JPH04500076A - 白血球付着阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 白血球付着阻害物質 本発明は、白血球集団が細胞基質を認識し、該基質に付着することを阻害する過 程に関与し、それによって炎症過程に影響を及ぼす白血球付着阻害物質などの細 胞間付着阻害分子に関する。さらに、本発明は、該白血球付着阻害分子の製造方 法、該分子の精製方法、該分子のスクリーニング検定、および該分子の使用に関 する。

関連分野の説明 細菌、ウィルスまたはその他の侵入性の寄生体などの外来の侵入体が皮膚または 粘膜を貫通すると、細胞性の防御機序が直ちに誘導される。免疫系の２つの食細 胞型細胞である局所および血液生成のマクロファージおよび多形核白血球（ＰＭ Ｎ）が侵入体のまわりに集まり、食作用を開始する。この防御系の優れた概説を 、Ｅ　１ｓｅｎ、　Ｈ。

Ｗ、ビＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　ｉｇｙ”＋　３ｒｄ　Ｅｄ、　、　Ｈａｒｐｅｒ　 ａｎｄ　Ｒｏｗ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐ、Ａ（P９ ８０）、ｐｐ、２９０−２９５　ａｎｄ　３８１−４１８３が提供している。

・このような外来物質の存在によって、（１）周囲の血管の拡張：（２）血管透 過性の増加；および（３）血管外遊出、即ち血管壁を通過する単球およびＰＭＮ の移動；を特徴とする炎症反応が生じることになる。

炎症および損傷部位における血液白血球の集積は、血管内層へのそれらの局在化 された付着に依存している。局在化された付着は種々の病態生理学的過程におい て必須である。これら侵入体に対して宿主を適切に防御するためには、白血球は 細胞基質に付着することができるものでなければならない。また、これらは内皮 細胞に付着して、循環から進行中の炎症部位に移動できるものでなければならな い。さらに、これらは抗原を提供する細胞に付着して、特異的な免疫反応を起こ すことができるものでなければならない。最後に、これらは適当な標的細胞に付 着して、ウィルス感染細胞または腫瘍細胞の溶解を起こすことができるものでな ければならない。

炎症および損傷領域の血管内皮への白血球の付着は既知となってから久しい。ま た、体液性の媒介物質がこれら内皮−白血球の相互作用の調節に関与していると 推測されてからも久しい。しかし、この考えを支持する実験的証拠は最近まで欠 けていた［Ｈａｒｌａｎ、　Ｊ、　、　Ｂｏ。

耐層：　５１３−５２５（１９８５）を参照コ。

最近の研究は、ある種の炎症性のサイトカイン類、例えばインターロイキン−１ （Ｉ　Ｌ−１）［例えば、ＢｅｖｉＩａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｃ ｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅ鳴７６　：　２００３−２０１１（１９８５）　；　Ｂｅｖ ｉＩａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、　、　”Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｅｍｉｇｒａｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　５ｅｑｕｅｌａｅ″、　Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ、　ＡＧ、 　Ｂａ５ｅｌ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ７９|９ ３（１９８６）　；　Ｄｕｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉ ｃ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｇｉｃ　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｒ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１”、　Ａｌａｎ　 Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐS５ −５９（１９８５）　；　Ｓｃｈｌｅｉｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１３６　：　６４９−６５４（１９８６）　G　Ｇ ａｍｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２　：　８６６７−８６ ７１（１９８５）　；　Ｐｏｈｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、@Ｊ。

：　１１３−１１７（１９８７）を参照コ、腫瘍壊死因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ　）［Ｇ ａｍｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐリボポリサツカリド；　Ｌ　Ｐ　Ｓ　）［Ｓ ｃｈｌｅｉｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、同上（１９８６）　；　Ｐｏｈｌｍａｎ　 ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６　：　４５４ｇ−４５５３（ １９８６）］がイイントロで血管内皮に直接作用して、血液白血球ならびに関連 の白血球セルライン（ＨＬ−６０およびＵ９３７）に対する内皮細胞表面の付着 性を増大させうることを示した。

また、他の走化性因子、例えば精製された補体成分、ホルミル−メチオニル−ロ イシル−フェニルアラニンおよびロイコトリエン８４なども、培養された内皮単 層へのＰＭＮの付着を増大させることができる「例えば、Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１２２：　１６９−１７７（１９７９）相対 的な重要性、およびそれらの付着に関与している細り包機序はその大部分が未知 のままである。

白血球付着の阻害は炎症過程に中心的な重要性を有している。白血球付着は通常 は望ましいものであるが、器官移植の拒絶、組織移植の拒絶および多くの自己免 疫疾患の原因となることもある。従って、細胞の付着を減少または阻害しうるい ずれかの手段が、ある種の患者に極めて望ましいであろう。

定態 簡略化のために、本明細書において次の短縮形を用いる。

ＣＭ：ならし培地； Ｆｅ２　：ウシ胎児血清： ＨＥＣ：ヒト謄静脈内皮細胞； ＴＩＳ：）ランスフェリン／インスリン／セレン；ｈｍｌＬ−１：ヒト単球由来 のインターロイキン−１゜ｒｌ　Ｌ−１：組換えＩＬ−１； ｒＴＮＦ：組換え腫瘍壊死因子： ＬＰＳ・グラム陰性細菌内毒素； ＬＡＩ：白血球付着阻害物質； ＰＭＮ　：多形核白血球。

ＧＭ−ＧＳＦ：顆粒球−単球コロニー刺激因子；ｆＭＬＰ：Ｎ−ホルミル−メチ オニル−ロイシル−フェニルアラニン； ＬＴＢ、：ロイコトリエンＢ４； ＰＭＡ：ホルボール　１２−ミリステート　１３−アセテート。

情報の開示 以下に挙げる文献は本発明に関係しており、これらは本明細書の一部を構成する 。

らのならし培地か、刺激された好中球によるスーパーオキシド産生の減少を生し ることを開示している。

Ｈａｒｌａｎら［Ｂｌｏｏｄ　６６　：　１６７−１７８（１９８５）ｌは、Ｃ Ｄｗ１８：１７プレ、。

シス（白血球表面分化抗原コンプレックス）に対するモノクローナル抗体が、ア ゴニスト誘導の多形核白血球付着の有意の阻害を生じることを開示している。

Ｚ　ｉｍｍｅｒｍａｎら［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４　：　１８６６−１ ８７４（１９１！５）］は、内皮細胞のプロスタグランジン中間代謝物が、付着 を含むいくつかの白血球の機能を阻害することを開示している。

Ｋ　ｅｒｒら［Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０３：　１７６０（１９８６）］ は、多形核白血球を未刺激の内皮細胞またはこれら細胞で条件づけられた培地に 暴露すると、未刺激の内皮単層および組織培養プラスチックへの白血球の付着か 阻害されることを開示している。

Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎら［Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、１８　：　７６０− ７７０（１９８６）］は、アデノシンおよびその類似体２−クロロアデノノンが 、培養されたヒト屑静脈内皮細胞へのＮ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェ ニルアラニン刺激の好中球の付着を阻害することを開示している。

ＷｈｅｅｌｅｒらｌＦｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４５　：　４５０（１９８６）コお よびＷｈｅｅｌｅｒら［血管内皮細胞の生物学についての第４回国際シンポジウ ム会期中、１９８６年夏、オシンダ］は、インターロイキン−１処理した内皮細 胞が、白血球−内皮の付着の阻害物質を生じることを開示している。

Ｗｈ、ｅｅｌｅｒら［Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４６　：　７５ｇ（１９８７）コ は、白血球付着の天然形態の内皮誘導阻害物質の特徴をいくつか開示している。

発明の要約 本発明者らは、Ｉ　Ｌ−１、ＴＮＦまたはＬＰＳで処理したヒト内皮細胞、特に ヒト済静脈内皮細胞も、過付着性の（サイトカイン刺激された）内皮表面へのＰ ＭＮおよび単球の付着をブロックするがリンパ球の付着はブロックしないように 作用する可溶性の非シクロオキシケナーセ誘導の阻害物質を産生ずることを発見 した。本発明はこの事実に関するものである。この阻害物質の産生はヒト機静脈 内皮細胞に限定されるものではなく、５Ｖ４Ｑウイルスで形質転換されたヒト謄 静脈内皮細胞およびヒト二倍体皮膚線維芽細胞を含む複数の細胞型を包含する。

この内皮誘導の「白血球付着阻害物質ｊ　（Ｌ　’Ａ　Ｉ　）の作用は、白血球 に選択的に指向しているよってある。しかし、これは、可溶性の炎症刺激物質、 例えばホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン、ロイコトリエンＢ ４またはホルボール　１２−ミリステート１３−アセテートなどへの白血球の反 応の全体的な阻害を生じるものではない。代わりに、この新しく発見された阻害 分子は、炎症および／または損傷の正にその部位での白血球−血管壁相互作用の 調節にある役割を演じているようである。

具体的には、サイトカインおよび細菌内毒素刺激のヒト内皮培養によって、活性 化された内皮細胞の可溶性の天然産物であるＬＡＴが生成する。その生成には新 たなタンパク質合成が必要とされるようであるが、シクロオキ／ケナーセ経路に 依存することはない。ＬＡｌ活性は、種々の生理学的条件ならひに極端な温度お よびｐＨにおいて安定である。この熱および酸安定性ならびにプロスタサイクリ ン産生を排除する濃度でのアスピリン処理の影響の欠如は、付着を含むいくつか の白血球の機能を阻害することか知られている内皮細胞のプロスタグランジン中 間代謝物とＬＡＩを区別するものである）Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１３４　：　１８６６−１８７４（１９８５）］。

検出可能なＬＡＩ活性は未処理の内皮培養物由来のならし培地中には見い出され ない。これは、未刺激の内皮細胞またはこれら細胞で条件つけられた培地にＰＭ Ｎを暴露すると未刺激の内皮単層および組織培養プラスチックへのＰ　Ｍ　Ｎの 付着か阻害されたという報告とは対照的である［Ｋｅｒｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０３：　９７１ａ（１９８６）］。

また、未刺激のヒトおよびウシ内皮由来のならし培地も、刺激された好中球によ るスーパーオキシド産生の減少を生じる［Ｂａ５ｆｏｒｄ　ｅｔａｌ、　、　Ｂ ｌｏｏｄ　６８　：　７９ａ（１９８６）　；　Ｈａｒｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、　 、　Ｂｌｏｏｄ　６６　：　１６７ｌ６７−P７８（ １９を参照］。対照的に、ＬＡＴは、スーパーオ牛シトの産生および細胞質ゾル のカルシウム濃度のアゴニスト刺激の変化を含む、白血球の機能の全体的な阻害 を生しることなく白血球の付着を選択的にブクブクするようである。

また、本発明者らは、ＬＡＩが、サイトカイン活性化したヒト謄静脈内皮細胞へ のヒトＰＭＮの強力な付着を逆方向に変えうろことを証明した。即ち、活性化さ れた内皮細胞に付着性であるＰ　Ｍ　ＮにＬＡＩを加えると、ＰＭＮは内皮細胞 表面から遊離する。この「遊離」の動力学は早く（１〜５分）、潜在的に可逆性 である。

白血球付着に対するり、ｌの特徴的な作用、即ちＰＭＮおよび単球付着の有意の 阻害ならびにリンパ球付着に影響しないことは、ＬＡｌの作用か、過付着性の内 皮細胞表面を認識する別個の白血球受容体に関係しているのかもしれないことを 示唆する。同様に、前骨髄球セルラインＨＬ−６０および単球様ラインＵ９３７ に対する影響がないことは、ＬＡＩか、この未分化のセルラインに欠けている成 熟白血球の表面構造または機能に指向しているのかもしれないことを示唆する。

内皮とのＰ　！ｙ４　Ｎ付着の相互作用には、白血球表面分化抗原コンブＬ／　 ７’クシスＤｗ１８（ＬＦＡ刊、λ４ａｃ−１、ｐ１５０．９った。濃縮された ＬＡＩ（５Ｘの相対濃度まで）の存在下では、ｆＭＬＰ、ＬＴＢ、またはＰＭＡ （定義を参照）で活性化されたＰＭＮの対照内皮単層への付着は阻害されなかっ た。対照的に、ＣＤｗ１８コンプレックスに対するモノクローナル抗体は、アゴ ニスト刺激のＰＭＮ付着の有意の阻害を生じた［Ｈａｒｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｂｌｏｏｄ　６６　：　１６７−１７ｇ（１９８５）］。さらに、ＰＭＮ付着の ＬＡＩ阻害は、血清被覆の組織培養プラスチックへのＰＭＮの付着かＬＡＩの存 在によって変わらないので、「過付着性Ａ内皮細胞表面に特異的なようである。

本発明は、ＬＡＩならびにその機能的誘導体に関する。さらに、本発明は、ＬＡ Ｉの製造および精製方法、ＬＡＩのスクリーニング検定、ＬＡＩの診断および治 療への使用、ならひにＬＡＩまたはその機能的誘導体を含有する組成物に関する 。

特に、本発明は、天然の不純物を実質的に含まない白血球付着阻害物質ＬＡＩま たはその機能的誘導体を包含している。さらに、本発明は、検出可能なようにラ ベルされたＬＡＩおよびその誘導体に関する。

また、本発明は、実質的に純粋な形態のＬＡＩの回収方法であって、以下の工程 を含む（これらに限定はされな（り方法を包含するものである。

（ａ）細胞供給源からならし培地を集め。

（ｂ）該ならし培地を限外濾過してり、ＡＩを含有する分画を得；（ｃ）限外濾 過によってＬＡＩを濃縮および脱塩し。

（ｄ）凍結乾燥し、アセトン沈澱によってＬＡＩを脱脂質化し；（ｅ）ＨＰ　Ｌ 　ＣクロマトグラフィーによってＬＡＩをケル濾過し：（ｆ）ＬＡＩのイオン交 換クロマトグラフィーを行い；そして（ｇ）実質的に純粋な形態で工程（ｆ）で 得られた濾液を回収する。

本発明は上記の方法で得られたＬＡＩを包含する。

また、本発明は、哺乳動物対象の炎症の治療方法であって、該炎症を抑制するに 十分な量のＬＡＩ、ＬＡＩのフラグメント、ＬＡＩの化学的誘導体、ＬＡＩの変 異体、およびＬＡＩの類似体からなる群から選ばれる抗炎症薬を、そのような治 療を必要としている対象ｊこ与えることからなる方法に関する。

さらに、本発明は、該抗炎症薬が適当な担体中で投与される上記炎症の治療方法 をも包含するものである。

また、本発明は、炎症を軽減する量の抗炎症薬を投与することからなる哺乳動物 対象の炎症を治療するための医薬組成物であって、該抗炎症薬がＬＡＴ、ＬＡＩ のフラグメント、ＬＡＩの化学的誘導体、ＬＡＩの変異体、およびＬＡＩの類似 体からなる群から選ばれるものである組成物に関する。

さらに、本発明は、炎症を有していることが疑われている哺乳動物対象の炎症の 存在および位置の診断方法であって、（ａ）ＬＡＩを識別し、これと結合するこ とができる検出可能なようにラベルされた結合性分子（例えば、抗体）を含有す る組成物を該対象に投与し：そして（ｂ）該結合性分子を検出することからなる 方法に関する。

また、本発明は、炎症を有していることが疑われている哺乳動物対象の炎症の存 在および位置の診断方法であって、（ａ）ＬＡＩを識別することができる検出可 能なようにラベルされた結合性分子（例えば、抗体）の存在下で、ＬＡＩを含ん でいることか推測される該対象からの生物学的試料をインキュベートシ；そして （ｂ）該試料中で結合した該結合性分子を検出することからなる方法に関する。

この生物学的試料には、生検試料または体液、例えば血液（血清または血漿）、 関節／胸膜／腹膜滲出液、脳を髄液、または眼液なとが含まれよう。

従って、本発明は、新規なＬＡＩ分子およびその機能的誘導体の回収および精製 方法、哺乳動物対象の炎症の診断および治療方法、ならびにＬＡＩまたはその機 能的誘導体を含有する組成物を包含するものである。

白血球付着阻害の過程およびＬＡＩ分子それ自体の理解は、リウマチ学、器官移 植、アレルギーおよび腫瘍学などの分野におけるその治療および／または診断用 途の開発の助けとなろう。本発明は、医学分野において、炎症疾患過程をより効 果的に診断および治療すること、ならびに進行中の炎症の臨床所見の時間的経過 および／または強さをモニターするためにＬＡＩの定量検定を利用することを可 能にするであろう。さらに、本発明は、炎症における白血球の機能および白血球 −内皮細胞の相互作用の機序の研究を可能にするで図１は、ＩＬ−１処理した内 皮単層へのＰＭＮの付着を示すものである。１１宜イン／ウムーラヘルのＰＭＮ を、ｈｍｌ　Ｌ−１（５Ｕ／ｍｌ）で前処理したＨＥＣ単層に表示した時間加え 、付着ＰＭＮＯ数を標準の１０分間単層付着検定で測定した。黒丸（「洗浄」） は、ＰＭＮ添加の直前にならし培地を除去し、単層を洗浄したウェルを示すもの である。白丸（「未洗浄」）は、ＰＭＮをならし培地中に直接添加したウェルを 示すものである。ならし培地の存在下（白玉角）または非存在下（黒三角）での 未処理ＨＥＣへのＰＭＮの付着は１４および８時間のところに示す。

図２は、刺激および未刺激の内皮細胞へのＰＭＮの付着に対する種々のならし培 地の作用を示すものである。ならし培地は次のようにして集めた。即ち、（１） ｒｌＬ−１βを含むか、もしくは含まずに４時間前処理し、洗浄し、続いて５時 間ＲＰＭＩ、−ＦＣ３中てイノ牛ユヘートしたＨＥＣ単層からＩ　Ｌ−１のＣＭ およびＳＨＡＭのＣＭを集めるか（内皮ＣＭ）、または、（２）内皮細胞を含ま ないセラチン被覆のペトリ皿中、ｒｌＬ川β用５ｔＪ／ｍｌ；９時間）を含むか 、もしくは含まずにＲＰＭＩ−Ｆｅ２をインキュベートしたく細胞不含のＣＭ） 。Ｉｌｌ　ｉ　ｎラベルしたＰＭＮを、標準の単行付着検定用に、インキュベー トしていないＲＰＭＩ＋ＦＣ３（新鮮な培地）、ＳＨＡＭおよびＩＬ−Ｉ　ＣＭ 細胞不含のＣＭ、または内皮ＳＨＡＭ　ＣＭおよびＩＬ−Ｉ　ＣＭ（２ｘｌＯ６ 細胞／ｍ１）で希釈した（実施例５を参照）。さらに、検定の直前にｒｌＬ−β （５Ｕ／ｍ＋）を別の内皮ＳＲＡＭ　ＣＭに直接加えた。洗浄し、非活性化（黒 の棒）または活性化（斜線の棒）［５Ｕ／ｍｌ　ｒｌ　Ｌ−β；４時間］したＨ ＥＣ単層に対するＰＭＮの付着を評価した。値は、この代表的実験の３回の測定 の平均二標準偏差として表す。同様の結果か２つの別の実験で得られた（＊Ｐ＜ ０．０１、ＳＨＡＭ　ＣＭと比較したときのＩＬ−ＣＭ）。

図３は、ＬＡＩのヒト血管内皮生成のＩ　Ｌ−１刺激の濃度依存性を示すもので ある。全面成長のＨＥＣ単層を増加濃度のｈｍｌＬ−１またはｒｌ　Ｌ−１βて ４時間前処理し、洗浄し、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　−ｒ’　Ｆ　ＣＳ中でさらに５時間イ ンキュベートした。ＩＬ−Ｉ　ＣＭおよびＳ　ＨＡ　ＭＣＭを集め、標準の単層 付着検定てＬＡＩ活性を調べた。ＰＭＮ付着の阻害率（％）を実施例７の記載の ようにして計算した。それぞれの点は３つの独立した実験の平均ＸＳＥＭを表す 。

図４は、ＰＭＮ付着のＬＡＩ誘導の阻害のＩＬ−Ｉ　ＣＭの濃度依存性を示すも のである。ＩＬ−ＩＣＭを、血清不含のＴＩＳ追加培地において集め、λｍ１ｃ ｏｎ　Ｙ　Ｍ　３０限外濾過メンプランで濾過し、Ａ　ｍ１ｃｏｎ　Ｙ　Ｍ　Ｌ ）メンプランで２０Ｘの濃度（ｖ／ｖ）まで濃縮した。次いで、この濃縮液をＬ ＡＩ活性の検定用にＲＰＭＩ−ＬＦＣ８で連続的に再希釈した。それぞれの点は ５つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。

図５は、未処理およびＩ　Ｌ−１処理の内皮細胞単層への別種白血球の付着に対 するＬＡＩの作用を示すものである。単離して放射ラベルしたＰＭＮ、単球、リ ンパ球またはＨＬ−６０細胞をＳＲＡＭＣＭ　（斜線の棒）またはＩＬ−Ｉ　Ｃ Ｍ（黒の棒）中に再懸濁し、未処理（−）またはＩ　Ｌ−１処理（：　）（２， ５Ｕ／ｍｌ　ｒＩ　Ｌ−１β；４時間）のＨＥＣへの付着を１０分検定で評価し た。値は、平均＝ＳＥＭで表す（＊Ｐ＜０．０１、ＩＬ−ＩＣＭ対ＳＨ，ＡＭＣ Ｍ）。

図６は、ＩＬ−１処理したＨＥＣ単層へのＰＭＮの付着のホフマン微分干渉差顕 微鏡の結果を示すものである。単離したＰＭＮをＳＨＡ　Ｍ　ＣＭ　（Ａ　）ま たはＩＬ−Ｉ　ＣＭ（Ｂ）に再懸濁し、Ｉ　Ｌ−１で前処理したＨ　Ｅ　Ｃ（２ ，５Ｕ／ｍｌのｒＩ　Ｌ−］β、４時間）に１０分間加え、この単層を洗浄して 未付着のＰＭＮを除去した。パネルＢでは付着ＰＭＮＯ数か減少し、ＨＥＣ単層 の表面上での広がり方が少ないように見えることに注意すべきである（元の倍率 、４００ｘ）。

図７は、ＰＭＮにおける一時的なＣａ”の上昇およびアコニスト誘導の膜消極を 示すものである。

（Ａ）ＰＭＮ（２ｘ　１０’／ｍｌ）をＣａ”およびＭｇ”（２ｍＭ）であるＨ Ｂ　Ｓ　Ｓ　（１，９ｍ１）に再懸濁し、５ＰＥＸ蛍光計中、３７℃においてｄ ｉｓ　Ｃ３−（５）［１、５μＭの最終濃度］で平衡化した。２０ｘ！縮のＳＨ ＡＭ　ＣＭ（破線）またはＩＬ−Ｉ　ＣＭ（実線）の１００μｍつつを加えた。

５分後に１０−’ＭのｆＭＬＰ（最上のパネル）、１０−’ＭのＬＴＢ、（真中 のパネル）または１１００ｎ／ｍｌのＰＭＡ（最下のパネル）を加え、蛍光の増 加を記録した（Ｆ＝１０％フルスケール）。

（Ｂ）Ｆｕｒａ−２処理したＰＭＮ（１ｘ　１０６／ｍｌ）をＣａ”とＭｇ”含 有のＨＢＳＳ（１，９ｍ１）に懸濁した。２０ｘに濃縮したＩＬ−Ｉ　ＣＭ（上 ）またはＳＲＡＭ　ＣＭ（下）を１００μｍつつ加えた。５分後にｌ　Ｑ−’Ｍ ノｆＭＬ　Ｐヲ加、ｔ、蛍光放射（励起３４０および３８ｏ）の変化を５０．５ ｎｍで記録した。細胞質ゾル遊離のカルシウムｉａ　ｆＸ　（ｙ軸）を、放射さ れた蛍光シグナルの比から計算したＪＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔａｌ、、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６吋３４４０−３４５０（１９８５）］。

図８は、高圧液体クロマトグラフィーにょるＩＬ−Ｉ　ＣＭの分画を示すもので ある。ＩＬ−Ｉ　ＣＭを、血清不含のＴＩＳ追加培地に集メ、Ａ　ｍ１ｃｏｎ　 Ｙ　Ｍ　３０メンプランで濾過し、ＹＭ５メンプランで濃縮し、洗浄して塩を除 去し、そして凍結乾燥した。その一部を０２Ｍ酢酸、０，１Ｍトリエチルアミン （ｐＨ３，９）に再Ｖ＆濁し、Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐ、ＡＫ　１２ ５ケル濾過カラムに付した。１　、８　ｍ１７分の流速で分画を集め、ＰＢＳに 対して透析し、ＬＡＩ活性（点を打った棒）の検定用にＲＰＭＩ、−Ｆｅ２て１ 　ｌｏに希釈した。タンパク質含量はＰＢＳ中の未希釈分画において測定した（ 黒点）。同様ノ結果が３つの別の実験で得られた。

図９は、ＬＡＩＯ分画されたコレクションを示すものである。コレクション培地 中のＬＡＩの出現は、分画（時間によって）されたコレクションによれば時間依 存性である。ＨＥＣ培養物を時間Ｏのときに５０／ｍｌのインターロイキン−１ で処理した。１時間のときに培地を集め、新鮮な培地に置き換えた。５時間まで この置換培地にサイトカインを加えた。この図に示すように、ＬＡＩは１時間程 度の早さで培地中に現れ、４〜５時間の間にピークの産生に到達し、９時間まで 維持された。９時間を過ぎると、活性の低下が観察された。

好ましい態様の説明 本発明の態様の１つは、「白血球付着阻害物質Ｊ（ＬＡＩ）と呼ばれる天然の細 胞間付着の阻害物質を発見したことに関する。本発明は、実質的に純粋なＬＡＩ およびその「機能的誘導体」に関する。

この「機能的誘導体Ｊなる用語は、分子の「フラグメント」、「変異体」、「類 似体」または「化学的誘導体」を包含することを意図している。ＬＡＩのような 分子の「フラグメント」とは、この分子のあらゆるポリペプチド部分を指すこと を意味する。ＬＡＩのような分子の「変異体」とは、完全な分子またはそのフラ グメントのどちらかと実質的に同じ天然の分子を指すことを意味する。ＬＡＩの ような分子の「類似体−：とは、完全な分子またはそのフラグメントのとちらか と実質的に同じ非天然の分子を指すことを意味する。

２つの分子中のアミノ酸配列か実質的に同一であり、２つの分子が同様の生物学 的活性を保持しているときに、ある分子は別の分子と口実質的に同じ」であると 言われる。即ち、２つの分子が同様の活性を保持しているという条件のもとで、 この用語を本明細書中で用いるときには、一方の分子か他方に見い出されない別 のアミノ酸残基を含有しているときであっても、また、アミノ酸残基配列が同一 ではないときであっても、これら分子は変異体とみなされる。

本明細書で用いる場合、ある分子か通常はその分子の一部ではない別の化学的部 分を含有しているときに、該分子は別の分子の「化学的誘導体」であると言う。

このような部分は、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善すること もある。また、この部分が分子の毒性の減少、分子のあらゆる望ましくない副作 用の排除ゐるいは低減を与えることもある。このような作用に関与することがで きる部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ ｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されており、当業者には明らかであろう。

ある化合物がＬＡＩの機能的誘導体であるか否かを決定するための適当なスクリ ーニング法には、例えばＰＭＮ−内皮細胞付着について記載されているような生 物検定、ならびに天然ＬＡＩに対する特異的な中和抗体（モノクローナルまたは ポリクローナル）の調製に基ライてＲＩＡまたはＥＬ？ＳＡを用いる免疫検定が 含まれる。

本明細書中に開示したＬＡＩ分子は、これを含有する調製物が、この産物が天然 に普通に伴っそいる物質を実質的に含んでいないときに「天然の不純物を実質的 に含んでいない」と称される。

本発明の目的に好ましい精製方法には、免疫アフィニティークロマトグラフィー 精製に用いるための中和ウサ牛ヘテロ血清およびマウスモノクローナル抗体を調 製すること、Ｍｏｎｏ　Ｓなどのカチオン交換カラムでのイオン交換クロマトグ ラフィー、およびプレパラティブ５ＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く電気溶離が含ま れる。好ましい精製方法には次の工程および原材料が含まれるが、これらは例示 のためのものであり、限定のためのものではない。

ａ）　Ｉ　Ｔ　Ｓ　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｂｅ ｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を追加したＲＰＭ　Ｉ　−１６４０（Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中の細胞供給源からＬＡＩを集める。

ｂ）メンブランＹＭ−３Ｑを用いるＡｍ１ｃｏｎ撹拌の限外濾過セルで培地を限 外濾過する。

Ｃ）工程（ｂ）からの培地をＹＭ−５で濃縮し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ精製水（Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ）て洗浄して悦塩し、凍結させ、そして乾燥する。不純な脂質は５ 倍容量の水冷アセトンで凍結乾燥ペレットを洗浄することによって除去する。

ｄ）凍結乾燥した物質を０．２Ｍ酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） およびＯＩＭ）リエチルアミン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）で復 元し、Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ１２５ケル濾過カラム（Ｗａｔｅｒｓ）にかけ る。

ｅ）工程（ｄ）からの分画を１０ｍＭ）リス（ｐＨ７）（ＢｉｏＲａｄ）中に透 析し、１０ｍＭ）リス（ｐＨ７）で平衡化したＣＭ−：コアテ、シスまたはＳＰ −セファテックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて２５°Ｃで２０分間インキュ ベートする。ＬＡＩ活性は両力チオン交換樹脂によって取得する。

また、クエン酸を基本にする緩衝系を用いることもできる。活性の溶離は直線塩 勾配（０，ＯＩ　Ｍ＝　Ｉ　Ｍ　ＮａＣメンを用いて行う。この方法によって得 られる分画をＬＡＩ活性について調べ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 にかける。

さらに本発明に意図されているのは、有機合成もしくは組換えＤＮＡ法を用いて 、またはタンパク質加水分解によって製造した精製ＬＡＩフラグメントまたはそ の誘導体である。

また、本発明は、試料または対象においてＬＡＩまたはその機能的誘導体を検出 する方法を包含する。例えば、ＬＡＩまたはその機能的誘導体に特異的な抗体を 、適当なあらゆる配位子、例えば放射アイソトープ、酵素、蛍光ラベル、常磁性 ラベル、または遊離ラジカルで検出可能なようにラベルすることかできる。炎症 の存在をこのような検出可能にラベルされた物質の使用によって検出することが できる。このような検出可能にラベルされた抗体またはその機能的誘導体を調製 および検出する方法は当業者には周知である。

このような検出可能にラベルされた抗体の存在部位を検出することは炎症の部位 を示すことになる。ある態様では、この炎症の試験は、組織または血液試料を採 取し、この試料を検出可能にラベルされた抗体の存在下でインキュベートするこ とによって行われる。好ましい態様では、この方法は磁気イメージ、フルオログ ラフィーなどの使用により非侵入性の方法で行われる。゛例えば、このような診 断試験を、器官移植を受けた者の潜在的な組織拒絶の初期の徴候をモニターする のに用いることかできる。また、このような検定を、対象の慢性関節リウマチお よびその他の慢性の炎症性疾患の臨床状態を測定する際に行うこともできる。

抗体またはその機能的誘導体を用い、ＬＡＩの検定を利用することによって、炎 症を有していることか疑われている哺乳動物対象の炎症の存在および位置を検出 または診断することかできるが、これは、ＬＡＩを含有することが予想される該 対象由来の生物学的試料を、ＬＡＩを識別しうる検出可能にラベルされた結合性 分子（例えば、抗体）の存在下でインキュベートし、試料中で結合した該結合性 分子を検出することかろなる。

即ち、本発明のこの態様においては、生物学的試料を、ニトロセルロース、また は細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化しろる他の固体支持体で処 理する。次いで、この支持体を適当な緩衝液で洗浄し、続いて検出可能にラベル されたＬＡＩ特異的な抗体で処理する。次に、この固相支持体を２回目の緩衝液 で洗浄して未結合の抗体を除去する。次いて、抗体上の結合ラベルの量を常法に よって検出することができる。

ＬＡＩを含有する試料について本発明の検定を行う際には、以下の工程が含まれ る・ （ａ）ＬＡＩを含有すると予想される試料を固体支持体と接触させてＬＡＪの固 定化を行い： （ｂ）該固体支持体を検出可能にラベルされたＬＡＩ特異的な抗体と接触させ： （ｃ）該検出可能にラベルされたＬＡＩ特異的な抗体と該支持体を、該ＬＡＩ特 異的な抗体が該固定化されたＬＡＩに結合するに十分な時間インキユベートシ： （ｄ）工程（ｃ）で得られたインキュベート混合物から同相支持体を分離し１そ して （ｅ）結合したラベルを検出し、それによってＬＡＩを検出および定量する。

本発明のこの帖様は、以下の工程からなる試料中のＬＡＩまたはそのフラグメン トの検出方法に関するものである（ａ）Ｌ、ＡＩを含有すると予想される試料を 、ＬＡＴに結合するＬＡｌ特異的な抗体またはそのフラグメントと接触させ；そ して（ｂ）コンプレックスか形成されたか否かを検出する。

実際の検出可能にラベルされた抗体およびＬＡＩの比濃度、インキュベートの温 度および時間ならびにその他の検定条件は、勿論、試料中のＬＡＩの濃度、試料 の性質などを含む種々の因子に依存して変わるであろう。当業者なら、通常の実 験を用いてそれぞれの測定のための有効かつ最適な検定条件を決定することがで きるであろう。

洗浄、撹拌、振盪、濾過などのその他の工程を、特定の状況に慣例であるか、ま たは必要であるときに検定に加えてもよい。

ＬＡＩ特異的な抗体を検出可能にラベルしうる方法の１つは、これを酵素と結合 させることによるものである。この酵素は、後にその基質に暴露されたときに基 質と反応して、例えば分光測光法、蛍光測定法または視覚的な方法によって検出 しうる化学的部分を生成するであろう。ＬＡＴ特異的な抗体を検出可能にラベル するのに用いることができる酵素には、マレート・デヒドロゲナーゼ、スタフィ ロコツカル・ヌクレアーゼ、δ−■−ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコー ル・デヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トリオ ースホスフェート・イソメラーゼ、西ワサビペルオキ／ダーゼ、アルカリホスフ ァターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ 、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−■１−ホスフェー ト・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリン・エステラーゼ か含まれるかこれろに限定はされない。

また、Ｌ　Ａ　’Ｉ特異的な抗体を、ガンマカウンターもしくはシンチレーショ ンカウンターの使用、またはオーンオラシオグラフィーによって測定しうる放射 活性なアイソトープでラベルすることもてきる。本発明の目的に特に有用なアイ ソトープは３Ｈ１１２５■、＋３１　■、３５Ｓ、　１４Ｃおよび”Ｃｒである 。

また、ＬＡＩ特異的な抗体を蛍光化合物でラベルすることもできる。蛍光的にラ ベルされた抗体を適切な波長の光に暴露したときには、その存在を染料の蛍光に よって検出することができる。最も普通に用いろれる蛍光ラベル化用の化合物と しては、フルオレセイン・インチオンアネート、ロータミン・フイコエリテリン 、フィコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−フタアルデヒドおよびフルオレサ ミンが挙げられる。

さらに、ＬＡＩ特異的な抗体を、１５２Ｅｕのような蛍光を放出する金属、また はランタン系列のその他の金属を用いて検出可能にラベルすることもできる。こ れらの金属を、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミ ン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化団を用いてＬＡＩ特異的な抗体に結 合させることができる。

さらに、化学発光化合物と結合させることによってＬＡＩ特異的な抗体を検出可 能にラベルすることかできる。次いで、化学発光の標識をつけたＬＡＩ特異的な 抗体の存在を、化学反応の過程で発生する発光の存在を検出することによって測 定する。特に有用な化学発光のラベル化用化合物の例は、ルミノール、イソルミ ノール、テロマチック　アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウ ム塩およびオキサレートエステルである。

同様に、生物発光化合物を本発明のＬＡＩ特異的な抗体をラベルするのに用いる ことかできる。生物発光は、触媒性のタンパク質が化学発光反応の効率を増加さ せる生物学的な系で見ちれる化学発光の一種である。発光の存在を検出すること によって生物発光タンパク質の存在を測定する。ラベル化のために重要な生物発 光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

ＬＡＩ特異的な抗体の検出は、検出可能なラベルが放射活性なガンマ放出である ときには、例えば７ンチレーンヨンカウンターで、また、ラベルか蛍光物質であ るときには、例えば蛍光計て行うことができる。酵素ラベルの場合には、この酵 素の基質を用いる比色定量法によって検出を行うことができる。また、検出は、 基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準と視覚によって比較することによ っても行うことができる。

ＬＡＩは活性化された内皮細胞の可溶性産物であり、それ自体が炎症過程に関与 している。１″炎症、′なる用語は、特異的および非特異的な両防御系の反応を 含むことを意味する。特異的な防御系の反応は、抗原に対する特異的な免疫系の 反応応答である。特異的な防御系の反応の例には、風疹ウィルスのような抗原に 対する抗体の反応、およびＴ−細胞か介する遅延型の過敏反応１例えば、￥ａｎ ｔａｕｘ試験の結果か璽陽性Σである個体で見られるような二か含まれる。

非特異的な防御系の反応は、免疫学的な記憶かできない白血球か関与している炎 症反応である。このような細胞には、顆粒球、マクロファージ、好中球などが含 まれる。非特異的な防御系反応の例には、ハチ剥削部位の即時の肺脹、火傷部位 に誘導される赤化および細胞浸潤、および細菌感染部位のＰＭＮ白血球の集積（ 例えば、細菌性肺炎における肺浸潤、膿瘍における膿の生成）が含まれる。

本発明か、慢性関節リウマチ、ａｃｕ４ｅおよび慢性の炎症、虚血後（再潅流） の白血球媒介の組織損傷、急性の白血球媒介の肺損傷（例えば、成人呼吸窮迫症 候群）、ならびにその他の組織または器官特異的なａｃｕ４ｅ炎症の形態（例え ば、糸状体腎炎）などの炎症性疾患の過程の診断、モニター、および治療に適用 するのか容易であることは理解されるであろう。

当業者には明らかであるように、ＬＡＩの治療効果は、完全なしＡ１分子または そのあらゆる治療学的に活性なペプチドフラグメントを患者に供することによっ て得ることかできる。

また、ＬＡＩの治療学的な利点か、ＬＡＩの担体との結合を増強するか、または ＬＡＩの活性を増強するために加えられた付加的なアミノ酸残基を保持するＬＡ Ｉの突然変異体または変異体を使用することによって増大することも明らかであ る。さらに、本発明の範囲にはＬＡＩの突然゛変異形態か含まれる（このような 突然変異Ｌ　Ａ１分子が細胞の付着に影響を及：ミす能力を示す限り、ある種の アミノ酸残基を欠くか、または変えられたアミノ酸残基を含有するＬＡＩ分子が 含まれる）。

本発明のＬＡＩ分子およびその機能的誘導体は、薬学的に有用な組成物を製する ための既知の方法に従って製剤化することができ、これによって、この物質また はその機能的誘導体を薬学的に許容しうる担持担体との混合物にする。適当な担 体およびその製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は 、例えば弛ｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ［１６ｔｈ　ｅｄ、　、　０ｓｏｌ、　Ａ、　、　Ｅｄ、　、　Ｍ≠モ求A 　Ｅ ａｓｔｏｎ、　ＰＡ（１９８０）：に記載されている。効果的な投与に適する薬 学的に許容しうる組成物を得るために、このような組成物は、治療学的有効量の ＬＡＩ分子またはその機能的誘導体（炎症を減少させる量）を、適当量の担持担 体とともに含有しているであろう。

本発明の好ましい産物は、ＬＡＩまたはその機能的誘導体を含有する治療用の滅 菌医薬組成物であり、静脈内投与に適したものである。この産物は、適当な担体 または希釈剤の添加によって使用時に復元される凍結乾燥形態であってよいし、 また水溶液の形態であってもよい。

本発明に従って凍結乾燥産物を復元するために、近似の生理学的条件に広く認め られている物質、および／または政府の法令で要求されている物質を含んでいる こともある滅菌希釈剤を用いることができる。これに関して、この滅菌希釈剤は 、生理学的に許容しうるｐＨを得るための緩衝剤（例えば、塩化ナトリウム、食 塩水、リン酸緩衝食塩水）、および／またはその他の物質（生理学的に許容され 、モして／または使用するに安全なもの）を含有していてもよい。通常、ヒトの 静脈内注射用の物質は、当分野の者か入手可能なＦ　ｏｏｄａｎｄ　Ｄｒｕｇ　 、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎに規定される規則に従うべきである。

また、この医薬組成物は、凍結乾燥産物の復元に関して上記した物質と同じ物質 を多数含有する水溶液の形態であってもよい。

上記のように、本発明の産物は、治療用に使用しうる医薬調製物中に導入するこ とができる。しかし、この「医薬調製物−：なる用語は、本明細書中ではさらに 広い意味が意図されており、治療用だけでなく当分野で既知の試薬もしくは診断 用または組織培養用に用いられる、本発明に係るタンパク質組成物を含む調製物 を包含している。治療用に意図される医薬調製物は、「薬学的に許容しうる」ま たは「治療学的有効量」のＬＡＩ、即ち予防または治療上の健康対策に必要な量 を含有しているはずである。この医薬調製物か試薬または診断用に使用されると きには、試薬または診断量のＬＡＩを含有しているはずである。

組成物は、その投与か受容患者にとって耐えることかできるものであるときに、 「薬学的に許容しつる」ものであると言う。そのような薬剤は、投与された量か 生理学的に有意なものであるときに、「治療学的有効量」で投与されると言う。

ある薬剤は、その存在か受容患者の生理に検出可能な変化を生じるときに、″生 理学的に有意、□である。

定義により、１単位のＬＡＩ活性は、規格化されたインビトロの検定系において 、２ｘｌＯ”細胞／ｍｌのＰＭＮ濃度でＰＭＮＭＮＯＳ０％阻害を生じるものと する。１０倍高い濃度のＬＡＩ（ＩＯＵ／ｍｌ）は、同じ細胞濃度で８５〜９０ ％の最大阻害を生じる。ＩＬ−１刺激したヒト内皮培養のならし培地から精製し たＬＡＩＯ比活性は、ＩＵ／Ｑ、５μｇタンパク質である。従って、１ＱＬｊ／ ｍ１＝５μｇ／ｍ１重量対容量である。全血中の正常なＰ　Ｍ　Ｎ　４１度は１ 〜３ｘｌＯ”／ｍｌである。従って、治療用量は５μｇ／ｍｌのａ度を越えるも のであろう。

投与される治療および／または診断用量は、関係している特定の炎症状態に依存 し、また哺乳動物対象の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、および 同時治療の種類（もしあれば）に依存するであろう。通常は、約１００〜１０， ０００単位の活性または５０μｇ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲のタンパク質用量を受容 体に与えるのか望ましいが、さらに低いかまたはさらに高い用量を投与すること もできる。

本発明の分子を投与するのに有用な方法には、局所、皮下、関節内、腹腔内、胸 膜内、または眼内が含まれる。ＬＡＩまたはその機能的誘導体を注射によって投 与するときには、その投与は持続注入によるものであってもよいし、また１回も しくは複数回のホーラスであってもよい。

本発明の方法に有用な有効分子は、例えば注射用の滅菌懸濁液のような形態で用 いることもできるし、また、ＥＬＡＭ−１などの炎症関連の細胞表面構造に指向 性の抗体によって特異的な組織部位に標的化するためにカプセル化することもで きるｊＢｅ〜＋１ｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ。

、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８４　：　９２３８−９２４２（１９８７）　；　Ｃｏ ｔｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　P６４ ：　６６１−６６６（１９８６）］。

別の薬学的方法を用いて作用期間をフントロールすることもできる。放出かコン トロールされた調製物は、Ｌ、ｌまたはその機能的誘導体を吸収またはコンプレ ックス化するポリマーを使用することによって得ることかできる。放出のコント ロールは、適当な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル 、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキンメチルセル ロース、または硫酸プロタミン）および適当な巨大分子の濃度ならひに導入方法 を、放出コントロールのために選択することによって達成することができる。

放出コントロール調製物によって作用期間をコントロールするのに有用な他の可 能性ある方法は、ＬＡＩ分子またはその機能的誘導体をポリマー物質、例えばポ リエステノベポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、またはエチレン酢酸ビニル フポリマーの粒子中に導入することである。

別法では、ＬＡＩまたはその機能的誘導体をポリマー粒子中に導入する代わりに 、これらの物質を、例えばコアセルベート法もしくは界面重合によって調製した マイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはセラチ ンマイクロカプセルおよびポリメタアクリル酸メチルマイクロカプセル）中に、 コロイド状薬物放出系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、微小エマルシ コン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、または巨大エマルジョン中に捕捉 させることができる。このような方法は、肚１那ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（１９１１１０）に開示されている。

（以下、余白） Ｋ穐例 以上に本発明の詳細な説明したが、以下の具体的な実施例を参照することによっ て本発明をさらに明瞭に理解することができよう。

これら実施例は例示のためだけに挙げたものであり、特に記すことがなければ本 発明を限定するものではない。

炎症の原材料および生化学的試薬 以下の試薬を表示した供給源から入手した。ヒト単球由来のＩＬ−１（ｈｒＡＩ Ｌ−１）、ヒト組換えＩ　Ｌ−１−β（ｒｌＬ−１β）、およびヒト組換え顆粒 球−単球コロニー刺激因子（Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆ　）　：　Ｇ　ｅｎｚｙｍｅ、　 １ｎｃ４．　Ｂ　ｏｓｔｏｎ、　Ｍ　Ａ　；大腸菌中で発現するヒト組換えＩＬ −１−α（ｒｌＬ−１１２）：　Ｃ１５ｔｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｐ ｉｎｅ　Ｂｒｏｏｋ、Ｎ　Ｊ　；グラム陰性細菌内毒素（大腸菌０１１１　：　 Ｂ４）：　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｌ；ア フィニティー精製したヒトインターフェロンガンマ（７−Ｉ　Ｆ　Ｎ）　：　Ｉ 　ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｔ　ｎｃ、、　Ｔｈｒｅｗ　Ｂ 　ｒｕｎｓｔｈｉｃｋ、　Ｎ　Ｊニトリプシン（タオブｘ１）、トロンビン（ヒ ト血漿由来）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロインルーフェニルアラニン（ｆＭ ＬＰ）、ポルホール１２−ミリステート　１３−アセテート（Ｐ　Ｍ　Ａ　）、 セラチン−アガロース、および硫酸アンモニウム（グレーＶ　ＩＩＩ）　：　Ｓ 　ｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；　ｏイ コトリエンＢ　４（Ｌ　Ｔ　Ｂ　４）　：　Ｂ　＋ｏｍｏｌ、　１ｎｃ、　、　 Ｐ　ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐ　Ａ　；コンカナバリンＡ−アガロース：Ｖ ｅｃｔ。

ｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂ　ｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ　；　ヘ パリン−セファ０−ス　ＣＬ−６Ｂおよびペプシン−アガロース：　Ｐ　ｈａｒ ｍａｃｉａ、　Ｉ：　ｐｐｓａｌａ、　Ｓ　ｗｄｅｎ。

Ｆ　ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｉｕｍ由来のヘパリナーセは Ｄ　ｒ、　Ｈｏｗａｒｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ［Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｉｔｓ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ］から提供を受けた。組換えＴ　Ｎ　Ｆ　（ｒＴ　Ｎ　Ｆ　）、ｒＩＬ−２、お よびｒｌＬ−１βはＢ　ｉｏｇｅｎ、　Ｉ　ｎｃ、　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　 ＭＡ）から得た。

５の素状組織セグメントから単離して培養し、プールし、そして２０％ウシ胎児 血清（Ｆ　ＣＳ　；　Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　 ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）および抗生物質を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９　（Ｍ１９ ９　；　Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ） を用いる１次培養で増殖させた。０．１％ゼラチン（バタトセラチン０１４３− ０２　；　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ ）を被覆したＣ　ｏｓｔａｒ組織培養フラスｍｌ　（７５ｃｍ’　；　Ｃｏ５ｔ ａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）中、ブタ腸ヘパリン（５０〜１００　、 ｃｚｇ／ｍｌ　：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ 、　ＭＯ）および内皮細胞成長因子（５０〜１００ｕ　ｇ／　ｍｌ　；　Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　ｌ　ｎｃ、　、　Ｓｔｏｕｇｈｔ ｏｎ、　ＭＡ）を追加したＭ　１．９９−２０％ＦＯ８を用いて、いくつかの株 を連続的に継代培養した（１：３の配分比）。

実験用には、ＨＥＣ株を、微量滴定ウェル中の１５ｍｍのＴ　ｈｅｒｍａｎｏｘ プラスチック製カバースリップ（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｎａｐ ｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）上１こ、またはフィブロネクチン（１ｔｔ　ｇ／　ｃ ｍ！；　Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｆ　１ｅｌｄ 、　ＭＡ）もしくは０．１％ゼラチンのどちらかを被覆した１００＋ｎｍの組織 培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　ＮＹ ）にプレートした（継代培養レヘル２−５）。

実施例２　白血球の単離および放射ラベル血液を正常なヒトボランティアからＣ ＣＤ緩衝液Ｅ１：９；１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１３０ｍＭグルコース（ ｐＨ６，５）］中に採取した。Ｂ　ｅｖｉ　１ａｃｑｕａらＩＪ、　Ｃｌ１ｎ、 　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６　：　２００３−２０１１（１９８５）Ｅの方法に従っ てＰＭＮ（＞９５％）の＠濁液を調製した。単核白血球をリンパ球分離培地（Ｌ ｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、　 ＳＣ）で単離し、さらにＲｅｃａｌｄｅら［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ 、　６９　：　７ｌ−７７（１９８４）］の方法に従って単球に富む集団（７５ 〜８８％）または血清被覆したプラスチック製ベト９皿ての単球減少によってリ ンパ球懸濁液（〉９５％）のどちらかに分画した。前骨髄球セルラインＨＬ−６ ０および単球様セルラインＵ９３７をＢ　ｅｖｉ　１ａｃｑｕａら（上記）の記 載のように培養した。それぞれの白血球型を、Ｂ　ｅｖｉｌａｃｑｕａら（上記 ）の記載の方法を用いて目１インンウムーオキシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒ ｐ、、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）で放射ラベルした。

実施例３　培地の調製 Ｉ　Ｌ−１ならし培地（ＩＬ−Ｉ　ＣＭ）またはｓｈａｍならし培地（Ｓ’ＨＡ Ｍ　ＣＭ）を調製するために、（１）追加のタンパク質なし；（２）５ｎｇ／ｍ １トランスフェリノ、５μｇ／ｍｌインスリン、および５ｎｇ／ｍｌセレン（最 終濃度）（Ｔ　Ｉ　Ｓ　；　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ＣａｒＱｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含む規定の非血清添加物；　（３）　１％（ｖ ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｆｅ２；内毒素＜　０　、０２７　ｎｇ／　ｍｌ　；　Ｈ ｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　、　Ｌｏｇａｎ、　ＵＴ ）：および（４）　１０　ｍｇ／　ｍｌウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　；　 Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏ、）を含有する ＲＰＭＩ−１６４０（ＲＰＭＩ　；Ｍ、Ａ。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）中、Ｉ　Ｌ− １（２，５〜５Ｕ／ｍｌのｈｍＩ　Ｌ−１またはｒｌＬ−β）を含むか、または 含まずに全面成長のＨＥＣ単層（１００ｍｍ皿）をインキュベートした。４時間 後に、全ての皿をＣａ”またはＭｇ”を含まないＨａｎｋｓバランス塩溶液（Ｈ ＢＳＳ、Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　（５ｍｌ）で洗浄してサイト カイン含有の培地を除去し、ＲＰＭＴ単独またはＴＩＳ、Ｆｅ２もしくはＢＳＡ を追加したＲＰＭＩ中でさらに５時間インキュベートした。培地を集め、遠心し く４００　ｘ　ｇ、１０分間）、そして通常は一８０℃で凍結した。

一部の実験では、アクチンマイシンＤ　（５ｕ　ｇ／　ｍｌ　＋　Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏ、）、アセチルサリチル酸（５００Ｉｔ　Ｍ　；　Ｆｉｓ ｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃ。

、　、　Ｍｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）、またはインドメタノン（５ｔｔＭ　；　Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を、ｒｒ　Ｌ−１の添加の３０分前に内 皮培養物に加え、前処理段階の間は培地中に残存させた。

実施例４　ＬＡＩの酵素処理 ＬＡＩを次のように酵素で処理した。即ち、ＲＰＭ　Ｉ　ＴＴ　Ｔ　Ｓ中に集め たＳ　ＨＡ　Ｍ　ＣＭおよびＩＬ−Ｉ　ＣＭを、Ｎ、下、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭ３ ０メンプラン（名目の分子量遮断３０　、　ＯＯＯ；　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ 、　。

Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）で濾過し、トリプシン（１，０ＯＯＵ／ｍｌ、ｐＨ７ ，３７°Ｃ１１８時間）、トロンビン（２Ｕ／ｍｌ、３７°Ｃ，２時間）、ヘバ リナーゼ（１５０／ｍｌ、３０°Ｃ，２時間）、またはペプシン結合のアガロー ス（４、５００Ｕ／ｍｌ、ｐＨ４，１８時間、３７°Ｃ）で処理した。

煮沸（１００°Ｃ１１５分）によって、またはペプシン結合のアガロースの場合 にはアガロースビーズを除去するＢ　ｅｃｋｍａｎ　Ｍ　ｉｃｒｏｆｕｇｅ中て の遠心によって酵素処理を停止させた。トリプシンおよびトロンビンは、発色性 基質ＢＡＥＥ（Ｘ−α−ベンゾイル−し−アルギニンエチルエステル；　Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の加水分解によって測定するとＳＨＡＭＣＭ およびＩＬ−ＩＣＭの両方で完全な活性を、および血漿凝固活性をそれぞれ保持 していた。

実施例５　ＬＡＩ活性の検定 標準の放射線単層付着検定ＸＢｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

匹：　２００３−２０１１（１９８５）を参照］てＬＡＩ活性を測定した。簡単 に説明すると、Ｔ　ｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップまたは微量滴定ウェルで増 殖させた全面成長のＨＥＣ単層からなる標的の単層を、ｒｌ　Ｌｌβ（２゜５〜 ５Ｌ″／ｍｌ、４時間）を含むか、または含まないＲＰＭＩ＋ＦＣ８中で前処理 した。■インジウムでラベルした白血球懸濁液（２ｘ１０７細胞／ｍｌ）の一部 を、ＩＬ−Ｉ　ＣＭ、ＳＨＡＭ　ＣＭ、または新鮮なＲＰ　Ｍ　Ｔ　＋　Ｆ　Ｃ ＳもしくはＴＩＳ中で直接希釈しく最終濃度＝２Ｘ　１０’細胞／＋ｎｌ）、洗 浄した単層に加え、静止状態のもと、３７℃で１０分間インキュベートした。こ の検定を、Ｔ　ｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ上のＨＥＣ単層については標準 化した洗浄によって終結させ［Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、　（上記） を参照コ、また、微量滴定プレートの場合には封をし、反転させ、そして遠心し た［Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、ｅｔ　ａｌ。

、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ：ＳＡ　８４　：　９ ２３ｇ−９２４２（１９８７）　：　Ｃｈａｒｏ　ｅｔ　ａ戟A　、　Ｂｌ 廻動：　４７３−４７９（１９８５）を参照］。

付着＋１１Ｊｎラベルの白血球の数を、Ｇａｍｍａ５．５００カウンター（Ｂｅ ｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、 　ＣＡ）を用いて白血球調製物の比活性（ｃｐｍ／細胞）および単層結合の放射 活性から決定した。阻害率（％）は以下の式で計算し、平均上平均の標準誤差（ ＳＥＭ）で表した。

有意性は２つの尾部を有するスチニーテントのＴ−検定で調べた。

実施例６　ＰＭＮに対する内皮細胞の付着性のサイトカイン誘導による増加 図１に示すように、ＨＥＣ単層をｈｍｌＬ−１て処理すると、多形核白血球（Ｐ ＭＮ）に対する表面付着性が時間に依存して増加する結した白血球を添加する直 前に、サイトカイン含有の培地を常法によりアスピレータ−吸引し、それぞれの ウェルを新鮮な培地で洗浄した。この「洗浄した」系では、Ｉ　Ｌ−１処理した ＨＥＣ単層へのＰＭＮの付着は、Ｉ’　Ｌ　−１の１時間後程度の初期に未処理 の単層に比へて有意に増加し、ピークの付着が３〜４時間で生じ、次いで徐々に 低下した。対照的に、前処理培地を除去せず、そしてＰＭＮをウェルに直接加え たときには（「未洗浄の」系）、特に３時間以後に著しく少ないＰＭＮ付着が観 察された。未刺激のＨＥＣ単層へのＰＭＮの付着は、洗浄および未洗浄の同条件 につい、て、試験した全ての時間で同一であった。これらの観察に基づいて、我 々は、未刺激ではなくＩＬ−１刺激されたＨＥＣ単層由来のならし培地がＰＭＮ −内皮の付着を阻害する活性（「白血球付着阻害物質ｊ、ＬＡＩ）を含有してい るものと仮定した。

実施例７　ＬＡＩ活性の同定および代謝的な評価刺激された内皮細胞かＰＭＮ− 内皮付着の阻害物質を含有しているという仮定を検定するため、１００ｍｍ皿で 増殖させた内皮細胞培養物からならし培地を果めた。ＨＥＣを洗浄して培養培地 を除き、Ｉ　Ｌ−１を含むかまたは含まずにＲＰＭＩ＋ＦＣ３中で４時間インキ ュベートし、この時点でＨＥＣをもう一度洗浄した。新しいＲＰＭＩ＋ＦＣ３中 でさらに５時間インキュベートした後、ＩＬ−１ｃＭおよびＳＲＡＭ　ＣＭを集 めた。過付着性のＨＥＣ単層（２，５〜５Ｕ／ｍｌのｒｌ　Ｌ−１βて前処理、 ４時間）へのＰＭＮの付着は、ＳＨＡＭ　ＣＭと比べると、ＩＬ−Ｉ　ＣＭの存 在下で有意に阻害された（７２±６％、ｎ＝１０、Ｐ＜０．００１＋図２）。集 めた後にｒｌＬ−１β（＋１；／ｍｌ）を加えたＳＨＡＭ　ＣＭは、阻害作用を 全く有さなかった。内皮細胞の非存在下でｒｌ　Ｌ−１β（５Ｕ／ｍり含有の培 地をインキュベートしても阻害活性は生成しなかった。

ＨＥＣのアセチルサリチル酸（５００μＭ）処理は、構成性およびカルシウムイ オン透過担体刺激のＰＧＩ、生成を排除する条件下では、ＬＡＩの産生を変える ことはなかったく未処理のＨＥＣから９０〜９７％のＬＡＩ活性、３回の実験） 。同様の結果がインドメタ７ン前処理で得られ、ＬＡＩ活性の生成にはシクロオ キシゲナーセ経路を経るアラキドン酸代謝は必要でないことを示した。し力１し 、ｒｌ　Ｌ−１による刺激（２，５〜５Ｕ／ｍｌ、４時間）の前に３０分間、Ｈ ＥＣをアクチノマイ／ンＤ（５μｇ／ｍｌ）で処理すると、後のＬＡ■生成を実 質的にブロックした（未処理のＨＥＣからのＬＡＩ活性の０〜１０％、６回の実 験）。相当量のＬＡＩ活性が、タンパク質不含のＲＰＭＩ培地中に（６５＝４％ のＬＡＩ活性、４回の実験）、血清不含のＴＩＳ追加培地中に（５８±３％のＬ ＡＩ活性、１０回の実験）およびＢＳＡ追加培地中に（５７ｆ　６％のＬＡＩ活 性、５回の実験）集めたＩＬ−Ｉ　ＣＭ中に検出された。

上記の観察は、新たなタンパク質合成がサイトカイン刺激された内皮細胞による ＬＡＴ活性の生成に必要であること、さらに、ＬＡＩ活性は外部から加えたある 種の培地成分（例えば、血清因子またはＩＬ−１）の代謝によっては得られない ことを示唆する。

また、ヒト組換えＩ　Ｌ−１βおよび天然のヒト単球由来のＩＬ−１に加えてヒ ト組換えＩ　Ｌ−１α（１０Ｕ／ｍｌ）、ヒト組換えＴＮＦ（１０００／＋ｎｌ ）および細菌性Ｌ　Ｐ　Ｓ　（１μｇ／ｍｌ）も、以下の表１に示すように、Ｈ ＥＣ単層によるＬＡＩ活性の生成を誘導した。

媒介物質　ＰＭＮ付着の阻害率（％） ｈｍＩＬ−１（５Ｕ／ｍｌ）　７２：　６ｒｌ　Ｌ−１ａ　（１０Ｕ／ｍｌ）　 ５８±　７ｒｌ　Ｌ−１β（２，５Ｕ／ｍｌ）　６９：　１０（−１−ポリミキ シンＢ）　６０：　７（−Ｌ加熱）　７±１３ ＬＰＳ　（１βｇ／＋ｎｌ）　３９±　８（÷ポリミキ／ンＢ）　１２＝　３ （−加熱）　３：３＝　５ ｒＴＮＦ　（２００Ｕ／ｍｌ）　５４：　４ＩＦＮ７　（２００Ｕ／ｍｌ）　− １：　９ＧＭ−ＣＳ　Ｆ　（２００％ｇ／ｍｌ）　−１±１５ＩＬ−２（５００ Ｕ／ｍｌ）　−９＝　９全面成長の単層を表示した種々の媒介物質によりＲＰＭ Ｉ＋ＦＣ３中で４時間処理し、洗浄し、そしてＲＰＭＩＱＦＣ３中で５時間イン キュベートした。ならし培地を集め、洗浄したＩ　Ｌ−１処理（５Ｕ　ｒｌ　Ｌ −１β、４時間）の）ＩＥｃ単層に対して標準の単層細胞付着検定で検定した（ 希釈せず）。結果は平均±ＳＥＭて示す。

硫酸ポリミキ７ンＢ（２０μｇ／ｍｌ）処理はＬＰＳの刺激作用を中和したが、 ｒｌ　Ｌ−１βの作用を減少させることはなかった。対照的に、ｒＩ　Ｌ−２（ １００Ｕ／ｍｌ）、ｒｌ　Ｆ　Ｎ−ｙ　（２００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳ　 Ｆ　（２００Ｕ／ｍｌ）はＬＡＩ産生を刺激しなかった。また、ＩＬ−Ｉ　ＣＭ 中のＬＡＩ活性は、以下の表２に示すように、ＴＮＦ（２００ｔｊ／ｍ＋、４時 間）およびＬ　Ｐ　Ｓ　（１μｇ／ｍｌ、４時間）で活性化したＨＥＣ単層への ＰＭＮの付着を阻害した。同様に、ＴＮＦおよびＬＰＳのならし培地も、ＩＬ− １，ＴＮＦおよびＬＰＳ活性化された内皮単層へのＰＭＮの付着を阻害した。

ＩＬ−１刺激したＨＥＣ由来のならし培地は、ＴＮＦ（２００Ｕ／ｍｌ、４時間 ；５４：４％、５回の実験）、Ｌ　Ｐ　Ｓ　（１μｇ／ｍｌ、４時間＋５６：７ ％、３回の実験）、またはＩ　Ｌ−１（２，５０／ｍｌ、４時間；６８：４％、 ５回の実験）で活性化したＨＥＣ標的単層へのＰＭＮ付着の相当な阻害を生じた （以下の表２を参照）。対照的に、ＩＬ−Ｉ　ＣＭは、新鮮なヒト血清（４−３ ％阻害、４回の実験）、未補足のヒト血清（−１０±４％、３回の実験）または チモサン活性化したヒト血清（−８−１０％、３回の実験）で被覆されたプラス チ、夕表面へのＰＭＮの付着を阻害しなかった。これらの結果は、活性化してい ない内皮細胞へのＰＭＮ付着に効果かないことと合わせて、ＬＡＩか白血球の「 過付着性≦内皮細飽表面との相互作用を優先的に阻害するように作用することを 示唆する表２サイトカインおよび内毒素活性化したＨＥＣ単層で測定したサイト カインおよび内毒素刺激したＨＥＣ由来のＬＬＡＩ活性　活性化されたＨＥＣへ の の供給源＊　ＰＭＮ付着の阻害率（％）ＩＬ−Ｉ　ＣＭ　６８±４　５４±４　 ５６＝７ＴＮＦ　ＣＭ　４５±９　３８−９　３６＝８ＬＰＳ　ＣＭ　３９±８ 　３１＝７　１２±３＊実施例３の記載のようにしてサイトカインおよび内毒素 刺激したＨＥＣ単層からならし培地（ＣＭ）を集めた。標的のＨＥＣ単層をｒｌ 　Ｌ−ｉβ（５０／ｍｌ）、Ｔ　Ｎ　Ｆ　（２０００／ｍｌ）またはＬＰＳ（１ βｇ／ｍｌ）で前処理（４時間）し、被験培地に再懸濁したＩｌｌ　ｉ　ｎ−ラ ベルのＰＭＮを添加する直前にｌ７１１．浄した。ＰＭＮの付着は定量的単層付 着検定７ＬＢｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎＩｎｖｅｓｔ、 　７６：　２００３−２０１１（１９８５）３で測定した（実施例５を参照）。

結果は３回の独立した実験の平均力ＳＥＭで表した。

ＬＡＩ活性の生成はＩ　Ｌ−１の濃度に依存し、０．１０／ｍｌのｒｌＬ−１β て始まり、２．５〜５Ｕ／ｍｌで最大になることがわかった（図３）。ＩＬ−Ｉ 　ＣＭ中のしＡ■の出現は時間依存性であり、１時間間隔て集めた培地中の阻害 活性はＩ　Ｌ−１後の１〜２時間で検出可能になり（３０：ｍ６％、ｎ＝５）、 ５〜６時間で最大になった（６５＝２％）。９時間後には活性の減少が観察され た（図９を参照）。

ＬＡＩ活性はＡｍ１ｃｏｎ　ＹＭ３０（名目上の分子量排除＝３０，０００）を 自由に通過するが、Ａ　ｍ１ｃｏｎ　Ｙ　Ｍ　５　（名目上の分子量排除＝５． ０００）で１０〜２０Ｘに濃縮された。ＰＭＮ付着の阻害は、５ＸのＩＬ−ＩＣ Ｍ濃度で最大にブロックされ（ＰＭＮ付着の７５±７％阻害、ｎ＝５；図４）、 それより低いＴＬ−ＩＣＭ濃度ではそれに比例して少ないＬＡＩ活性が検出可能 であった。

実施例８　ＬＡＩ活性の標的の評価 ＬＡＩ活性か白血球または内皮細胞にその阻害作用を発揮するか否かを測定する ために、それぞれの細胞種を選択的に前処理した。

活性化したＨＥＣ単層（５Ｕ／ｍｌのｒｌ　Ｌ−１，４時間）をＩＬ−Ｉ　ＣＭ と３０分間インキュベートすると７続いて新しい培地（１，５ｍｌンと交換］、 ＰＭＮ付着の阻害は観察されなかった（５：８％阻害、Ｐ〉００５．３回の実験 ）。

対照的に、ＰＭＮ（３Ｘ１０’細胞、１５ｍｌ中）を３０分間、ＩＬ−Ｉ　ＣＭ で前処理し、遠心しく１１００Ｘ、２分）、相当量の新鮮な培地に再ｊＱ［し、 そして活性化したＨＥＣ単層に加えると、ＰＭＮ付着は有意に阻害された（２５ ″：３％阻害、Ｐ＜０．００１．３回の実験）。ざるに、固定化したｌ　Ｌ−１ 刺激のＨＥＣ単層（２％バラポルムアルデヒドのＰＢＳ中、２２°Ｃて５分間、 次いて４°ＣのＰＢＳ−ｒ　Ｂ　Ｓ　、Ａ中で一晩保存）への未固定のＰＭＮの 付着は、ＩＬ−ＩＣＭによって有意に阻害され続けた（４５二９％阻害、２回の 実験）。

対照的に、Ｐ　Ｍ　Ｎの短時間の固定（２％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ中、 水上で５分）は、＞８０％まてＬＡＩの阻害作用を減少させた。ＰＭＮの固定そ れ自体は、未処理またはＩＬ−１処理のＨＥＣ単層への付着を変えなかった。こ れらの廿察は、ＬＡＩの阻害作用が主として白血球に向いていることを示すもの である。

図５に示すように、ＬＡＩ活性は、サイトカイン活性化および未活性化内皮への ある種の血液白血球の付着に特異的に影響を及はすよってある。ＩＬ−Ｉ　ＣＭ は活性化されたＨＥＣ単層へのＰＭＮの付着の顕著を阻害を首尾一貫して生成す るが（サイトカイン刺激の付着の７６±４％阻害、ｐ＜ｏ、ｏ○１．５回の実験 ）、未活性化単層へのＰＭＮの付着には作用を有していなかった。同様に、活性 化されたＨＥＣ単層への単球の付着は有意に阻害、されたが（サイトカイン刺激 の付着の５５＝１２％阻害、Ｐ＜０．０１．５回の実験）、活性化されていない 単層への比較的大きな付着に対する影響は観察されなかった。対照的に、ＩＬ− Ｉ　ＣＭは、ＩＬ−１活性化または未活性化のＨＥＣ単層のいずれかに対する末 梢血液リンパ球（−４±６％阻害、Ｐ〉０１．３回の実験）、ＨＬ−６０細胞（ ２±６％、Ｐ＞０．１．４回の実験）またはＵ９３７（１土９％、Ｐ＞０．１． ４回の実験）の付着を有意に変えることはなかった。

ＬＡＩの存在下および非存在下での活性化ＨＥＣ単層へのＰ　Ｍ　Ｎ付着の生体 顕微鏡は顕著な相違を示した。ＳＨＡＭ　ＣＭにおいては、ＰＭＮは、単層表面 に多数か強固に付着した（図６Ａ）。対照的に、ＬＡＩの存在下てＰＭＮ付着の 程度は顕著に減少し、定量的な放射線検定と一致した。個々のＰＭＮは形状の変 化を受けたか、これらか単層表面に広がるようには見えなかったことは重要であ る（図６Ｂ）。

実施例９　ＰＭＮ活性化の検定 可溶性の刺激物質（１０−’Ｍ　ｆＭＬＰ、ＩＱ−’　ＬＴＢ、、１１００ｎ／ ｍｌ　ＰＭＡ）に対するＰＭＮの応答を、メンプランポテンンヤルの変化および 細胞質ゾル遊離カルシウム濃度の定量測定によって調べた。

メンプランポテンンヤルの変化は、３７℃にコントロールされたキュベツト区画 を有するＳ　Ｐ　Ｅ　Ｘ　Ｆ　ｌｕｏｒｏｌｏｇ　ＩＩ蛍光分光光度計を用い、 フルオレセント・シアニンプローブｄｉＳ　Ｃ５−５ｊＷｈｉｔｉｎＣａ”感受 性のＦｕｒａ−２蛍光を測定するために、ＰＭＮの懸濁液（１０７細胞／ｍｌ） をＣａ”およびＭｇ”を含まないＨＢＳＳ中に再懸濁し、１μＭの最終濃度で１ ０分間、３７°ＣでＦ　ｕｒａ−２／　Ａ　Ｍ　（保存溶液、ジメチルスルホ牛 シト中の１ｍＭ）とともにインキュベートした。この細胞をＨＢＳＳで５倍に希 釈し、３７°Ｃでさらに１５分間インキュベートした。この細胞を冷ＨＢＳＳで 遠心することによって２回洗浄し、１０’Ｃで保存した。検定の直前に、細胞を Ｂ　ｅｃｋｍａｎＭ　１ｃｒｏｆ　ｕｇｅ（モデルＢ）でペレット化し、温ＨＢ ＳＳ＋Ｃａ”およびＭｇ”（１、６ｍｌ）に再懸濁し、キュベツト中で５分間平 衡化し、次いでアコニストを加エタ。

蛍光の測定は、ビーム・スプリッター、２つの励起モノクロメータ−１および２ つの波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍてのＦｕｒａ−２の迅速な交互の（３０Ｈ ｚ）励起を可能にするための特殊化した光学配置における２重ミラー変向構造を 装着したＳ　Ｐ　Ｅ　Ｘ　（Ｅｄｉｓｏｎ、　ＮＪ）　Ｆ　ｌｕ。

ｒｏｌｏｇ　ＩＩ（モデルＣＭ−１）蛍光分光光度計で行った。励起バンドの幅 は６．６ｎｍにセ、トシた。放出された蛍光シグナル（５０５ｒ＋ｍ、７２ｎＭ ）の比が、細胞数、染料負荷および染料漂白に依存しない細胞内Ｃａ”濃度の計 算を可能にした。蛍光シグナルは、細胞内および細胞外Ｃａ”の平衡を可能にす る８０μＭのジキトニンを用い（最大）、次いで１Ｍ）リス、３００ｍＭ　ＥＧ ＴＡ、ｐＨ＞　１０．０を添加して（最小）検量した。細胞内Ｃａ”のヘースお よび最大の増加をＧ　ｒｙｎｋｉｅｔｖｉｃｚらＩＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２６０　：　３４４０−３４５０（１９８５）Ｅの記載のよさらに、可溶性 の炎症性刺激物質に応答してのスーパーオキシドの生成および刺激一応答のシグ ナルを調へた。ＩＬ−Ｉ　ＣＭまたはＳＲＡＭ　ＣＭを添加しても、静止してい るメンプランボテンシャルを変えること、または１０−’Ｍ　ｆＭＬＰＳ　１０ −’Ｍ　ＬＴＢ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌ　ＰＭ、Ａによって誘導されるメン プランの消極を阻害することはなかった（図６Ａ）。同様に、ＩＬ−Ｉ　ＣＭお よびＳＨＡＭ　ＣＭのどちらも、ｆＭＬＰ誘導の細胞質ゾルカル／ラム量の増加 を変えることかなかった（図６Ｂ）。また、１０−’ＭｆＭＬＰあるいは１００ ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡに応答してのスーパーオキシドの生成も、ＬＡＩによって阻 害されることはなかった（データは示していない）。これらの結果は、ＰＭＮに おいては、活性化シグナルの形質導入（メンプランの消極および細胞質ゾル遊離 カル／ラムの増加によって示される）、および細胞の応答（スーパーオキシドの 生成な予備的な生化学特徴付けを容易にするため、血清不含のトランスフェリン ／インスリン／セレン追加の培地中のＩ　Ｌ−１活性化ＨＥＣ単層からＬＡＩを 集めた。これら調製物中のＬＡＩ活性は、２０分間の煮沸、１８時間の酸性化（ ｐＨ２または４）、凍結（−８０°Ｃ１３ケ月まで）、およびプロテアーゼ阻害 物質の添加なしでの４°Ｃで１４日までの保存を含む種々の処理に対して安定で あることかわかった。ＬＡＩ活性は非沈澱性（２５０，０００ｘｇ、４５分）で あり、膜フラグメントと結合しておらず可溶性であることを示唆した。ＬＡＴ活 性は、ゼラチン−アガロース、コンカナバリンＡ−アガロースまたはヘパリン− セファ０−スによって吸着されなかった。３０，０００分子量排除のメンプラン で濾過しておいたＩＬ−Ｉ　ＣＭの、トリプシ７（１，００ＯＬ’／ｍｌ、ｐＨ ７，３７°Ｃ１１８時間）、トロンビン（２Ｕ／ｍｌ、３７°Ｃ１２時間）また はヘパリナーセ（１５Ｌ；／ｍｌ、３０℃、２時間）による処理は、ＬＡＩ活性 に影響を及ぼさなかった。しかし、ペブ／ン結合のアガロースで処理すると（４ ，５００１Ｊ／ｍＬｐＨ４，３７°Ｃ１１８時間）、未処理対照でのＬＡＩ活性 が有意に減少した。ＬＡＩ活性は６０〜８０％飽和の硫酸アンモニウムによって 沈澱し、全活性がこの分画中に回収された。これらの結果は、ＬＡＩの生物学的 活性がタンパク質成分に依存していることを２つのモテル５　］、　Ｏ溶媒ポン プおよびプログラム可能なＳ　ｙｓｔｅｍｓＣｏｎｔｒｏｌ　Ｉｅｒ勾配メーカ ーからなるＷａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ。

ＭＡ）液体クロマトグラフィー／ステムを用いてＨＰＬＣを行った。

カラムの溶離液は、Ｗａｔｅｒｓモデル４８１吸収検出器を用いて２８Ｏｎｍで モニターした。ＲＰＭＩ−！−ＴＩＳ中のＩＬ−１ＣＭおよびＳＲＡＭＣＭを、 Ａ　ｍ１ｃｏｎ　Ｙ　Ｍ　３０メンプランで濾過し、溶離液をＹＭ　５メンプラ ン（名目の分子量排除５，０００）で２０〜４０ｘに濃縮し、蒸留水に対して透 析しＥＳ　ｐｅｃｔｒａｐｏｒ７．１０，０００分子量排除＋　Ｓｐｅｃｔｒｕ ｍ　Ｍｅｄ、　ｌｎｄ、　、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、　ＣＡ］、そして凍結 乾燥した。凍結乾燥した試料を、０．２Ｍ酢酸、Ｑ、１Ｍ）リエチルアミン（ｐ Ｈ３，９）中、約１　ｍｇ／　ｍ　１　（Ｄ　４度に復元し、Ｗａｔｅｒｓ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ−ＰＡＫ１２５ゲル濾過カラム（７，８ｍｍＸ　３０ｃｍ）にかけ た（２５０μｍ試料）。このカラムを１　、８　ｍ１７分の流速でイソクラティ ック系として溶離し、０．９ｍｌの分画を集めた。分画を、リン酸緩衝食塩水（ １３６ｍＭＮａＣ１，０，３ｍＭＫＣ］、Ｏ−８ｍＭ　Ｎ　ａ　２　ＨＰＯ４、 Ｏ，１ｍＭ　ＫＨ，ＰＯ，、ｐＨ７，４）に対して１８時間（４°Ｃ）透析した 。分画をＲＰＭＴ↓ＦＣ３て希釈し、標準の単層付着検定で検定した。タンパク 質測定はＢ　１ｏ−Ｒａｄタンパク質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ，へ）を用いて行った。

凍結乾燥したＩＬ−Ｉ　ＣＭの試料を、Ｗａｔｅｒｓ　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ−Ｐ　 Ａ　Ｋゲル濾過カラムの高速液体クロマトグラフィーで分画した（上記のように ）。分画（０，８ｍ１）をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４）に対して透析し、Ｒ ＰＭＩ＋ＦＣ８て１：１０に希釈し、標準の単層付着検定で検定した。この系に おいて、ＬＡＩ活性のピーク（分画１２）が主タンパク質ピーク（分画９）から 分離した（図８を参照）。ピーク分画中のＬＡＩ活性は、ＰＭＮＭＮＯＳ０％阻 害までの連続希釈によって計算すると、８０ｘの有効濃度で存在していた。連続 希釈により回収活性として概算されるＬＡｌの収率は９０％以上であった。予備 実験では、ピーク分画中のＬＡＩ活性は煮沸および酸性化に対して安定であり、 ペプンンによる処理で完全に破壊された（ペブンン処理中のＬＡＩ活性か一８＝ ６％であるのに対し未処理の対照中のＬＡＩ活性は６２：ｔｌＯ％）。

以上に本発明を具体的な態様に則して説明したか、さらに修飾を加えることがで きるのは理解されよう。本出願は、全体的に見て本発明の原理に従う本発明のあ らゆる変異、利用あるいは適合を保護するものであり、そして本発明か属してい る分野において既知または慣例の実施にあたるか、または添付した請求の範囲Ｃ 二ｇ己載された必須の特徴にあてはまる本明細書の開示からの逸脱を包含するも のである。

継続的なＩＬ−１処理（時） ＦＩＧ、ｆ 付着ＰＭＮ／ｍｍ” ＩＬ−１処理した内皮細胞ならし培地の相対濃度Ｆ／Ｇ、４ Ｆ／Ｇ、５ ＦＩＧ、７４ ＦＩＧ、７Ｂ ＬＡＩ活性 ＰＭＮ付着の阻害率（％） タンパク質含量（ｍｇ／ｍｌ） 白血球付着阻害物質（ＬＡＴ） 時間（時） ＦＩＧ、　９ 国際調査報告 ＩＨＩ＠、＋ａ１ｍＭＩ　１ｍ、、４ｍｍ＋　ｋ。Ｆ’＝；呻ｐ　９　／　Ｐ　 ’ｌ　Ｌ　？　−ｍＩＣ’＋４１＃１１ｍｍ＋Ｉｍｍ　１ＩＪＰ。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．別の細胞表面への白血球の付着を阻害することができる、天然の不純物を実 質的に含まないＬＡＩ。
2. ２．別の細胞表面べの白血球の付着を阻害することができる、ＬＡＩのフラグメ ントである請求項１記載のＬＡＩ分子。
3. ３．分子が検出可能にラベルされている請求項１または２のいずれかに記載のＬ ＡＩ分子またはそのフラグメント。
4. ４．分子が、放射アイソトープ、酵素、蛍光ラベル、常磁性ラベルおよび遊離ラ ジカルラベルからなる群から選ばれるラベルで検出可能にラベルされている請求 項３記載のＬＡＩ分子。
5. ５．炎症を有していることが疑われている哺乳動物対象の炎症の存在および位置 を診断する方法であって、（ａ）ＬＡＩを識別しうる検出可能にラベルされた結 合性分子を含有する組成物を該対象に投与し；そして（ｂ）該結合性分子を検出 すること； からなる方法。
6. ６．炎症を有していることが疑われている哺乳動物対象の炎症の存在および位置 を診断する方法であって、（ａ）ＬＡＩを識別しうる検出可能にラベルされた結 合性分子の存在下で該対象の組織試料をインキュベートし；そして（ｂ）該組織 試料に結合した該結合性分子を検出すること；からなる方法。
7. ７．実質的に純粋な形態のＬＡＩを回収する方法であって、以下の工程からなる 方法： （ａ）細胞供給源からならし培地を集め；（ｂ）該ならし培地を限外濾過してＬ ＡＩ含有の分画を得；（ｃ）該ＬＡＩ含有の分画を限外濾過によって濃縮および 脱塩し；（ｄ）該ＬＡＩ含有の分画を凍結乾燥し、アセトン沈澱によって脱脂質 化し； （ｅ）該ＬＡＩ含有の分画をＨＰＬＣクロマトグラフィーによってゲル濾過し； （ｆ）該ＬＡＩ含有の分画をイオン交換クロマトグラフィーにかけ；（ｇ）実質 的に純粋な形態で工程（ｆ）で得た濾液を回収する。
8. ８．請求項７記載の方法によって製造したＬＡＩ。
9. ９．炎症を軽減する量のＬＡＩおよび薬学的に許容しうる担体を含有する哺乳動 物対象の炎症を治療するのに有用な医薬組成物。
10. １０．哺乳動物対象の炎症を治療する方法であって、そのような治療を必要とし ている対象に請求項９記載の医薬組成物を供することからなる方法。
11. １１．炎症が特異的な防御系の反応である請求項１０記載の方法。
12. １２．炎症が非特異的な防御系の反応である請求項１０記載の方法。
13. １３．炎症が遅延型の過敏反応である請求項１０記載の方法。
14. １４．炎症が自己免疫疾患の症状である請求項１０記載の方法。