la figure 6.

(iv) Procédé "par compétition"
On place 100/ul d'un échantillon d'essai obtenu à l'exemple 2(i) dans un tube à essais auquel on ajoute 500 l de tampon tris-HCl 0,3 M (pH 7,4) contenant une teneur finale en gélatine de 0,22% en poids/volume, CaCl2 5 mM et MgCl2 5 n. On ajoute à l'échantillon une perle-MGP (substance semblable au TAG insolubilisée préparée à l'exemple 1(xii)) et 100/ul de lectineperoxydase (DBA marquée lyophilisée préparée à l'exemple I (ii) à une concentration de 1 mg/l du tampon tris-HCl décrit ci-dessus) et, après agitation, on fait incuber le mélange pendant 48 h à 4 C.On separe le mélange de réaction en utilisant une trompe à eau et on lave la perle avec 2 ml de solution de sérum physiologique puis on élimine l'eau de lavage en utilisant une trompe à eau. On répète trois fois cette opération de lavage.

On dissout 60 mg d'orthophénylènediamine dans 20 ml de tampon de Mcllevein 0,2 M (pH 5,8) et on ajoute H202 à la solution résultante jusqu'à une concentration finale de 0,02% en volume et on agite le mélange pour former un agent colorant.

On place dans un tube à essais 2 ml de solution de sérum physiologique et 500 l de l'agent colorant, ainsi que la perle lavée, puis on fait incuber à la température ambiante pendant 30 min.

On arrête ensuite la réaction enzymatique avec 1 ml de HCl 3 N. On mesure la densité optique du mélange de réaction à 492 nm. En même temps, on mesure l'absorption de la meme manière, sauf que l'on remplace l'échantillon par des échantillons à diverses concentrations d'une substance étalon (MGP) pour tracer une courbe d'étalonnage (figure 7). Ensuite, on détermine le TAG dans les échantillons d'essais obtenus à l'exemple 2(i) an utilisant la courbe d'étalonnage.

Les résultats obtenus sont indiqués dans les figures 8a, 8b et 8c.

EXEMPLE 4 (i) Procédé "par compétition"
On place un disque de la substance semblable au TAG insolubilisée préparée à l'exemple l(x) dans 50 l de peroxydase fixée à la lectine de Lotus tetragonolobus (lectine marquée préparée a l'exemple 1(iii) et 200 l de l'échantillon (MGP à diverses concen trations) et on fait incuber à 250C pendant 20 h. On lave ensuite le disque par une solution de tampon au phosphate et on le place dans 2,0 ml d'une solution aqueuse de sérum physiologique, et on ajoute 0,5 ml d'une peroxydase puis on fait incuber à 25 C pendant 1 h. On ajoute ensuite 1,0 ml d'acide chlorhydrique 3 N et on mesure l'absorption à 492 nm.En meme temps, on mesure l'absorption de la même manière, sauf que l'on remplace l'échantillon par une substance étalon (MGP) à diverses concentrations pour tracer une courbe d'étalonnage (figures 9 et 9a) où les valeurs de TAG sont indiquées comme teneurs en tEP exprimées en hexose et en teneurs en MGP exprimées en
L-fucose, respectivement.

(ii) Procédé par ''mise en sandwich"
On ajoute 200 y de lectine de Lotus tetragonolobus-agarose à 100 l d'une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0) contenant 1 à 10 /ml de MGP et on effectue l'incubation à 250C pendant 1 h en agitant. Après avoir lavé la solution de réaction trois fois par une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0), on ajoute 6 y de lectine de Lotus tetragonolobus marquée à la peroxydase obtenue à l'exemple l(iii) et 100/ul d'une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0) puis on fait incuber à 250C pendant 1 h en agitant. Après centrifugation å 3000 tr/min pendant 10 min, on recueille le précipité et on le lave trois fois avec une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0).

On place dans un tube à essais 2 ml de solution de sérum physiologique et 500/ul de l'agent colorant, ainsi que la perle lavée, puis on fait incuber à la température ambiante pendant 30 min. On arrSte ensuite la réaction enzymatique avec 1 ml de HCl 3 N. On mesure l'absorption à 492 nm. En même temps, on mesure l'absorption de la meme manière, sauf que l'on remplace l'échantillon par une substance étalon (MGP) à diverses concentrations pour tracer une courbe d'étalonnage représentée å la figure 10.

(iii) Détermination
A 0,1 ml de chacun des échantillons d'essais préparés à l'exemple 2(i), on ajoute un égal volume de 10 y/ml de lectine de Lotus tetragonolobus-peroxydase dans 0,2 ml de solution tampon de phosphate 0,1S M et une feuille de MGP insolubilisée et on agite bien le mélange et on laisse reposer à 20-37 C pendant 24 h; Après avoir abondamment lavé la feuille de MGP insolubilisée dans la liqueur de réaction, on mesure l'activité de la lectine de Lotus tetragonolobus-peroxydase fixée à la feuille à partir de la valeur
D492 par le procédé de détermination de l'activité enzymatique utilisant H202 comme substrat et l'orthophénylènediamine comme agent colorant.On obtient une courbe d'étalonnage en remplaçant les échantillons d'essais par une substance étalon (MGP) à diverses concentrations. La courbe obtenue est représentée à la figure 11, où les valeurs de TAG-D sont indiquées en teneur en MGP calculée en hexose.

Résultate :
Come indiqué dans la figure 11, toutes les personnes ont une valeur TAG-D de moins de 3 nanomoles/ml.

(iv) Détermination
On place deux des échantillons d'essais (de 200 l chacun) préparés h l'exemple 2(i) dans deux tubes à essais dans lesquels on ajoute 501u1 de lectine dé Lotus tetragonolobus marquée par la peroxydase (3,5 γ/ml de lectine dans une solution tampon de trisacide chlorhydrique 0,1 M ayant un pH d'environ 7,5) préparée à l'exemple 1(iii). On agite légèrement chaque mélange et on le laisse reposer à 20-300C pendant 1 h. On ajoute à un échantillon (échan- tillon A) 250 l de solution à 8% en poids/volume de polyéthylèneglycol (PM 6000) dans une solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 H et à l'autre échantillon (échantillon B) 250 l de solution tampon de tris-acide chlorhydrique 0,1 M, et on agite légèrement chaque échantillon.On laisse reposer les deux échantillons à 20300C pendant 30 a 60 min et on centrifuge avec un rotor oscillant à 1000 G pendant 40 à 60 min. On décante le liquide surnageant (50 l) dans 2 ml de sérum physiologique et on agite vigoureusement le
mélange. On ajoute à chaque mélange 500 l d'une solution de substrat
de peroxydase (ci-après dénommée liqueur de substrat) et on laisse
reposer le mélange dans une pièce sombre à 20-30 C pendant 30 min.

On prépare la liqueur de substrat en ajoutant de l'orthophénylène-
diamine et du peroxyde d'hydrogène à une solution tampon de citrate
0,1 M pour obtenir des concentrations finales respectives de 6% et
0,1%. On maintient de préférence la liqueur de substrat à 40C
jusqu'à l'utilisation. On arrete la réaction enzymatique par addi
tion de lXUl d'acide chlorhydrique 2 N. On évalue le changement de
couleur en mesurant l'absorption à 492 nm avec un spectrophotomètre.

On porte sur la courbe comme quantité de lectine fixée au TAC la
valeur (c) obtenue en soustrayant l'absorption (a) de l'échantillon
A de l'absorption (b) de l'échantillon B. Le résultat obtenu est
représenté à la figure 12,dans laquelle les cercles indiquent les
personnes saines, les points marqués (1) et (2) indiquent les patients
atteints d'ulcère de l'estomac et le point marque (3) indique les
patientes atteintes de cancer du sein. Les échantillons ayant une
valeur (c) supérieure à celle des personnes saines signifient une
teneur en TAG plus élevée dans le plasma et suggèrent que des
cellules cancéreuses ont été produites chez les hôtes.

(v) Procédé "par compétition"
On place 100 ut d'un échantillon d'essai obtenu à l'exemple 2(i) dans un tube à essais auquel on ajoute 500 l de tampon tris-HCl 0,3 M (pH 7,4) contenant une concentration finale de 0,22% en poids/volume de gélatine, Cacl2 5 mM et MgCl2 5 mM. On ajoute à l'échantillon une perle-MGP (la substance semblable aii TAG insolubilisée préparée à l'exemple 1(xii)) et 100 l de lectineperoxydase (la DBA marquée lyophilisée preparée à 1exemple l(iiai) à une concentration de 1 mg/l du tampon tris-HCl décrit ci-dessus) et, après agitation, on fait incuber le mélange pendant 48 11 à 40C.On sépare le mélange de réaction en utilisant une trompe à eau et on lave la perle avec 2 ml de solution de sérum physiologique puis on sépare les eaux de lavage au moyen d'une trompe 3 eau. On r-pate trois fois cette operation de lavage.

On dissout 60 mg d'orthophénylènediamine dans 20 ml de tampon de Mcllevein 0,2 M (pH 5,8) et on ajoute H2O2 à la solution résultante à une concentration finale de 0,02% en volume et on agite le mélange pour former un agent colorant.

On place dans un tube à essais 2 ml de solution de sérum physiologique et 500/ul de l'agent colorant,ainsi que la perle lavée, puis on fait it incuber u la température ambiante pendant 30 min. On arrete ensuite la réaction enzymatique avec 1 ml de HC1 3 N. On mesure la densité optique du mélange de réaction à 492 nm. En meme temps, on mesure l'absorption de la meme manière, sauf que l'on remplace l'échantillon par une substance étalon (MCP) à diverses concentrations pour tracer une courbe d'étalonnage (figure 13). En outre, on détermine le TAG dans les échantillons d'essais obtenus l'exemple 2(i) en utilisant la courbe d'étalonnage. Les résultats obtenus sont indiqués dans la figure 14.

I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus a titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour determiner la teneur en composés à liaisons

gluco associés aux tumeurs (TAG) dans un échantillon d'humeur de l'organisme, caractérisé en ce que l'on fait réagir le TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme avec une lectine fixant la N-acétyl-D-ga,lactosamine (AG) ou une lectine fixant le L-fucose

pour former un complexe TAG-lectine et on mesure la quantité de complexe TAG-lectine ou de lectine n'ayant pas réagi.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que la reaction entre le TAG et la lectine est effectuée par réaction

compétitive du TAG de l'humeur de l'organisme à mesurer et d'une

quantité définie d'un TAG insolubilisé ou d'une substance semblable au TAG insolubilisée avec une quantité définie de lectine marquée,

on sépare le TAG insolubilisé ou la substance semblable au TAG

insolubilisée fixée à la lectine marquée de la lectine non fixée

et on mesure l'activité de l'agent de marquage sur l'un ou l'autre.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que la réaction entre le TAG et la lectine est effectuée par réaction

compétitive du TAG de l'humeur de l'organisme à mesurer et d'une quantité définie de TAG marqué ou de substance sembl-able au TAG marquée avec une quantité définie de lectine ou de lectine inaolu

bilisée, on sépare le TAC marque ou la substance semblable au TAC

marquée fixée à la lectine ou à la lectine insolubilisée du TAG mar-

que non fixé ou de la substance semblable au TAG marquée non fixée

et on mesure l'activité de l'agent de marquage sur l'une ou 1'autre

substance.

4. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce

que l'on effectue la réaction entre le TAG et la lectine par réaction

du TAG de l'humeur de l'organisme à mesurer avec une lectine insolu

bilisée pour former un complexe TAG-lectine insolubilisée, on fait

réagir ce complexe avec une quantité définie d'une lectine marquée,

on sépare l'un de l'autre le complexe fixé à la lectine marquée et

la lectine marquée non fixée et on mesure l'activité de l'agent de marquage de l'une ou l'autre substance.

5. Procédé selon la revendication 1 2, 3 ou 4, caractérisé en outre en ce que l'on sépare le TAG dudit échantillon d'humeur de l'organisme et on fait réagir le TAC séparé avec ladite lectine.

6. Procédé selon la revendication 2 ou 4, caractérisé en ce que ladite lectine marquée est une lectine marquée par une enzyme, une substance fluorescente ou une substance radioactive.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on ajoute une protéine protectrice à ladite humeur de l'organisme.

8. Procédé selon la revendication 1, 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que ladite humeur de l'organisme est le sang, le suc cellulaire, la lymphe, le liquide thoracique, le liquide abdominal, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, l'urine pancréatique, le liquide cérébrospinal ou la salive.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite humeur de l'organisme est le sérum ou le plasma sanguin.

10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite enzyme est la glucoamylase, la glucose oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou l'hémooctapeptide ou un de ses fraga;ents actifs.

11. Procédé selon la,revendication 6, caractérisé en ce que ladite substance fluorescente est la fluorescéine, l'isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou le chlorure de dansyle.

12. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite substance radioactive est l'iode radioactif ou le tritium.

13. Procédé pour le diagnostic du cancer, caractérisé en ce que l'on mesure la teneur en composés à liaisons gluco associé au cancer dans~une humeur de l'organisme d'un sujet selon le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 4 et on compare la teneur ainsi mesurée avec celle d'une personne saine normale.

14. Nécessaire pour la détermination de la teneur cn TAG dans une humeur de l'organisme, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine fixant ltAG ou une lectine fixant le L-fucose comme agent spécifique d'agglutination du TAC.

15. Nécessaire selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite lectine a été lyophilisée et le nécessaire contient en outre un réactif de reconstitution contenant un solvant aqueux ou miscible avec l'eau.