JP2003515313A - 組換え血小板コラーゲン受容体糖タンパク質ｖｉおよびその薬学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、その単離、精製および組換え製造法に関する。特に、本発明は、血栓症的疾患および心臓血管疾患などの血液凝固異常に直接的または間接的に相間する異常および病理学的事象の処置におけるＧＰＶＩ、好ましくは組換えＧＰＶＩ、の使用に関する。この細胞外組換えタンパク質はまた、栓球および血小板がそれぞれコラーゲンに結合することを阻害する、膜結合型ＧＰＶＩの潜在的な阻害剤を見出すスクリーニングアッセイを確立するためにも使用することができる。ＧＰＶＩの変化は、血栓症的疾患および心臓血管疾患に対する血小板の老化および露出をモニターするために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、その単離、精製および組換え製造
法に関する。特に、本発明は、血栓症的疾患および心臓血管疾患などの血液凝固
異常に直接的または間接的に相関する異常および病理学的事象の処置におけるＧ
ＰＶＩ、好ましくは組換えＧＰＶＩの使用に関する。この細胞外組換えタンパク
質は、血小板およびコラーゲンの相互作用を阻害するための、膜結合型ＧＰＶＩ
の潜在的な阻害剤を見出すスクリーニングアッセイを確立するためにも使用する
ことができる。血小板表面のＧＰＶＩは、血小板の寿命期間中に生体内で変化を
受け、従って血小板老化プロファイルのマーカーとして使用することができる。

【０００２】 糖タンパク質ＶＩは、Ｆｃγの共通したサブユニットと一緒に複合体を形成す
る６２／６５ｋＤａ（それぞれ、非還元／還元型）の血小板膜糖タンパク質であ
る。ＧＰＶＩサブユニットはコラーゲン結合部位を含有し、Ｆｃγサブユニット
はシグナル伝達に関与している。この複合体は、コラーゲンに応じて血小板の活
性化に重要な、血小板表面の主要なコラーゲン受容体の１つを形成している。コ
ラーゲン上の認識配列は（ＧｌｙＰｒｏＨｙｐ）_nの配列からなる。ＧＰＶＩの
遺伝子的欠損を有する患者が日本から知られている。その患者らは軽度の出血の
問題を有しており、患者の血小板は、おそらくは他の受容体を介して、コラーゲ
ンに弱く応答するだけである。非常に多くことが、ＧＰＶＩから出発するシグナ
ル伝達カスケードについて突き止められており、このシグナル伝達カスケードは
、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体およびナチュラルキラー細胞受容体を含む免疫受
容体に由来するシグナル伝達カスケードと著しく類似している。これらのカスケ
ードには、ｐ７２^SYKと同様にＦｙｎおよびＬｙｎなどのｓｒｃファミリーのチ
ロシンキナーゼ、ならびに多くの他のチロシンキナーゼおよびホスファターゼ、
およびＬＡＴなどのアダプタータンパク質が含まれる。これらのカスケードの主
要な標的は、リン脂質を切断して二次メッセンジャーのジアシルグリセロールお
よびＩＰ₃を生じさせるホスホリパーゼＣγ２の活性化である。ＧＰＶＩは、損
傷を受けた血管壁に対する血小板接着における主要な役割を有する血小板インテ
グリンα２β１の活性化に関与していると考えられる。Ｆｃγサブユニットが「
ノックアウト」されたマウスは、コラーゲンに対する応答を依然として示す血小
板を有する。このことは、α２β１の休止状態もまたＧＰＶＩ／Ｆｃγ複合体に
よって調節されているかもしれないことを意味している。

【０００３】 血小板のコラーゲン受容体ＧＰＶＩは、ＦｃαＲと同様に、ｐ５８ＫＡＲファ
ミリーのナチュラルキラー活性化受容体に非常に関連している。

【０００４】 循環している休止血小板の血管傷害部位における接着および活性化は、止血栓
に伝達される血栓が形成されるプロセスの第１段階である。コラーゲンは、血小
板の活性化に関わる血管壁の主要な成分の１つである。コラーゲンには多くのタ
イプが存在し、これらのうちの７つが内皮下層で見出されている。コラーゲンに
対するいくつかの異なる受容体が血小板において同定されているが、主要な受容
体は、現在、インテグリンα₂β₁および非インテグリンのＧＰＶＩであると見な
されている。α₂β₁は十分な特徴付けが行われ、そして両方のサブユニットが数
年前にクローン化および配列決定されたが、ＧＰＶＩの構造は、いくつかの特徴
が同定されているにもかかわらず、解明されないままである。ＧＰＶＩは、分子
量が６０ｋＤａ〜６５ｋＤａの範囲にあり、酸性のｐＩを有する主要な血小板糖
タンパク質であることが約２０年前に明らかにされた。推定的なコラーゲン受容
体としてのその役割は、血小板がコラーゲンへの応答の特異的な欠如を示し、こ
の受容体を有しない、軽度の出血異常患者が日本で確認された後に確立された。
この患者はその不完全な受容体に対する自己抗体をも発達させていたので、この
自己抗体を使用してこの分子の特徴付けがさらに行われた。より近年には、ＧＰ
ＶＩが、複合体のシグナル伝達部として作用する共通のＦｃγサブユニットと非
共有結合的に会合していることが明らかにされた。ＧＰＶＩに対するコラーゲン
上の認識配列がコラーゲンの三重らせん構造内の反復したＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙ
ｐトリプレットであること、そしてこの構造に基づく合成ペプチドがＧＰＶＩに
対する特異的なアゴニストとして使用され得ることもまた明らかにされた。ＧＰ
ＶＩ／Ｆｃγ複合体は、ｐ７２^SYKの活性化を含み、キナーゼ／ホスファターゼ
／アダプタータンパク質の相互作用のカスケードによりＰＬＣγ２を活性化させ
、従って顆粒の放出および血小板の凝集に至る免疫受容体様の機構によって血小
板内部にシグナル伝達することが明らかにされた。この分子を特徴付けることに
おけるさらなる段階は、熱帯ガラガラヘビＣｒｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ
ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓから得られたヘビＣ型レクチンのコンブルキシン（ｃｏ
ｎｖｕｌｘｉｎ）が、多量体相互作用によりＧＰＶＩをクラスター化することに
よって血小板を活性化し得るということが明らかにされたことであった。コンブ
ルキシンは、ＧＰＶＩに特異的に結合することを示し、確立された方法と組み合
わせてこの受容体を精製する方法を提供する。

【０００５】 従って、ＧＰＶＩは、とりわけコラーゲン−血小板の相互作用に依存する血液
凝固事象に、直接的または間接的に関連する適用に関する多くの治療分野におい
て、非常に興味深い化合物であると考えられることは先行技術から明らかである
。従って、ＧＰＶＩを組換え形態で提供し、かつ直接的な治療標的としてのその
効力、または小さな化合物、特に、自然のコラーゲン−血小板相互作用を阻害ま
たは阻止する能力を有する化学合成化合物または化学合成可能な化合物、をスク
リーニングするためのツールとしてのその効力を示すことは本発明の目的であっ
た。

【０００６】 本発明はまた、コラーゲンに結合する、という生物学的活性を保持しているＧ
ＰＶＩタンパク質の一部分またはフラグメントに関する。

【０００７】 本発明は、予備的な特徴付けおよびペプチドの配列決定に十分な量のＧＰＶＩ
を精製することに成功した。その配列を使用して、ＤＮＡライブラリーにおける
陽性配列を同定するためのＰＣＲ用プライマーを設計した。このＤＮＡ配列は、
その後、ほぼ完全なｃＤＮＡ配列をライブラリーから単離するためのプローブと
して使用され、そして足りない５’−配列が、血小板のｃＤＮＡライブラリーか
らＲＡＣＥ法を使用して得られた。

【０００８】 本発明はまた、例えば、損傷を受けた血管壁を有する患者において投与された
ときに、コラーゲンに結合し、従って、膜結合型ＧＰＶＩを有する血小板が前記
コラーゲンに結合しないようにし得る治療に適用可能な化合物として、組換えＧ
ＰＶＩが使用されることを示すことにも成功した。ＧＰＶＩのこの組換え可溶性
細胞外ドメインは、コラーゲン結合部位を含有し、コラーゲンによる血小板の活
性化を妨げることができる。従って、このドメインは、アテローム硬化性斑破裂
などの、コラーゲンにより増大した血小板活性化を含む疾患状態の処置に、ある
いは不安定狭心症などの疾患において、あるいは血管壁に対する相当の損傷およ
び血小板の大きな活性化を生じさせ、そして多くの場合には血管の再閉鎖を後で
生じさせる、バルーンカテーテルの膨張によって動脈が再開通される経皮冠動脈
管腔拡張術（ＰＴＣＡ）などの手術的処置のときに適用することができると考え
られる。組換えＧＰＶＩフラグメントの利点は、現在の処置法と比較した場合、
フラグメントが、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａアンタゴニストによる凝集などの血小板
活性化後の事象を抑制することによるのではなく、むしろ血小板の活性化を妨げ
るか、または血小板の活性化を低下させることによって、より早い段階で作用す
るということである。従って、より少ない量の血小板顆粒内容物が放出される。
これには、外傷修復だけでなく、平滑筋遊走による血管壁の再構築、およびアテ
ローム性動脈硬化症の一因であることが知られている単球などの食細胞の引き寄
せにも関与している増殖因子およびケモカインが含まれる。ＧＰＶＩに対するヒ
ト化マウスモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントは、上記のような類似する
適用で血小板表面のＧＰＶＩを阻止するために類似した効果で使用することがで
きる。

【０００９】 本発明による組換えＧＰＶＩはまた、この相互作用を阻害することができ、か
つコラーゲン−血小板相互作用の阻害剤である治療化合物を開発するために使用
され得る（例えば、コンビナトリアルライブラリーの）小さな分子をスクリーニ
ングするために、コラーゲンに対する結合アッセイにおいて使用することができ
る。好適な誘導体化により、これらの化合物は経口的に利用することができる。
再度ではあるが、主要な目的は、ＧＰＶＩ−コラーゲンの相互作用を低下させ、
従って、血小板がコラーゲンと接触する状況で血小板の活性化を低下させる化合
物を調製することである。そのため、本発明において使用されているスクリーニ
ング技術自体は、先行技術において十分に確立されている。そのようなスクリー
ニングアッセイにより、本発明は、血小板表面に存在する天然の膜結合型ＧＰＶ
Ｉをコラーゲンアンタゴニストとして阻害し得る新しい標的の発見および開発を
可能にする。小さな化学物質分子であり得るそのような標的は、その後さらなる
発明の基礎となり得る。

【００１０】 ＧＰＶＩおよびＧＰＶＩの特定ドメインを認識する試薬の別の主要な適用は、
血小板の老化および機能性のマーカーとしての適用である。若い血小板は、一般
に、老化した血小板よりも活性であり、かつ機能的であると考えられる。若い血
小板は、ＧＰＶＩに特異的なヘビ毒液Ｃ型レクチンのコンブルキシンに結合し、
かつコンブルキシンにより活性化され、そして血小板は老化するに従って、その
結合および活性化度はともに低下する。これは、循環における血小板の活性化ま
たは損傷によるＧＰＶＩにおけるタンパク質分解的または立体配座的な変化ある
いはＦｃγとのその会合のいずれかのためであり得る。これは、医学的に管理さ
れている患者ならびに健常者における血小板の老化プロファイルおよび機能プロ
ファイルを測定するための有用なパラメータであり得る。血小板の老化プロファ
イルは、骨髄または免疫系を冒す多くの疾患において変化し、そのより良好な決
定方法が得られる場合には重要な診断基準になり得る。例えば、血小板の増大し
た代謝回転が関与する疾患患者はより多くの若い血小板を示し、これに対して、
化学療法または放射線処置を受けている患者は一様に老化した集団を示す。従っ
て、そのような老化プロファイルは、処置の精密なモニターリングに使用するこ
とができる。正常である健康な集団では、老化プロファイル分布について、そし
て健康における変化を予測するものとしてのその役割についてはほとんど知られ
ていていない。ＧＰＶＩの変化が止血事象における血小板の部分的な関与である
かどうか、そして変化が広範囲の心臓血管疾患を有する患者でより顕著であり得
るかどうかは知られていない。現在、チアゾールオレンジが、ｍＲＮＡを含有す
る若い網状化血小板を検出するために使用されている。このｍＲＮＡはすぐに崩
壊し、このため、この方法は最も若い血小板のみに制限されている。そのような
アッセイにおいて使用され得る試薬には、コンブルキシンなどのＧＰＶＩ特異的
なヘビ毒液タンパク質、あるいはＧＰＶＩのＮ末端領域を認識するモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体、あるいは無傷の分子に存在し、かつ老化した
分子には存在しない、またはその逆のＮ末端ドメインまたは特定の立体配置のタ
ンパク質分解により露出した新しい部位または立体配置を認識するモノクローナ
ル抗体、あるいは無傷のＧＰＶＩを特異的に認識する選択された小さな化学的実
体またはその改変形態が含まれる。これらの試薬は、血小板の結合プロファイル
を測定するために、蛍光マーカーで標識されるか、あるいは蛍光標識された二次
抗体またはアフィニティ試薬と一緒にされてフローサイトメトリーにおいて使用
される。代替可能な後者の段階では、血小板プロファイルの自動化された測定に
基づくあまり手間のかからない測定技術を採用することができる。フローサイト
メトリーまたは磁気ビーズによる細胞選別を使用することによって、若い血小板
および老化した血小板を単離して、老化した血小板の循環からの除去に関与する
因子を調べることが可能になるはずである。ＧＰＶＩの特定の形態を認識する試
薬は、そのような研究にとって重要である。

【００１１】 従って、糖タンパク質ＶＩまたはその生物学的活性フラグメントをコードする
ＤＮＡ、特に図２の配列を提供することは本発明の目的である。

【００１２】 図１ａおよび図１ｂのアミノ酸配列を含む糖タンパク質ＶＩをコードするＤＮ
Ａを提供することは本発明のさらなる目的である。

【００１３】 組換えＧＰＶＩを、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と一緒に含
む医薬組成物、ならびに血小板−コラーゲン間の相互作用に関連する血栓症的お
よび心臓血管系の事象および異常の治療分野における医薬品を製造するためのそ
の使用を提供することは本発明の別の目的である。

【００１４】 本発明の別の目的は、血小板−コラーゲン間の相互作用の特異的な阻害剤を検
出するスクリーニングツールにおける組換えＧＰＶＩの使用である。

【００１５】 本発明の別の目的は、心臓血管疾患に対する血小板の老化および露出のマーカ
ーとしてのＧＰＶＩの使用である。

【００１６】 考えられる医学的な症状および適用にはそれぞれ、例えば、不安定狭心症、Ｐ
ＴＣＡ、この分野におけるステントの使用、冠状動脈血管に対する手術、血管に
対する一般的な手術、股関節手術などのより大きな血管に損傷を与え得る手術が
ある。さらに、血管壁と、血栓形成および血管閉塞のリスクが高い凝固系との相
互作用の異常によって生じる血栓塞栓性事象に関連するすべての適応症が含まれ
る。

【００１７】 上記に示されているように、本発明によるＧＰＶＩタンパク質またはそのフラ
グメントは、医薬組成物および配合物における薬学的に効果的な化合物として好
適である。

【００１８】 本発明による医薬配合物は必要に応じて、ヒルジンまたはヘパリンなどの抗凝
固剤、あるいはプラスミノーゲン活性化因子またはヘメンチンなどの血栓溶解剤
、あるいはアブシキマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）またはエプチフィバチドのよう
なＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａアンタゴニストなどの他の血小板受容体に対するアンタ
ゴニスト、あるいはクロピドグレルなどのＡＤＰ受容体アンタゴニストのような
さらなる有効成分を含むことができる。

【００１９】 本発明による新規タンパク質およびその生物学的活性フラグメントは、それぞ
れ、任意の非毒性の有機酸または無機酸との薬学的に許容される塩を形成し得る
。無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸、ならびにオルトリ
ン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸金属塩である。有機酸の
例には、酢酸、グルコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタ
ル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、
ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮
酸、サリチル酸などのモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸、な
らびにメタンスルホン酸などのスルホン酸がある。カルボキシ末端アミノ酸残基
の塩には、任意の好適な無機塩基または有機塩基によって形成される非毒性のカ
ルボン酸塩が含まれる。これらの塩は、例えば、ナトリウムおよびカリウムなど
のアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アル
ミニウムを含むＩＩＩＡ族の軽金属、ならびにトリエチルアミン、プロカイン、
ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン
、ジヒドロアビエチルアミンおよびＮ−アルキルピペリジンを含む、トリアルキ
ルアミンなどの、有機の第一級、第二級、および第三級アミンを含む。

【００２０】 本明細書中で使用されている用語「薬学的に許容される担体」は、活性化合物
または患者と逆に反応を起こさない、不活性で非毒性の固体または液体の充填剤
材料、希釈剤材料またはカプセル化材料を意味する。好ましい液体担体はこの分
野ではよく知られており、例えば、滅菌水、生理食塩水、デキストロース水溶液
、糖の溶液、エタノール、グリコールおよびオイル（石油起源、動物起源、植物
起源または合成起源のものを含み、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油およびミネ
ラルオイル）などである。

【００２１】 本発明による配合物は、非経口投与に関して典型的な従来の非毒性の薬学的に
許容される担体、希釈剤、補助剤およびビヒクルを含有する単位用量物として投
与され得る。

【００２２】 用語「非経口」は、本明細書中では、皮下、静脈内、動脈内および気管内への
注射技術および注入技術を含む。また、経口投与および局所適用などの他の投与
法も好適である。非経口用の組成物および配合物は、最も好ましくは知られてい
る手法により、ボーラス剤の形態でまたは一定の注入物として静脈内投与される
。経口投与される錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤
、滑沢剤、崩壊剤および湿潤化剤などの従来の賦形剤を含有する。錠剤は、この
分野でよく知られている方法に従ってコーティングされ得る。

【００２３】 経口用の液体調製物は、水性または油状の懸濁物、溶液、エマルション、シロ
ップまたはエリキシル剤の形態であり得るか、あるいは使用前に水または他の好
適なビヒクルで再構成される乾燥製剤として提供され得る。そのような液体調製
物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤のような従来の添加剤を含
有させることができる。

【００２４】 局所適用剤は、水性または油状の懸濁物、溶液、エマルション、ゼリー、また
は好ましくはエマルション軟膏の形態であり得る。

【００２５】 本発明による単位用量物は、本発明によるタンパク質の１日必要量、あるいは
所望の用量を構成するその部分分割量を含有することができる。特定の患者（ヒ
トを含む哺乳動物）に対する最適な治療的に受け入れられる投薬量および投薬割
合は、用いられる特定の活性物質の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、
食事、投与時間および投与経路、クリアランス速度、処置目的（すなわち、治療
または予防）、ならびに処置される血栓症的疾患の性質、抗血小板活性または抗
凝固活性などの様々な要因に依存する。

【００２６】 従って、（ｉｎ ｖｉｖｏ）処置される患者で抗凝固剤として有用な組成物お
よび配合物において、本発明のポリペプチドの薬学的に効果的な日用量は、約０
．０１ｍｇ／ｋｇ体重と１００ｍｇ／ｋｇ体重との間であり、好ましくは約０．
１ｍｇ／ｋｇ体重と１０ｍｇ／ｋｇ体重との間である。適用形態に従って、１回
の単回用量物は、０．５ｍｇと１０ｍｇとの間のコラーゲン阻害剤を含有するこ
とができる。体外の血液において抗凝固作用を達成するためには、本発明のペプ
チドの薬学的に効果的な量は、０．２ｍｇ／ｌ体外血液と１５０ｍｇ／ｌ体外血
液との間であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ体外血液と２０ｍｇ／ｌ体外血液との間
である。

【００２７】 （図面の簡単な説明） （図１） ＧＰＶＩのタンパク質配列（１文字表記）を示す図である。

【００２８】 図１ａ：リーダー配列 図１ｂ：成熟タンパク質 オープンリーディングフレーム：３３９アミノ酸 アステリクス：グリコシル化部位 二重下線部：膜貫通ドメイン 下線部：配列決定定されたペプチド （図２） １０１７ｂｐのオープンリーディングフレームならびに３’領域および５’領
域を含むＧＰＶＩヌクレオチド配列（総数：１２４９ｂｐ）を示す図である。

【００２９】 （発明の詳細な説明） 遺伝暗号における最も低い縮重度を示す７アミノ酸の２つの配列を、ＰＣＲに
よってＧＰＶＩのｃＤＮＡの一部を増幅するためのＤＮＡプライマーを合成する
ために選んだ。タンパク質内の両ペプチドの位置は全く不明であったので、その
それぞれについて、１つのセンスと１つのアンチセンスの２つの縮重プライマー
を調製した。これらのプライマーを使用して、ヒト骨髄ライブラリーを増幅した
。配列ＰＡＭＫＲＳＬをコードするセンスプライマー５’ＴＹＡＴＨＣＣＮＧＣ
ＮＡＴＧＡＡＲＭＧ３’と、ＤＱＦＡＬＹＫに対応するアンチセンスプライマー
５’ＴＴＲＴＡＮＡＲＮＧＣＲＡＡＹＴＧＲＴＣ３’との組合せにより、２２１
ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅された。選択されたペプチドに加えて、増幅さ
れたＤＮＡは、ＬｙｓＣ／ＡｓｐＮペプチドのＤＱＬＥＬＶＡＴＧＶＦＡＫＰＳ
ＬＳＡＱＰＧＰＡＶＳＳをコードした。これにより、この配列はＧＰＶＩのｃＤ
ＮＡに明らかに連結された。

【００３０】 この２２１ｂｐのＤＮＡフラグメントを用いて骨髄ライブラリーから６００．
０００ｐｆｕをスクリーニングすることにより、４個の陽性ｐｆｕが得られた。
３つは、制限酵素ＳａｌＩまたはＥｃｏＲＩで切断しても１３５０ｂｐの挿入断
片を有し、ＩｇＧスーパーファミリーに属した。４個目は、ＳａｌＩ消化による
４．６ｋｂの挿入断片を有し、ＥｃｏＲＩで処理したときにそれぞれ２３００ｂ
ｐおよび１３００ｂｐの２つのフラグメントをもたらした。そのＤＮＡは、ＧＰ
ＶＩのアミノ酸配列決定に由来する１０個のペプチドに対する配列をコードして
いたが、アミノ末端に達しないところで停止していた。開始メチオニンまたはリ
ーダー配列を見出すことができなかったが、Ａｌｕ配列で終了する、以前に配列
決定された非リーディングフレームＤＮＡの２０００ｂｐ以上が存在していた。
５’末端ＲＡＣＥ実験を、それらのペプチドの配列によって裏付けられたＧＰＶ
Ｉ配列の一部分内に位置するプライマーを用いて血小板のポリＡ ＲＮＡに対し
て行った。４番目のクローンの配列における２７８ｂｐを含む３４８ｂｐのフラ
グメント、および最初のメチオニンを含む１４アミノ酸に対応する１９８７ｂｐ
に由来する新しい７０ｂｐが見出され、その後、確立されたＧＰＶＩ配列に達し
た。従って、合計で１２４９ｂｐ、すなわち、開始コドンの上流の２５ｂｐの５
’配列、リーダー配列を含み、３３９アミノ酸を有するタンパク質をコードする
１０１７ｂｐのオープンリーディングフレーム、および停止コドンを含む２０７
ｂｐの３’領域を含有するｃＤＮＡを配列決定することができた。

【００３１】 血小板ＧＰＶＩをコードするｃＤＮＡが、不足する５’配列を補充するための
血小板ｍＲＮＡを用いたＲＡＣＥを使用して、ヒト骨髄のｃＤＮＡライブラリー
からクローン化され、そして配列決定された。１０１７ｂｐのオープンリーディ
ングフレームは３３９個のアミノ酸をコードし、非翻訳３’領域を有する。アミ
ノ酸配列の疎水性分析により、２つの推定的な膜貫通ドメイン、推定的な２０ア
ミノ酸シグナル配列、および成熟タンパク質の残基２４７と残基２６５との間の
１９アミノ酸ドメインが存在することが明らかにされた。配列およびそのアミノ
酸翻訳を図２および図１に示す。ＧｅｎＢａｎｋの検索において見出された最も
類似する分子のアミノ酸配列と比較することにより、ＧＰＶＩは免疫グロブリン
スーパーファミリーに属すること、およびその細胞外ドメインは、２つのジスル
フィド架橋により形成された２つのＩｇＣ２ドメインループを含有することが明
瞭にされる。ＧＰＶＩは、Ｎ末端を外側に有する膜横断タンパク質クラスの分子
であり、膜を１回横断する。最も近縁の分子は、阻害タイプおよび活性化タイプ
の両方を含有するナチュラルキラー受容体クラスに属する。ＧＰＶＩは、その機
能によるだけでなく、阻害クラスとは異なり、ＩＴＩＭ配列をその細胞質ドメイ
ンに含有しないために活性化サブクラスに属することは明らかである。ＧＰＶＩ
は、リン酸化に関与し得るチロシン残基を１つも含有しない。このドメインには
数個のトレオニン残基およびセリン残基が存在するが、それらは、キナーゼのコ
ンセンサス配列に対する基準を何ら満たさない。ＮＫ受容体の活性化クラスと同
様に、ＧＰＶＩは、Ｆｃγサブユニットとの複合体形成に関与する膜横断ドメイ
ンの３番目のアミノ酸としてアルギニン残基を含有する。細胞質ドメインは、こ
のファミリーの他のメンバーの細胞質ドメインに対する（膜のすぐ下流の領域に
おける）わずかな類似性のみを示す５１個のアミノ酸を含有する。このことは、
ＧＰＶＩにおけるこのドメインは、それ以外のファミリーメンバーとは異なるタ
イプの細胞質分子と会合し得ることを示唆している。ＧＰＶＩは、１個の推定的
なＮ−グリコシル化部位をＡｓｎ６９に含有するだけである。しかし、Ｉｇドメ
インのβシートが終了した後の膜のすぐ上流のドメインは、ＧＰＩｂαおよびＧ
ＰＶにおいて見出されているようなＯ−グリコシル化部位を提供し得るトレオニ
ン残基およびセリン残基が多い。このＯ−グリコシル化の主要な機能は、その嵩
張ったリガンドとの相互作用を容易にするために血小板表面から十分に広がった
受容体構造体を提供することであると考えられる。ＧＰＶＩはシアロ糖タンパク
質としてより以前には明らかにされていたので、理論的なアミノ酸質量（３７ｋ
Ｄａ）とゲル電気泳動で決定された質量（６５ｋＤａ、還元）との分子量の差は
、このグリコシル化のためであるに違いない。

【００３２】 この２つのドメインタイプのナチュラルキラー受容体の構造が、Ｘ線結晶学研
究によって明らかにされ、そして２つのＩｇドメインが、ひじ部の外側に位置す
るペプチド保有ＨＬＡ抗原の受容体部位とともに鋭角を形成していることが示さ
れた。ＨＬＡペプチド結合部位の構造をコラーゲンの構造と直接比較することに
より、それが含有するＨＬＡ結合部位およびペプチドの多数のα−らせん構造が
コラーゲンの三重らせん構造に非常に類似しているので、直ちに、なぜこれらの
受容体が共通の起源を有するかが示唆される。ナチュラルキラー受容体は、ナチ
ュラルキラー細胞が調べている細胞における２つの離れたＨＬＡ部位を認識する
２つの受容体による二量体化機構によって作用することが推定される。おそらく
は、この二量体化は、受容体のクラスに依存した活性化機構または失活化機構の
一部である。ＧＰＶＩの場合、２つのＧＰＶＩ分子が１つのＦｃγと会合する可
能性があり得る。これは、Ｆｃγダイマーの各モノマーが認識部位を有するから
である。しかしながら、化学量論は未だ知られておらず、そしてコラーゲンの構
造、ＧＰＶＩおよびコンブルキシンを介して作用するコラーゲン様ペプチドとの
構造に基づいて、シグナルの強さが、一緒にクラスター化しているＧＰＶＩ／Ｆ
ｃγ複合体の数に関連することは確からしい。このＩｇファミリーに属する他の
血小板受容体には、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）およびＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）
が含まれる。

【００３３】 請求された発明に関連して直接的に明細書中に記載されていない微生物、細胞
株、発現システム、発現宿主、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製
起源、ベクターの制限部位あるいは他のフラグメントまたは部分は、すべて市販
されているか、そうでなければ、一般に手に入れることができる。他の示唆が与
えられていない場合、それらは例として使用されるだけであり、本発明に関して
必須ではなく、従って他の好適なツールおよび生物学的材料によりそれぞれ置き
換えることができる。

【００３４】 本発明により必須である技術は、下記および上記に詳しく記載されている。詳
しく記載されていない他の技術は、当業者によく知られている、知られた標準的
な方法に対応しているか、あるいは引用された参考文献および特許明細書に、そ
して標準的な文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）にさらに詳しく記載されている。

【００３５】 （実施例） 実施例１：材料−プロテインＡ−セファロース、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
マウス抗体およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体、ウシ血清アルブミン
、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ毒液、コムギ胚
芽凝集素（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ；ＷＧＡ）、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルクロロホルマート活性化架橋４％ビーズ状アガロース
ならびにトリトンＸ−１１４をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．（Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｏ
ＮＭＧ）およびノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＮＮＭＧ）をＯｘｙｌ Ｃ
ｈｅｍｉｅ（Ｂｏｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）から入手した。

【００３６】 実施例２：血小板からのＧＰＶＩの単離−膜糖タンパク質を、以前に記載され
たようにして血小板から単離した。簡単に記載すると、血小板（４０の軟膜に由
来）を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤の存在下、２％トリトンＸ−１１４中で溶解
した。トリトンＸ−１１４および水相を分離し、界面活性剤相を、セファロース
４Ｂに結合させたコムギ胚芽凝集素のカラムに負荷した。血小板糖タンパク質を
、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％
オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＯＮＭＧ）および２％Ｎ−アセチルグル
コサミンにおいて溶出した。透析および濃縮を行った後、糖タンパク質の溶液を
、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミジル−ｐ−ニトロフェニルクロロホルマート活性
化架橋４％ビーズ状アガロースに結合させたコンブルキシンのカラム（１ｍｇ／
ｍｌ）に負荷した。カラムを、４容量の１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４
）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＮＮＭ
Ｇ）で洗浄し、次いで４容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３
０ｍＭ ＮａＣｌおよび２％ＮＮＭＧで洗浄した。ＧＰＶＩを、０．０８％ＳＤ
Ｓを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出した。溶液を濃縮し
、４９１型Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ、ＣＡ）を使用する８．５％ポリ
アクリルアミドの調製用ゲルに負荷した。調製用電気泳動を製造者の説明書に従
って非還元条件下で行った。ＧＰＶＩは６５ｋＤａの単一バンドとして溶出した
。この画分をまとめ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ、ＭＡ）で濃縮し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．１
％ＯＮＭＧに再懸濁した。

【００３７】 実施例３：ＧＰＶＩのアミノ酸分析−ＧＰＶＩをエンドプロテイナーゼＬｙｓ
ＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐＮ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ、ドイツ）で消化した。得られた１０個のペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離し
、１２０Ａ型オンラインフェニルチオヒダントインアミノ酸分析計を備えたＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の４７７Ａ型パルス液相タンパク質シーケン
サで配列決定した。

【００３８】 実施例４：ＧＰＶＩの一部をコードする２２１ｂｐフラグメントのλｇｔ１１
ｃＤＮＡライブラリーからの増幅− ヒト骨髄ライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に
由来するサンプル（１０¹⁰ｐｆｕ）（プラーク形成単位）を、４つの縮重プライ
マーの２つの組合せを使用して増幅した。プライマーの最終濃度は２μＭであり
、ｄＮＴＰ濃度は２００μＭであり、２Ｕ／１００μｌ反応物のＡｍｐｌｉＴａ
ｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）を使用
した。ＰＣＲ条件は、３７℃での５サイクル、その後、４４℃での３０サイクル
であった。５’ＴＹＡＴＨＣＣＮＧＣＮＡＴＧＡＡＲＭＧ３’のセンス１９ｍｅ
ｒおよび５’ＴＴＲＴＡＮＡＲＮＧＣＲＡＡＹＴＧＲＴＣ３’のアンチセンス２
０ｍｅｒにより、２２１ｂｐのフラグメントが増幅され、これをＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＫＳ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にサブクロー
ン化し、Ｔ７Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スイス）を使用
して配列決定した。

【００３９】 実施例５：２２１ｂｐのＧＰＶＩプローブを用いたλｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニング−２２１ｂｐのフラグメントをプラスミドから切断し
、清浄化し、Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、スイス）を使用してα³²Ｐ−ＡＴＰ（２０ＭＢ
ｑ／５０μｌ、Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｋ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ、ドイツ）で標識した。ヒト骨髄ライブラリーを製造者の説明書に従ってスク
リーニングした。陽性ファージを増殖させ、そのＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ部
位またはＳａｌＩ部位のいずれかを使用してＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにサブクロー
ン化し、配列決定した。配列決定を、ＲＡＣＥのＡＢＳシステムを用いて行った
。血小板のポリＡ ＲＮＡを、以前に記載されたようにして調製した（Ｐｏｗｅ
ｒ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７、４７９〜４８２、１９９５）。逆転写（３０μｌ
）を、５μｇのポリＡ ＲＮＡを、プライマー５’ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＣＧＧＴ
ＣＡＧＴＴＣＡＧＣ３’（２０μＭ）、ｄＮＴＰ（１ｍＭ）、ＲＮＡｓｉｎ（４
０Ｕ）、１Ｘ ＡＭＶ緩衝液、および２０ＵのＡＭＶ逆転写酵素とともに使用し
て４５℃で２０分間行い、その後、５２℃で２０分間行った。反応混合物を２μ
ｌの６Ｎ ＮａＯＨで６５℃において３０分間処理し、２μｌの６Ｎ酢酸で中和
して、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。アンカーをＡｐｔ
ｅｓおよびＳｉｅｂｅｒｔのプロトコル（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５：
８９０〜８９３、１９９３）に従って第１鎖ＤＮＡに連結した。ネスティッドＰ
ＣＲを、アンカーに相補的なプライマーおよびプライマー５’ＴＴＧＴＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＡＡＴＴＧＧＴＣ３’を使用して行い（３５サイクル、５５℃）、その
後、プライマー５’ＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧ３’を使用して
行った（５３℃で３０サイクル）。最も大きなバンド（３５０ｂｐ）を、それよ
りも小さいバンドからアガロース電気泳動で分離し、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにサ
ブクローン化して、配列決定した。

【００４０】 実施例６：抗ＧＰＶＩＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂の調製−ヒトＧＰＶＩに対
するポリクローナル抗血清をウサギにおいて生成させた。ＩｇＧを、ウサギ抗Ｇ
ＰＶＩ抗血清から、記載されたようにして精製した。Ｆａｂフラグメントを生成
させるための固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）によるＩｇＧの消化を供給者の標
準的なプロトコルに従って行った。Ｆａｂフラグメントを、固定化プロテインＡ
（Ｓｉｇｍａ）カラムを使用して未消化ＩｇＧおよびＦｃフラグメントから分離
した。素通り部分を透析チューブに移し、固体のポリエチレングリコール２０，
０００を使用して濃縮し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍ
ＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析し、そして使用するまで４℃で保
存した。Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを、０．５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）
中における３７℃で１８時間にわたるＩｇＧのペプシン消化（１：５０の酵素対
基質比（ｗ／ｗ））によって調製した。ｐＨを希ＮａＯＨで７．４に調節し、サ
ンプルを２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４）に対して透析し、その後、Ｆ（ａｂ’
）₂フラグメントを、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して未消化ＩｇＧ
およびＦｃフラグメントから分離した。素通り部分を透析チューブに移し、固体
のポリエチレングリコール２０，０００を使用して濃縮し、２０ｍＭのＨｅｐｅ
ｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析
し、小分けして−２０℃で保存した。洗浄した血小板をトリトンＸ−１１４中で
溶解し、相分離を可溶物に対して行い、その後、トリトンＸ−１１４相と会合し
た膜糖タンパク質を、以前に記載されたようにしてコムギ胚芽凝集素−セファロ
ース４Ｂでのアフィニティークロマトグラフィーで分離した。ＧＰＶＩは血小板
膜糖タンパク質プールの非常に小さな画分を示すので、本発明者らは、この受容
体を分離するために、ヘビＣ型レクチンのコンブルキシンの特異性を使用した。
セファロース４Ｂに結合させたコンブルキシンでのアフィニティークロマトグラ
フィーにより、６５ｋＤａのタンパク質が主生成物として得られた。しかし、そ
れよりも大きなＭｒおよびそれよりも小さなＭｒの両方の特徴付けられない物質
がＧＰＶＩと同時に溶出し、これらはカラムの徹底的な洗浄で除去できなかった
。８．５％ポリアクリルアミドでの調製用ゲル電気泳動を精製の最終ステップと
して加えた。ＧＰＶＩを含有する画分をまとめ、これは再分析で単一バンドを示
した。精製ＧＰＶＩを、コラーゲンによる血小板凝集を阻止するその能力につい
て試験した。わずかな阻害作用が、ＧＰＶＩ溶液の一部を血小板懸濁液に加えた
ときに認められた。しかし、混合物を血小板懸濁物に加える前にＧＰＶＩをコラ
ーゲンとプレインキュベーションすることによって、凝集は用量依存的に阻害さ
れた。これらの血小板は、新たなコラーゲンが添加されたときにもやはり凝集し
た。非還元条件下において、この単離されたタンパク質は６２ｋＤａのＭｒを有
し、還元条件下ではわずかに大きなＭｒ（６５ｋＤａ）に変化した。ＧＰＶＩの
アミノ末端はブロックされていることが見出されたので、タンパク質を、配列が
得られる４個のペプチドおよび６個のペプチドをそれぞれもたらす酵素ＬｙｓＣ
および酵素ＬｙｓＣ／ＡｓｐＮで消化した。これらのペプチドをＣ４カラムでの
逆相ＨＰＬＣで分離し、エドマン法を使用して配列決定した。これらのペプチド
のアミノ酸配列には、翻訳されたｃＤＮＡ配列（図１）において下線が引かれて
いる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧＰＶＩのタンパク質配列（１文字表記）を示す図である。 図１ａ：リーダー配列 図１ｂ：成熟タンパク質 オープンリーディングフレーム：３３９アミノ酸 アステリクス：グリコシル化部位 二重下線部：膜貫通ドメイン 下線部：配列決定定されたペプチド

【図２】 １０１７ｂｐのオープンリーディングフレームならびに３’領域および５’領
域を含むＧＰＶＩヌクレオチド配列（総数：１２４９ｂｐ）を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 クレメトソン、ケネス、ジェイ． スイス国 シーエイチ−3065 ベルン フ ルラクカー 29 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA25 AA40 BA13 CA24 DA12 DA13 DA14 DA36 DA44 DA77 FA36 FA37 FB03 FB05 FB06 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 HA01 HA11 4C084 AA07 BA01 BA22 BA23 CA62 NA14 ZA36 ZA54 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 糖タンパク質ＶＩまたはその生物学的活性フラグメントをコ
   ードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 図２の配列の一部または全体を含む請求項１に記載のＤＮＡ
   。
3. 【請求項３】 図２の配列を有するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 図１ａおよび図１ｂのアミノ酸配列を含む糖タンパク質ＶＩ
   をコードする請求項１から３に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 図１ｂのアミノ酸配列を含む、医薬品としての組換えヒト糖
   タンパク質ＶＩ。
6. 【請求項６】 請求項５に記載されるタンパク質と、それに対する薬学的に
   許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
7. 【請求項７】 薬理学的に活性な化合物をさらに含む医薬組成物。
8. 【請求項８】 血小板−コラーゲン間の相互作用の特異的な阻害剤を検出す
   るためのスクリーニングツールにおける組換えＧＰＶＩの使用。
9. 【請求項９】 血小板−コラーゲン間の相互作用に関連する血栓症的および
   心臓血管系の事象および異常の治療分野における医薬品を製造するための組換え
   ＧＰＶＩの使用。
10. 【請求項１０】 血栓症的および心臓血管系の状態または事象に対する血小
    板老化および血小板露出のマーカーとしてのＧＰＶＩにおける変化の使用。