MXPA01011274A

MXPA01011274A - Glicoproteina vi recombinante del receptor de colageno sobre plaquetas y su uso farmaceutico.

Info

Publication number: MXPA01011274A
Application number: MXPA01011274A
Authority: MX
Inventors: Kenneth J Clemetson
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2002-05-06
Also published as: HUP0201049A2; BR0010325A; PT2341141E; AU4555500A; WO2000068377A1; EP1177289B1; HK1045714B; EP1942186A3; DE60038675T2; KR20010112951A; CZ302693B6; BRPI0010325B1; JP2011097948A; US20070172480A1; NO333408B1; US20110237655A1; AR023848A1; KR100703592B1; EP1942186B1; ATE393223T1

Abstract

La invencion se relaciona con la glicoproteina VI (GPVI), su aislamiento, purificacion y metodos para la produccion recombinante. En especial, la invencion se relaciona con el uso de la GPVI, preferentemente GPVI recombinante, en el tratamiento de desordenes y eventos patologicos correlacionados directa- o indirectamente con desordenes de la coagulacion de la sangre tales como desordenes tromboticos y cardiovasculares. La proteina recombinante extracelular tambien se puede usar para establecer ensayos de rastreo (screening) para encontrar potenciales inhibidores de la GPVI unida a membrana para inhibir la union al colageno de trombocitos y plaquetas, respectivamente. Se pueden usar cambios en la GPVI para monitorear la edad de las plaquetas y la exposicion a enfermedades tromboticos y cardiovasculares.

Description

Glicoproteína VI recombinante del receptor de colágeno sobre plaquetas y su uso farmacéutico Descripción de la Invención La invención se relaciona con la Glicoproteína VI (GPVI) , su aislamiento, purificación y métodos para producción recombinante. En especial, la invención se relaciona con el uso de la GPVI , de preferencia GPVI recombinante, en el tratamiento de desórdenes y eventos patológicos correlacionados directa- o indirectamente con desórdenes de la coagulación de la sangre, tales como enfermedades trombóticas y cardiovasculares. La proteína extracelular recom-bmante también se puede usar para establecer ensayos de rastreo (screening) para encontrar inhibidores potenciales de la GPVI unida a membrana a fines de inhibir la interacción entre plaquetas y colágeno. La GPVI sobre la superficie de las plaquetas se modifica durante el curso de la vida dé las plaquetas in vivo y por eso se puede usar como marcador del perfil de edad de las plaquetas. La glicoproteína VI es una glicoproteína de la membrana c.e las plaquetas de 62/65 kDa (no reducida/ reducida, respectivamente) que forma un complejo junto con la subunidad común Fc?. La subunidad de la GPVI contiene el sitio de unión del colágeno y la subunidad Fc? es la responsable de emitir señales. El complejo forma uno de los principales receptores de colágeno sobre la superficie de REF: 133218 plaquetas, que es crítico para la activación de las plaquetas como respuesta a colágeno. La secuencia de reconocimiento sobre el colágeno consiste de secuencias de (GlyProHyp) n. Se conocen pacientes de Japón con una deficiencia genética de GPVI . Presentan leves problemas de hemorragia y sus plaquetas responden sólo levemente al colágeno, presumiblemente vía otros receptores. Se ha aprendido una gran cantidad acerca de las cascadas de señales que se originan en la GPVI que se semejan mucho a aquellas de los receptores inmunológicos inclusive receptores de células T, células B y células citotóxicas naturales (natural killer cells) . Estas cascadas involucran tirosin quinasas de la familia src tales como Fyn y Lyn así como p72s?? y varias otras tirosin quinasas y fosfatasas y proteínas adaptadoras tales como LAT. Un objetivo importante de estas cascadas es la activación de la fosfolipasa C?2 que rompe fosfolípidos para dar los mensajeros secundarios diacilglicepapel y IP3. Se cree que la GPVI está involucrada en la activación de la integrina de plaqueta a2ßl que juega un papel importante en la adhesión de plaquetas a la pared del vaso dañado . Ratones con la subunidad Fc? "destruida" presentan plaquetas que todavía registran respuestas a colágeno a partir de lo cual se puede inferir que el estado de reposo de a2ßl también puede ser regulado por el complejo GPVI/ Fc?.

La GPVI de receptor de colágeno sobre plaquetas está estrechamente relacionada con los receptores activadores de las células T citotóxicas (natural killer) de la familia de p58KAR así como con FcaR. La adhesión y activación de plaquetas circulantes en reposo en un lugar de daño vascular es el primer paso en un proceso que lleva a la formación de un trombo que se convierte en un tapón hemostático. El colágeno es uno de los componentes principales de la pared vascular responsable de la activación de las plaquetas. Existen muchos tipos de colágeno y siete de estos se han encontrado en las capas subendoteliales . Se han identificado varios receptores diferentes para el colágeno sobre plaquetas pero actualmente se considera que las principales son la integrina a.^ y la no-integrina GPVI . Aunque hace varios años se ha caracterizado muy bien la a2ß: y se han clonado y secuenciado ambas subunidades, sigue sin conocerse completamente la estructura de la GPVI , aunque se han identificado varios aspectos. Se ha determinado hace aproximadamente veinte años que la GPVI es una glicoproteína mayor de las plaquetas con un peso molecular que oscila entre 60-65 kDa y un pH ácido. Su papel como receptor putativo de colágeno se estableció siguiendo la identificación de un paciente en Japón con un desorden de hemorragia leve cuyas plaquetas presentaban un defecto espe-cífico de respuesta al colágeno y carecían de este receptor.

Este paciente desarpapelló asimismo autoanticuerpos contra el receptor deficiente y estos se usaron para seguir caracterizando a la molécula. Más recientemente se estableció que la GPVI está asociada de manera no covalente con la subunidad Fc? que actúa como parte emisora de señales del complejo. Se demostró asimismo que la secuencia de reconocimiento sobre el colágeno para la GPVI es un triplete repetido Gly-Pro-Hyp. Se mostró que el complejo GPVI / Fc? envía señales al interior de la plaqueta por medio de un me-canismo de tipo receptor inmunológico, que involucra la activación de p72SYK y lleva por medio de un cascada de interacciones de kinasa/ fosfatasa/ adaptador de proteína a la activación de PLC?2 y por lo tanto a la liberación de granulos y agregación de plaquetas. Otro paso en la caracteri- zación de esta molécula fue la demostración que la lectina de tipo C de víbora, la convulxina, de la cascabel tropical, Crotalus durissus terrificus era capaz de activar plaquetas agrupando GPVI a través de una interacción multimérica. Se mostró que la convulxina une específicamente la GPVI pro-porcionando de esa manera un método para la purificación de este receptor conjuntamente con enfoques establecidos. Entonces queda claro del arte anterior que la GPVI parece ser un compuesto muy interesante en muchos campos terapéuticos que se relacionan todos con aplicaciones asocia- das directa- o indirectamente a eventos de la coagulación de a*Jte*¿ ? s ---¿*^*- áá la sangre que dependen de la interacción colágeno - plaqueta. Por lo tanto, el objeto de la presente invención fue proporcionar GPVI en una forma recombinante y mostrar su eficacia como objetivo terapéutico directo o como herra-mienta para rastrear compuestos cortos, en especial compuestos sintetizados o sintetizables químicamente con la capacidad de inhibir o bloquear la interacción natural entre plaquetas-colágeno. La invención de relaciona también con porciones o fragmentos de la proteína GPVI que han conservado su actividad biológica que es la de unir colágeno. La invención ha sido exitosa en la purificación de cantidades adecuadas de GPVI para la caracterización preliminar y para el secuenciado de péptidos. Las secuencias se usaron para diseñar cebos para PCR para identificar una secuencia positiva en una genoteca. Esta secuencia de ADN se usó entonces como una sonda para aislar una secuencia de ADNc casi completa de la genoteca y se obtuvo la secuencia 5 ' ausente usando un método de RACE de una genoteca de ADNc de plaquetas. La invención también fue exitosa en demostrar el uso de la GPVI recombinante como compuesto de aplicación terapéutica capaz de unirse a colágeno cuando se administra a un paciente por ej . con vasos sanguíneos dañados, previnien-do de esta manera que las plaquetas portadoras de GPVI unida rosis. Se podría usar el fragmento Fab de anticuerpos monoclonales de ratón humanizado contra GPVI con efecto similar para bloquear GPVI sobre la superficie de las plaquetas con aplicaciones similares a las mencionadas anteriormente. La GPVI recombinante de acuerdo con esta invención también se puede emplear en un ensayo de unión a colágeno para rastrear moléculas pequeñas (en genotecas combinatorias por ejemplo) capaces de inhibir esta interacción y que se pueden usar para desarpapellar compuestos terapéuticos que sean inhibidores de la interacción colágeno-plaqueta. Preparando derivados adecuados se logra que estos compuestos estén oralmente disponibles. Nuevamente el objeto principal consiste en preparar compuestos que reduzcan las interacciones entre GPVI y colágeno y también la activación de plaquetas en situaciones donde las plaquetas entran en contacto con el colágeno. En el arte anterior se ha establecido muy bien la tecnología de rastreo así como la que se usa en esta invención. Por medio de tales ensayos de rastreo la invención permite encontrar y desarpapellar nuevos objetivos que pueden inhibir la GPVI natural unida a membrana sobre la superficie de las plaquetas como un antagonista de colágeno. Tales objetivos que pueden ser pequeñas moléculas químicas pueden ser entonces la base para otras invenciones. Otra aplicación mayor de la GPVI y reactivos que reconocen dominios específicos de la GPVI es como marcador . A * ?x* itaAft ^^¿á 3 de la edad y funcionalidad de las plaquetas. En general, se considera que plaquetas jóvenes son más activas y funcionales que las más viejas. Plaquetas jóvenes se unen a y son activadas por la lectina de tipo C de veneno de víbora, la convulxina, que es específica para la GPVI, y que a medida que envejece disminuye tanto la unión como el grado de activación. Esto se puede deber ya sea a cambios proteolíticos o conformacionales en la GPVI o a su asociación con Fc? debido a la activación de las plaquetas o al daño en la circulación. Este puede ser un parámetro útil para medir la edad y el perfil de función de las plaquetas en pacientes y en personas normales durante contpapeles médicos. El perfil de edad de las plaquetas cambia en muchas enfermedades afectando la médula ósea o el sistema inmune y podría ser un importante criterio de diagnóstico si se dispondría de mejores métodos para su determinación. Por ejemplo, pacientes con enfermedades que involucran una incrementada renovación de plaquetas presentarán mayor cantidad de plaquetas jóvenes mientras que pacientes con quimioterapia o tratamiento radiante presentarán una población de edad estable. Por lo tanto, un perfil de edad de este tipo se puede usar para un monitoreo preciso del tratamiento. En una población sana normal se sabe muy poco sobre la distribución del perfil de edad y su papel como pronóstico de cambio en la salud. No se sabe si los cambios de la GPVI se deben a que las plaquetas están parcialmente involucradas en eventos homeostáticos y si los cambios pueden ser más notorios en pacientes con enfermedad cardiovascular extensiva. En la actualidad el naranja de tiazol se usa para detectar plaquetas jóvenes reticuladas que contienen ARNm. Este ARNm decae rápidamente, limitando el método únicamente a las plaquetas más jóvenes. Reactivos que se podrían usar en este tipo de ensayos incluirían proteínas de veneno de víbora GPVI-específicas tales como convulxina, o anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen la región N-terminal de la GPVI o anticuerpos monoclonales que reconocen nuevos sitios o conformaciones expuestas por proteólisis del dominio N-terminal o conformaciones específicas presentes ya sea en la molécula intacta y no en la envejecida o viceversa o pequeñas entidades químicas seleccionadas para reconocer específicamente GPVI intacta o su forma modificada. Estos reactivos se marcarían con un marcador fluorescente o junto con un segundo anticuerpo o reactivo de afinidad marcado con fluorescencia y se usarían en citometría de flujo para medir el perfil de unión de las plaquetas. En una alternativa de un paso posterior se podrían adoptar técnicas de medición menos laboriosas basadas en la medición automatizada de perfiles de plaquetas. Usando métodos de selección de células con citometría de flujo o perlas magnéticas podría ser posible aislar plaquetas jóvenes y viejas para examinar los factores involucrados en la remoción de plaquetas viejas de la circulación. Serían claves para estos estudios reactivos que reconozcan formas específicas de la GPVI . Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un ADN que codifique para la glicoproteína VI o fragmentos biológicamente activos de la misma, en especial la secuencia de la Fig. 2. Además, es un objeto de esta invención proporcionar un ADN que codifique para la glicoproteína VI que comprenda la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1. Otro objeto de esta invención consiste en proporcionar una composición farmacéutica que comprende la GPVI recombinante junto con un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y su uso para la elaboración de un medicamento en el campo terapéutico de eventos trombóticos y carediovasculares y desórdenes relacionados con interacciones plaquetas-colágeno. Otro objeto de la invención es el uso de GPVI recombinante en una herramienta de rastreo para detectar inhibidores específicos de interacciones plaqueta-colágeno. Otro objeto de la invención es el uso de la GPVI como marcador para la edad de la plaqueta y la exposición a enfermedades cardiovasculares. Posibles indicaciones y aplicaciones médicas son, respectivamente, por ej . angina de pecho inestable, PTCA, el uso de "stents" en este campo, cirugías de las coronarias, cirugías generales de los vasos sanguíneos, cirugías que pueden dañar vasos sanguíneos mayores tales como cirugías de la articulación ilíacofemoral . Además, se incluyen todas las indicaciones que estén relacionadas con eventos tromboembólicos causados por desórdenes de la interacción entre la pared del vaso y el sistema de coagulación con un alto riesgo de formación de trombos y bloqueo de los vasos . Como se ha indicado anteriormente, la proteína GPVI y fragmentos de la misma de acuerdo con la presente invención son adecuados como compuestos farmacéuticamente efectivos en composiciones y combinaciones farmacéuticas. Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención opcionalmente pueden comprender sustancias activas adicionales tipo anticoagulantes, tales como hirudina o heparina o agentes trombolíticos tales como activador plasminógeno o hementina o antagonistas de otros receptores de plaquetas tales como los antagonistas de GPIIb-IIIa del tipo abciximab o eptifibatida o antagonistas del receptor ADP tales como clopidogrel . La nueva proteína y sus fragmentos biológicamente activos respectivamente de acuerdo con la invención pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido orgánico o inorgánico, no tóxico. Ácidos inorgánicos son por ej . ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico o fosfórico y sales de ácidos de metales, tales como ortofosfato monoácido de sodio y sulfato ácido de potasio. Ejemplos de ácidos orgánicos son los ácidos mono, di y tricarbo-xílicos tales como ácido acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinámico, salicílico y sulfónico tales como ácido metansulfónico. Sales de la porción aminoácida carboxiterminal incluyen las sales de ácidos carboxílicos no tóxicas formadas con cualquier base inorgánica u orgánica adecuada. Estas sales incluyen, por ejemplo, metales alcalinos tales como sodio y potasio, metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio, metales livianos del grupo IIIA incluyendo aluminio, y aminas orgánicas primarias, secundarias y terciarias tales como trialquilaminas, incluyendo trietilamina, procaina, dibencilamina, 1-etenamina, N,N' -dibenciletilen-diamina, dihidroabietilamina y N-alquilpiperidina. Así como se usa aquí, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material de relleno, diluyente o encapsulante inerte, no tóxico, sólido o líquido, que no reaccione adversamente con la sustancia activa o con el paciente. Portadores adecuados, preferentemente líquidos, son conocidos en el arte tales como agua estéril, Li ii ?ii ; ^^^^A^ ^^ft soluciones salinas, dextrosa acuosa, soluciones azucaradas, etanol, glicoles y aceites, incluyendo aquellos del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de maní, aceite de soja y aceite mineral. Las formulaciones de acuerdo con la invención se pueden administrar como dosis unitarias que contienen portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos convencionales, no tóxicos, farmacéuticamente aceptables que son típicos para la administración parenteral. El término "parenteral" incluye aquí la inyección subcutánea, intravenosa, intraarticular e intratraqueal y técnicas de infusión. También son adecuadas otras administraciones tales como la administración oral y la aplicación tópica. Composiciones y combinaciones paren-terales se administran preferentemente por vía intravenosa ya sea como bolo o como una fusión constante de acuerdo con procedimientos conocidos . Los comprimidos y las cápsulas para administración oral contienen excipientes convencionales tales como agentes ligantes, de relleno, diluyentes, agentes para comprimidos, lubricantes, desintegrantes y agentes humectantes. Los comprimidos se pueden recubrir de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Las prepraciones líquidas orales pueden ser en forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes, elixires o se pueden presentar como un * i . productos seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado para el uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes . Las aplicaciones tópicas pueden ser en forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, gelatinas o de preferencia ungüentos de emulsiones. Las dosis unitarias de acuerdo con la invención pueden contener las cantidades diarias requeridas de la proteína de acuerdo con la invención o sub-múltiplos de la misma para llegar a la dosis deseada. La dosis óptima terapéuticamente aceptable y los intervalos de dosis para un determinado paciente (mamíferos, inclusive humanos) dependen de una variedad de factores, tales como la actividad de la sustancia activa específica usada, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento y la vía de administración, la velocidad de clearance, el objeto del tratamiento, o sea si se trata de terapia o profilaxis y la naturaleza de la enfermedad trombótica a ser tratada, la actividad antiplaqueta o anticoagulante. Por lo tanto, en composiciones o combinaciones útiles como anticoagulantes en un paciente tratado (in vivo) una dosis diaria farmacéuticamente efectiva de los péptidos de esta invención oscila entre 0,01 y 100 mg/ kg de peso . »« féta jjsA,y& .¿aj. í corporal, preferentemente entre 0,1 y 10 mg/ kg de peso corporal. De acuerdo con la forma de aplicación una dosis única puede contener entre 0,5 y 10 mg de inhibidor de colágeno. Para alcanzar el efecto anticoagulante en sangre extracorpó- 5 rea una cantidad farmacéuticamente efectiva de los péptidos de esta invención oscila entre 0,2 y 150 mg/l, preferentemente entre 1 mg y 20 mg/l de sangre extracorpórea. Breve descripción de las figuras: Fia. 1: Secuencia proteica de la GPVI (código de una 10 letra) la : secuencia líder Ib: proteína madura Marco de lectura abierto: 339 aminoácidos Asterisco: sitio de glicosilación 15 Doble subrayado: dominio transmembrana Simple subrayado: péptidos secuenciados Fig. 2 : Secuencia de nucleótidos de la GPVI que cubre el marco de lectura abierto de 1017 pb (pb: pares de bases) más las regiones 3' y 5' total 1249 pb. 20 Descripción detallada de la invención Se seleccionaron dos secuencias de 7 aminoácidos que presentaban la última degeneración en el código genético para sintetizar cebos de ADN a fines de amplificar parte del ADNc de la GPVI mediante PCR. Dado que la ubicación de ambos 25 péptidos en la proteína era totalmente desconocida, se prepararon dos cebos degenerados, para cada uno de ellos, uno en sentido y el otro en contrasentido. Estos cebos se emplearon para amplificar una genoteca de médula ósea humana. La combinación del cebo en sentido 5'TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3' que codificaba para la secuencia PAMKRSL con el cebo en antisentido 5 ' TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3' correspondiente a DQFALYK amplificó un fragmento de AD? de 221 pb. Además de los péptidos seleccionados, el AD? amplificado codificó para el péptido LysC/Asp? DQLELVATGFAKPSLSAQPGPAVSS, que claramente unía la secuencia al AD?c para GPVI . El rastreo de 600.000 pfu (pfu = unidades formadoras de placas) de una genoteca de médula ósea con este fragmento de AD? de 221 pb produjo 4 pfu positivas. Tres presentaban insertos de 1350 pb ya sea cortados con las enzimas de restricción Sal I o EcoR I y pertenecían a la superfamilia de las IgG. La cuarta pfu presentaba un inserto de 4,6 kg por digestión con Sal I y dio dos fragmentos de 2300 pb y 1300 pb respectivamente cuando se trató con EcoRI . Su AD? codificó la secuencia para los 10 péptidos derivados del secuenciado de aminoácidos de la GPVI pero se detuvo poco antes del extremo aminoterminal . ?o se pudo encontrar ninguna secuencia iniciadora de metionina ni líder, pero estuvieron presentes más de 2000 pb de AD? de un marco de no-lectura secuenciado previamente en una secuencia Alu. El .^^^J^^J^^^^^^^^^^iM^M^t^ia^At ^^^^^mA^^^^^ experimento del extremo 5' RACE se completó sobre ARN poliA de plaquetas con cebos ubicados en una parte de la secuencia de GPVI que había sido corroborada por aquella de los péptidos. Antes de volver a caer sobre la secuencia de GPVI establecida se encontró un fragmento de 348 pb incluyendo 278 pb sobre la secuencia del cuarto clon y 70 pb nuevos desde el pb 1987 correspondiendo a 14 aminoácidos inclusive la primera metionina. Por lo tanto, se pudieron secuenciar un ADNc que contenía en total 1249 pb, una secuencia 5' de 25 pb aguas arriba del codón de iniciación, un marco de lectura abierto de 1017 pb que codificaba para una proteína, inclusive la secuencia líder, con 339 aminoácidos, y una región 3' de 207 pb incluyendo el codón de finalización. Se clonó y secuenció un ADNc para GPVI de plaqueta de una genoteca de ADNc de médula ósea humana usando RACE con ARNm de plaquetas para proporcionar la secuencia 5' ausente. El marco de lectura abierto de 1017 pb codifica para 339 aminoácidos y una región 3' no traducida. Un análisis de hidrofobicidad de la secuencia de aminoácidos reveló la presencia de dos dominios de transmembrana putativos, una secuencia de señal putativa de 20 aminoácidos y un dominio de 19 aminoácidos entre los residuos 247 y 265 de la proteína madura. La secuencia y su traducción de aminoácidos se muestran en la Fig. 2 y Fig. 1. Una comparación con la secuencia de aminoácidos de las moléculas más similares encontrada en una búsqueda de GenBank reveló claramente que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y que el dominio extracelular contiene dos loops (lazos) del dominio de la Ig C2 formados por dos puentes disulfuro. Es una molécula de clase uno de proteína que atraviesa la membrana con el extremo N-terminal en el exterior y que atraviesa la membrana una vez . Las moléculas más estrechamente relacionadas pertenecen a la clase de receptor de células citotóxicas ("natural killer") que contiene tanto tipos inhibidores como activadores. La GPVI pertenece claramente a la subclase activadora no sólo debido a su función sino también porque a diferencia de la clase inhibidora no posee ningún residuo tirosina que podría estar involucrado en la fosforilación. Hay algunos residuos de treonina y serina en este dominio, pero no se ajustan a ningún criterio para secuencias de consenso de kinasa. Como la clase activadora de receptores de células citotóxicas naturales (NK: natural killer) , la GPVI contiene un residuo arginina como tercer aminoácido del dominio que atraviesa la membrana que está involucrado en la formación del complejo con la subunidad Fc??. El dominio citoplasmático contiene 51 aminoácidos, que sólo presenta una similitud menor (en la región justo por debajo de la membrana) con los dominios citoplasmáticos de otros miembros de esta familia. Esto sugiere que este dominio en la GPVI se puede asociar con tipos de moléculas citoplasmáticas diferentes que los otros miembros de la familia. La GPVI contiene solo un único sitio de N-glicosilación putativo en Asn69. Sin embargo, el dominio justo por debajo de la membrana después de que terminen las capas beta del dominio de la Ig es rico en residios de treonina y serina que podrían proveer sitios de O-glicosilación como los que se encuentran en GPIba y GPV. La función principal de esta O-glicosilación parece consistir en presentar las estructuras del receptor que se extienden desde la superficie de la plaqueta para facilitar las interacciones con sus voluminosos ligandos. Dado que la GPVI se estableció antes como una sialoglicoproteína, la diferencia en la masa molecular entre la masa de aminoácidos teórica (37 kDa) y la masa determinada por electroforesis en gel (65 kDa reducido) debe deberse a su glicosilación. La estructura de los receptores de las células citotóxicas (natural killer) del tipo de dos dominios ha sido establecida por estudios de cristalografía de rayos X y se vio que los dos dominios de la Ig forman un ángulo agudo con el sitio del receptor para los antígenos HLA portadores de péptidos ubicados sobre la cara exterior del codo. Una comparación directa de la estructura del sitio de unión del péptido HLA con aquella del colágeno sugiere inmediatamente por qué estos receptores tienen un origen común, dado que las estructuras alfahelicoidales múltiples del sitio de unión de HLA y el péptido que contienen se asemejan notoriamente a la estructuras triple helicoidales del colágeno. Se postula que los receptores de células citotóxicas (natural killer) trabajan por medio de un mecanismo de dimerización donde dos receptores reconocen dos sitios HLA separados sobre la célula que está investigando la célula cititóxica. Posiblemente esta dimerización es parte del mecanismo de activación o desactivación, lo que depende de la clase de receptor. En el caso de la GPVI también puede existir la posibilidad que dos moléculas de GPVI se asocien con una de Fc?, dado que cada monómero del dímero de Fc? presenta una secuencia de reconocimiento. Sin embargo, todavía no se conoce la estequiometría y, en base a la estructura de colágenos, de péptidos del tipo colágeno que actúan vía GPVI y de la convulxina parece probable que la intensidad de la señal esté relacionada con el número de complejos GPVI/Fc? que están agrupados entre sí. Otros receptores de plaquetas pertenecientes a esta familia de Ig incluyen ICAM-2- (CD102) y PECAM (CD31) . Todos los microorganismos, líneas celulares, sistemas de expresión, hospedantes de expresión, plásmidos, promotores, marcadores de resistencia, orígenes de replicación, sitios de restricción u otros fragmentos o partes de vectores que se mencionan en la descripción y que no están directamente relacionados con la invención que se reivindica ^^^ ^^^^^^s^^^^^^^^^ se pueden adquirir comercialmente o en general de otra forma. Siempre que se sugiera otra cosa sólo se usan como ejemplos y no son esenciales con respecto a la invención, y pueden ser reemplazados por otras herramientas y materiales biológicos adecuados, respectivamente. Las técnicas que son esenciales de acuerdo con la invención se describen en detalle más adelante y se han descripto anteriormente. Otras técnicas que no se describen en detalle corresponden a métodos estándar conocidos que son bien conocidos para una persona especializada en el arte, o se describen con mayor detalle en las referencias y solicitudes de patentes que se citan y en la literatura estándar (por ej . Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, Harlow, Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor) . EJEMPLOS Ejemplo 1: Materiales Proteína A - Sefarosa, anticuerpos cabra-antiratón y anticonejo peroxidasa-conjugados, sero-albúmina bovina, veneno de Crotalus durissus terrificus, aglutinina de germen de trigo, agarosa en glóbulos al 4 % entrecruzada y activada con cloroformiato de N-hidroxisuccinimidilo y Tritón X-114 son de Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO) , octanoil -N-metil -glucamida (ONMG) y nonanoil-N-metil- t iSjt.it , glucamida (NNMG) son de Oxyl Chemie (Bobingen, Alemania) . Ejemplo 2: Aislamiento de GPVI de plaquetas - Se aislaron las glicoproteínas de membrana de plaquetas de acuerdo con lo 5 descripto anteriormente. Brevemente, se lavaron plaquetas (de 40 recubrimientos inflados) y se lisaron en 2 % de Tritón X-114 en la presencia de inhibidores de la proteasa. El Tritón X-114 y las fases acuosas se separaron y la fase de detergente se cargó en una columna de aglutinina de 10 germen de trigo acoplada a Sefarosa 4B. Las glicoproteínas de las plaquetas se eluyeron con Tris HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM, 0,2 % de octanoil -N-metilglucamida (ONMG) y 2 % de N-acetilglucosamina. Después de la diálisis y concentración, la solución de glicoproteínas se cargó en una columna 15 de convulxina unida a agarosa en glóbulosal 4 % entrecruzada y activada con cloroformiato de N-hidroxilsuccinamidil-p- nitrofenilo (1 mg/ml) . La columna se lavó con 4 volúmenes de Tris HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM, 0,2 % de nonanoil-N- metilglucamida (NNMG) y luego con 4 volúmenes de Tris HCl 10 20 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM y 2 % de NNMG. La GPVI se eluyó con 0,08 % de SDS en 10 mM de Tris/HCl, pH 7,4. La solución se concentró y cargó sobre un gel preparativo de 8,5 % de poliacrilamida usando el Prep Cell Modelo 491 (BioRad, CA) . La electroforesis preparativa se realizó bajo condiciones no 25 reducidas siguiendo las instrucciones de fabricante. La GPVI ag^ß^h^^^^^^^^^^^^^*^^»^^^?to^^^^^g^^^^^^^^^^ se eluyó como una única banda de 65 kDa. Se combinaron las fracciones, se concentraron en un Centr?con-30 (Amicon, Beverly, MA) y se resuspendieron en 10 mM de Tris/ Hcl, pH 7,4 y 0,1 % de ONMG. E emplo 3: Análisis de aminoácidos de la GPVI - La GPVI se digirió con las endoproteinasas LysC y AspN (Boehpnger Mannheim, Alemania) . Los 10 péptidos generados se separaron mediante HPLC de fase reversa y se secuenciaron en un secuenciador de proteínas de fase líquida pulsada Applied Biosystem modelo 477A con un analizador de aminoácidos de feniltiohidantoína on-line modelo 12OA. Ejemplo 4 : Amplificación de un fragmento de 221 pb que codifica para parte de la GPVI de una genoteca de ADNc de ?gtll. Se amplificó una muestra (10 10 pfu) (pfu = unidades formado-ras de placas) de una genoteca de médula ósea humana (Clone-tech, Palo Alto, CA) usando 2 combinaciones de 4 cebos degenerados. Las concentraciones finales de cebo fueron de 2 µM, la concentración de dNTP fue de 200 M y se usaron 2 U/ 100 µl de AmpliTaq Gold de reacción (Perkin Elmer, Rotkreuz, Suiza) . Las condiciones de la PCR fueron 5 ciclos a 37 °C seguidos por 30 ciclos a 44 °C. El 19mero de sentido 5 ' TYATHCCNGCNATGAARMG 3' y el 20mero antisentido 5 ' TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3' amplificó un fragmento de 221 pb a t^ -,.»&£ que se subclonó en Bluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenció usando el kit de T7 Sequenase (Amersham, Suiza) . Ejemplo 5: Rastreo de la genoteca de ADNc de ?gtll con la sonda de GPVI de 221 pb- El fragmento de 221 pb se cortó del plásmido, se limpió y se marcó con a32P-ATP (20mBq/50 µl , Hartmann Analytik, Braunschweig, Alemania) usando el kit de High Prime Labelling para marcado de cebos (Boehringer Mannheim, Suiza) . La genoteca de médula ósea humana se rastreó siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejaron crecer fagos positivos, se aisló su ADN y se subclonaron en Blue Script usando ya sea sitios EcoRI o Sal I y se secuenciaron. El secuenciado se llevó a cabo usando el sistema de ABS de RACE. ARN poli A de plaqueta se preparó de acuerdo con lo descripto anteriormente (Power et al., Cytokine 7, 479 - 482, 1995). La transcripción reversa (30 µl) se realizó usando 5 µg de ARN poli A con el cebo 5 ' TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3' (20 µM) , dNTP (1 mM), ARNsin (40 U) , 1 x buffer AMV y 20 U de transcriptasa reversa AMV durante 20 minutos a 45 °C seguido por 20 min a 52 °C. La mezcla de reacción se trató con 2 µl de NaOH 6N a 65 °C durante 30 min, se neutralizó con 2 µl de ácido acético 6N y se concentró en un Centricon 30 (Amicon) . Se ligó un ancla a la primera hebra de ADN siguiendo el protocolo de Aptes y Siebert (Bio Techniques 15: 890-893, 1993). Se realizó una PCR anidada usando un cebo complementario al ancla y el cebo 5 ' TTGTACAGAGCAATTGGTC 3' (35 ciclos, 55 °C) seguido por el cebo 5 ' GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3' (30 ciclos a 53 °C) . La banda más alta (350 pb) se separó de las bandas más bajas mediante electroforesis en agarosa, se subclonó en BlueScript y se secuenció. Ejemplo 6: Preparación de Fab anti-GPVI y F(ab')2 - Se generó antisuero policlonal contra GPVI humana en conejos. Se purificó IgG de antisuero anti-GPVI de conejo de acuerdo con lo descripto anteriormente. Se llevó a cabo una digestión de IgG con papaína inmovilizada (Pierce) para generar fragmentos de Fab de acuerdo con el protocolo estándar del proveedor. Se separaron fragmentos Fab de IgG no digerida y fragmentos Fe usando una columna de proteína A inmovilizada (Sigma) . El flujo que atravesó la columna se transfirió a un tubo de diálisis, se concentró usando polietilenglicol sólido 20.000, se dializó cuidadosamente contra Hepes 20 mM, NaCl 140 mM, KCl 4 mM, pH 7,4 y se guardó a 4 °C hasta usar. Los fragmentos de F(ab')2 se prepararon por medio de digestión con pepsina de IgG, relación enzima: sustrato 1 : 50 (p/p), en 0,5 M de buffer acetato, pH 4,0 a 37 °C durante 18 horas. El pH se ajustó en 7,4 con NaOH diluido y la muestra se dializó contra fosfato 20 mM, pH 7,4. Los fragmentos F(ab')2 se separaron de IgG no digerida y de fragmentos de Fe usando una cromatografía de proteína A. El flujo se transfirió a tubos de diálisis, se concentró usando polietilenglicol 20000 sólido, se dializó intensivamente 5 contra Hepes 20 mM, NaCl 140 mM, KCl 4 mM, pH 7,4 y se almacenó en alícuotas a -20 °C. Las plaquetas lavadas se lisaron en Tritón X-114 y sobre el material soluble se realizó una separación de fases antes de aislar las glicoproteínas de membrana asociadas con la fase de Tritón 10 X-114 mediante cromatografía de afinidad sobre aglutinina de germen de trigo-Sefarosa 4B de acuerdo con lo descripto anteriormente. Como la GPVI representa una fracción muy pequeña del pool de glicoproteínas de membrana de plaquetas, usamos la especificidad de la convulxina de lectina de tipo 15 C de víbora para aislar a este receptor. La cromatografía de afinidad sobre convulxina acoplada a Sefarosa 4B dio una proteína de 65 kDa como producto principal. Sin embargo, el material no caracterizado tanto de Mr más alto como de Mr más bajo co-eluyó con la GPVI y no se pudo remover con 20 lavado extensivo de la columna. Se agregó una electroforesis preparativa en gel sobre 5 % de poliacrilamida como etapa final de purificación. Las fracciones conteniendo GPVI se combinaron y en el reanálisis dieron una única banda. Se analizó la capacidad de la GPVI purificada de bloquear a 25 agregación de plaquetas por parte de colágeno. Se observó un leve efecto inhibidor cuando se agregaron alícuotas de la solución de GPVI a la suspensión de plaquetas. Sin embargo, por medio de la preincubación de GPVI con colágeno antes de agregar la mezcla a la suspensión de plaquetas fue posible inhibir la agregación de una manera dosis-dependiente. Estas plaquetas se siguieron agregando al agregar colágeno fresco. Bajo condiciones no reductoras la proteína aislada presentaba un Mr de 62 kDa con un desplazamiento hacia un Mr levemente superior (65 kDa) bajo condiciones reductoras. Dado que se encontró que el extremo aminoterminal de la GPVI estaba bloqueado, se digirió la proteína con las enzimas LysC y LysC/AspN que produjo 4 y 6 péptidos, respectivamente, de los cuales se obtuvieron las secuencias. Los péptidos se separaron mediante HPLC de fase inversa en una columna C4 y se secuenciaron usando el método Edman. Las secuencias de aminoácidos de estos péptidos están subrayadas en la secuencia de ADNc traducidas (Fig. 1) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. j?ti ? ti.?i * fatua Jt-L JKLB.IL J ii i

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1 . ADN que codifica para la glicoproteína VI o fragmentos biológicamente activos de la misma . 2. ADN de acuerdo ccn la reivindicaciión 1, caracterizado porque comprende parcial- o completamente la secuencia de la Fig.
2.
3. ADN con la secuencia de la Fig. 2.
4. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3 para la glicoproteína VI que comprende la secuencia de amino ácidos de la Fig. 1.
5. Glicoproteína VI recombinante como medicamento .
6. Composición farmacéutica caracterizado perqué aaprprai-te la proteína de la reivindicación 5 y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable para la misma.
7. Composición fanracéutica caracteriza-to pcangue_scppta?de aclaras una sustancia activa farmacéuticamente aceptable.
8. Uso de la GPVI recombinante en una herramienta de rastreo para detectar inhibidores específicos de las interacciones plaqueta-colágeno.
9. Uso de la GPVI recombinante para la elaboración de un medicamento en el campo terapéutico de eventos trombóticos y cardiovasculares y desórdenes relacionados con las interacciones plaqueta-colágeno.
10. Uso de cambios en la GPVI como un marcador de la edad de las plaquetas y la exposición de las plaquetas a iíí..AyA.¿ yi.? y ^mé condiciones o eventos trombóticos y cardiovasculares . ¡ait, tf w t,