KR20010112951A - 재조합 혈소판 콜라겐 수용체 당단백질 ｖｉ및 이의제약학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당단백질 VI (GPVI), 이의 단리, 정제 및 재조합체 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 GPVI, 바람직하게는 재조합 GPVI 의 혈전증 및 심혈관 질환과 같은 혈액응고 장애에 직간접적으로 상관된 병리학적 이벤트 및 장애의 치료에서의 용도에 관한 것이다. 또한 세포외 재조합 단백질을 막결합 GPVI 의 잠재적 억제제를 찾아 혈소판 및 콜라겐의 결합작용을 억제시키기 위한 스크리닝 검정을 확립하는데 사용할 수 있다. GPVI에서의 변화는 혈전증 및 심혈관 질환에 대한 노출 및 혈소판 노화을 모니터하는데 사용할 수 있다.

Description

재조합 혈소판 콜라겐 수용체 당단백질 ＶＩ 및 이의 제약학적 용도 {RECOMBINANT PLATELET COLLAGEN RECEPTOR GLYCOPROTEIN VI AND ITS PHARMACEUTICAL USE}
본 발명은 당단백질 VI (GPVI), 이의 단리, 정제 및 재조합체 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 GPVI, 바람직하게는 재조합 GPVI 의 혈전증 및 심혈관 질환과 같은 혈액응고 장애에 직간접적으로 상관된 병리학적 이벤트 및 장애의 치료에서의 용도에 관한 것이다. 또한 세포외 재조합 단백질을 막결합 GPVI 의 잠재적 억제제를 찾아 혈소판과 콜라겐의 상호작용을 억제시키기 위한 스크리닝 검정을 확립하는데 사용할 수 있다. 혈소판 표면 상의 GPVI 는 혈소판 노화동안 생체 내에서 개질되어 혈소판 노화 프로필의 마커로서 사용할 수 있다.
당단백질 VI 는 Fcγ공통 서브유니트와 함께 복합체를 형성하는 62/65kDa (각각 비환원/환원됨)혈소판 막 당단백질이다. GPVI 서브유니트는 콜라겐 결합 부위를 포함하고, Fcγ서브유니트는 시그널링에 관계한다. 복합체는 콜라겐에 반응하여 혈소판을 활성화시키는데 중요한, 혈소판 표면 상의 주 콜라겐 수용체중 하나를 형성한다. 콜라겐 상의 인식 서열은 (GlyProHyp)n 서열로 구성된다. GPVI 이 유전적으로 결핍된 환자가 일본에서 알려졌다. 이들은 경도의 출혈 문제를 가지며, 이들의 혈소판은 추정컨데 다른 수용체를 통해, 단지 약하게 콜라겐에 반응한다. T-세포 수용체, B-세포 수용체 및 천연 킬러 세포 수용체를 포함하는 면역 수용체 유래의 시그널 캐스케이드를 상당히 닮은 GPVI 에서 시발하는 시그널링 캐스케이드에 관하여 상당히 많은 것들이 알려졌다. 이러한 캐스케이드는 p72SYK뿐만아니라 Fyn 및 Lyn 과 같은 src 계 티로신 키나아제 및 많은 다른 티로신 키나아제 및 포스파타아제 및 어답터 단백질, 예컨대 LAT 를 수반한다. 이러한 캐스케이드의 주표적은 인지질을 절단하여 2 차 메신저 디아실글리세롤 및 IP3를 생성시키는 포스포리파아제 Cγ2의 활성화이다. GPVI 는 손상된 혈관벽에의 혈소판의 부착에서 주요한 역할을 하는 혈소판 인테그린 α2β1 의 활성화에 관여하는 것으로 여겨진다. Fcγ서브유니트가 "녹아웃된(knocked-out)" 마우스는 여전히 콜라겐에 대한 반응을 보이는 혈소판을 갖고, 이는 α2β1의 휴지상태가 또한 GPVI/Fcγ복합체에 의해 조절될 수 있음을 의미한다.
혈소판 콜라겐 수용체 GPVI 는 FcαR 뿐만 아니라 p58KAR 계의 천연 킬러 활성 수용체와 밀접한 관련이 있다.
순환하는 휴지 혈소판의 혈관 손상 부위에서의 부착 및 활성화는 지혈 플러그로 전환되는 혈전의 형성을 가져오는 프로세스의 첫 단계이다. 콜라겐은 혈소판 활성화의 원인이 되는 혈관벽의 주성분 중의 하나이다. 많은 유형의 콜라겐이 존재하고, 이들중 7 개가 내피하층에서 발견된다. 콜라겐에 대한 여러 다른 수용체가 혈소판 상에서 확인되었으나, 주요한 것들은 현재 인테그린 α2β1 및 비스인테그린 GPVI 인 것으로 여겨진다. 비록 α2β1 이 잘 특징화되어 있고, 양 서브유니트가 수 년 전에 클로닝 및 서열화되었으나, GPVI 의 구조는 비록 여러 특징들이 확인되었으나 여전히 확실치 않다. GPVI 가 분자량이 60-65 kDa 이고 산 pI 를 갖는 주요한 혈소판 당단백질인 것이 약 20 년전에 결정되었다. 추정의 콜라겐 수용체로서의 이의 역할은 혈소판이 콜라겐에 대한 반응의 특이적 결핍을 보이고 이러한 수용체가 부족한, 경도의 출혈 장애를 가지는 일본 거주의 환자의 확인후 확립되었다. 이 환자는 또한 결핍 수용체에 대한 자가항체를 발현시켰고, 이는 추가로 분자를 특징화하는데 사용되었다. 좀더 최근에, GPVI가 복합체의 시그널링 부분으로 작용하는 공통 Fcγ서브유니트와 비공유결합적으로 결합됨이 확립되었다. 또한 GPVI 에 대한 콜라겐 상의 인식서열은 콜라겐 3 중 나선 구조내 반복 Gly-Pro-Hyp 트리플렛이고, 이러한 구조를 기반으로 하는 합성 펩티드는 특이적 GPVI 지시성(directed) 아고니스트로서 사용될 수 있음이 입증되었다. GPVI/Fcγ 복합체는, p72SYK의 활성화를 포함하고, 키나아제/포스파타아제/어답터 단백질 상호작용의 캐스케이드에 의해 PLCγ2 를 활성화시켜 과립의 방출 및 혈소판 응집화를 가져오는 면역 수용체 유사 메카니즘에 의해 혈소판 내부로 신호를 보내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 분자의 특징화에서의 추가의 단계는 열대성 방울뱀 (Tropical Rattlesnake (Crotalus durissus terrificus)) 유래의 뱀 C-형 렉틴, 컨불신이 다량체 상호작용을 통해 GPVI 를 덩어리지게 함으로써 혈소판을 활성화시킬 수 있음의 입증이었다. 컨불신은 GPVI 에 특이적으로 결합함이 밝혀졌고 이는 확립된 연구법과 함께 이러한 수용체의 정제 방법을 제공한다.
따라서, GPVI 는 무엇보다도 콜라겐-혈소판 상호작용에 좌우되는 혈액 응고이벤트에 직간접으로 연관된 용도에 관하여 많은 치료 분야에서 매우 흥미로운 화합물인 것으로 보이는 것은 선행 기술로부터 분명하다. 따라서, 본 발명의 목적은 재조합체 형태로 GPVI 를 제공하고, 직접적인 치료 표적 또는 쇼트(short) 화합물, 특히 자연적인 혈소판-콜라겐 상호작용을 억제 또는 차단하는 능력을 가진 화학적으로 합성된 또는 합성가능한 화합물의 스크리닝 도구로서의 이의 효능을 밝히는 것이다.
본 발명은 또한 콜라겐에 대한 결합인 이들의 생물학적 활성을 유지하는 GPVI 단백질의 일부 또는 단편에 관한 것이다.
본 발명은 예비 특징화 및 펩티드 서열화를 위해 적당량의 GPVI 를 정제하는데 성공하였다. 서열은 DNA 라이브러리에서 양성 서열을 동정하기 위하여 PCR 용 프라이머를 디자인하는데 사용하였다. 이어서 이러한 DNA 서열을 프로브로 사용하여 라이브러리로부터 거의 완전한 cDNA 서열을 단리하였고, 누락된 5'-서열은 혈소판 cDNA 라이브러리로부터 RACE 방법을 이용하여 수득하였다.
또한 본 발명은, 예컨대 손상된 혈관을 가진 환자에게 투여하는 경우, 콜라겐에 결합하여 막결합 GPVI 를 보유한 혈소판이 상기 콜라겐에 결합하는 것을 방해할 수 있는 치료학적으로 적용가능한 화합물로서의 재조합 GPVI 의 용도를 보여주는데 성공하였다. GPVI 의 재조합 가용성 세포외 영역은 콜라겐 결합 부위를 포함하고, 콜라겐에 의한 혈소판 활성화를 방해할 수 있다. 따라서, 불안정한 협심증과 같은 질환에서, 아테롬성경화증성 플라크 파열과 같은 콜라겐과의 증가된혈소판 활성화를 수반하는 질환 상태의 치료에, 또는 혈과벽에 상단한 손상을 야기하는 벌룬 카테터의 팽창에 의해 동맥이 재개방되고, 더 많은 혈소판이 활성화되며, 종종 후에 혈관의 재폐쇄를 가져오는, 경피적경혈관관상동맥확장술 (Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty (PTCA))과 같은 외과치료동안 적용가능하다. 현재의 치료방법과 비교하여 재조합 GPVI 단편의 이점은, 이것은 GPIIb-IIIa 길항제에 의한 응집화와 같은 혈소판 활성화 후의 이벤트를 억제하는 것보다 혈소판 활성화를 예방 또는 감소시켜 초기 단계에서 작용한다는 것이다. 따라서, 상처 회복뿐만 아니라 평활로 이동에 의한 혈관벽의 리모델링 및 아테롬성경화증에 기여하는 것으로 공지된 단핵구와 같은 식세포의 유인에 관여하는 케모카인 및 성장인자를 포함하는 더 적은 양의 혈소판 과립 내용물이 방출된다. GPVI 에 대한 인간화 마우스 모노클로날 항체의 Fab 단편을 사용하여 유사한 효과로 전술한 바와 같은 유사한 적용에 의해 혈소판 표면 상의 GPVI 를 차단할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 재조합 GPVI 는 상기 상호작용을 억제할 수 있고, 콜라겐-혈소판 상호작용의 억제제인 치료학적 화합물을 개발하는데 사용할 수 있는 소형 분자를 스크리닝 (예컨대 조합된 라이브러리에서)하기 위한 콜라겐에 대한 결합 검정에 사용할 수 있다. 적당한 유도체화를 통해, 이러한 화합물을 경구용으로 제조한다. 다시, 본 발명의 주 목적은 GPVI-콜라겐 상호작용을 감소시켜, 혈소판이 콜라겐과 접촉하게 되는 상황에서 혈소판의 활성화를 감소시키는 화합물을 제조하는 것이다. 본 발명에서 사용하는 바와 같은 스크리닝 기술은 선행기술에 잘 확립되어 있다. 이러한 스크리닝 검정을 통해 본 발명은 콜라겐 길항제로서혈소판 표면상의 천연 막결합 GPVI 를 억제할 수 있는 새로운 표적을 발견 및 개발할 수 있다. 이어서 소형의 화학적 분자일 수 있는 이러한 표적은 추가 발명을 위한 기초가 될 수 있다.
GPVI 및 GPVI 의 특이적 영역을 인식하는 시약의 또 하나의 주요한 용도는 혈소판 노화 및 기능성의 마커로서의 용도이다. 젊은 혈소판은 통상적으로 노쇠한 혈소판보다 좀더 활동적이고 기능적인 것으로 생각된다. 젊은 혈소판은 GPVI 에 특이적인, 뱀 독 C-형 렉틴 컨불신에 결합하고 이에 의해 활성화되며, 이들이 쇠퇴함에 따라 결합 및 활성도는 감소한다. 이는 GPVI 에서의 단백질분해적 변화 또는 구조변화에 인한 것일 수 있거나, 또는 순환중 혈소판의 활성화 또는 손상에 인한 이의 Fcγ과의 결합에 인한 것일 수 있다. 이것은 의료적 컨트롤동안 정상인뿐만 아니라 환자에서 혈소판의 노화 및 기능 프로필을 측정하는데 유효한 파라미터일 수 있다. 혈소판 노화 프로필은 골수 또는 면역계에 영향을 미치는 많은 질병들에서 변화될 수 있으며, 만일 이의 측정을 위한 더 나은 방법이 이용될 수 있다면 중요한 진단 표준일 수 있다. 예컨대, 증가된 혈소판 교체를 수반하는 질병의 환자는 좀더 젊은 혈소판을 보이는 반면, 화학치료 또는 방사선 치료를 받는 환자는 꾸준히 노화되는 집단을 보일 것이다. 따라서, 이러한 노화 프로필은 치료의 정확한 모니터링에 사용될 수 있다. 정상의 건강한 집단에서는 노화 프로필 분포 및 건강에서의 변화의 전조로서의 이의 역할에 대하여 거의 알려진 바가 없다. GPVI 에서의 변화가 혈전증에서의 혈소판의 부분적 관여로 인한 것인지, 그리고 변화가 광범위한 심혈관질환 환자에서 좀더 두드러질 수 있는 것인지 알려진 바 없다. 현재 티아졸 오렌지가 mRNA 를 함유하는 젊은 망상 혈소판을 검출하는데 사용된다. 이러한 mRNA 는 곧 쇠퇴되어, 이 방법은 아주 어린 혈소판에 대해서만 적용된다. 이러한 검정에서 사용될 수 있는 시약에는 컨불신과 같은 GPVI-특이적 뱀 독 단백질, 또는 GPVI 의 N-말단 영역을 인식하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 온전한 분자에는 존재하나 노쇠한 분자에는 존재하지 않는 또는 이의 반대로 존재하는 특이적 구조 또는 N-말단 영역의 단백질 분해로 노출된 세로운 구조 또는 부위를 인식하는 모노클로날 항체 또는 온전한 GPVI 또는 이의 개질형을 특이적으로 인식하도록 선택된 소형의 화학적 엔티티(entity)가 포함된다. 이러한 시약은 형광 마커로, 또는 형광 표지된 이차 항체 또는 친화성 시약과 함께 표지되어, 유동 세포 계산에서 사용되어 혈소판 결합 프로필을 측정한다. 대안적인 후속단계 에서, 혈소판 프로필의 자동화 측정을 기반으로 하는 덜 노동집약적인 측정 기술을 채택할 수 있다. 유동 세포계산 또는 자기 비드를 수반하는 세포 분류 방법을 이용하여, 젊은 혈소판 및 노쇠한 혈소판을 분리시켜 순환에서 노쇠한 혈소판을 제거하는데 관여하는 인자를 조사할 수 있어야 한다. GPVI 의 특이적 형태를 인식하는 시약은 이러한 조사의 키이의 역할을 할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 당단백질 VI 또는 이의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 DNA, 특히 도 2 의 서열을 제공하는 것이다.
또한 도 1a 및 1b 의 아미노산 서열을 포함하는 당단백질 VI 를 코딩하는 DNA 를 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 재조합 GPVI 를 함유하는 제약학적 조성물 및 혈소판-콜라겐 상호작용과 관련된 혈전증 및 심혈관 이벤트 및 장애의 치료 분야에서 약제의 제조를 위한 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 혈소판-콜라겐 상호작용의 특이적 억제제를 검출하기 위한 스크리닝 도구에서의 재조합 GPVI 의 용도이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 혈소판 노화 및 심혈관질병에의 노출에 대한 마커로서의 GPVI 의 용도이다.
각각 가능한 의약적 예시 및 용도는, 예컨대 불안정한 협심증 펙토리스, PTCA, 이러한 분야에서의 스텐트(stent)의 용도, 관상 혈관에 대한 수술, 혈관에 대한 일반적 수술, 엉덩이 관절 수술과 같은 더 큰 혈관을 손상시킬 수 있는 수술이다. 더욱이, 혈전의 형성 및 혈관의 차단의 높은 위험을 수반하는 혈관벽과 응고 시스템 사이의 상호작용의 장애로 야기되는 혈전색전증과 관련된 모든 예시가 포함된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 GPVI 단백질 및 이의 단편은 제약학적 조성물 및 배합물에서 제약학적으로 유효한 화합물로서 적합하다.
본 발명에 따른 제약학적 제형물은 임의적으로 예컨대 항응고제, 히루딘 또는 헤파린 또는 플라미노겐 활성화제 또는 헤멘틴과 같은 혈전융해제, 또는 다른 혈소판 수용체에 대한 길항제, 예컨대 abciximab 또는 eptifibatide 과 같은 GPIIb-IIIa 길항제 또는 ADP-수용체 길항제, 예컨대 clopidogrel 과 같은 추가의활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 각각의 신규의 단백질 및 이의 생물학적 활성 단편은 임의의 비독성 유기 또는 무기 산과 제약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 무기산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산 및 산금속염, 예컨대, 소듐 모노하이드로겐 오르토포스페이트 및 황산수소나트륨을 들 수 있다. 유기산의 예로는 모노, 디 및 트리 카르복실산, 예컨대, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 히드록시말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산 및 술폰산, 예컨대, 메탄술폰산을 들 수 있다. 카르복시 말단 아미노산 부분의 염에는 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기와 형성된 비독성 카르복실산 염이 포함된다. 이러한 염의 예에는 알칼리 금속, 예컨대, 소듐 및 포타슘, 알칼리 토금속, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘, 알루미늄을 포함한 IIIA 족의 경금속, 및 유기 일차, 이차 및 삼차 아민, 예컨대, 트리에틸아민을 포함한 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 디히드로아비에틸아민 및 N-알킬피페리딘이 포함된다.
여기에서 사용하는, 용어 "제약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 화합물 또는 환자와 부작용을 일으키지 않는 불활성, 비독성 고형물 또는 액형 충진제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 예컨대, 증류수, 식염수, 수성 덱스트로오즈, 당용액, 에탄올, 글리콜 및 페트롤륨, 동물성유, 식물성유 또는 합성유, 예컨대 땅콩유, 대두유 및 광물유를 포함한 오일과 같은 적합한, 바람직하게는 액형 담체가 당해 기술에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 제형물은 비경구 투여에 전형적인 통상의 비독성이고 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보조제 및 비히클을 함유하는 단위 용량으로 투여할 수 있다.
용어 "비경구" 에는 피하, 정맥내, 관절내 및 기관내 주사 및 주입 기술이 포함된다. 또한 경구 투여 및 국부적 적용과 같은 다른 투여방법이 적합하다. 비경구 조성물 및 배합물이 볼러스 형태로 또는 공지된 절차에 따른 일정한 주입으로 가장 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 경구 투여용 정제 및 캡슐은 통상의 부형제, 예컨대, 결합제, 충진제, 희석제, 정제화제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 함유한다. 정제는 당해 기술에 공지된 방법에 따라 코팅될 수 있다.
경구용 액체 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 일릭서의 형태일 수 있거나, 사용전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성시키는 건조 제품으로 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 통상의 첨가제, 예컨대, 현탁화제, 유화제, 비수성 비히클 및 방부제를 함유할 수 있다. 국부 적용은 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 젤리 또는 바람직하게는 에멀젼 연고의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 단위 용량은 1 일 필요량의 본 발명에 따른 단백질 또는 목부하는 용량을 채우기 위하여 이의 서브멀티플을 함유할 수 있다. 주어진 환자(인간을 포함한 포유류)에 대한 최적의 치료학적으로 허용가능한 투여량 및 용량 비율은 다양한 인자, 예컨대, 사용된 특정 활성 물질의 활성, 연령, 체중, 일반적 건강, 성, 식이, 투여 시간 및 경로, 제거율, 치료의 목적, 예컨대, 치료 또는 예방 및 치료코자하는 혈전 질환의 성질, 항혈소판 또는 항응고제 활성에 좌우된다.
따라서, 치료환자에서 항응고제로 유용한 조성물 및 배합물에서(생체내) 본 발명의 펩티드의 제약학적으로 유효한 1 일 용량은 약 0.01 내지 100mg/kg(체중), 바람직하게는 0.1 내지 10mg/kg 이다. 적용 형태에 따라, 단일 용량에는 0.5 내지 10mg 의 콜라겐 억제제가 함유될 수 있다. 체외 혈액에서 항응고 효과를 달성하기 위한, 본 발명의 펩티드의 제약학적으로 유효한 양은 0.2 내지 150mg/l(체외혈액), 바람직하게는 1 mg 내지 20 mg/l 이다.
도면의 간단한 설명
도 1: GPVI 의 단백질 서열 (1 문자 코드)
1a : 리더 서열
1b : 성숙한 단백질
개방 판독 프레임 : 339 아미노산
별표 : 글리코실화 부위
이중밑줄 : 막내외 영역
밑줄 : 서열화 펩티드
도 2: 1017bp 의 개방 판독 프레임 + 3' 및 5' 영역을 포함하는 GPVI 뉴클레오티드 서열 (총 1249 bp)
유전적 코드에서 최소의 축퇴를 보이는 7 아미노산의 2 개의 서열을 DNA 프라이머의 합성을 위해 선택하여 PCR 로 GPVI cDNA 의 일부를 증폭시켰다. 단백질에서 양 펩티드의 위치가 전혀 알려져 있지 않아, 이들의 각각에 대하여 2 개의 축퇴성 프라이머, 센스 및 안티센스 각각을 제조하였다. 이 프라이머를 사용하여 인간 골수 라이브러리를 증폭시켰다. 서열 PAMKRSL 을 코딩하는 센스 5' TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3' 프라이머와 DQFALYK 에 해당하는 안티센스 5'TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3' 프라이머를 조합시켜 221bp 의 DNA 단편을 증폭시켰다. 선택된 펩티드에 더해, 증폭된 DNA 는 LysC/AspN 펩티드 DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS 를 코딩하며, 확실하게 서열을 GPVI 에 대한 cDNA 에 결합시킨다.
상기 221 bp DNA 단편을 이용하여 골수 라이브러리로부터 600.000 pfu 를 스크리닝하여 4 개의 양성 pfu 를 생성시켰다. 3 개는 제한효소 SalI 및 EcoR I 로 절단되거나 되지 않은 1350bp 의 인서트를 가지며, IgG 슈퍼패밀리에 속한다. 4 번째의 것은 SalI 절단에 의해 4.6 kb 인서트를 가지며, EcoRI 로 처리시 각각 2300 bp 및 1300 bp의 두개의 단편을 생성시킨다. 이의 DNA 는 GPVI 의 아미노산 서열화으로부터 유래된 10 개의 펩티드에 대한 서열을 코딩하나 아미노산 말단의 앞에서 종결된다. 어느 출발 메티오닌 또는 리더 서열도 발견할 수 없었으나, Alu 서열에서 종결되는 2000bp 이상의 앞서 서열화된 비판독 프레임 DNA가 존재하였다. 5' 말단 RACE 실험은 펩티드의 서열에 의해 확인되었던 GPVI 서열의 일부에 위치하는 프라이머를 이용하여 혈소판 폴리 A RNA 에 대하여 완성하였다. 4 번째 클론의 서열상의 278bp 를 포함하는 348 bp 의 단편 및 1 번째 메티오닌을 포함하는 14 아미노산에 해당하는 1987 bp 유래의 새로운 70bp 가 확립된 GPVI 서열에 의지하기 전에 발견되었다. 따라서, 개시 코돈 상류의 25bp 5' 서열, 339 아미노산 서열을 갖는, 리더 서열을 포함한 단백질을 코딩하는 1017bp 의 개방 판독 프레임 및 종결코돈을 포함한 207bp 의 3' 영역을 포함하는 총 1249 bp의 cDNA 를 서열화시킬 수 있었다.
혈소판 GPVI 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하고, 혈소판 mRNA 와 함께 RACE 를 이용하여 인간 골수 cDNA 라이브러리로부터 서열화시켜, 누락된 5' 서열을 제공하였다. 1017 bp 의 개방판독 프레임은 339 아미노산 및 비번역된 3' 영역을 코딩하였다. 아미노산 서열의 소수성 분석으로 두개의 추정의 막내외 영역, 추정의 20 아미노산 시그널 서열, 및 성숙한 단백질의 잔기 247과 265 사이에 19 아미노산 영역의 존재가 밝혀졌다. 서열 및 이의 아미노산 번역은 도 2 및 1 에 나타내었다. GenBank 의 조사에서 발견된 가장 유사한 분자의 아미노산 서열과의 비교로, 이것은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, 세포외 영역은 두개의 디술피드 브릿지에 의해 형성된 두개의 Ig C-2 영역 루프를 포함하는 것이 명확히 밝혀졌다. 이것은 N-말단을 가진 하나의 분자가 외부에 존재하는 막통과 단백질 클래스로써 1 회 막을 통과한다. 가장 밀접하게 관련된 분자는 억제 및 활성 유형 모두를 포함하는 천연 킬러 수용체 클래스에 속한다. GPVI 는 이의 기능을 통해서뿐만 아니라 억제 클래스와는 다르게 이것은 이의 세포질 영역에서 ITIM 서열을 포함하지 않기 때문에 활성 서브클래스에 분명히 속한다. 이것 중 어느 것도 포스포릴화에 관여할 수 있는 어떠한 티로신 잔기도 포함하지 않는다. 이 영역에는 일부의 트레오닌 및 세린 잔기가 존재하나 이것은 키나아제 컨센서스 서열에 대한 어떠한 표준에도 맞지 않는다. NK 수용체의 활성 클래스와 같이, GPVI 는 Fcγ서브유니트와 복합체 형성에 관여하는 막 관통 영역의 세번째 아미노산으로서 아르기닌 잔기를 포함한다. 세포질 영역은 51 개의 아미노산을 함유하며, 이는 단지 이러한 패밀리의 다른 원의 세포질 영역에 대해 최소한의 유사성 (막 바로 아래의 영역에서)을 보인다. 이는 GPVI 에서의 상기의 영역이 다른 패밀리 원보다 상이한 유형의 세포질 분자와 결합할 수 있음을 시사한다. GPVI 는 Asn69 에서 단지 하나의 추정의 N-글리코실화 부위를 함유한다. 그러나, Ig 영역의 베타 쉬트가 끝난 후의 막의 바로 위의 영역은 GPIbα및 GPV 에서 발견되는 것과 같은 O-글리코실화 부위를 제공할 수 있는 트레오닌 및 세린 잔기가 풍부하다. 이러한 O-글리코실화의 주 기능은 벌크 리간드와의 상호작용을 촉진시키기 위하여 혈소판 표면으로부터 잘 연장된 수용체 표면을 제공하는 것으로 보인다. GPVI 가 시알로당단백질로 초기에 확립되었기 때문에, 이론적 아미노산양 (37kDa)과 겔 전기영동으로 측정한 양 (65kDa 감소)사이의 분자량 차이는 이러한 글리코실화로부터 기인하는 것이 틀림없다.
두개의 영역 유형의 천연 킬러 수용체의 구조는 X-선 결정학적 조사로 확립되었고, 두개의 Ig -영역은 엘보우 외측에 있는 펩티드 보유 HLA 항원에 대한 수용체 부위와 급격한 각을 형성하는 것으로 밝혀졌다. HLA 펩티드 결합 부위의 구조와 콜라겐의 구조의 직접적인 비교는 왜 이러한 수용체가 공통의 기원을 갖는지를 즉시 보여주는데, 이는 HLA 결합 부위의 다중 알파-나선 구조 및 이 결합부위가 포함하는 펩티드가 콜라겐의 트리플 나선 구조를 상당히 닮았기 때문이다.천연 킬러 수용체가 조사중인 세포상의 두개의 별개의 HLA 부위를 인식하는 두개의 수용체를 이용한 이량체화 메카니즘으로 작동하는 것으로 추측된다. 아마도 이 이량체화는 수용체의 클래스에 좌우되는, 활성화 또는 불활성화 메카니즘의 일부이다. GPVI 의 경우에는, Fcγ이량체의 각각의 단량체가 인식서열을 갖기 때문에, 두개의 GPVI 분자가 하나의 Fcγ와 결합할 가능성이 또한 존재한다. 그러나, 화학양론은 아직 알려져 있지 않고, 콜라겐의 구조, GPVI 를 통해 작용하는 콜라겐-유사 펩티드 및 컨불신을 기초로 하여, 이는 시그널의 강도가 함께 클러스터를 형성하는 GPVI/Fcγ복합체의 수와 관련되는 것으로 보인다. 상기 Ig 패밀리에 속하는 다른 혈소판 수용체에는 ICAM-2(CD102) 및 PECAM (CD31) 이 포함된다.
청구된 발명과 직접적으로 연관되지 않은 명세서에서 언급된 모든 미생물, 세포주, 발현 시스템, 발현 숙주, 플라스미드, 프로모터, 내성 마커, 복제 오리진, 제한 부위 또는 기타 단편 또는 벡터의 일부는 시중에서 구입하거나 또는 이와 달리 통상적으로 이용가능하다. 단, 다른 언급이 없는 한, 이것들은 단지 예로서 주어지는 것이며 발명과 관련하여 필수적인 것은 아니며, 다른 적합한 도구 및 생물학적 재료로 각각 대체될 수 있다.
본 발명에 기본적인 기술은 하기 및 상기에 상술되어 있다. 상술하여 기술되지 않은 다른 기술들은 당업자에게 잘 알려진 공지의 표준 방법에 해당하거나, 인용 문헌 및 특허출원 및 표준 문헌에 상세히 기술되어 있다 (예, Sambrook et al., 1989., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor; Harlow, Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor).
실시예
실시예 1:재료 - 프로테인 A-세파로오스, 퍼옥시다아제-접합 염소 항마우스 및 항-토끼 항체, 소혈청알부민, 크로탈러스 두리서스 테리피커스 (Crotalus durissus terrificus) 독, 소맥아 아굴루티닌(WGA), N-히드록시숙신이미딜 클로로포르메이트-활성화된 가교 4% 비드화 아가로오스 및 Triton X-114 는 Sigma Chemical Co. (St Louis, Mo)로부터 구입하였고, 옥타노일-N-메틸-글루카미드 (ONMG) 및 노나노일-N-메틸-글루카미드 (NNMG)는 Oxyl Chemie (Bobingen, Germany) 로부터 구입하였다.
실시예 2 : 혈소판으로부터 GPVI 분리- 막 당단백질을 전술한 바와 같이 혈소판으로부터 단리시켰다. 간략하게는, 혈소판 (40 버피 코트) 를 프로테아제 억제제의 존재하에 2% Triton X-114 에서 세정 및 용해시켰다. Triton X-114 및 수성상은 분리시키고, 세제 상을 Sepharose 4B 에 커플링된 소맥아 아굴루티닌의 컬럼에 부하하였다. 혈소판 당단백질을 10mM Tris HCl, pH 7.4, 30mM NaCl, 0.2% 옥타노일-N-메틸글루카미드 (ONMG) 및 2% N-아세틸글루코사민으로 용출시켰다. 투석 및 농축후, 당단백질의 용액을 N-히드록실숙신아미딜-p-니트로페닐 클로로포르메이트로 활성화된 가교 4% 비드화 아가로오스 (1 mg/ml)에 결합된 컨불신의 컬럼에 부하하였다. 컬럼을 4 부피의 10mM Tris HCl, pH7.4, 30mM NaCl, 0.2% 노나노일-N-메틸글루카미드 (NNMG)로 세정한 후, 4 부피의 1O mM Tris HCI, pH7.4, 30 mM NaCl 및 2% NNMG로 세정하였다. GPVI 를 10 mM Tris/HCI (pH 7.4)중 0.08% SDS 로 용출시켰다. 이 용액을 농축시킨 후, Model 491 Prep Cell (BioRad, CA)을 이용하여 8.5 % 폴리아크릴아미드의 분취 겔 상에 부하하였다. 분취 전기영동을 비환원 조건하에서 제조자의 지시에 따라 실행하였다. GPVI 는 65 kDa 에서 단일 밴드로 용출되었다. 분획을 풀링하고 Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA)에서 농축시킨 후, 10 mM Tris/HCl, pH7.4 및 0.1% ONMG 에 재현탁시켰다.
실시예 3 : GPVI 의 아미노산 분석- GPVI 를 엔도프로테인나아제 LysC 및 AspN (Boehringer Mannheim, Germany)로 절단하였다. 생성된 10 개의 펩티드를 역상 HPL 로 분리시킨 후, Applied Biosystem model 477A 펄스-액체-상 단백질 시퀀서에서 model 120A 온라인 페닐티오히단토인 아미노산 분석기를 이용하여 서열화하였다.
실시예 4 : λgt11 cDNA 라이브러리 유래의 GPVI 의 일부를 코딩하는 221 bp 단편의 증폭
인간 골수 라이브러리 (Clonetech, Palo Alto CA) 유래의 시료 (1010pfu)(plaque forming units) 를 4 개의 축퇴성 프라이머의 2 개의 조합물을 이용하여 증폭시켰다. 최종 프라이머 농도는 2μM 이었고, dNTP 농도는 200 μM 이었으며, 2 U/1OO ㎕ 반응 AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Rotkreuz, Switzerland)를 사용하였다. PCR 조건은 37℃ 에서 5회 사이클 후 44℃ 에서 30 회 사이클이었다. 센스 l9mer 5'TYATHCCNGCNATGAARMG3' 및 안티센스 20mer5'TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3' 는 Bluescript KS+(Stratagene, La Jolla, CA) 에 서브클론시킨 221bp 단편을 증폭시킨 후, T7 Sequenase kit (Amersham, Switzerland)를 이용하여 서열화되었다,
실시예 5: 221 bp GPVI 프로브를 이용한 λgt11 cDNA 라이브러리의 스크리닝- 221 bp 단편을 플라스미드로부터 절단 및 세정한 후, High Prime Labelling kit (Boehringer Mannheim, Switzerland)를 이용하여 α32P-ATP (20MBq/50 ㎕, Hartmann Analytik, Braunschweig, Germany)로 표지하였다. 인간 골수 라이브러리를 제조자의 지시에 따라 스크리닝하였다. 양성 파아지를 생육시키고, 이들의 DNA 를 단리한 후, EcoRl 또는 SalI 부위를 이용하여 BlueScript 에 서브클론시키고, 이어서 서열화시켰다. RACE 의 ABS 시스템을 이용하여 서열화를 수행하고- 혈소판 폴리 A RNA 를 전술한 바와 같이 제조하였다 (Power et al., Cytokine 7, 479-482, 1995). 역전사 (30 ㎕)을 5㎍ 의 폴리 A RNA 와 함께 프라이머 5'TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3'(20 μM), dNTP (1mM), RNAsin (40 U), 1X AMV 버퍼 및 20 U AMV 역전사효소를 사용하여 45℃ 에서 20분간 수행한 후, 52℃ 에서 20 분간 수행하였다. 반응 혼합물을 65℃에서 30분간 2㎕ 6N 수산화나트륨으로 처리한후, 2㎕ 6N 아세트산으로 중화시키고, Centricon 30 (Amicon)으로 농축시켰다. 앵커를 Aptes 및 Siebert (BioTechniques 15: 890-893, 1993)의 프로토콜에 따라서 첫번째 가닥 DNA 에 결찰시켰다. 네스트된 PCR 를 앵커에 상보적인 프라이머 및 프라이머 5'TTGTACAGAGCAAATTGGTC 3' (35 사이클, 55℃)를 사용한후 프라이머 5'GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3'(30 사이클, 53℃) 를 이용하여 수행하였다. 최상의 밴드 (350 bp)를 하위의 밴드로부터 아가로오스 전기영동으로 분리시켜, BlueScript에 서브클론시키고, 서열화하였다.
실시예 6 : 항-GPVI Fab 및 F(ab') 2 의 제조- 인간 GPVI 에 대한 폴리클로날 항혈청을 토끼에서 발생시켰다. 토끼 항-GPVI 항혈청 유래의 IgG 를 전술한 바와 같이 정제하였다. Fab 단편을 발생시키기 위하여 고정된 파파인 (Pierce)에 의한 IgG 의 절단을 공급자의 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. Fab 단편을 고정된 프로테인 A (Sigma) 컬럼을 이용하여 비절단된 IgG 및 Fc 단편으로부터 분리시켰다. 유출물 (flow-through)을 투석 튜브로 옮긴 후, 고체 폴리에틸렌글리콜 20,000 를 이용하여 농축시키고, 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, pH 7.4 에 대해 철저히 투석한 후, 사용전까지 4℃ 에서 저장하였다. F(ab')2단편을 0.5 M 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)중에서 1:50 효소 대 기질 비율(w/w)로 37℃에서 18시간동안 IgG의 펩신을 절단하여 제조하였다. pH 는 묽은 NaOH로 7.4 로 조정하고, 시료를 20 mM 포스페이트 (pH 7,4)에 대하여 투석하였다. F(ab')2단편을 프로테인 A 크로마토그래피를 이용하여 비절단된 IgG 및 Fe 단편으로부터 분리시켰다. 유출물을 투석 튜브에 옮긴 후, 고형 폴리에틸렌글리콜 20,000 을 이용하여 농축시키고, 20 mM Hepes, 140 m M NaCl, 4 mM KCl, pH 7.4 에 대하여 강력하게 투석하여, -20℃ 분취량으로 저장하였다. 세정된 혈소판을 Triton X-114 에서 용해시키고, 상 분리를 전술한 바와 같이 소맥아 아굴루티닌-Sepharose 4B 에 대하여 친화성 크로마토그래피하여 Triton X-114 상과 결합된 막 당단백질을 분리하기 전에 가용성 재료에 대하여 수행하였다. GPVI 는 혈소판 막 당단백질 풀의 매우 작은 분획을 나타내기 때문에, 본 출원인은 이러한 수용체의 분리를 위해 뱀 C-형 렉틴 컨불신의 특이성을 이용하였다. Sepharose 4B에 커플링된 컨불신에 대한 친화성 크로마토그래피로 주 생성물로 65 kDa 단백질을 수득하였다. 그러나, 상위 및 하위 Mr 모두의 비특징화된 물질이 GPVI 와 함께 용출되나, 컬럼의 광범위한 세정으로 제거할 수는 없다. 8.5 % 폴리아크릴아미드 상에서의 분취 겔 전기영동을 정제의 마지막 단계로 도입하였다. GPVI 를 함유하는 분획을 풀링하여 재분석시에 단일 밴드를 수득하였다. 정제된 GPVI를 콜라겐에 의한 혈소판 응집화를 차단하는 능력에 대하여 시험하였다. 약간의 억제 효과가 분취량의 GPVI 용액을 혈소판 현탁액에 첨가하였을 때 관찰되었다. 그러나, 혼합물을 혈소판 현탁액에 첨가하기 전에, GPVI와 함께 콜라겐을 예비항온배양함으로써, 응집화는 투여량 의존 방식으로 억제될 수 있다. 이러한 혈소판은 여전히 새로운 콜라겐이 첨가되는 경우 응집되었다. 비환원 조건하에서, 단리된 단백질은 62 kDa의 Mr를 가지며, 환원조건하에서 약간 더 높은 Mr (65 kDa)쪽으로 이동한다. GPVI 의 아미노 말단은 차단되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 단백질을 효소 LysC 및 LysC/AspN 으로 절단하여 4 개 및 6 개의 펩티드를 각각 제조하고, 이로부터 서열을 수득하였다. 이 펩티드를 C4 컬럼 상에서 역상 HPLC 으로 분리시키고, Edman 법을 이용하여 서열화시켰다. 이 펩티드의 아미노산 서열은 번역된 cDNA 서열에 밑줄 그어져 있다 (도 1).

Claims (10)

  1. 당단백질 VI 또는 이의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 DNA.
  2. 제 1 항에 있어서, 부분적으로 또는 완전히 도 2 의 서열을 포함하는 DNA.
  3. 도 2 의 서열을 갖는 DNA.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 도 1a 및 1b 의 아미노산 서열을 포함하는 당단백질 VI 를 코딩하는 DNA.
  5. 도 1b 의 아미노산 서열을 포함하는 약제로서의 재조합 인간 당단백질 VI.
  6. 제 5 항의 단백질 및 이에 대한 제약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 함유하는 제약학적 조성물.
  7. 추가적으로 약리학적 활성 화합물을 함유하는 제약학적 조성물.
  8. 혈소판-콜라겐 상호작용의 특이적 억제제의 검출을 위한 스크리닝 도구에서의 재조합 GPVI 의 용도.
  9. 혈소판-콜라겐 상호작용과 관련된 혈전증 및 심혈관 이벤트 및 장애의 치료 분야에서의 약제의 제조를 위한 재조합 GPVI 의 용도.
  10. 혈전증 및 심혈관 증세 또는 이벤트에 대한 혈소판의 노출 및 혈소판 노화에 대한 마커로서의 GPVI 의 변화의 용도.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK15762001A3 (sk) 1999-05-07 2002-04-04 Merck Patent Gmbh Rekombinantný doštičkový kolagénový receptor glykoproteínu VI a jeho farmaceutické použitie
US7291714B1 (en) 1999-06-30 2007-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotein VI and uses thereof
US6245527B1 (en) 1999-06-30 2001-06-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules encoding glycoprotein VI and recombinant uses thereof
US20040001826A1 (en) 1999-06-30 2004-01-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotein VI and uses thereof
AU7097400A (en) * 1999-09-01 2001-03-26 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Platelet membrane glycoprotein vi (gpvi) dna and protein sequences, and uses thereof
EP1224942A1 (en) * 2001-01-23 2002-07-24 Bernhard Dr. Nieswandt Use of JAQ1 (monoclonal antibody anti GPVI) as a medicament for the protection against thrombotic diseases
EP1406929A2 (en) * 2001-07-18 2004-04-14 MERCK PATENT GmbH Glycoprotein vi fusion proteins
US7531178B2 (en) 2002-06-07 2009-05-12 Trigen Gmbh Immunoadhesin comprising a glycoprotein VI domain
EP1369128A1 (en) 2002-06-07 2003-12-10 Procorde GmbH Inhibitors of glycoprotein VI and their therapeutic use
US20070071744A1 (en) 2002-06-07 2007-03-29 Gotz Munch Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI
DE102004017295A1 (de) * 2004-04-05 2005-11-03 Zlb Behring Gmbh Verbindungen, welche die Entfernung von Rezeptoren von Zelllmembranen bewirken oder verhindern, und Verfahren zu ihrem Nachweis
CN1964990B (zh) 2004-04-29 2012-12-12 大冢制药株式会社 糖蛋白ⅵ特异的抗体以及生产这些抗体的方法
US7645592B2 (en) 2004-04-29 2010-01-12 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Glycoprotein VI antibodies and methods of use thereof
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
RU2010121878A (ru) * 2007-10-31 2011-12-10 Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд. (Jp) Применения ингибитора гликопротеина vi (gpvi)
EP2694709B1 (en) 2011-04-08 2016-09-14 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide constructs and assay systems
EP3184544A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Glycoprotein v inhibitors for use as coagulants

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT662088E (pt) 1993-07-01 2002-06-28 Merck Patent Gmbh Inibidor da agregacao de plaquetas estimulada por colagenio
AU701576B2 (en) * 1993-10-22 1999-02-04 Trigen Limited Platelet-derived growth factor analogues
AU5927398A (en) * 1997-01-21 1998-08-07 Human Genome Sciences, Inc. Fc receptors and polypeptides
CA2250291A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Toray Industries Inc. Chimeric proteins, their heterodimer complexes, and platelet substitutes
SK15762001A3 (sk) 1999-05-07 2002-04-04 Merck Patent Gmbh Rekombinantný doštičkový kolagénový receptor glykoproteínu VI a jeho farmaceutické použitie
US7291714B1 (en) * 1999-06-30 2007-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotein VI and uses thereof
US20040001826A1 (en) 1999-06-30 2004-01-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotein VI and uses thereof
US6245527B1 (en) * 1999-06-30 2001-06-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules encoding glycoprotein VI and recombinant uses thereof
AU7097400A (en) * 1999-09-01 2001-03-26 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Platelet membrane glycoprotein vi (gpvi) dna and protein sequences, and uses thereof
EP1406929A2 (en) 2001-07-18 2004-04-14 MERCK PATENT GmbH Glycoprotein vi fusion proteins
EP1538165A1 (en) 2003-12-03 2005-06-08 Procorde GmbH Inhibitors of glycoprotein VI based on monoclonal antibody hgp 5c4

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Publication number Publication date
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