RU2287580C2 - Рекомбинантный рецептор коллагена на тромбоцитах гликопротеин vi и его применение в фармацевтике - Google Patents
Рекомбинантный рецептор коллагена на тромбоцитах гликопротеин vi и его применение в фармацевтике Download PDFInfo
- Publication number
- RU2287580C2 RU2287580C2 RU2001132140/13A RU2001132140A RU2287580C2 RU 2287580 C2 RU2287580 C2 RU 2287580C2 RU 2001132140/13 A RU2001132140/13 A RU 2001132140/13A RU 2001132140 A RU2001132140 A RU 2001132140A RU 2287580 C2 RU2287580 C2 RU 2287580C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gpvi
- collagen
- platelets
- platelet
- glycoprotein
- Prior art date
Links
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 40
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- -1 carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 7
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 108010089485 convulxin Proteins 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 102100038394 Platelet glycoprotein VI Human genes 0.000 description 3
- 101710194982 Platelet glycoprotein VI Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 102000009268 Collagen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- HVIBGVJOBJJPFB-OFQRNFBNSA-N Gly-Pro-Hyp Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)C(O)CC1 HVIBGVJOBJJPFB-OFQRNFBNSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000002473 artificial blood Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 108010017349 glycyl-prolyl-hydroxyproline Proteins 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010064773 platelet membrane glycoprotein VI Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 101710122462 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229940123228 Collagen inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000271538 Crotalus durissus Species 0.000 description 1
- 241000271533 Crotalus durissus terrificus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010056764 Eptifibatide Proteins 0.000 description 1
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100025305 Integrin alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010017642 Integrin alpha2beta1 Proteins 0.000 description 1
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010648 Natural Killer Cell Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010077854 Natural Killer Cell Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004422 Phospholipase C gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010056751 Phospholipase C gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101710099833 Venom protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960004468 eptifibatide Drugs 0.000 description 1
- GLGOPUHVAZCPRB-LROMGURASA-N eptifibatide Chemical compound N1C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCNC(=N)N)NC(=O)CCSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H]1CC1=CN=C2[C]1C=CC=C2 GLGOPUHVAZCPRB-LROMGURASA-N 0.000 description 1
- UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N ethenamine Chemical compound NC=C UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940083124 ganglion-blocking antiadrenergic secondary and tertiary amines Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010005808 hementin Proteins 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N hydroxymaleic acid group Chemical group O/C(/C(=O)O)=C/C(=O)O UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005404 magnetometry Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M potassium bisulfate Chemical compound [K+].OS([O-])(=O)=O CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000719 purinergic P2Y receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 235000020374 simple syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N tetrahydropyridine hydrochloride Natural products C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/018—Platelets
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4728—Details alpha-Glycoproteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/22—Haematology
- G01N2800/222—Platelet disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицине. Получена ДНК, кодирующая гликопротеин VI (GPVI). На ее основе с помощью методов рекомбинантных ДНК синтезирован рекомбинантный GPVI, который затем использован для создания фармацевтических композиций, обладающих способностью ингибировать или блокировать взаимодействие тромбоцитов и коллагена. Применение изобретения обеспечивает получение GPVI в рекомбинантной форме и применение данного продукта для терапевтического назначения. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Изобретение относится к гликопротеину VI (GPVI), его выделению, очистке и способу получения рекомбинантными методами. В частности, изобретение относится к применению GPVI, предпочтительно - рекомбинантного GPVI, для лечения расстройств и патологий, которые либо непосредственно, либо косвенным образом связаны с такими расстройствами коагуляции крови, как тромбозные и сердечно-сосудистые заболевания. Внеклеточный рекомбинантный протеин можно также применять для скрининга на предмет потенциальных ингибиторов связанного с мембраной GPVI с целью ингибирования взаимодействия тромбоцитов с коллагеном. На протяжении времени жизни тромбоцита в естественных условиях (in vivo) GPVI на его поверхности видоизменяется и может быть использован как маркер для определения возраста тромбоцита.
Гликопротеин VI представляет собой гликопротеин 62/65 кДа (невосстановленный/восстановленный соответственно) мембраны тромбоцита, который образует комплекс с общей субъединицей Fcγ. Субъединица GPVI содержит сайт, связывающий коллаген, а субъединица Fcγ. ответственна за сигнализацию. Этот комплекс является одним из основных рецепторов коллагена на поверхности тромбоцита, ответственных за активирование тромбоцита по отношению к коллагену. Распознавательная последовательность на коллагене состоит из последовательностей (GlyProHyp)n. Известны пациенты из Японии с генетическим дефицитом GPVI. У них проблемы со свертываемостью крови и их тромбоциты весьма слабо реагируют на коллаген, вероятно, через другие рецепторы. Было обнаружено, что сигнальные каскады GPVI нежизнеспособны; эти каскады имеют большое сходство с сигнальными каскадами иммунных рецепторов, в том числе рецепторов Т-клеток, В-клеток и рецепторов природных клеток-убийц. Эти каскады включают группу src тирозинкиназ, таких как Fyn и Lyn, а также p72SYK и многие другие тирозинкиназы, фосфатазы и адаптер типа LAT. Главное назначение этих каскадов - активация фосфолипазы Сγ2, которая расщепляет фосфолипиды на вторые молекулы диацилглицерола и IP3. Предполагается, что GPVI вовлечен в активацию интегрина α2β1 тромбоцита, который играет главную роль в адгезии тромбоцитов с поврежденной стенкой сосуда. Мыши с "выключенной" субъединицей Fcγ. имеют тромбоциты, которые по-прежнему реагируют на коллаген, откуда следует, что состояние покоя α2р1 тоже должно регулироваться комплексом GPVI/Fcγ.
Рецептор коллагена GPVI тромбоцитов тесно связан с активаторными рецепторами семейства p58KAR природных убийц и с FcαR.
Адгезия и активация покоящихся тромбоцитов, циркулирующих на поврежденном участке сосуда, - первый шаг в процессе, который приводит к образованию тромба, который преобразуется в кровоостанавливающую пробку. Коллаген - один из главных компонентов стенки сосуда, ответственный за активацию тромбоцита. Существуют много типов коллагена, и семь из них обнаружены в субэндотелиальных слоях. На тромбоцитах идентифицированы несколько различных рецепторов коллагена, однако в настоящее время главными считаются интегрин α2β1 и неинтегрин GPVI. Притом, что α2β1 всесторонне изучены, и обе субъединицы были клонированы и секвенированы несколько лет назад, структура GPVI остается невыясненной, хотя определены некоторые ее свойства. Около двадцати лет назад было установлено, что GPVI - главный гликопротеин тромбоцита; он имеет массу в интервале 60-65 кДа и кислотное pi. Его роль как предполагаемого рецептора коллагена была установлена после того, как обнаружилось, что тромбоциты у пациента из Японии с плохой свертываемостью крови имеют специфический дефект - они слабо реагируют на коллаген и у них отсутствует названный рецептор. Кроме того, у этого пациента имелись аутоантитела для отсутствующего рецептора, при помощи которых оказалось возможным определить и другие характеристики молекулы. Позднее было установлено, что GPVI образует нековалентную связь с общей субъединицей Fcγ, которая функционирует как сигнальная часть комплекса. Кроме того, было показано, что распознающая GPVI последовательность коллагена представляет собой повторяющийся триплет Gly-Pro-Hyp внутри тройной спирали структуры коллагена, и что основанные на этой структуре синтетические пептиды можно использовать как специфические в отношении GPVI агонисты. Установлено, что комплекс GPVI/Fcγ подает сигнал внутренней части тромбоцита посредством иммунного механизма рецепторного типа, включающего активацию p72SYK, и вызывает каскад взаимодействий киназа/фосфатаза/адаптер протеина, что приводит к активации PCLγ2 и, следовательно, к освобождению гранул и агрегации тромбоцитов. Следующий шаг в выяснении характеристик этой молекулы был сделан, когда обнаружилось, что змеиный лектин С-типа, конвулксин тропической гремучей змеи Crotalus durissus terrificus может активировать тромбоциты путем кластеризации GPVI в ходе многомерного взаимодействия. Было показано, что конвулксин образует специфическую связь с GPVI, что позволило на этой основе разработать методику очистки данного рецептора.
Из всего сказанного следует, что соединение GPVI представляет большой интерес для многих терапевтических сфер, и его особенно важные применения относятся к сфере, которая связана непосредственно или косвенным образом с коагуляцией крови, которая зависит от коллаген-тромбоцитных взаимодействий. В связи с этим цель настоящего изобретения состояла в получении GPVI в рекомбинантной форме и в том, чтобы продемонстрировать его эффективность в прямом терапевтическом назначении, а также - как инструмента для скрининга коротких соединений, в особенности - синтезированных или синтезируемых химически соединений, с возможностью ингибировать или блокировать взаимодействие между природными тромбоцитом и коллагеном. Изобретение относится также к долям или фрагментам протеина GPVI, сохранившим свою биологическую активность, которая выражается в способности образовывать связи с коллагеном.
Изобретение было успешно осуществлено в плане очистки адекватных количеств GPVI для предварительного исследования и секвенирования пептидов. Последовательности были использованы с целью конструирования праймеров для PCR, чтобы идентифицировать положительную последовательность в библиотеке ДНК. Эту последовательность ДНК далее использовали в качестве детектора для выделения из библиотеки почти полной последовательности кДНК, а недостающая 5'-последовательность была получена методом RACE из библиотеки кДНК тромбоцитов.
Изобретение было успешно осуществлено также в плане демонстрации применения рекомбинантных GPVI в качестве терапевтически применимого соединения, которое способно при его назначении, например, пациенту с поврежденными кровеносными сосудами, связывать коллаген и, таким образом, предотвращать появление тромбоцитов со связанными с мембраной GPVI, которые появляются при образовании связей с названным коллагеном. Растворимый рекомбинантный внеклеточный домен GPVI содержит связывающий коллаген сайт и может предотвращать активацию тромбоцита коллагеном. Таким образом, его можно применять для лечения проявлений заболеваний, вызывающих повышенную активацию тромбоцитов коллагеном, таких как атеросклеротическое разрушение тромбоцитов, при таких заболеваниях, как нестабильная стенокардия, или в процессе хирургической операции, такой как подкожная трансиллюминационная коронарная ангиопластика (РТСА), при которой возобновляют проходимость артерий путем введения баллонного катеттера, что приводит к значительному повреждению стенок сосудов и активации большого количества тромбоцитов, что часто обуславливает впоследствии их повторную закупорку. Преимущество применения рекомбинантных фрагментов GPVI по сравнению с существующими методами лечения состоит в том, что они начинают действовать на более ранней стадии путем предотвращения или замедления активации тромбоцитов, а не путем подавления эффектов, возникающих в результате активации тромбоцитов, таких как агрегация антагонистами GPIIb-IIIa. Таким образом, высвобождается меньшее количество содержимого тромбоцитных гранул, включая факторы роста и хемокины, которые участвуют не только в заживлении ран, но и в реконструкции стенки сосуда за счет перемещения гладкой мускулатуры, а также в привлечении фагоцитных клеток - таких, как моноциты, которые стимулируют атеросклероз. В тех же целях и с аналогичным эффектом для блокирования GPVI на поверхности тромбоцита можно применять фрагменты Fab приближенных к человеческим мышиных моноклональных антител против GPVI.
Рекомбинантные GPVI по данному изобретению можно применять также в связывающем анализе коллагена для скринирования маленьких молекул (например, в комбинаторных библиотеках), которые могут ингибировать это взаимодействие и которые можно применять для получения терапевтических соединений, являющихся ингибиторами взаимодействия коллагена с тромбоцитами. Путем соответствующей дериватизации эти соединения можно сделать пригодными для орального приема. Главной целью данного изобретения является получение соединений, уменьшающих взаимодействие GPVI-коллаген и, следовательно, активацию тромбоцита в ситуациях, когда возникает контакт тромбоцитов с коллагеном. Технология скрининга, подобная используемой в данном изобретении, хорошо обоснована в прототипе. При использовании такого скрининга изобретение позволяет обнаруживать и получать новые мишени, которые способны, как антагонисты коллагена, ингибировать образование природных связанных с мембраной GPVI на поверхности тромбоцита. Такие мишени, которые могут представлять собой маленькие химические молекулы, могут создать основу для дальнейших изобретений.
Другое важное применение GPVI и реагентов, которые распознают специфические домены GPVI, - это их применение в качестве маркеров возраста и функциональности тромбоцита. Предполагается, что в общем случае молодые тромбоциты более активны и функциональны, чем они старшие. Конвулксин - пектин С-типа из змеиного яда - связывает и активирует молодые тромбоциты, поскольку он специфичен по отношению к GPVI, однако, по мере старения тромбоцитов это связывание и степень активации снижаются. Это может происходить за счет либо протеолитических, либо конформационных изменений GPVI или его ассоциатов с Fcγ. в результате активации тромбоцита или нарушений циркуляции. Это может оказаться полезным параметром для измерения при медицинском обследовании возрастных и функциональных профилей тромбоцитов у пациентов и у здоровых людей. Возрастные профили тромбоцитов изменяются при многих заболеваниях, поражающих костный мозг или иммунную систему и, если будут разработаны лучшие методы для их определения, могут стать важным критерием в диагностике. Например, у пациентов с заболеваниями, которые сопряжены с ускоренным обновлением тромбоцитов, должно наблюдаться сравнительно большое количество молодых тромбоцитов, в то время как у пациентов, которые проходят курс химиотерапии или облучения, будет преобладать более взрослая популяция. Таким образом, подобные возрастные профили можно использовать для четкого контролирования процесса лечения. В отношении здорового населения о распределении возрастных профилей и их роли в качестве прогнозирующего параметра известно очень мало. Неизвестно, происходят ли изменения в GPVI за счет частичного вовлечения тромбоцитов в события кровоостанавливания, и будут ли изменения более выраженными у пациентов с обширным сердечно-сосудистым заболеванием. В настоящее время для определения молодых сетчатых тромбоцитов, содержащих мРНК, используется тиазоловый оранжевый. Эта мРНК быстро убывает, ограничивая применимость метода только самыми молодыми тромбоцитами. Реагенты, которые следовало бы применять в таком анализе, должны включать специфические по отношению к GPVI протеины змеиного яда, такие как конвулксин, или моноклональные, либо поликлональные антитела, распознающие области N-концов GPVI, или моноклональные антитела, распознающие новые сайты или структуры, обусловленные протеолизом доменов концов N, либо специфические структуры, присутствующие только в неповрежденных молекулах и отсутствующие в старых молекулах или наоборот, или маленькие химические объекты, выбранные для специфической идентификации неповрежденных GPVI, либо его модифицированной формы. Эти реагенты могут быть помечены флюоресцентным маркером или вторым антителом с флюоресцентной меткой, либо реагентом со специфическим сродством; их можно применять проточной цитометрией для измерения профилей связывания тромбоцитов. На последующей стадии, альтернативно можно внедрить менее трудоемкую методику с использованием аппаратуры для автоматического измерения профилей тромбоцитов. При помощи таких методов сортировки клеток, как проточная цитометрия или магнитометрия, окажется возможным выделять молодые и старые тромбоциты для изучения факторов, воздействующих на удаление из системы циркуляции старых тромбоцитов. Для подобных исследований ключевыми являются реагенты, распознающие специфические формы GPVI.
Таким образом, предметом настоящего изобретения является кодирование ДНК для Гликопротеина VI или их биологически активных фрагментов, особенно - последовательности, представленной на Фиг.2.
Другим предметом настоящего изобретения является кодирование ДНК для Гликопротеина VI, включающего аминокислотные последовательности, представленные на Фиг.1a и 1b.
Следующим предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, включающая эффективное рекомбинантный GPVI совместно с разбавителем, приемлемым с точки зрения фармацевтики, носитель или эксципиент, и ее применение для производства лекарств для лечения тромбозных и сердечно-сосудистых заболеваний, а также нарушений, связанных с взаимодействием тромбоцитов с коллагеном. Эта фармацевтическая композиция наряду с указанным протеином может содержать другие известные из уровня техники фармацевтически активные соединения, пригодные для лечения вышеуказанных заболеваний и нарушений
Кроме того, предметом данного изобретения является применение рекомбинантного GPVI в качестве инструмента скринирования - для определения специфических ингибиторов взаимодействий тромбоцитов с коллагеном.
Еще одним предметом данного изобретения является применение GPVI в качестве маркера возраста тромбоцита и для обнаружения сердечно-сосудистых заболеваний.
Возможными медицинскими показаниями и назначениями соответственно являются, например, нестабильная стенокардия, РТСА, введение стентов, операции на сердечных сосудах, общие операции на кровеносных сосудах, операции, которые могут привести к повреждению более крупных кровеносных сосудов, такие как операции на тазобедренных суставах. Кроме того, сюда входят все показания, которые связаны с тромбоэмболическими явлениями, обусловленными расстройствами взаимодействий стенки сосуда с коагуляционной системой, что обуславливает высокую степень риска образования тромбов и блокирования сосудов.
Как показано выше, протеины GPVI и их фрагменты по данному изобретению пригодны для применения в качестве фармацевтически эффективных соединений в фармацевтических композициях и комбинациях.
Фармацевтические рецепты по данному изобретению могут включать дополнительные активные ингредиенты, например антикоагулянты, такие как гирудин или гепарин, либо тромболитические агенты, такие как активатор плазминогена или гементин, либо антагонисты другим рецепторам тромбоцита, например антагонисты GPIIb-IIIa, такие как абциксимаб или эптифибатид, либо антагонисты ADP-рецептора, такие как клопидогрель.
По данному изобретению новый протеин и его биологически активные фрагменты соответственно могут образовывать фармацевтически приемлемые соли с любыми нетоксичными органическими или неорганическими кислотами. В качестве неорганических кислот могут быть использованы, например, соляная, бромистоводородная, серная или фосфорная, а также кислые соли металлов, такие как моногидрогенортофосфат натрия и гидрогенсульфат калия. Примерами органических кислот являются моно-, би- и трикарбоксильные кислоты типа уксусной, гликолевой, молочной, пировиноградной, малоновой, янтарной, глутариловой, фумаровой, яблочной, виннокаменной, лимонной, аскорбиновой, малеиновой, гидроксималеиновой, бензойной, гидроксибензойной, фенилуксусной, коричной, салициловой и сульфоновые кислоты типа метансульфоновой кислоты. Соли карбоксиконцевых компонентов аминокислот включают нетоксичные соли карбоновой кислоты, которые образуются в их реакции с любыми подходящими неорганическими или органическими основаниями. В эти соли могут входить, например, щелочные металлы, такие, как натрий и калий, щелочноземельные металлы, такие как кальций и магний, легкие металлы группы IIIA, включая алюминий, и органические первичные, вторичные и третичные амины, такие как триалкиламины, включая триэтиламин, прокаин, дибензиламин, 1-этенамин, N,N'-дибензилэтилендиамин, дигидроабиэтиламин и N-алкилпиперидин.
В контексте данного изобретения, термин "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает инертный, нетоксичный твердый или жидкий наполнитель, растворитель или капсулирующий материал, который не вступает в реакции с действующим соединением или с организмом пациента. Подходящие, предпочтительно жидкие, носители хорошо известны в фармацевтике, к ним относятся, например, стерильные вода, физраствор. жидкая декстроза, сахарные сиропы, этанол, гликоли и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое, соевое и минеральные масла.
Препараты с рецептурой по данному изобретению можно назначать в виде единичных доз, содержащих подходящие нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, растворители, вспомогательные лекарственные вещества и связующие, которые обычно используются в фармацевтике для парентеральных назначений.
Термин "парентеральный" охватывает подкожные, внутривенные, внутрисуставные и внутритрахеальные инъекции, а также инфузионные методы. Возможны также оральные назначения и местное применение. Парентеральные составы и комбинации наиболее предпочтительно назначать внутривенно или в виде пилюль, а также в виде постоянной фузии по известной методике. Таблетки и капсулы для оральных назначений содержат подходящие эксципиенты, такие как связующие вещества, наполнители, растворители, таблетирующие вещества, смазочные компоненты, дезинтегрирующие агенты и увлажнители. На таблетках можно формировать покрытия по известным фармацевтическим методикам.
Жидкие оральные препараты можно назначать в виде водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов и эликсиров; они могут быть представлены также сухим веществом, предназначенным для разведения перед приемом в воде или в другом подходящем носителе. Такие жидкие препараты могут содержать подходящие добавки типа суспендирующих или эмульгирующих агентов, неводных носителей и консервантов. Препараты для местного применения могут быть водными или масляными суспензиями, растворами, эмульсиями, желе, или - что предпочтительно - мазями.
Единичные дозы по настоящему изобретению могут содержать необходимые суточные количества протеина по данному изобретению или их кратные части, из которых можно скомбинировать суточную дозу. Оптимальная терапевтически приемлемая дозировка и дозы, которые требуются конкретному пациенту (млекопитающие, включая человека), зависят от множества факторов, таких как степень активности, связанная с видом деятельности пациента, его возраст, вес, общее состояние здоровья, пол, диета, время и курс назначения препарата, объект лечения, т.е. терапия или профилактика, природа тромбозного заболевания, степень выраженности антитромбоцитной или антикоагуляционной активности.
В составах и комбинациях, показанных для конкретного пациента (in vivo) в качестве антикоагулянтов, фармацевтически эффективная суточная доза пептидов по данному изобретению варьируется в диапазоне от примерно 0,01 до 100 мг/кг веса тела, предпочтительно - от 0,1 до 10 мг/кг веса. В зависимости от способа применения одна доза может содержать от 0,5 до 10 мг ингибитора коллагена. Чтобы достичь антикоагуляционного эффекта в искусственной крови, фармацевтически эффективное количество пептидов по данному изобретению составляет от 0,2 до 150 мг/л искусственной крови, предпочтительно - от 1 до 20 мг/л.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Протеиновая последовательность GPVI (однобуквенный код):
1а: Лидирующая последовательность
1b: Зрелый протеин
Открытая рамка считывания: 339 аминокислот
| Звездочка: | Сайт гликозилирования |
| Двойное подчеркивание: | Трансмембранный домен |
| Подчеркивание: | Секвенированные пептиды |
Фиг.2. Нуклеотидная последовательность GPVI, охватывающая открытую рамку считывания из 1017 п.о. плюс области 3" и 5', в общей сложности - 1249 п.о.
Подробное описание изобретения
Для синтеза праймеров ДНК были выбраны две последовательности из 7 аминокислот с минимальной вырожденностью генетического кода с целью укрупнения при помощи кДНК участка GPVI в реакции PCR. Поскольку, в общем случае, локализация обоих пептидов в протеине не была известна, для каждого из них были приготовлены два вырожденных праймера - один смысловой и один антисмысловой. Эти праймеры были использованы для расширения библиотеки человеческого костного мозга. Комбинация смыслового праймера 5'TYA THC CNG CAN TGA ARMG 3' кодирует последовательность PAMKRSL, а антисмысловой праймер 5'TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3' соответствует укрупненному DQFALYK фрагменту ДНК из 221 пар основ Дополнительно к выбранным пептидам амплифицированная ДНК кодирует LysC/AspN пептидной DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS, посредством чего связывает последовательность с кДНК для GPVI.
Скрининг 600000 pfu из библиотеки костного мозга при помощи этого фрагмента ДНК из 221 пар основ позволил получить 4 положительных pfu. Три из них имели вставки из 1350 пар основ, обрезанные рестриктазами Sal I или EcoR I и принадлежащие к надсемейству IgG. Четвертая имела вставку 4,6 тысячи гетероциклических оснований нуклеотидов нуклеиновой кислоты, полученную в результате расщепления при помощи Sal I, и после обработки EcoRI предоставила два фрагмента из 2300 пар основ и 1300 пар основ соответственно. Ее ДНК кодировала последовательность для 10 пептидов, полученных в результате аминокислотного секвенирования GPVI, но с оборванными аминоконцами. Не было обнаружено ни исходного метионина, ни лидирующей последовательности, однако присутствовали более 2000 пар основ предварительно секвенированной несчитывающей рамки ДНК, заканчивающейся последовательностью Alu. Эксперимент RACE с концом 5′ был проведен на поли- А РНК тромбоцита с праймерами, локализованными во фрагменте последовательности GPVI, усиленной пептидными последовательностями. До возврата к установленной последовательности GPVI были обнаружены Фрагмент из 348 пар основ, включающий 278 пар основ последовательности четвертого клона и 70 новых пар основ из 1987 пар основ, соответствующих 14 аминокислотам, включая первый метионин. Таким образом, оказалось возможным секвенировать кДНК, содержащую, в общей сложности, 1249 пар основ, последовательность 5' из 25 пар основ, предшествующую стартовому кодону, открытую рамку считывания из 1017 пар основ, кодирующих протеин, включая лидирующую последовательность из 339 аминокислот и области 3' из 207 пар основ, включая стоп-кодон.
С целью восполнить недостающую последовательность 5' была клонирована кДНК, кодирующая GPVI тромбоцита; клонирование и секвенирование осуществляли из библиотеки кДНК человеческого костного мозга при помощи RACE с мРНК тромбоцита. Открытая рамка считывания из 1017 пар основ кодирует 339 аминокислот и нетранслируемую область 3'. При анализе гидрофобности аминокислотных последовательностей полученного протеина было обнаружено присутствие двух предположительно трансмембранных доменов, предположительно сигнальной последовательности из 20 аминокислот и домена между остатками 247 и 265, состоящего из 19 аминокислот. Последовательность и ее аминокислотная трансляция показаны на фиг.2 и 1. Сравнение с аминокислотными последовательностями наиболее похожих молекул из банка генов с очевидностью свидетельствует, что полученная последовательность относится к надсемейству иммуноглобулина, а внеклеточные домены - две спирали Ig домена С2, образованные двумя дисульфидными мостиками. Одна из молекул относится к классу проникающих через мембрану протеинов с концами N на поверхности и проходит через мембрану однократно. Молекулы с наиболее короткими связями относятся к классу рецепторов природных убийц, в котором содержатся как ингибиторы, так и активаторы. Очевидно, что GPVI относятся к подклассу активаторов не только в связи с их функцией, но и потому, что они, в отличие от молекул класса ингибиторов, не содержат последовательность ITIM в своих цитоплазматических доменах. Кроме того, они не содержат каких-либо тирозиновых остатков, которые могли бы быть вовлечены в фосфорилирование. В этом домене присутствует некоторое количество треониновых и сериновых остатков, но они не соответствуют критериям для последовательностей общих типичных элементов структуры киназы. Как и рецепторы NK класса активаторов, GPVI содержит агрининовый остаток в качестве третьей аминокислоты проникающего через мембрану домена, который принимает участие в образовании комплекса с субъединицей Fcγ. Цитоплазматический домен содержит 51 аминокислоту и имеет только весьма небольшое сходство (в области, которая находится непосредственно под мембраной) с цитоплазматическими доменами других членов этого семейства. Соответственно, следует ожидать, что этот домен в GPVI может ассоциироваться скорее с другими типами цитоплазматических молекул, чем с остальными членами семейства. GPVI содержит только единственный предположительно N-гликозилирующий сайт на Asn69. Тем не менее домен, который находится непосредственно над мембраной после бета-слоев конца домена Ig, содержит много тиониновых и сериновых остатков, которые могут предоставлять сайты O-гликозилирования, аналогичные обнаруженным в GPIbα и GPV. Основной функцией этого O-гликозилирования представляется поставка рецепторных структур, распространяющихся далеко от поверхности тромбоцита, что облегчает взаимодействия с их объемистыми лигандами. Поскольку ранее GPVI был идентифицирован как сиалогликопротеин, то различие молекулярных масс между теоретическим значением массы аминокислот (37 кДа) и значением, полученным при помощи гель-электрофореза (65 кДа восстановленного вещества), должно объясняться этим гликозилированием.
При помощи рентгенокристаллографического анализа была установлена структура рецепторов природных убийц двух типов доменов и было показано, что два домена Ig образуют острый угол с рецепторным сайтом для несущих пептид антигенов HLA, расположенным с наружной части угла. Прямое сравнение структуры сайта, связывающего пептиды HLA, со структурой коллагена позволяет сделать вывод об общих истоках этих рецепторов, поскольку повторяющиеся альфа-спиралеобразные структуры сайта, связывающего HLA и пептиды, которые он содержит, чрезвычайно похожи на тройную спиральную структуру коллагена. Постулируется, что рецепторы природных убийц действуют по механизму димеризации, при помощи двух рецепторов, которые распознают два отдельных сайта HLA на клетке, которую исследует клетка-убийца. Возможно, что эта димеризация является частью механизма активации или дезактивации в зависимости от класса рецептора. В случае GPVI должна существовать возможность, что две молекулы GPVI будут объединяться с одной Fcγ., поскольку каждый мономер димера Fcγ. имеет распознающую последовательность. Тем не менее, стехиометрия пока неизвестна, и, основываясь на структуре коллагенов, можно предположить, что сила сигнала коллагеноподобных пептидов, которые действуют через GPVI и конвулксин, зависит от количества объединившихся комплексов GPVI/Fcγ. В число других рецепторов тромбоцита, принадлежащих к этому семейству Ig, входят ICAM-2 (CD102) и РЕСАМ (CD31).
Все микроорганизмы, колонии клеток, происходящие от одного общего предка, системы экспрессии, хозяева экспрессии, плазмиды, промоторы, резистивные маркеры, источники репликации, сайты рестрикции или другие фрагменты и части векторов, которые упомянуты в описании, не имеют непосредственного отношения к предмету данного изобретения они имеются в продаже и общедоступны. Если не оговорено особо, эти материалы используются исключительно как образцы, не имеют значения для сущности изобретения, и могут быть заменены другими инструментами и биологическими материалами.
Методики, которые требуется использовать по данному изобретению, подробно описаны выше и ниже. В отношении других методов, которые широко известны, подробное описание здесь отсутствует, но представлены ссылки на соответствующие патенты и литературные источники, где они описаны достаточно подробно (например, Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor; Harlow, Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor).
ПРИМЕРЫ
Материалы - протеин А-сефароза, соединенные с пероксидазой, козьи антимышиные и антикроличьи антитела, альбумин бычьей сыворотки, яд Crotalus durissus temficus, агглютинин зародышей пшеницы (WGA), 4% зерненная арагоза с поперечными связями, активированная N-гидроксисукцинимидилхлорформиатом и Triton Х-114, приобретенные у Sigma Chemical Co. (St Louis, МО), октанол-N-метилглюкамид (ONMG) и нонаноил-N-метилглюкамид (NNMG) от Oxyl Chemie (Bobingen, Germany).
Пример 1: Выделение GPVI из тромбоцитов - мембранные гликопротеины выделяли из тромбоцитов по описанной ранее методике. Вкратце, тромбоциты (из 40 светлых слоев кровяного сгустка) промыли и растворили в 2% Triton X-114 в присутствии ингибиторов протеазы. Отделили Triton X-114 от водной фазы и детергентную фазу загрузили в колонку агглютинина зародышей пшеницы, связанного с сефарозой 4 В. Гликопротеины тромбоцитов элюировали посредством 10 мМ трис HCl, рН 7,4, 30 мМ NaCl, 0,2% октаниол-N-метилглюкамидом (ONMG) и 2% N-ацетилглюкозамином. После диализа и концентрирования раствор гликопротеинов загрузили в колонку конвулксина, связанного с 4% зерненной арагозой с поперечными связями (1 мг/мл), активированной N-гидроксилсукцинамидил-р-нитрофенилхлорформиатом. Колонку промывали 4 объемами 10 мМ трис HCl, рН 7,4, 30 мМ NaCl, 0,2% нонаноил-N-метилглюкамида (NNMG), после этого - 4 объемами 10 мМ трис HCl, рН7,4, 30 мМ NaCl и 2% NNMG. GPVI элюировали 0,08% раствором SDS в 10 мМ трис HCl, рН 7,4. Раствор сконцентрировали и загрузили в препаративный гель 8,5% полиакриламида; использовали установку Model 491 Prep Cell (BioRad, CA). Препаративный электрофорез проводили при условиях, описанных в инструкции производителя установки, которые здесь не приводятся. В результате элюирования GPVI получили единственную полосу при 65 кДа. Фракции отстаивали, концентрировали на установке Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) и повторно суспензировали в 10 мМ трис HCl, рН7,4 и 0,1% ONMG.
Пример 2: Анализ аминокислот GPVI - GPVI переваривали эндопротеиназами LysC и AspN (Boenringer Mannheim, Germany). Полученные 10 пептидов разделили при помощи жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) с обращенными фазами и секвенировали на импульсном жидкофазном секвенаторе протеина Applied Biosystem модели 477А, объединенном с фенилтиохидантоиловым анализатором аминокислот модели 120А.
Пример 3: Амплификация фрагмента из 221 п.о., кодирующего участок GPVI из библиотеки кДНК λ gt11 -
Образец (1010 pfu) (бляшкообразующее число) из библиотеки человеческого костного мозга (Clonetech, Palo Alto, CA) был амплифицирован с использованием двух комбинаций из 4 вырожденных праймеров. Конечная концентрация праймеров составляла 2 мкМ, концентрация dNTP была 200 мкМ и использовали 2 U/100 мкл реакционного AmpliTag Gold (Perkin Elmer, Rotkreuz, Switzerland). Условия проведения PCR были следующими: 5 циклов при 37°С, затем 30 циклов при 44°С. Смысловой 19mer 5' TYATHCCNGCNATGAARMG 3' и антисмысловой 20mer 5' TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3' амплифицировали фрагментом из 221 пар основ, который был субклонирован в Bluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) и секвенировали с использованием секвенатора Т7 Sequenase kit (Amersham, Switzerland).
Пример 4: Скрининг библиотеки кДНК λgИ1 с использованием образца GPVI с 221 пар - Фрагмент из 221 пар основ оторвали от плазмиды, очистили и пометили α32Р-АТР (20 МВк/50 мкл, Hartmann Analytik, Braunschweig, Germany) при использовании High Prime Labelling kit (Boehringer Mannheim, Switzerland). Скрининг библиотеки человеческого костного мозга производили в соответствии с инструкциями производителя установки. Выращивали положительные фаги, выделяли их ДНК и субклонировали в BlueScript с использованием сайтов либо EcoRI, либо Sal I, и затем - секвенировали. Секвенирование производили с использованием системы ABS RACE - Platelet, поли- А РНК получали по описанной ранее методике (Power и др., Cytokine 7, 479-482, 1995). Обратную транскрипцию (30 мкл) осуществляли при использовании 5 мкг поли- А РНК с праймером 5'TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3' (20 мкм), dNTP (1 мМ), PHKsin (40 U), буфером 1Х AMV и 20 U обратной транскриптазы AMV в течение 20 мин при 45°С, затем в течение 20 мин при 52°С. Далее реакционную смесь обработали при помощи 2 мкл 6N NaOH при 65°С в течение 30 мин, нейтрализовали с использованием 2 мкл 6N уксусной кислоты и сконцентрировали в Centricon 30 (Amicon). Якорь был привязан к первой нити ДНК по системе Aptes и Siebert (BioTechniques 15: 890-893, 1993). Внутригенную PCR провели с использованием праймера, дополнительного к якорю, и праймера 5'TTGTACAGAGCAAATTGGTC 3' (35 циклов, 55°С), затем с праймером 5'GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3' (30 циклов при 53°С). Самая высокая полоса (350 пар основ) была отделена электрофорезом в агарозе от более низких, далее ее субклонировали в BlueScript, затем секвенировали.
Пример 5: Получение анти-GPVI Fab и F(ab')2 - поликлональную антисыворотку против человеческого GPVI вырабатывали в кроликах. IgG из кроличьей антисыворотки анти-GPVI очистили, как описано ранее. Для получения фрагментов Fab произвели расщепление IgG при помощи иммобилизованного папаина (Pierce) в соответствии со стандартной методикой поставщика. Фрагменты Fab отделили от нерасщепленных IgG и фрагментов Fc с использованием колонки с иммобилизованным Протеином Protein A (Sigma). Проточную ячейку преобразовали в диализную трубку, произвели концентрирование при помощи твердого полиэтиленгликоля 20000 и провели диализ до конца на фоне 20 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 4 мМ KCI, pH 7,4 и сохраняли продукт при 4°С до его использования. Фрагменты F(ab')2 получали при помощи расщепления пепсином из IgG при соотношении фермента и основы 1:50 (вес/вес), в 0,5 М ацетатном буфере, pH 4,0, при 37°С в течение 18 часов. Далее довели pH до 7,4 при помощи разбавленной NaOH и подвергли образец диализу на фоне 20 мМ фосфата, pH 7,4. Фрагменты F(ab')2 отделили от нерасщепленных IgG и фрагментов Fc при помощи хроматографии с Протеином А. Проточную ячейку преобразовали в диализную трубку, произвели концентрирование при помощи твердого полиэтиленгликоля 20000 и осуществляли интенсивный диализ на фоне 20 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 4 мМ KCI, pH 7,4; полученный продукт сохраняли в аликвотных количествах при -20°С. Промытые тромбоциты растворили в Triton X-114 и произвели разделение фаз на растворимом материале с последующим выделением мембранных гликопротеинов, ассоциированных с фазой Triton X-114, методом аффинной хроматографии на агглютинин-сефарозе зародышей пшеницы 4В по описанной ранее методике. Поскольку GPVI представляет весьма малую фракцию отстоя гликопротеинов мембраны тромбоцитов, для выделения этого рецептора использовали специфичность змеиного лектина С-типа конвулксина. Аффинная хроматография на конвулксине, связанном с сефарозой 4В, позволила получить в качестве основного продукта протеин 65 кДа. При этом совместно с GPVI были элюированы неисследованные материалы с более высокими или более низкими Mr, которые нельзя было удалить при помощи тщательной промывки колонки. Поэтому в качестве завершающего этапа очистки был произведен препаративный гель-электрофорез на 8,5% полиакриламиде. После отстоя фракции, содержащие GPVI, обнаружили при повторном анализе единственную полосу. Очищенный GPVI подвергли испытаниям на предмет его способности блокировать агрегацию тромбоцитов коллагеном. При добавлении к суспензии тромбоцитов аликвотных растворов GPVI наблюдали слабый ингибирующий эффект. Однако после предварительного инкубирования GPVI с коллагеном последующее добавление его к суспензии тромбоцитов оказывало ингибирующий эффект, степень которого зависела от вводимой дозы GPVI. Агрегация тромбоцитов возобновлялась после введения новой порции коллагена. При невосстанавливающихся условиях выделенный протеин имел Mr 62 кДа со сдвигом в сторону несколько более высоких Мг (65 кДа) при восстановительных условиях. Поскольку было обнаружено, что аминные концы GPVI блокированы, произвели расщепление протеина ферментами LysC и LysC/AspN, в результате было получена 4 и 6 пептидов соответственно, из которых была получена последовательность. Разделение пептидов осуществили при помощи HPLC с обращенными фазами на колонке С4, затем секвенировали по методу Edman. Аминокислотные последовательности подчеркнуты на фиг.1, где представлена транслированная последовательность кДНК.
Фрагмент ДНК, кодирующий первые 187 аминокислот зрелого рецептора GPVI (3 и 4 экзоны), амплифицировали с помощью ПЦР посредством считывания информации полимеразой с кДНК GPVI полной длины с использованием праймеров 5'CTTGGATCCGATTGAGGGACGCCAGAGTGGACCGCTCCC 3'- (смысловой) и
5'TGCGGACCTTAGGTTCCTGTGACCACAAG 3 (антисмысловой). [ДНК фрагмент 687 п.о.]. Последовательность ДНК для сайта расщепления фактором Ха ввели в смысловой праймер для удаления 6 х гистидинового - tag, кодируемого вектором. ПЦР фрагмент ввели в плазмиду pQE31 (Quiagen), полученной конструкцией трансформировали Е.coli M 15 [pREP4]. Для экспрессии трансформированные E.coli выращивали в виде серий в 5-ти литровом ферментере 0,9D600 после введения 0,2% лактозы. После 4 часов E.coli собирали, выделяли тела включения и медленно растворяли в Трис/фосфатном буфере, содержащем 6М гуанидин/HCl (рН 8,0) и супернатант помещали на Ni-NTA колонку (Quiangen). Колонку промывали сразу после элюирования 6 х His-tag протеином в Трис/фосфатном буфере, содержащем 6 М гуанидиниум/HCl при 5,1. Анализы элюированного пика с помощью гель-электрофореза показал основную полосу при 26 кДа и несколько отдельных пиков со значительно меньшей молекулярной массой. Рекомбинантный фрагмент GPVI инкубировали с DTT для снижения количества дисульфидных связей, образующихся в Е.coli. Восстановление складчатости инициировали посредством постепенного добавления буфера для восстановления складчатости (40 мМ NaHPO4, рН 8,0,150 мМ NaCl, 10% глицерин, 0,01% CHAPS и восстановленный глутатион GSH/окисленный глутатион GSSG) с объединением элюированных из колонки Ni-NTA фракций. После восстановления складчатости и диализов рекомбинантный фрагмент GPVI очищали посредством хроматографии на сефарозе Q. Гистидин-tag расщепляли фактором Ха. Очищенный рекомбинантный фрагмент GPVI мигрировал на SDS-PAGE геле при 26 кДа при восстанавливающих условиях и при 24 кДа при невосстанавливающих условиях и обладал чистотой >97%. Прединкубация рекомбинантного протеина GPVI с коллагеном блокирует агрегацию тромбоцитов в зависимости от дозы (IC50 мкг/мл).
Фиг.3. Рекомбинантный фрагмент GPVI, полученный из различных серий E.coli, выделяют с помощью гель-электрофореза SDS-PAGE на 15% полиакриаламиде при восстанавливающих условиях (линии 2, 3, 4) или невосстанавливающих условиях (линии 5 и 6). Четкий сдвиг в миграции при восстановлении показывает правильную складчатость и формирование дисульфидных мостиков. Для тестирования способности рекомбинантного GPVI блокировать коллагеновую активацию тромбоцитов образцы очищали и концентрировали, 4 мкг рекомбинантного GPVI заполняли в случае 1 полосы.
Фиг.4. Агрегацию тромбоцитов ингибировали посредством инкубации коллагена с фрагментом рекомбинантного GPVI до агрегации. Агрегацию осуществляли в агрегометре (Labinhtec, Montpellier, Франция) с растворенными тромбоцитами (5×108 тромбоцитов/мл) рессупендировали в 10 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 5 мМ глюкозного буфера, рН 7,4, в присутствии 2 мМ Ca2+ и 2 мМ Mg2+. В контрольном эксперименте 1 мкм/мл коллагена добавляют в перемешанную суспензию тромбоцитов с индуцированием быстрой агрегации тромбоцитов. В. Агрегация тромбоцитов полностью ингибируется, когда 1 мг/мл коллагена прединкубируют с 5 мг/мл рекомбинатного GPVI.
Claims (6)
1. ДНК, кодирующая Гликопротеин VI или его биологически активные фрагменты, которая частично или полностью содержит последовательность, представленную на фиг.2.
2. ДНК, которая кодирует Гликопротеин VI и имеет последовательность, представленную на фиг.2.
3. ДНК по пп.1 и 2, которая кодирует Гликопротеин VI, который содержит аминокислотную последовательность, представленную на фиг.1а и 1b.
4. Рекомбинантный Гликопротеин VI как медицинский препарат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную на фиг.1b, и кодируемый ДНК по п.2.
5. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать или блокировать взаимодействие тромбоцитов и коллагена и включающая эффективное количество протеина по п.4 и фармацевтически приемлемые растворитель, носитель или их эксципиенты.
6. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать или блокировать взаимодействие тромбоцитов и коллагена и включающая эффективное количество протеина по п.4 и других фармакологически активных соединений, а также фармацевтически приемлемые растворитель, носитель или их эксципиенты.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99109094 | 1999-05-07 | ||
| EP99109094.5 | 1999-05-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001132140A RU2001132140A (ru) | 2003-08-10 |
| RU2287580C2 true RU2287580C2 (ru) | 2006-11-20 |
Family
ID=8238132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001132140/13A RU2287580C2 (ru) | 1999-05-07 | 2000-04-25 | Рекомбинантный рецептор коллагена на тромбоцитах гликопротеин vi и его применение в фармацевтике |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US7928066B1 (ru) |
| EP (3) | EP1177289B1 (ru) |
| JP (2) | JP5480457B2 (ru) |
| KR (1) | KR100703592B1 (ru) |
| CN (1) | CN1253569C (ru) |
| AR (1) | AR023848A1 (ru) |
| AT (1) | ATE393223T1 (ru) |
| AU (1) | AU775952B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0010325B1 (ru) |
| CA (1) | CA2372515C (ru) |
| CY (2) | CY1108190T1 (ru) |
| CZ (1) | CZ302693B6 (ru) |
| DE (1) | DE60038675T2 (ru) |
| DK (2) | DK2341141T3 (ru) |
| ES (2) | ES2534652T3 (ru) |
| HK (1) | HK1045714B (ru) |
| HU (1) | HUP0201049A2 (ru) |
| MX (1) | MXPA01011274A (ru) |
| NO (1) | NO333408B1 (ru) |
| PL (1) | PL204449B1 (ru) |
| PT (2) | PT2341141E (ru) |
| RU (1) | RU2287580C2 (ru) |
| SI (1) | SI1177289T1 (ru) |
| SK (1) | SK15762001A3 (ru) |
| WO (1) | WO2000068377A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200110071B (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7928066B1 (en) | 1999-05-07 | 2011-04-19 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Recombinant platelet collagen receptor glycoprotein vi and its pharmaceutical use |
| US20040001826A1 (en) | 1999-06-30 | 2004-01-01 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| US6245527B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-06-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules encoding glycoprotein VI and recombinant uses thereof |
| US7291714B1 (en) * | 1999-06-30 | 2007-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| AU7097400A (en) * | 1999-09-01 | 2001-03-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Platelet membrane glycoprotein vi (gpvi) dna and protein sequences, and uses thereof |
| EP1224942A1 (en) * | 2001-01-23 | 2002-07-24 | Bernhard Dr. Nieswandt | Use of JAQ1 (monoclonal antibody anti GPVI) as a medicament for the protection against thrombotic diseases |
| JP2005511005A (ja) * | 2001-07-18 | 2005-04-28 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 糖タンパク質ｖｉ融合タンパク質 |
| US7531178B2 (en) | 2002-06-07 | 2009-05-12 | Trigen Gmbh | Immunoadhesin comprising a glycoprotein VI domain |
| EP1369128A1 (en) | 2002-06-07 | 2003-12-10 | Procorde GmbH | Inhibitors of glycoprotein VI and their therapeutic use |
| US20070071744A1 (en) | 2002-06-07 | 2007-03-29 | Gotz Munch | Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI |
| DE102004017295A1 (de) * | 2004-04-05 | 2005-11-03 | Zlb Behring Gmbh | Verbindungen, welche die Entfernung von Rezeptoren von Zelllmembranen bewirken oder verhindern, und Verfahren zu ihrem Nachweis |
| WO2005111083A2 (en) | 2004-04-29 | 2005-11-24 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Antibodies specific for glycoprotein vi and methods of producing these antibodies |
| US7645592B2 (en) | 2004-04-29 | 2010-01-12 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Glycoprotein VI antibodies and methods of use thereof |
| US20090041783A1 (en) | 2005-04-28 | 2009-02-12 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody |
| AU2008319336A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Uses of a glycoprotein VI (GPVI) inhibitor |
| EP2694709B1 (en) | 2011-04-08 | 2016-09-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
| EP3184544A1 (en) * | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Glycoprotein v inhibitors for use as coagulants |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3742429B2 (ja) | 1993-07-01 | 2006-02-01 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | コラーゲン刺激血小板凝集の阻害剤 |
| WO1995011259A1 (en) * | 1993-10-22 | 1995-04-27 | Ellerman Pharmaceuticals Limited | Platelet-derived growth factor analogues |
| WO1998031806A2 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Fc RECEPTORS AND POLYPEPTIDES |
| WO1998032771A1 (fr) * | 1997-01-29 | 1998-07-30 | Toray Industries, Inc. | Proteines chimeres, complexes heterodimeres de ces proteines et substituant de plaquette |
| US7928066B1 (en) | 1999-05-07 | 2011-04-19 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Recombinant platelet collagen receptor glycoprotein vi and its pharmaceutical use |
| US20040001826A1 (en) | 1999-06-30 | 2004-01-01 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| US6245527B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-06-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules encoding glycoprotein VI and recombinant uses thereof |
| US7291714B1 (en) * | 1999-06-30 | 2007-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
| AU7097400A (en) * | 1999-09-01 | 2001-03-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Platelet membrane glycoprotein vi (gpvi) dna and protein sequences, and uses thereof |
| JP2005511005A (ja) | 2001-07-18 | 2005-04-28 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 糖タンパク質ｖｉ融合タンパク質 |
| EP1538165A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-08 | Procorde GmbH | Inhibitors of glycoprotein VI based on monoclonal antibody hgp 5c4 |
-
2000
- 2000-04-25 US US09/959,802 patent/US7928066B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-25 DE DE60038675T patent/DE60038675T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-25 PL PL351437A patent/PL204449B1/pl unknown
- 2000-04-25 JP JP2000616343A patent/JP5480457B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-25 SI SI200030996T patent/SI1177289T1/sl unknown
- 2000-04-25 RU RU2001132140/13A patent/RU2287580C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-04-25 CN CNB008072922A patent/CN1253569C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-25 AU AU45555/00A patent/AU775952B2/en not_active Ceased
- 2000-04-25 DK DK11001216T patent/DK2341141T3/en active
- 2000-04-25 CA CA2372515A patent/CA2372515C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-25 AT AT00927035T patent/ATE393223T1/de active
- 2000-04-25 PT PT110012168T patent/PT2341141E/pt unknown
- 2000-04-25 EP EP00927035A patent/EP1177289B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-25 ES ES11001216.8T patent/ES2534652T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-25 MX MXPA01011274A patent/MXPA01011274A/es active IP Right Grant
- 2000-04-25 CZ CZ20013989A patent/CZ302693B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-04-25 DK DK00927035T patent/DK1177289T3/da active
- 2000-04-25 BR BRPI0010325A patent/BRPI0010325B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-04-25 HU HU0201049A patent/HUP0201049A2/hu unknown
- 2000-04-25 ES ES00927035T patent/ES2304347T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-25 SK SK1576-2001A patent/SK15762001A3/sk unknown
- 2000-04-25 EP EP08004264.1A patent/EP1942186B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-25 WO PCT/EP2000/003683 patent/WO2000068377A1/en active IP Right Grant
- 2000-04-25 KR KR1020017014164A patent/KR100703592B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-04-25 EP EP11001216.8A patent/EP2341141B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-25 PT PT00927035T patent/PT1177289E/pt unknown
- 2000-05-04 AR ARP000102136A patent/AR023848A1/es unknown
-
2001
- 2001-11-06 NO NO20015420A patent/NO333408B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 ZA ZA200110071A patent/ZA200110071B/xx unknown
-
2002
- 2002-09-26 HK HK02107061.7A patent/HK1045714B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-21 US US11/689,392 patent/US20070172480A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-21 US US11/689,385 patent/US8198030B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-07-11 CY CY20081100731T patent/CY1108190T1/el unknown
-
2010
- 2010-12-20 JP JP2010283409A patent/JP5554696B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-03-11 US US13/046,210 patent/US8278430B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-04-09 CY CY20151100344T patent/CY1116336T1/el unknown
-
2016
- 2016-03-08 US US15/064,157 patent/US20160207976A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JANDROT-PERRUS MARTINE ET AL, J. Biol. Chem., 1997, vol.272, no.43, стр.27035-27041. XP 002143942 ISSN: 0021-9258. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8198030B2 (en) | Recombinant platelet collagen receptor glycoprotein VI and its pharmaceutical use | |
| EP1754719A2 (en) | Anti-osteopontin antibody and use thereof | |
| CN1344318A (zh) | 用于防止血小板粘附的蛋白 | |
| US5219994A (en) | Inhibitor of tissue factor activity | |
| JP4212651B2 (ja) | サソリ由来神経ペプチド | |
| RU2138275C1 (ru) | Ингибиторы тромбина, способы их получения и фармацевтическая композиция на их основе | |
| EP3077048A1 (en) | Compositions and methods of treating thrombosis | |
| JPH0578391A (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
| WO1992022580A1 (fr) | Nouvel agent inhibiteur de l'adhesion de neutrophiles d'origine humaine et composition pharmaceutique contenant cet agent | |
| JPH0570489A (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
| JPH0570490A (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
| JPH0570491A (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
| JPH0570486A (ja) | ペプチドおよびその塩 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180426 |