KR101631740B1 - 모에신 단편의 진단학적 및 치료학적 용도 - Google Patents

Abstract

본 출원은 혈소판의 활성 및 정량을 조절하고, 혈소판의 비정상적인 활성 및 정량과 관련된 장애 또는 질환을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

모에신 단편의 진단학적 및 치료학적 용도{DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES OF MOESIN FRAGMENTS}

본 출원은 자가면역 질환에 관한 분자 생물학 및 의학 연구 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 혈소판의 활성 및 정량 조절을 위한, 모에신 단편 및 모에신 단편에 대한 항체의 용도에 관한 것이다.

자가면역 질환은 자기 자신의 물질 및 조직에 대한 면역계의 이상 반응으로부터 유발된 질환이다. 80가지 초과의 상이한 유형의 자가면역 질환이 존재하는데, 이는 통틀어 만성 질병 원인 중 2위, 및 최대 64세까지인 모든 연령군의 여성에서 상위 10가지 주요 사망 원인 중 하나에 해당된다.

이에, 자가면역 질환의 기전을 이해하고, 효과적인 진단 및 치료를 찾아내고자 하는 데 상당한 의학적 연구 노력을 기울여 왔다. 현재 다수의 자가면역 질환은 자가항체의 존재 및 비바람직한 활성을 특징으로 한다. 이러한 자가항체는 대개 정상적인 및 건강한 자가 항원을 인식하여 그에 결합함으로써 관련된 조직 및 기관에 상당한 손상 및 기능상실을 유발한다.

면역성 혈소판 감소증은 혈액 중의 혈소판을 파괴하는 면역계의 공격으로 인해 혈소판 계수가 비정상적으로 낮아진 것을 특징으로 하는, 자가면역성 혈액 질환이다. 혈소판 파괴는 환자 자신의 혈소판에 대한 항체인 것인 항혈소판 자가항체의 존재에 기인한다. 이와 같이 혈소판 계수가 낮으면 타박상, 잇몸 출혈 또는 비출혈이 쉽게 일어날 수 있고, 이보다 드물긴 하지만, 심각한 내출혈도 일어날 수 있다.

혈전증은 혈관 중 혈괴가 형성되는 것인데, 이는 혈관내 혈류를 폐쇄시키고, 그 결과, 심혈관계의 기능을 심하게 방해한다. 혈전증은 혈소판의 비정상적인 활성화 및 응집과 관련이 있는 것으로 여겨진다.

항인지질 증후군 (APS)은 항인지질 (aPL) 항체, 특히, 카디오리핀 및 베타2 당단백질에 대한 항체가 존재하는 것을 특징으로 한다. APS는 동맥 및 정맥 둘 모두에서 혈전증을 유발할 수 있을 뿐만 아니라, 유산 및 모계 및 태아의 이환을 유발할 수 있다. 임의의 기저 질환에 관한 어떤 증거도 발견되지 않은 원발성 항인지질 증후군 (PAPS) (문헌 [Asherson, R. A., et al., (1989) Medicine 68:366-374]), 및 APS가 다른 질환, 예컨대, 전신 홍반 루푸스 (SLE)와 관련이 있는 것인 속발성 항인지질 증후군 (SAPS) (문헌 [Alarcon-Segovia, D. et al., (1989) Medicine 68:353-365])이라는 2가지 형태의 APS가 기술된 바 있다.

본 출원은 혈소판의 활성 및 정량을 조절하고, 혈소판의 비정상적인 활성 및 정량과 관련된 장애 또는 질환을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 추가로, 본 출원은 혈소판의 비정상적인 활성 및 정량과 관련된 장애 또는 질환을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 섹션 중 하기에서 사용되는 특정의 관련된 용어는 본 출원의 정의 섹션에서 정의된다.

한 측면에서, 본 출원은 샘플을, 모에신 단편에 대한 제1 항체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 수준 (즉, 활성 및/또는 정량)을 억제시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에게 제약상 유효량의, 모에신 단편에 대한 제1 항체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환은 혈전증, APS (예컨대, PAPS 또는 SAPS), 유산 (예컨대, 습관성 유산), 항인지질 (aPL) 항체-매개 혈전증 (aPL-혈전증), 항인지질-증후군-관련 임신 합병증 (APS-관련 임신 합병증), 또는 고혈소판증 (예컨대, 원발성 고혈소판증 또는 속발성 고혈소판증)이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 샘플을, 모에신 단편을 포함하는 제1 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판 수준을 조절하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편에 대한 자가항체를 함유하거나, 함유할 것으로 의심되는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에게 제약상 유효량의, 모에신 단편을 포함하는 제1 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 대상체에서 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편에 대한 자가항체를 가지거나, 가지는 것으로 의심되는 것이다. 특정 실시양태에서, 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환은 면역성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증 및 속발성 혈소판 감소 자반증 (예컨대, 혈전성 혈소판 감소 자반증, 또는 용혈 요독 증후군을 동반한 혈전성 혈소판 감소 자반증), 용혈, 간 효소 상승 및 저 혈소판 증후군 (HELLP 증후군), 파종 혈관내 응고, 전신 홍반 루푸스 및 재생불량 빈혈이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 샘플을 모에신 단편에 대한 제2 항체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 수준을 자극시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에게 제약상 유효량의, 모에신 단편에 대한 제2 항체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 대상체에서 혈소판의 수준을 자극시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 샘플을, 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 수준을 억제시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편에 대한 자가항체를 함유하거나, 함유할 것으로 의심되는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에게 제약상 유효량의, 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 대상체에서 혈소판의 수준을 억제시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편에 대한 자가항체를 가지거나, 가지는 것으로 의심되는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에게 제약상 유효량의, 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인, 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편에 대한 자가항체를 가지거나, 가지는 것으로 의심되는 것이다. 특정 실시양태에서, 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환은 혈전증, APS (예컨대, PAPS 또는 SAPS), 유산 (예컨대, 습관성 유산), aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증, 또는 고혈소판증 (예컨대, 원발성 고혈소판증 또는 속발성 고혈소판증)이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 (i) 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 단편을 포함하는 제1 펩티드와 접촉시키는데, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인 단계; (ii) 상기 제1 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 제1 펩티드에 결합하는 항-모에신 자가항체가 샘플 중에, 참조 샘플로부터 수득된 정상 수준보다 더 높은 수준으로 존재한다면, 이는 대상체에서 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 위험이 높다는 것을 나타내는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 (i) 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드와 접촉시키는데, 여기서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 것인 단계; (ii) 상기 제2 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 제2 펩티드에 결합하는 항-모에신 자가항체가 샘플 중에, 참조 샘플로부터 수득된 정상 수준보다 더 높은 수준으로 존재한다면, 이는 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 위험이 높다는 것을 나타내는 것이다.

특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.

특정 실시양태에서, 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 대략적으로 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로부터의 아미노산 잔기로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-574, 471-575, 471-576, 471-577, 472-574, 472-575, 472-576, 472-577, 473-574, 473-575, 473-576, 473-577, 474- 574, 474-575, 474-576, 또는 474-577 사이의 영역으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-487, 488-501, 502-577, 및 471-577 사이의 영역으로부터의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 전체 C-말단 테일 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인의 임의의 실질 부분을 함유하지 않는다. 본원에서 사용되는 바, "실질 부분"이라는 용어는 전체 관련 도메인 (나선형 도메인 또는 N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)에 결합할 수 있는 항체에의 특이 결합에 대하여 관련 도메인 (나선형 도메인 또는 N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)과 경쟁할 수 있는 상기 관련 도메인 (나선형 도메인 또는 N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)의 일부를 의미한다.

특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-487 사이의 영역으로부터의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 488-501 사이의 영역으로부터의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 502-577 사이의 영역으로부터의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.

특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-487, 488-501, 502-577, 및 471-577로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유하다.

특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인의 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인의 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.

특정 실시양태에서, 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 대략적으로 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로부터의 아미노산 잔기로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-294, 1-295, 1-296, 1-297, 2-294, 2-295, 2-296, 2-297, 3-294, 3-295, 3-296, 3-297, 4-294, 4-295, 4-296 또는 4-297 사이의 영역으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 전체 N-말단 FERM 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편의 아미노산 잔기로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-94, 95-201, 202-297, 및 1-297 사이의 영역으로부터의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 임의의 실질 부분을 함유하지 않는다.

특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-94 사이의 영역으로부터의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 95-201 사이의 영역으로부터의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 202-297 사이의 영역으로부터의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.

특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-94, 95-201, 202-297, 및 1-297로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.

또 다른 측면에서, 본 출원에 기술된 제1 및/또는 제2 펩티드는 캐리어 폴리펩티드를 추가로 포함한다. "캐리어 폴리펩티드"라는 용어는 본 출원의 펩티드의 모에신 단편에 접합될 수 있는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 캐리어 폴리펩티드는 예컨대, 본 출원의 펩티드의 안정성, 가용성, 특이 또는 비-특이 결합 친화성 및/또는 기능을 촉진시키는 것에 있어서 본 출원의 펩티드에 유익할 수 있다. 그러나, 본 출원의 펩티드에 어떤 이익이나 또는 심지어는 생물학적 기능을 제공하는 데 있어서 캐리어 폴리펩티드가 요구되는 것은 아니다. 보편적으로 사용되는 캐리어 폴리펩티드로는 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 항체 단편, 예컨대, 항체 불변 영역을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 제1 및 제2 펩티드와 접촉시키는데, 여기서, 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 제1 모에신 단편을 포함하고, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 제2 모에신 단편을 포함하는 것인 단계, 및 제1 및 제2 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 각각 제1 및 제2 펩티드에 결합한 항-모에신 자가항체의 상이한 수준이 대상체에서 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 상이한 단계 및 중증도와 상관관계가 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드의 항-모에신 항체에의 결합에 대하여 샘플을 시험한 후, 제2 펩티드의 항-모에신 항체에의 결합에 대하여 시험한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 펩티드의 항-모에신 항체에의 결합에 대하여 샘플을 동시에 시험한다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드의 항-모에신 항체에의 결합에 대하여 샘플을 시험한 후, 제1 펩티드의 항-모에신 항체에의 결합에 대하여 시험한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물의 제조에서 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편에 대한 제1 항체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물의 제조에서 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편에 대한 제2 항체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물의 제조에서 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 제1 펩티드의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 제약 조성물의 제조에서 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 진단을 위한 진단용 조성물의 제조에서 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 제1 펩티드의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 진단을 위한 진단용 조성물의 제조에서 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 제1 펩티드, 및 검출용 시약을 포함하는, 대상체에서 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 검출용 시약은 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 펩티드는 고체상에 결합되어 있다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 제2 펩티드, 및 검출용 시약을 포함하는, 대상체에서 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은

(i) APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)를 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 펩티드를 포함하는 조성물과 접촉시키는데, 여기서, 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 것인 단계;

(ii) 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하고, 펩티드에 결합된 항-모에신 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및

(iii) 항-모에신 자가항체의 수준을, 항-모에신 자가항체의 역가와 APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)의 병리학적 상태의 상관관계를 보여주는 이환된 참조 샘플로부터 수득된 참조 데이터베이스와 비교함에 따라 대상체의 병리학적 상태를 결정하는 단계를 포함하는, APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)를 앓는 대상체의 병리학적 상태를 결정하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 항-모에신 자가항체의 역가와, 대상체에서의 혈소판 계수의 수준 사이의 관계를 보여주는 참조 곡선이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은

(i) APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)를 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 펩티드와 접촉시키는데, 여기서, 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 것인 단계;

(ii) 상기 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하고, 펩티드에 결합된 항-모에신 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및

(iii) 항-모에신 자가항체의 수준을, 항-모에신 자가항체의 역가와 APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)의 병리학적 상태의 상관관계를 보여주는 이환된 참조 샘플로부터 수득된 참조 데이터베이스와 비교함에 따라 대상체의 병리학적 상태를 결정하고, 여기서 역가의 감소는 대상체가 해당 치료법에 대하여 양성 반응을 보임을 나타내는 것인 단계를 포함하는, APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)에 대한 치료를 받고 있는 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 상이한 단계의 치료법에서 항-모에신 자가항체 수준에 대한 데이터를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 (i) 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인의 8개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를, 대상체로부터 수득된 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 항-모에신 자가항체가 상기 샘플 중에, 참조 샘플 중의 상기 항-모에신 자가항체 수준보다 더 큰 수준으로 존재하는지 여부를 결정하고, 이로써 대상체가 APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)를 앓는지를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 APS (또는 혈전증 또는 다른 질환 또는 장애)를 진단하는 방법을 제공한다.

도 1은 전장의 인간 모에신 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 나타낸 것이다.
도 2는 모에신 단편: N-말단 FERM 도메인 (서열 번호 2), 나선형 및 C-말단 테일 도메인 (서열 번호 3), 나선형 도메인 (서열 번호 4) 및 C-말단 테일 도메인 (서열 번호 5)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 전장의 인간 모에신 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 (서열 번호 6)을 나타낸 것이다 (여기서, 밑줄로 표시된 첫번째 부분은 모에신의 N-말단 FERM 도메인을 코딩하는 cDNA 서열이고, 밑줄로 표시된 두번째 부분은 모에신의 C-말단 테일 도메인을 코딩하는 cDNA 서열이다).
도 4는 pET32a(+) 발현 벡터의 클로닝 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pET28a(+) 발현 벡터의 클로닝 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 항-모에신 N-말단 도메인 항체, N-말단 FERM 도메인 또는 ADP의 존재하에서의 CD62P 및 CD63의 발현을 도시한 그래프이다.
도 7은 혈소판 활성화에 대한 각종 억제제와 함께 조합된 항-모에신 N-말단 도메인 항체, N-말단 FERM 도메인 또는 ADP의 존재하에서의 CD62P 및 CD63의 발현을 도시한 그래프이다.
도 8은 ADP 또는 항-모에신 N-말단 도메인 항체와 함께 조합된 N-말단 FERM 도메인, 항-모에신 C-말단 테일 도메인 항체 또는 RGDS의 존재하에서의 혈소판 응집의 억제율을 도시한 그래프이다.
도 9는 상이한 환자군의 혈청 중 5가지의 상이한 자가항체의 존재를 도시한 그래프이다.

본 발명을 수행하기 위한 모드

달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 실시는 당업계의 기술 내에 포함되는, 종래의 (재조합 기법을 비롯한) 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기법을 이용할 것이다. 상기 기법은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" series (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 정기 간행물의 최신판)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 상세하게 설명되어 있다. 본 출원에서 사용되는 프라이머, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 지닌다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]는 당업자에게 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대한 일반적인 가이드를 제공한다.

정의

"모에신"이라는 용어는 문헌 [Lankes and Furthmayr (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:8297-8301]에 기술되어 있는 바와 같이, 막-조직화 연장 스파이크 단백질(membrane-organizing extension spike protein)을 나타낸다. 전장의 인간 모에신 단백질은 도 1에 제시된 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 가지는, 577개의 아미노산으로 된 폴리펩티드이다. 모에신 단백질은 하기에 추가로 정의되는 바와 같이, N-말단 FERM 도메인, 나선형 도메인, 및 C-말단 테일 도메인인 3개의 도메인으로 이루어진다. 이는 ERM (에즈린-라딕신-모에신) 패밀리에 속한다. 주로 형질막 바로 밑의 세포질에서 발현되는 3개의 ERM 단백질은 고도의 서열 상동성을 공유하며, 형질막과 액틴 세포골격 사이의 연결 단백질로서 작용한다. 추가로, 인간 모에신 단백질은 다른 종으로부터의 모에신, 예컨대, 마우스 및 소 모에신과 고도의 서열 상동성을 공유한다 (문헌 [Sato et al. (1992) J. Cell Sci. 103:131-143].

"모에신 단편"이라는 용어는 전장의 야생형 모에신 단백질보다 짧으며, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 도메인-특이 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 상기와 같은 모에신 단편이 본 출원에서 유용하다. 모에신 단편의 "단편"이라는 용어는 상기 모에신 단편보다 짧으며, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 모에신 단편의 일부를 의미한다.

인간 모에신 단백질의 "N-말단 FERM 도메인"이란 구조상 상기 단백질의 아미노-말단에 가장 가깝게 위치하고 있으며, 기능적으로는 단백질을 형질막으로 국소화시키는 것, 및 부착 분자와 상호작용하는 것을 담당하는 야생형 인간 모에신 단백질의 구형 부분을 의미한다. 밴드 4.1 단백질과 상동성이라는 이유에서 밴드 4.1 단백질, 에즈린, 라딕신, 모에신 상동성 도메인이라는 것을 나타내는 것인 FERM 도메인은, 세포 골격 단백질, 예컨대, 적혈구 밴드 4.1, 탈린, 및 에즈린-라딕신-모에신 (ERM) 단백질 패밀리 뿐만 아니라, 수개의 티로신 키나제 및 포스파타제 및 종양 억제 단백질인 멀린을 포함하는 것인 밴드 4.1 수퍼패밀리의 구성원을 의미한다. 구체적으로, 상기 용어는 성숙한 형태의 인간 모에신 단백질의 처음 약 297개의 아미노산 잔기 (예컨대, 아미노산 잔기 1-297 (서열 번호 2))를 의미한다. 특정 문헌에서는 동일의 도메인이 N-ERM 관련 도메인 (N-ERMAD)으로도 또한 알려져 있는데, 이는 본원의 정의에 포함된다 (문헌 [Bretscher et al. (1995) Biochem. 34, 16830-7]).

인간 모에신 단백질의 "C-말단 테일 도메인"이란 구조상 상기 단백질의 카르복시-말단에 가장 가깝게 위치하고 있으며, 기능적으로는 액틴 필라멘트에 결합하여 그와 상호작용하는 것을 담당하는 야생형 인간 모에신 단백질의 일부를 의미한다. 모에신의 테일 도메인은 양전하를 띠고, 연장된 만곡형(meandering) 구조를 취한다. 구체적으로, 상기 용어는 인간 모에신 단백질의 마지막 약 107개의 아미노산 잔기 (예컨대, 아미노산 잔기 471-577 (서열 번호 5))를 의미한다. 특정 문헌에서는 동일의 도메인이 C-ERM 관련 도메인 (C-ERMAD)으로도 알려져 있는데, 이는 본원의 정의에 포함된다 (문헌 [Bretscher et al. (1995)]). C-말단 테일 도메인의 마지막 34개의 아미노산 잔기는 ERM 단백질 중에서 고도로 보존적이며, F-액틴에의 결합을 위한 영역을 형성한다. F-액틴 결합 영역 내에는 단백질의 활성화 동안에 인산화되는 것인 트레오닌 잔기 (야생형 인간 모에신에서 Thr558)가 존재한다.

인간 모에신 단백질의 "나선형 도메인"은 N-말단 FERM 도메인과 C-말단 테일 도메인 사이에 있는 야생형 인간 모에신의 중앙 부분을 의미한다. 이는 상기 두 말단 도메인 사이의 링커로서의 역할을 하며, 연장된 알파-나선형 구조를 취한다. 구체적으로, 상기 용어는 대략적으로 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 298-470 (서열 번호 4)을 포함하는 영역을 의미한다.

"자가항체"라는 용어는 개체 자신의 고유 물질을 인식하여 그에 결합하는 개체의 면역계에 의해 생산된 임의의 항체를 의미한다. "항-모에신 자가항체"라는 용어는 개체 자신의 모에신 단백질 또는 그의 단편을 인식하여 그에 결합하는 개체의 면역계에 의해 생산된 항-모에신 항체를 의미한다. 항-모에신 자가항체의 존재는 비정상적인 수준의 혈소판과 관련이 있을 수 있으며, 체내 항-모에신 자가항체의 역가는 비정상적인 수준의 혈소판의 병리학적 상태와 상관관계에 있을 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "혈소판의 비정상적인 활성 및 정량과 관련된 장애 또는 질환" 또는 "비정상적인 고/저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환"이라는 용어는 대상체에서 혈소판의 비정상적인 활성화 또는 파괴에 기인한 비정상적인 고 또는 저 수준의 혈소판에 의해 유발되거나 촉진되는 장애 또는 질환을 의미한다. 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 질환된 예로는 혈전증, APS (예컨대, PAPS 또는 SAPS), 유산 (예컨대, 습관성 유산), aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증, 고혈소판증 (예컨대, 원발성 고혈소판증 또는 속발성 고혈소판증)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 질환된 예로는 면역성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증 및 속발성 혈소판 감소 자반증 (예컨대, 혈전성 혈소판 감소 자반증, 또는 용혈 요독 증후군을 동반한 혈전성 혈소판 감소 자반증), 용혈, 간 효소 상승 및 저 혈소판 증후군 (HELLP 증후군), 파종 혈관내 응고, 전신 홍반 루푸스 및 재생불량 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "진단"이라는 용어는 분자적 또는 병리학적 상태, 질환 또는 병증을 확인하는 것, 예컨대, 자가면역 질환을 확인하는 것을 의미하거나, 또는 특정 치료 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 자가면역 질환 환자를 확인하는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 진단이란 비정상적인 수준의 혈소판을 확인하는 것을 의미한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 진단이란 항-모에신 자가항체가 대상체에 정상적인 것보다 더 높게 존재하는 것과 관련된 비정상적인 수준의 혈소판을 확인하는 것을 의미한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 진단이란 대상체에서 APS를 확인하는 것을 의미한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 진단이란 대상체에서 습관성 유산의 위험을 확인하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "예후"라는 용어는 예를 들어, 질환의 재발, 발적 확장(flaring), 및 약물 내성을 비롯한, 질환 증상의 결과의 가능성을 예측하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 요법으로부터의 임상적 이익의 가능성을 예측하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "예측"이라는 용어는 환자가 약물 또는 약물 세트 또는 특정 요법 과정에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할지에 대한 가능성을 의미한다. 한 실시양태에서, 예측은 상기 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어, 특정 치료제를 이용한 치료 후에, 그리고 질환의 재발없이 특정 기간 동안 생존 또는 호전되게 될지 여부, 및/또는 그렇게 될 확률에 관한 것이다. 본 발병의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대해 가장 적절한 치료 양식을 선택함으로써 치료법을 결정하는 데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 출원의 예측 방법은 환자가 치료 요법, 예를 들어, 주어진 치료제의 투여 또는 그 병용 실시, 외과 수술, 스테로이드 치료 등을 비롯한, 주어진 치료 요법에 대해 유리하게 반응할 수 있는 가능성이 있는지 여부, 또는 치료 요법 이후 환자가 장기간 동안 생존할 수 있는 가능성이 있는지 여부를 예측하는 데 있어서 가치가 큰 도구이다.

본원에서 사용되는 바, "제약상 유효량"이라는 용어는 의도된 목적 (예컨대, 비정상적인 고 또는 저 수준의 혈소판 조절)을 달성하는 데 충분한, 본 출원에 따른 모에신 단편 (예컨대, 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인, 또는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인) 또는 항-모에신 항체 (예컨대, 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체, 또는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체) 또는 그의 단편 (또는 그의 집단 또는 그의 제약 조성물)의 임의의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는"이라는 용어는 임의 성분 (예컨대, 염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제)이 제약상 투여와 상용성인 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "혈전증"이라는 용어는 혈관내 혈전 (혈괴)이 형성되는 것을 의미한다. 상기 용어는 제한없이, 동맥맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 경정맥 혈전증, 신정맥 혈전증, 및 대뇌 정맥동 혈전증을 비롯한, 동맥 및 정맥 혈전증을 포함한다. 혈전증과 관련된 질환 및 병증으로는 제한없이, 급성 정맥 혈전증, 폐색전증, 임신 중 혈전증, 출혈성 피부 괴사, 급성 또는 만성 파종 혈관내 응고 (DIC), 수술로 인한 응괴 형성, 장기 침상 안정, 장기간의 부동화, 정맥 혈전증, 전격 수막구균혈증, 급성 혈전성 뇌졸중, 급성 관상 동맥 폐색증, 급성 말초 동맥 폐색증, 대량 폐색전증, 액와 정맥 혈전증, 대량 장골대퇴골 정맥 혈전증, 폐색 동맥 캐뉼러, 폐색 정맥 캐뉼러, 심근병증, 간 정맥폐색성 질환, 저혈압, 심장 박출량 감소, 혈관 저항 감소, 폐 고혈압증, 폐 유순도 감소, 백혈구감소증, 및 혈소판 감소증, 뇌졸증, 심근경색증, 바드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome), 파제트-쇼터(Paget-Schroetter) 질환을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "항인지질 항체-매개 혈전증" 또는 "aPL-혈전증"이라는 용어는 항인지질 항체에 의해 매개되거나, 그와 관련된 면역성 혈전증을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "항인지질-증후군-관련 임신 합병증" 또는 "APS-관련 임신 합병증"이라는 용어는 태아 이환율 증가, 태아 성장 제한 증가 및/또는 항인지질 증후군을 앓는 암컷 포유동물에서의 유산 빈도 증가를 의미한다. 인간에서, APS-관련 임신 합병증을 앓는 것으로서 환자를 분류하는 기준으로는 항인지질 (aPL) 항체의 존재 및: (1) 1회 이상의 원인불명의, 임신 10주차 때 또는 그 이후의 형태학상 정상인 태아의 사망; 또는 (2) 1회 이상의, 임신 34주차 때 또는 그 이전의 형태학상 정상인 태아의 조산; 또는 (3) 원인불명의, 임신 10주차 이전의 3회 이상의 연속 자연 유산 (문헌 [Levine et al., N. Eng. J. Med. 346:752-63 (2002)])을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "항인지질 증후군" 또는 "APS"라는 용어는 항인지질 항체와 응고항진 증후군 사이의 임상적 관련성을 의미한다 (문헌 [Levine et al., N. Eng. J. Med. 346:752-63 (2002)]). APS는 임의의 기저 질환에 관한 어떤 증거도 없는 원발성 항인지질 증후군 (PAPS), 및 APS가 다른 질환과 관련이 있는 것인 속발성 항인지질 증후군 (SAPS)을 포함한다. APS는 혈전증 또는 임신-관련 합병증 또는 다른 질환 또는 병증을 유발할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "유산"이라는 용어는 배아 또는 태아가 생존이 불가능한 단계에서, 일반적으로 인간에서는 임신 약 20주차 이전인 것으로 정의되는 단계에서 임신이 자연적으로 또는 자발적으로 종료되는 것을 의미한다. "습관성 유산"이라는 용어는 광범위하게 재발성 유산인 것으로 정의되고, 이는 구체적으로는 3회 이상의 연속 유산을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "혈소판 감소증"이라는 용어는 혈소판 생산 장애 또는 파괴에 기인하여 대상체에서의 혈소판 수준이 해당 개체에 대한 혈소판 개수의 정상 범위 아래로 하락되어 있는 상태인 임의의 장애를 의미한다. 한 실시양태에서, 혈액 혈소판 수준의 정상 범위는 인간 말초 혈액 1 ㎕당 약 150,000개 내지 300,000개이다. 본원에서 사용되는 바, 혈소판 감소증이란 또한 개체에서 특정 참조 시점에서 측정된 혈소판 개수와 비교하였을 때, 상기 개체에서의 혈소판 개수가 감소되어 있는 것을 의미하기도 한다. 언급된 참조 시점은 예를 들어, 요법, 예컨대, 방사선 요법 또는 화학요법 출발 시점일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "면역성 혈소판 감소증"이라는 용어는 개체 자신의 혈소판에 대하여 유도된 자가면역 반응으로부터 유발된 임의 유형의 혈소판 감소증을 의미한다. 면역성 혈소판 감소증은 혈소판 계수 감소의 최초 원인이 자가면역 반응인 것인, 원발성 면역성 혈소판 감소증을 포함한다. 면역성 혈소판 감소증은 예를 들어, 특발성 혈소판 감소 자반증을 포함한다. 추가로, 혈소판 계수 감소가 하나 이상의 다른 질환, 예컨대, 재생불량 빈혈, 철 결핍 빈혈 및 자가면역 용혈 빈혈, 백혈병, 전신 홍반 루푸스, HIV-관련 혈소판 감소증, 비스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 에반스 증후군(Evans syndrome) 등인 것인 속발성 면역성 혈소판 감소증도 있다. 속발성 면역성 혈소판 감소증에서, 상기와 같은 다른 질환은 개체의 체내에서 그 자신의 혈소판에 대한 자가면역 반응이 발생될 수 있도록 유도하거나 일으키거나 또는 다르게는 유발한다.

본원에서 "샘플" 또는 "시험 샘플"이란 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특징 규명, 및/또는 확인하고자 하는 세포적 및/또는 다른 분자적 엔티티를 함유하는, 관심의 대상이 되는 대상체로부터 수득되거나 유래된 조성물을 의미한다. 한 실시양태에서, 상기 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플 및 조직 샘플, 예컨대, 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 조직 샘플의 공급원은 신선, 냉동 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 것과 같은 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분, 예컨대, 혈장 또는 혈청; 체액; 및 대상체의 임신 또는 발생 중 어느 시간에나 그로부터 유래된 세포, 또는 혈장일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 전혈, 혈청 또는 혈장이다. 대상체는 인간 또는 동물 대상체일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 비정상적인 수준의 혈소판을 가지거나, 가질 것으로 의심되는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 정의는 그의 입수 후 어느 방식에 의해서든, 예컨대, 시약 처리, 가용화, 또는 특정 성분, 예컨대, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 강화에 의해 조작된 생물학적 샘플을 포함한다.

한 실시양태에서, 샘플은 임의 치료 이전에 대상체 또는 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 시험 샘플은 치료, 예컨대, 비정상적인 수준의 혈소판을 조절하는 요법 또는 APS 치료 요법 동안, 또는 그 이후에 수득된다. 한 실시양태에서, 시험 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 시험 샘플은 진단 검정에 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 본 출원의 방법으로 시험되기 이전에 다른 공지된 혈액 검사 방법으로 사전 검사된다. 이러한 혈액 검사 방법으로는 예를 들어, 전체 혈구 계수, 간 효소, 신장 기능, 비타민 B₁₂ 수준, 엽산 수준, 적혈구 침강 속도, 말초 혈액 도말, 골수 생검 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "참조 샘플"이란, 그를 확인하기 위해 본 출원의 방법 또는 조성물이 사용되는 것인 질환 또는 병증을 앓지 않는 것으로 알려져 있거나, 그러한 것으로 간주되는 공급원으로부터의 샘플을 의미한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 질환 또는 병증이 본 출원의 방법 또는 조성물을 사용하여 확인된, 동일의 대상체 또는 환자의 건강한 신체 일부로부터 수득된다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 질환 또는 병증이 본 출원의 조성물 또는 방법을 사용하여 확인된 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 건강한 신체 일부로부터 수득된다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 혈소판 계수가 정상인 건강한 개체로부터의 샘플이다.

본원에서 사용되는 바, "질환 참조 샘플"이란, 그를 확인하기 위해 본 출원의 방법 또는 조성물이 사용되는 것인 질환 또는 병증을 앓는 것으로 임상적으로 확인된 공급원으로부터의 샘플을 의미한다. 한 실시양태에서, 질환 참조 샘플은 APS인 것으로 임상적으로 진단을 받은 대상체 또는 환자로부터 수득된 샘플이다. 한 실시양태에서, APS인 것으로 임상적으로 진단을 받은 대상체 또는 환자는 APS에 대한 치료 중에 있는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "참조 데이터베이스"란 하나 이상의 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플로부터의 데이터, 표준, 또는 수준 수집물을 의미한다. 한 실시양태에서, 그러한 데이터, 표준, 또는 수준 수집물은 하나 이상의 샘플로부터의 데이터와의 비교 목적으로 사용될 수 있도록 정규화된다. "정규화하다" 또는 "정규화"란 측정 미가공 데이터를 그렇게 정규화된 다른 데이터와 직접 비교할 수 있는 데이터로 전환시키는 과정이다. 정규화는 검정에 따라 달라질 수 있는 인자, 예를 들어, 로딩량, 결합률, 검출 감도의 차이에 의해 유발될 수 있는 검정-특이 오차, 및 다른 다양한 오차를 극복하는 데 사용된다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스로는 항-모에신 자가항체의 역가, 혈소판 계수, 혈액 세포 계수, 및/또는 하나 이상의 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플로부터의 다른 실험실 및 임상 데이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 각각, 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플과 동일한 조건하에 시험된 대조군 샘플의 항-모에신 자가항체 수준 (예컨대, 항-모에신 자가항체의 공지된 양)의 백분율로서 정규화된 항-모에신 자가항체의 수준을 포함한다. 상기와 같이 정규화된 항-모에신 자가항체의 수준과의 비교를 위해, 시험 샘플의 항-모에신 자가항체의 수준 또한 측정하고, 시험 샘플과 동일한 조건하에 시험된 대조군 샘플의 항-모에신 자가항체 수준의 백분율로서 계산한다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는, 건강한 대상체로부터, 및/또는 질환 또는 병증이 본 출원의 조성물 또는 방법을 사용하여 확인된, 동일의 대상체 또는 환자의 신체 비-이환부로부터의 참조 샘플 데이터를 컴파일링함으로써 확립된다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 APS에 대한 치료 중에 있는 개체로부터 유래된 질환 참조 샘플로부터의 데이터를 컴파일링함으로써 확립된다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 예를 들어, 상이한 수준의 혈소판 계수 및 다른 임상 적응증에 의해 입증되는 바와 같은, 상이한 단계의 APS를 앓는 개체로부터 유래된 질환 참조 샘플로부터의 데이터를 컴파일링함으로써 확립된다.

특정 실시양태에서, "증가하다"라는 용어는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대, 본원에 기술된 방법에 의해 검출된 자가항체 수준이 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로 전반적으로 증가한 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 증가하다라는 용어는, 증가가 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플 중 자가항체 수준의 약 1.25X, 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X 이상인 것인, 샘플 중 자가항체 수준의 증가를 의미한다.

특정 실시양태에서, 본원에서 "감소하다"라는 용어는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대, 본원에 기술된 방법에 의해 검출된 자가항체 수준이 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로 전반적으로 감소한 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 감소하다라는 용어는, 감소가 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플 중 자가항체 수준의 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, 또는 0.01X 이상인 것인, 샘플 중 자가항체 수준의 감소를 의미한다.

"검출 수단"이라는 용어는 본원에서 ELISA로 검출가능한 항체의 존재를 검출하는 데 사용되는 모이어티 또는 기법을 의미하며, 이는 고정화된 표지, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트 상에 포획되어 있는 표지를 증폭시키는 검출용 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 검출 수단은 비색 검출용 제제, 예컨대, 아비딘 또는 스트렙트아비딘-HRP이다. 또 다른 실시양태에서, 검출 수단은 H₂O₂/TMB 착색 시스템이다.

"포획용 시약"이라는 용어는 샘플 중 표적 분자에 결합하여 그를 포획함으로써 적합한 조건하에서는 포획용 시약-표적 분자 복합체가 나머지 샘플로부터 분리될 수 있도록 할 수 있는 시약을 의미한다. 전형적으로, 포획용 시약은 고정화되어 있거나, 고정화가능한 것이다. 샌드위치 면역검정에서, 포획용 시약은 바람직하게는 표적 항원에 대한 항체 또는 상이한 항체들의 혼합물이다.

"상관관계를 보여주다" 또는 "상관관계를 보여주는"이라는 것은 어느 방식으로든 제1 분석법 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 제2 분석법 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜을 수행할 때 제1 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있고/거나, 제2 분석법 또는 프로토콜을 수행하여야 하는지 여부를 결정하기 위해 제1 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다. 자가항체 검출 실시양태와 관련하여, 특정의 치료 요법을 수행하여야 하는지 여부를 결정하기 위해 검출 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다.

"표지"라는 단어는 본원에서 사용될 때, 시약, 예컨대, 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되어, 그에 접합되거나 융합된 시약이 용이하게 검출될 수 있도록 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것이거나 (예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 효소 표지인 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화시킬 수 있다.

"단리된" 폴리펩티드는 그의 천연 환경의 오염 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 법에 의해 측정되는 바, 95중량% 초과의 폴리펩티드로, 또는 99중량% 초과로, (2) 방사 컵 배열 결정 장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하는 데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue), 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 환경의 1종 이상의 오염 성분도 존재하지 않는 바, 재조합 세포내 계내에서 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 폴리펩티드는 1 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본 출원의 모에신 도메인 또는 단편과 관련하여 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열들을 정렬하고, 필요할 경우, 서열 동일성(%)이 최대가 되도록 하기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않으면서, 모에신 도메인 또는 단편 중 아미노산 잔기와 동일한, 관심의 대상이 되는 서열 중 아미노산 잔기의 백분율(%)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%) 측정을 목적으로 하는 정렬은 당업계에 포함되어 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 멕얼라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]; [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]을 참조할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열 전반에 걸쳐 최대로 정렬될 수 있도록 하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 정렬을 측정하는 데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

"항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 구체적으로는 원하는 항원 결합 활성을 보이는 한, 모노클로날 항체 (전장의 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 2가지 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예컨대, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질성인 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉, 최소량으로 존재할 수 있는, 가능성을 지닌 돌연변이, 예컨대, 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하면, 집단에 포함된 개별 항체들은 동일하다는 것을 의미한다.

"치료"란 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 질환 또는 장애를 이미 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 그 질환 또는 장애를 예방하고자 하는 대상을 포함한다.

환자의 반응성은 제한없이, (1) 질환 진행의 저속화 및 완전한 정지를 비롯한, 어느 정도까지의 질환 진행 억제; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상 수의 감소; (3) 병변 크기 감소; (4) 질환 세포의 인접한 주변 기관 및/또는 조직으로의 침윤 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 중단); (5) 질환 확산 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 중단); (6) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화; (7) 치료 후 무병 제시 기간의 연장; (8) 예컨대, 무진행 생존과 같이, 질환 병변의 퇴행 또는 절제를 초래할 수는 있지만, 그러할 필요는 없는, 자가면역 반응 감소; (9) 전체적인 생존 기간 연장; (10) 반응 속도 증가; 및/또는 (11) 치료 후 주어진 시점에서의 사망율 감소를 비롯한, 환자에게의 이익을 시사하는 임의의 종점을 사용함으로써 평가할 수 있다. "이익"이라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이는 임의의 바람직한 효과를 의미한다.

본 발명의 전형적인 방법 및 물질

본 출원은 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단, 모니터링, 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 출원을 수행하는 데 당업자에게 공지된 종래의 방법이 사용될 수 있다.

벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 출원의 폴리펩티드는 쉽게 수득할 수 있는 기법 및 물질을 사용함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 종래 방법을 사용함으로써 쉽게 단리시키고, 서열 분석할 수 있다. 예를 들어, 인간 모에신 단백질을 코딩하는 DNA는 예컨대, 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 단리시키고, 서열 분석한다. 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분으로는 일반적으로 하기: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 선별 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

신호 서열 성분

본 출원의 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 전형적으로는 신호 서열이거나, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이 절단 부위를 가진 다른 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 제조될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열 안정성 내독소 II 리더로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예컨대, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산성 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기술되어 있는 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라, 바이러스성 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) gD 신호가 이용가능하다.

상기 전구체 영역에 대한 DNA를 리딩 프레임 내에서 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 결찰시킨다.

복제 기점 성분

발현 및 클로닝 벡터 둘 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 상관없이 독립적으로 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열이며, 이는 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 상기와 같은 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대한 것으로 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 대해 적합하며, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다 (전형적으로 SV40 기점은 단지 그가 조기 프로모터를 함유하고 있다는 이유 때문에 사용될 수 있다).

선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는, 선별가능한 마커로도 불리는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 매질로부터는 이용불가능한 중요한 영양소, 예컨대, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 코딩한다.

선별 방식에 대한 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하게 되고, 따라서, 선별 요법으로부터 생존하게 된다. 그러한 우성 선별의 예는 약물인 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.

포유동물 세포에 대하여 적합한 선별가능한 마커의 또 다른 일례로는 세포 성분의 확인을 통해 핵산이 소비될 수 있도록 하는 것, 예컨대, DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 전형적으로 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 있다.

예를 들어, 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 포함하는 배양 배지 중에서 형질전환체 모두를 배양함으로써 DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 확인한다. 야생형 DHFR이 사용될 때, 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성에 결함이 있는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

별법으로, 본 출원의 폴리펩티드, 야생형 DHFR 단백질, 및 또 다른 선별가능한 마커, 예컨대, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 공-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별 제제, 예컨대, 아미노글리코시드 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유하는 배지 중에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조할 수 있다.

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). trp1 유전자는 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1과 같이, 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 부족한 돌연변이체 효모 균주에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 중 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출할 수 있도록 하는 데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고, 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno: S.D.) 서열을 포함할 것이다.

프로모터 서열은 진핵생물에 대해서도 알려져 있다. 실제로, 모든 진핵 유전자에는 전사가 개시되는 부위로부터 상류쪽으로 대략 25 내지 30개의 염기만큼의 위치에 AT가 풍부한 영역이 존재한다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 상류쪽으로 70 내지 80개의 염기만큼의 위치에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 폴리 A 테일의, 코딩 서열의 3' 말단에의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열은 모두 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

전사가 성장 조건에 의해 제어되는 추가의 이점을 가지고 있는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 또한 효모 인핸서가 효모 프로모터와 함께 사용되는 것이 이롭다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 본 출원의 폴리펩티드의 전사는, 본 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 예를 들어, 바이러스, 예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-쇼크 프로모터로부터 수득되는 프로모터에 의해 제어된다.

SV40 바이러스에 대한 조기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 알맞게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 알맞게 수득된다. 벡터로서, 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기술되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하의 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조할 수 있다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.

인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에 의한 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 대개인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 현재 포유동물 유전자로부터의 것인 많은 인핸서 서열이 알려져 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-펙토단백질, 및 인슐린). 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 후반부 측 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반부 측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]를 참조할 수 있다. 인핸서는 폴리펩티드 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 전형적으로는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사를 종결시키는 데, 및 mRNA를 안정화시키는 데 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 보통 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이러한 영역은 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역부 중 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조할 수 있다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원의 벡터에서 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝 또는 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 상기 기술된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물로는 유박테리아, 예컨대, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에스케리키아(Escherichia), 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라, 바실리, 예컨대, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예컨대, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시되어 있는 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 비록 다른 균주, 예컨대, E. 콜라이 B, E. 콜라이 BL21 (DE3), E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하기는 하지만, 전형적으로, E. 콜라이 클로닝 숙주는 E. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 이러한 예들은 제한적이라기보다는 예시적인 것이다.

원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 가장 보편적으로 사용된다. 그러나, 예컨대, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커하미(K. wickerhamii) (ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리제이(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대, 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대, A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 일반적으로 이용가능하며, 본원에서 유용하다.

본 출원의 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예컨대, 스포돕프테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) (캐터필라), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염용으로서 다양한 바이러스 균주가 공개적으로 이용가능하며, 그 예로는 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 있으며, 상기 바이러스는 본원에서 본 출원에 따른 바이러스로서, 특히, 스포돕프테라 푸르기페다 세포의 형질감염을 위한 것으로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 더 큰 관심의 대상이 되어 왔으며, 배양물 (조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식이 통상적인 방법이 되어 왔다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)가 있다.

숙주 세포는 본 출원의 폴리펩티드의 제조를 위해 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는 데 적절하게 변형된 종래 영양 배지 중에서 배양된다.

숙주 세포 배양

본 출원의 폴리펩티드를 제조하는 데 사용되는 숙주 세포를 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대, 햄즈 F10(Ham's F10) (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코스 변형 이글스 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 배지 중의 임의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 상기 배지 중 임의의 것으로 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 유기 화합물로서 정의되는) 미량 원소, 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 이는 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.

펩티드의 화학적 합성

본 출원의 펩티드는 또한 화학적 합성법, 예를 들어, 문헌 [Merrifield in J.A.C.S. 85: 2149-2154 (1963)]에 기술되어 있는 고체상 합성 방법, 또는 문헌 ["Peptide Synthesis" by Bodanszky, et al., second edition, John Wiley and Sons, 1976]에 기술되어 있는 표준 용액 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 서적은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

고체상 펩티드 합성 방법의 일반적인 방법은 먼저 펩티드의 보호된 C-말단 아미노산을 수지에 부착시키는 단계를 포함한다. 부착 후, 수지를 여과하고, 세척하고, C-말단 아미노산의 알파 아미노기 상의 보호기 (예컨대, t-부틸옥시카르보닐)를 제거한다. 상기 보호기 제거는 물론 아미노산과 수지 사이의 결합을 파괴시키지 않으면서 일어나야 한다. 이어서, 생성된 수지 펩티드에, 말단에서 두 번째 위치에 있는 C-말단 보호된 아미노산을 커플링시킨다. 상기 커플링은 제2 아미노산의 유리 카르복시기와, 수지에 부착된 제1 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합 형성에 의해 이루어진다. 상기와 같은 순서의 이벤트는 연속된 아미노산을 통해 펩티드의 아미노산 모두가 수지에 부착될 때까지 반복된다. 마지막으로, 보호된 펩티드는 수지로부터 절단되고, 보호기는 제거됨으로써 원하는 펩티드가 수득된다. 펩티드를 수지로부터 분리하고, 보호기를 제거하는 데 사용되는 절단 기법은 수지 및 보호기 선택에 따라 달라지며, 이는 펩티드 합성 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

상기 언급된 수지는 임의의 적합한 중합체일 수 있고, 이는 제1 보호된 아미노산이 공유 결합에 의해 그에 견고하게 연결될 수 있는 작용기를 포함하여야 한다. 본 목적을 위해 다양한 중합체, 예컨대, 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 및 폴리스티렌이 적합하다. 고체상 합성법에서 사용될 수 있는 적절한 보호기로는 t-부틸옥시카르보닐 (BOC), 벤질 (BZL), t-아밀옥시카르보닐 (AOC), 토실 (TOS), o-브로모페닐메톡시카르보닐 (BrZ), 2,6-디클로로벤질 (BZLCl₂), 및 페닐메톡시카르보닐 (Z 또는 CBZ)을 포함한다. 추가의 보호기는 또한 문헌 [J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973]에 기술되어 있다. 상기 서적은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

표준 용액 합성 방법은 아미드 결합 형성의 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 아미노산 또는 펩티드 단편의 단계식 또는 블록 커플링에 의해 수행될 수 있다. 이러한 용액 합성 방법은 당업계에 주지되어 있다.

폴리펩티드 정제

본 출원의 폴리펩티드 또는 단백질은 대상체로부터 회수될 수 있다. 재조합 기법을 사용하여, 본 출원의 폴리펩티드를 세포내에서, 주변세포질 공간에서 제조할 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비시킬 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막에 결합되어 있을 경우, 적합한 세제 용액 (예컨대, 트리톤-X 100)을 사용하여, 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해, 예컨대, 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제에 의해 파괴될 수 있다.

펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 본 출원의 펩티드는 배지 중 다른 성분으로부터 원하는 펩티드를 분리해 낼 수 있는 임의의 적합한 기법에 의해 반응 매질로부터 회수될 수 있다. 고체상 합성 방법의 경우, 먼저 적합한 절단 용액을 사용하여 보호된 펩티드를 수지로부터 절단해 낸다. 절단 용액 선택은 수지, 및 그에 결합하는 아미노산의 특성에 따라 달라진다 (예컨대, FMOC 방법의 경우, 트리플루오로아세트산). 절단은 일반적으로 산성 조건하에서 수행된다. 절단 종료시, 이어서, 해리성 펩티드를 수득하고, 임의의 적합한 기법 (예컨대, 하기 기술되는 방법)을 사용하여 추가로 정제한다.

하기 방법은 적합한 단백질 정제 방법의 일례이다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼, DEAE 등) 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과; 오염 물질, 예컨대, IgG를 제거하는 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 에피토프 태깅된 형태의 본 출원의 폴리펩티드에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼에 의한 것. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology , 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)는 예를 들어, 사용되는 제조 공정 및 제조되는 본 출원의 특정 폴리펩티드의 성질에 따라 달라질 것이다.

검출 방법

본 출원의 방법에서, 생물학적 샘플은 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 질환 (예컨대, APS)을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터 수득되고, 이는 하나 이상의 항-모에신 자가항체의 발현 (예컨대, APS 검출을 위해 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체)에 대해 검사된다. 샘플 중 다양한 항-모에신 자가항체의 발현은 많은 방법에 의해 분석될 수 있는데, 그러한 방법들 중 다수는 당업계에 공지되어 있으며, 당업자에 의해 이해되고 있고, 그 예로 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 효소-결합 면역-유동 검정법 (ELIFA), 면역블롯팅, 웨스턴 블롯 분석법, 면역조직화학적 분석법, 면역침전법, 분자 결합 검정법 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다중 면역검정법, 예컨대, 룰즈 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery: MSD)로부터 이용가능한 것 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 단일 부위 및 비-경쟁적 유형의 2-부위 또는 "샌드위치" 검정법 둘 모두와, 그뿐만 아니라, 전통적인 경쟁적 결합 검정법에서의 것도 포함한다. 검출은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 수행될 수 있다.

그 중에서 샌드위치 검정법이 가장 유용하고 보편적으로 사용되는 검정법이다. 샌드위치 검정 기법에 대한 많은 변형 방법이 존재하며, 이들 모두 본 출원에 포함되는 것으로 한다. 간략하면, 전형적인 정방향 샌드위치 검정법에서, 비표지된 포획용 시약 (예컨대, 모에신 단편)을 고체 기판 상에 고정화시키고, 표적 단백질 (예컨대, 항-모에신 자가항체)에 대해 시험하고자 하는 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체가 형성될 수 있도록 하는 데 충분한 기간 동안의 적합한 기간 동안 인큐베이션시킨 후, 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 리포터 분자로 표지된, (예컨대, 항-모에신 자가항체의 Fc 영역에의 결합을 통해) 표적 단백질에 특이적인 검출 항체를 첨가하고, 포획용 시약-표적 단백질-검출 항체의 또 다른 복합체가 형성될 수 있도록 하는 데 충분한 기간 동안 인큐베이션시킨다. 임의의 비반응 물질을 세척하여 제거하고, 리포터 분자에 의해 발생될 신호를 관찰함으로써 표적 단백질의 존재를 측정한다. 결과는 간단하게 가시적 신호를 관찰함으로써 얻은 정질적 결과일 수 있거나, 또는 공지된 양의 리포터 분자를 함유하는 대조군 샘플과의 비교에 의해 정량화될 수 있다.

전형적인 정방향 샌드위치 검정법에서, 표적 단백질에 대하여 특이성을 가진 포획용 시약을 고체 지지체 상에 공유적으로 또는 수동적으로 결합시킨다. 고체 지지체는 전형적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 보편적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크, 또는 면역검정법을 수행하는 데 적합한 임의의 다른 표면 형태일 수 있다.

정방향 검정법에 대한 변형법으로는 샘플 및 검출 항체 둘 모두를 포획용 시약에 동시에 첨가하는 동시 검정법을 포함한다. 쉽게 자명해지는 바와 같이, 임의의 최소의 변형을 포함하는 상기와 같은 기법은 당업자에게 주지되어 있다. 또 다른 대체 방법은 샘플 중 표적 단백질을 고정화시킨 후, 고정화된 표적 단백질을, 리포터 분자로 표지되거나 표지될 수 없는 본 출원의 펩티드에 노출시키는 것을 포함한다. 표적 단백질의 양, 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 결합된 표적 단백질은 포획용 시약 (예컨대, 모에신 단편)으로의 직접적인 표지화에 의해 검출가능할 수 있다. 별법으로, 포획용 시약에 특이적인 제2 검출 항체를 표적 단백질-포획용 시약 복합체에 노출시켜 표적 단백질-포획용 시약-검출 항체 3원 복합체가 형성되도록 한다. 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 상기 복합체를 검출한다.

본원에서 사용되는 바, "리포터 분자"라는 용어는 그의 화학적 성질에 의해서, 항원-결합된 항체가 검출될 수 있도록 하는 분석적으로 확인가능한 신호를 발생시키는 분자를 의미한다. 이러한 유형의 검정법에서 가장 보편적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성핵종 함유 분자 (즉, 방사성 동위원소) 및 화학발광 분자이다.

특정 실시양태에서, 리포터 분자는 검출 항체에 접합된 효소이다. 효소는 일반적으로 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매화시킨다. 예를 들어, 효소는 분광광도측정법으로 측정될 수 있는, 기질의 변색을 촉매화시킬 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 특정 파장 광 조사에 의해 활성화되었을 때, 형광체는 광 에너지를 흡수하여 분자 상태를 여기 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상으로 광을 방출한다. 화학발광성 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 후, (예를 들어, 케밀루미노미터를 사용하여) 측정될 수 있는 광을 방출할 수 있거나, 에너지를 형광성 억셉터에 공여한다. 효소적 표지의 예로는, 루시퍼라제 (예컨대, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예컨대, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기법은 문헌 [Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기술되어 있다.

효소-기질 조합의 예로는 예를 들어: (i) 기질로서 히드로겐 퍼옥시다제와 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO) (여기서, 히드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예컨대, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다); (ii) 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리성 포스파타제 (AP); 및 (iii) 발색성 기질과 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal) (예컨대, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광성 기질과 상기의 것 (예컨대, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)를 포함한다. 다수의 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이에 관한 일반적인 리뷰를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조할 수 있다.

특정 실시양태에서, 리포터 분자는 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 단실, 리싸민, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 이용가능한 형광단, 예컨대, 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 것의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 형광단이다. 형광단은 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991)]에 개시된 기법을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용함으로써 정량화될 수 있다.

특정 실시양태에서, 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대, ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I이다. 검출 항체 또는 포획용 시약은 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌 동일]에 기술된 기법을 사용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정될 수 있다.

종종, 표지는 검출 항체 또는 포획용 시약과 간접적으로 접합된다. 당업자는 상기를 달성하기 위한 다양한 기법에 대해 알고 있을 것이다. 예를 들어, 검출 항체를 비오틴과 접합시키고, 표지를 아비딘과 접합시킬 수 있거나, 또는 그 반대로도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하는 바, 따라서, 표지는 간접적인 방식으로 검출 항체와 접합될 수 있다. 별법으로, 표지를 검출 항체와 간접적으로 접합시키기 위해, 검출 항체를 작은 합텐과 접합시키고, 표지를 항-합텐 항체와 접합시킨다. 따라서, 표지는 항체와 간접적으로 접합될 수 있다.

특정 실시양태에서, 검출 방법은 경쟁 항-모에신 항체가 사용되는 경쟁 결합 검정법이다. 그러한 경쟁 항체는 본 출원의 펩티드에의 결합에 대하여 모에신 자가항체와 경쟁할 수 있다. 경쟁 결합 검정법에서, 결합 신호가 감소하였다는 것은 상응하는 자가항체의 존재 및 역가를 나타내는 것일 수 있다.

진단용 키트

상기에서 기술되거나 제안된 적용에서 사용하기 위해, 본 출원은 또한 키트 또는 제조물품을 제공한다. 그러한 키트는, 각각의 용기 수단은 본 방법에서 사용하고자 하는 별개의 요소들 중 하나를 포함하는 것인, 하나 이상의 용기 수단, 예컨대, 바이알, 튜브 등을 긴밀하게 제한되는 상태로 수용하도록 구획화된 캐리어 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지된 또는 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 그러한 프로브는 항-모에신 자가항체에 대해 특이적인 모에신 단편일 수 있다.

본 출원의 키트는 전형적으로 상기 기술된 용기 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지를 비롯한, 상업적 관점 및 사용자 견지에서 바람직할 수 있는 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기, 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 인서트를 포함할 것이다. 라벨은 본 조성물이 특정 요법 또는 비-치료학적 적용을 위해 사용된다는 것을 지시하기 위해 용기 상에 존재할 수 있고, 이는 또한 예컨대, 상기 기술된 것과 같이 생체에서 또는 시험관내에서의 사용을 위한 설명을 명시할 수 있다.

본 출원의 키트는 다수의 실시양태를 가진다. 전형적인 실시양태는 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 포함되어 있는 조성물, 및 샘플 중 항-모에신 자가항체의 존재를 평가하기 위해 본 출원의 펩티드를 사용하는 것에 관한 설명서를 포함하며; 여기서, 상기 조성물은 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 본 출원의 펩티드를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨은 조성물이 샘플 중 항-모에신 자가항체의 존재를 평가하는 데 사용될 수 있음을 명시하는 것인 키트이다. 키트는 추가로 샘플을 제조하고, 본 출원의 펩티드를 샘플에 적용시키기 위한 한 세트의 설명서 및 물질을 포함할 수 있다. 키트는 표지, 예컨대, 효소적 표지에 접합된 제2 항체를 포함할 수 있다.

키트 중 다른 임의적 성분으로는 하나 이상의 완충제 (예컨대, 차단용 완충제, 세척용 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예컨대, 효소적 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예컨대, 색원체), 에피토프 검색용 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.

치료학적 또는 예방학적 적용

본 출원의 모에신 단편 및 항-모에신 항체 및 그의 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 비정상적인 수준의 혈소판을 치료학적으로 조절하기 위한 제약 조성물로서 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 출원의 N-말단 FERM 도메인 또는 그의 단편 및 C-말단 테일 도메인에 대한 또는 C-말단 테일 도메인의 단편에 대한 항체 및 그의 조성물은 대상체에서 혈소판의 수준을 억제시킴으로써, 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 출원의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편 및 N-말단 FERM 도메인에 대한 또는 그의 단편에 대한 항체 및 그의 조성물은 대상체에서 혈소판의 수준을 자극시킴으로써, 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 출원의 모에신 단편 및 항-모에신 항체 및 그의 조성물이 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것이 주시된다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 임상전 데이터를 수득하기 목적으로 본 출원의 모에신 단편 또는 항-모에신 항체 또는 그의 조성물을 비인간 포유동물에게 투여한다. 치료하고자 하는 비인간 포유동물의 예로는 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 임상전 연구가 수행되는 다른 포유동물을 포함한다. 상기와 같은 포유동물은 본 출원의 모에신 단편 또는 항-모에신 항체 또는 그의 조성물을 이용하여 치료하고자 하는 질환에 대하여 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 관심의 대상이 되는 본 출원의 모에신 단편 또는 항-모에신 항체 또는 그의 조성물의 독성을 연구하는 데 이용될 수 있다. 각각의 이들 실시양태에서, 포유동물에서 용량 점증 연구가 수행될 수 있다. 추가로, 또는 별법으로, 본 출원의 모에신 단편 또는 항-모에신 항체 또는 그의 조성물은 인간, 예컨대, 본 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 데 사용된다.

비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 예로는 혈전증, APS (예컨대, PAPS 또는 SAPS), 유산 (예컨대, 습관성 유산), aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증, 고혈소판증 (예컨대, 원발성 고혈소판증 또는 속발성 고혈소판증)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환의 예로는 면역성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증 및 속발성 혈소판 감소 자반증 (예컨대, 혈전성혈소판 감소 자반증, 또는 용혈 요독 증후군을 동반한 혈전성 혈소판 감소 자반증), 용혈, 간 효소 상승 및 저혈소판 증후군 (HELLP 증후군), 파종 혈관내 응고, 전신 홍반 루푸스 및 재생불량 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

제약 제제

다양한 물질 또는 분자 (예컨대, 본 출원의 모에신 단편 또는 항-모에신 항체 또는 그의 조성물)가 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 물질 또는 분자는 그의 제품이 제약상 허용되는 담체 비히클과 함께 혼합되어 조합되는, 제약상 유용한 조성물을 제조하는 공지의 방법에 따라 제제화될 수 있다. 보관을 위해 임의적 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 함께, 원하는 순도를 가지는 활성 성분을 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 치료학적 제제를 제조한다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당 알콜, 예컨대, 만닛톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 PEG를 포함한다.

생체내 투여용으로서 사용하고자 하는 제제는 멸균성이어야 하다. 이는 동결건조 및 재구성 이전에 또는 그 이후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 쉽게 달성된다.

본원의 치료학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어, 정맥내 투여용 용액 백 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통이 가능한 마개가 있는 바이알 안에 놓여 있다.

각종 질환, 예컨대, APS 및 혈전증 치료를 위해 사용될 때, 본 출원의 물질 또는 분자는 동일 또는 유사 질환에 적합한 다른 치료제와 함께 병용될 수 있다는 것이 주시된다. APS 또는 혈전증 치료를 위해 사용될 때, 본 출원의 물질 또는 분자는 종래의 APS 또는 혈전증 요법과 함께 병용하여 사용될 수 있다.

일부 다른 측면에서, 본 출원의 물질 또는 분자 (예컨대, 모에신의 N-말단 FERM 도메인 또는 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체)와 함께 혈전증에 대한 병용 요법에 유용한 다른 치료제로는 제한없이, 혈소판 억제제 2a, 저분자량 헤파린 및 헤파리노이드 뿐만 아니라, 비분획 헤파린 2b, 인자 Xa 억제제 2c, 복합 트롬빈/인자 Xa 억제제 2d, 피브리노겐 수용체 길항제 (당단백질 IIb/IIa 길항제) 2e 및 비타민 K 길항제 2f를 포함한다.

일부 다른 측면에서, 본 출원의 물질 또는 분자 (예컨대, 모에신의 N-말단 FERM 도메인 또는 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체)와 함께 APS에 대한 병용 요법에 유용한 다른 치료제로는 제한없이, 헤파린, 저분자량 헤파린, 아스피린 및 와파린을 포함한다.

투여 경로는 예컨대, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 또는 병변내 경로에 의해 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 지속 방출형 시스템에 의한 것과 같이, 공지된 방법과 일치한다.

본 출원의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로에 관한 결정은 일반의의 기술 범위 내에 주지되어 있다. 동물 실험은 인간 요법을 위한 유효 용량 결정에 대해 신뢰할 수 있는 가이던스를 제공한다. 문헌 [J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 규정되어 있는 원리에 따라 유효 용량에 관한 종간 크기 조정을 수행할 수 있다.

본 출원의 물질 또는 분자의 생체내 투여를 사용할 경우, 보통 투여량은 투여 경로에 따라, 1일당 약 10 ng/kg 내지 최대 100 mg/kg (포유동물 체중) 이상, 바람직하게는, 약 1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일로 달라질 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 가이던스는 문헌에 제공되어 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212를 참조할 수 있다. 상이한 치료 화합물과 상이한 장애에 대해서는 상이한 제제가 유효할 것이며, 예를 들어, 한 기관 또는 조직을 표적화하여 투여하고자 하는 경우에는 또 다른 기관 또는 조직에 대한 것과는 상이한 방식으로 전달되어야 할 가능성이 있는 것으로 예상된다.

물질 또는 분자의 투여를 필요로 하는 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 데 적합한 방출 특징을 가진 제제로 물질 또는 분자를 지속 방출형으로 투여하는 것이 바람직한 경우, 물질 또는 분자를 마이크로캡슐화하는 것이 주시된다. 지속 방출형인 것을 위해 재조합 단백질을 마이크로캡슐화하는 것은 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론- (rhIFN-), 인터루킨-2, 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 (문헌 [Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996)]; [Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993)]; [Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990)]; [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439462]; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국 특허 번호 5,654,010).

생체적합성 및 매우 광범위한 생체분해성 특성에 기인하여 폴리-락틱-코글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용함으로써 지속 방출형 제제를 개발할 수 있다. PLGA의 분해 생성물인 락트산 및 글리콜산을 인체로부터 신속하게 제거할 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해성은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월에서부터 수년으로 조정될 수 있다 (문헌 [Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41].

조성물 (예컨대, 제약 조성물)을 투여 설명서와 함께 키트, 용기, 팩, 또는 분배기에 포함시킬 수 있다. 키트로서 공급될 경우, 조성물의 상이한 성분이 별개의 용기에 패킹될 수 있고, 사용 직전에 혼합될 수 있다. 상기와 같이 성분들을 따로따로 패킹함에 따라 활성 성분의 기능 상실 없이 장기간 보관이 가능하다. 키트는 또한 특정 검사, 예컨대, 진단 검사 또는 조직형 검사가 용이하게 수행될 수 있도록 하는 시약을 별개의 용기에 포함할 수 있다.

키트에 포함된 시약은, 상이한 성분의 수명이 보존되고, 그 성분이 용기 물질에 의해 흡수되거나, 변경되지 않도록 하기 위해 임의 종류의 용기 안에 담긴 채로 공급될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 유리 앰플은 중성, 비-반응 기체, 예컨대, 질소하에 패킹된 동결건조된 조절제 물질/분자 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 앰플은 임의의 적합한 물질, 예컨대, 유리, 유기 중합체, 예컨대, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌 등, 세라믹, 금속 또는 전형적으로 시약을 수용하는 데 사용되는 임의의 다른 물질로 구성될 수 있다. 적합한 용기에 관한 다른 예로는 앰플과 같은 유사 물질로부터 제작될 수 있는 간이 병, 및 예컨대, 알루미늄 또는 합금같이 호일로 라이닝된 내부로 구성될 수 있는 인벨럽을 포함한다. 다른 용기로는 시험관, 바이알, 플라스크, 병, 시린지 등을 포함한다. 예컨대, 피하 주사용 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 병과 같이, 용기는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 다른 용기는, 제거시 성분들이 혼합될 수 있도록 하는 것인, 쉽게 제거가능한 막에 의해 분리되어 있는 2개의 구획을 가질 수 있다. 제거가능한 막은 유리, 플라스틱, 고무 등일 수 있다.

키트는 또한 설명서와 함께 공급될 수 있다. 설명서는 종이 또는 다른 기판 상에 프린팅될 수 있고/거나, 전자-판독형 매체, 예컨대, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, 집 디스크, 비디오 테이프, 레이저 디스크, 오디오 테이프 등으로서 공급될 수 있다. 상세한 설명이 키트와 물리적으로 관련이 없을 수도 있다; 대신, 사용자는 키트 제조사 또는 배급처에 의해 명시된 인터넷 웹으로 안내될 수 있거나, 또는 전자 메일로서 공급받을 수 있다.

본 출원의 또 다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애를 치료하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조물품을 제공한다. 제조물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 상기 병증을 치료하는 데 효과적인 조성물을 수용하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 투여용 용액 백 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통이 가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 활성제는 항체이다. 용기상의, 또는 용기에 결합되어 있는 라벨은 조성물이 선택되는 병증을 치료하는 사용된다고 명시한다. 제조물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지를 비롯한, 상업적 관점 및 사용자 견지에서 바람직할 수 있는 물질, 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 인서트를 추가로 포함할 수 있다.

하기는 본 출원의 방법 및 조성물의 일례이다. 상기 제공된 일반 설명을 고려해 볼 때, 다양한 다른 실시양태가 수행될 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예

실시예 1. 항- 모에신 모노클로날 항체의 생성

종래의 하이브리도마 방법을 사용하여 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 모노클로날 항체 및 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다. 먼저, PCR 기법을 사용하여 모에신의 N-말단 FERM 도메인 및 모에신의 C-말단 테일 도메인을 제조하였다.

서열 번호 2의 서열을 가지는 N-말단 FERM 도메인을 생성하기 위해, PCR을 사용하여 N-말단 FERM 도메인에 상응하는 cDNA 단편 (도 3에 제시되어 있는 서열 번호 6 참조, 여기서, 밑줄로 표시된 첫번째 부분은 N-말단 테일 도메인의 cDNA 서열이다)을 증폭시켰다. 서열 번호 5의 서열을 가지는 C-말단 테일 도메인을 생성하기 위해, PCR을 사용하여 C-말단 테일 도메인에 상응하는 cDNA 단편 (도 3에 제시되어 있는 서열 번호 6 참조, 여기서, 밑줄로 표시된 두번째 부분은 C-말단 테일 도메인의 cDNA 서열이다)을 증폭시켰다.

PCR-증폭된 모에신 cDNA 단편 (즉, C-말단 테일 도메인의 cDNA 단편, 또는 N-말단 FERM 도메인의 cDNA 단편)을 pET32a(+) 및 pET28a(+)로부터 선택된 발현 벡터로 클로닝하였다. 이어서, 배양 및 발현을 위해 구축된 벡터를 사용하여 E. 콜라이 숙주 세포주 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. pET32a(+) 및 pET28a(+)의 제한 및 클로닝 지도는 각각 도 4 및 5에 제시되어 있다. 제한 효소 분해를 이용하여 모에신 단편에 대한 구축된 발현 시스템을 확인한 후, 서열 분석함으로써 모에신 단편의 발현을 위해 올바른 리딩 프레임을 확인하였다.

충분히 배양시킨 후, 모에신 단편의 수집 및 정제를 위해 발현된 모에신 단편을 가진 숙주 세포를 표준 단백질 발현 프로토콜에 따라 수거하였다. SDS-PAGE로 생성된 단백질 단편을 검정하여 그의 아이덴티티 및 순도를 확인하였다.

이어서, BALB/C 마우스를 사용하여 하이브리도마 방법에 따라, 발현된 모에신의 N-말단 FERM 도메인 및 모에신의 C-말단 테일 도메인을 사용하여 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 모노클로날 항체, 및 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 모노클로날 항체를 각각 제조하였다.

하이브리도마 방법은 최초로 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)] (상기 문헌은 그 전문이 본 출원에 참고로 포함된다)에 기술되었다. 전형적인 하이브리도마 방법에서, 마우스 (예컨대, BALB/C 마우스)를 항원 (예컨대, N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)으로 면역화시킨 후, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켰다. 하이브리도마의 성장을 선택적으로 허용하는 배지 중에서 융합된 세포를 수거하고, 생존가능한 하이브리도마 콜로니를 성장시켰다. 충분한 시간이 경과한 후, ELISA 검사 및 항원을 사용한 면역조직화학적 검정법에 의해 상청액을 스크리닝하였다. 추가의 서브클로닝을 위해 양성 세포를 선별하였다. 선별된 클론을 제한 희석법에 의해 서브클로닝시켰다. 모든 클론이 ELISA-양성이 될 때까지 서브클로닝을 수행하였다. 이어서, 양성 클론을 선별함으로써 항원에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 수득하였다.

실시예 2. 혈소판 활성화 자극

CD62P 및 CD63의 발현은 혈소판 활성화와 관련이 있다. 그러므로, 혈소판 활성화의 프로파일을 특징화하기 위해 상기 두 단백질을 지시제로서 사용할 수 있다. 본 실험을 시험관내에서 수행함으로써 CD62P 모노클로날 항체 및 CD63 모노클로날 항체를 사용하여 CD62P 및 CD63의 발현 수준을 검출함으로써 다양한 작용제의 존재하에서의 혈소판 활성화의 자극을 평가하였다.

12명의 건강한 개체로부터 혈장 샘플을 수집하고, 이를 하기 표 1에 기술되어 있는 것과 같은 다양한 작용제의 존재하에 실온에서 수분 동안 (예컨대, 5 min) 배양하였다. 혈소판이 약 10 min 이내에 충분히 활성화될 수 있도록 배양 조건을 선택하였다. 그 후, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지된 CD62P 모노클로날 항체 및 CD63 모노클로날 항체를 사용하여 혈장 샘플 중 발현된 CD62P 및 CD63을 검출하고, 베크만 콜터 EPICS-XL(Beckman Coulter EPICS-XL)의 유세포 분석법을 이용하여 혈장 샘플의 형광 밀도 ("FD")를 검출하였다. CD62P 및 CD63의 발현 수준은 검출된 형광 밀도의 평균값으로 나타내었다.

혈소판 활성화를 자극시키는 작용제로서 알려져 있는 ADP (1군), 항-모에신 N-말단 도메인 항체 (2군), 및 모에신의 N-말단 FERM 도메인 (3군) (상기 둘은 모두 실시예 1에 따라 제조되었다)을 비롯한, 본 검정법에서 시험된 작용제는 하기 표 1에 열거되어 있다.

표 1에 열거된 작용제의 농도는 혈장 샘플 중 작용제의 최종 농도이다. 어떤 시험 제제도 포함하지 않는 혈장 샘플을 대조군으로서 시험하였다. 결과는 하기 표 1에 열거되어 있고, 이는 또한 도 6에도 도시되어 있다.

표 1 및 도 6에서의 결과를 보면, 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 모노클로날 항체를 통해 CD62P가 가장 높게 발현되고 (대조군의 발현 수준의 대략 6배), CD63이 가장 높게 발현된 것으로 나타났다 (대조군의 발현 수준의 대략 4배). 이는 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 모노클로날 항체가 혈소판의 활성화를 유의적으로 촉진시킬 수 있다는 것을 시사한다.

표 1 및 도 6에 제시되어 있는 바와 같이, 모에신의 N-말단 FERM 도메인을 통해서는 CD62P 및 CD63의 발현 수준이 대조군의 발현 수준과 유사하게 나타났다. 이는 모에신의 N-말단 FERM 도메인이 혈소판의 활성화를 자극시키지 못한다는 것을 시사한다.

실시예 3. 혈소판 활성화의 억제

각종의 상이한 활성제에 의해 유도된 혈소판 활성화에 대하여 다양한 억제제 (즉, 시험 제제)가 미치는 차단 효과를 평가하기 위해 본 실험을 수행하였다.

12명의 건강한 개체로부터 혈장 샘플을 수집하고, 이를 하기 표 2에 기술되어 있는 것과 같은 억제제의 존재하에 수분 동안 (예컨대, 5 min) 배양한 후, 그에 혈소판 활성화의 활성제를 첨가하고, 추가의 수분 동안 (예컨대, 5 min) 혈장 샘플을 추가로 배양하였다. 배양 조건은 실시예 2와 동일하였다. 그 후, FITC로 표지된 CD62P 모노클로날 항체 및 CD63 모노클로날 항체를 사용하여 혈장 샘플 중 발현된 CD62P 및 CD63을 검출하고, 베크만 콜터 EPICS-XL의 유세포 분석법을 이용하여 혈장 샘플의 형광 밀도를 검출하였다. CD62P 및 CD63의 발현 수준은 검출된 형광 밀도의 평균값으로 나타내었다. 임의의 억제제 대신 0.01 M PBS를 사용하는 대조군 또한 시험하였다.

본 실험에서 시험된 혈소판 활성화의 억제제 및 활성제는 하기 표 2에 열거되어 있다. 펩티드 RGDS는 혈소판 표면 상의 당단백질 (GP) IIb/IIIa 복합체에의 결합을 위해 혈소판 활성제 복합형-1 (PAC-1)과 경쟁함으로써 혈소판의 활성화를 억제시키는 혈소판 활성화의 억제제인 것으로서 알려져 있다. 종래의 펩티드 합성법에 따라 고체상에서 RGDS를 제조하고, 이를 본원에서는 0.01 M PBS 중 10 mg/ml의 농도로 사용하였다. 본 실험에서 사용된 모에신 단편 및 항-모에신 항체는 실시예 1에 따라 제조하였다. 본 실험에서 사용된 바, 항-모에신 N-말단 도메인 항체의 농도는 0.01 M PBS 중 20 ㎍/ml이고, N-말단 FERM 도메인의 농도는 0.01 M PBS 중 2 mM이고, 항-모에신 C-말단 도메인의 농도는 0.01 M PBS 중 20 ㎍/ml이었다. 본원에서 사용된 ADP의 농도는 0.01 M PBS 중 5 μM이었다. 결과는 하기 표 2에 열거되어 있고, 이는 또한 도 7에도 도시되어 있다.

표 2 및 도 7에서의 결과를 보면, 예상대로, RGDS는 ADP에 의해 유도된 혈소판 활성화를 실질적으로 억제시킬 수 있지만 (1군 참조); RGDS는 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체에 의해 유도된 혈소판의 활성화에 대해서는 어떤 차단 효과도 발휘하지 못한 것으로 나타났다 (2군 참조). 대조적으로, 모에신의 N-말단 FERM 도메인은 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체에 의해 유도된 혈소판의 활성화를 유의적으로 차단시킬 수 있었다 (3군 참조). 이는 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체 및 RGDS가 상이한 경로를 통해 혈소판 활성화를 억제시킨다는 것을 시사한다.

또한, 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체 (즉, 항-모에신 C-말단 도메인)는 혈소판 활성화에 대하여 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다 (4군 참조). 이는 모에신의 C-말단 테일 도메인 및 N-말단 테일 도메인이 혈소판 활성화에 대하여 반대 효과를 가진다는 것을 제안한다.

한편, N-말단 FERM 도메인은 대조군과 비교하였을 때, ADP에 의해 유도된 혈소판 활성화에 대하여 어떤 유의적인 효과도 발휘하지 못하였다 (5군 참조).

실시예 4. 혈소판 응집 검정

6명의 건강한 개체로부터 혈장 샘플을 수집하고, 혈장 응고를 막기 위해 이를 9:1 (v/v)의 비율로 3.8% 시트르산나트륨과 함께 혼합하였다. 이어서, 혼합된 혈장 샘플을 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장 ("PRP") 일부와, 혈소판이 부족한 혈장 ("PPP") 또 다른 일부를 수득하였다. PRP을 PPP로 희석하여 혈소판 계수가 1 ㎕당 5 x 10⁸개인 혈장 샘플을 추후 사용을 위한 시험 혈장 샘플로서 수득하였다.

시험 혈장 샘플을 하기 표 3에 기술되어 있는 것과 같은 혈소판 활성화의 억제제의 존재하에 수분 동안 (예컨대, 5 min) 인큐베이션시킨 후, 그에 하기 표 3에 기술되어 있는 것과 같은 혈소판 활성화의 활성제를 첨가하고, 추가의 수분 동안 혈장 샘플을 추가로 배양하여 최종 혼합물을 수득하였다. 본(Born) 방법에 따라 TYXN-91 인텔리전트 블러드 어글루토미터(TYXN-91 Intelligent Blood Agglutometer)를 사용하여 샘플의 투명도를 측정함으로써 혈액 응집에 대해 최종 혼합물을 검출하였다. 양성 대조군으로서, ADP 또는 모에신의 N-말단 도메인에 대한 항체의 존재하의 PRP의 투명도 또한 검출하였다. 어떤 억제제도 함유하지 않는 음성 대조군 또한 시험하였다.

혈소판 응집률 ("PAR") 및 혈소판 응집 억제율 ("PAIR")을 보여주는 시험 결과는 하기 표 3에 열거되어 있다.

1) 시험군의 투명도에서 PPP의 투명도를 감산하고, 2) 단계 1)의 결과를 PPP의 투명도로 나눈 후, 3), 여기에 100%를 곱함으로써 PAR을 계산하였다. PAIR은 1) 시험군의 PAR에서 PRP 군의 PAR을 감산하고, 2) 단계 1)의 결과를 PRP 군의 PAR로 나눈 후, 3), 여기에 100%를 곱함으로써 계산하였다.

종래의 펩티드 합성법에 따라 고체상에서 RGDS를 제조하고, 이를 본원에서는 0.01 M PBS 중 10 ug/ml의 농도로 사용하였다. 본 실험에서 사용된 모에신 단편 및 항-모에신 항체는 실시예 1에 따라 제조하였다. 하기 표 3에 기술된 바와 같은 억제제와 관련된 농도는 시험 혈장 샘플 중 억제제의 최종 농도이고, ADP 및 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체의 활성제와 관련된 농도는 시험 혈장 샘플 중 최종 농도를 언급한다.

PAR 및 PAIR로 나타낸 결과는 하기 표 3에 열거되어 있다. 도 8 또한 시험군 1-3 및 음성 대조군에 대한 PAIR을 도시하고 있다.

표 3의 결과를 보면, 모에신의 N-말단 FERM 도메인은 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체에 의해 유도된 혈소판 응집을 유의적으로 억제시킬 수 있는 반면 (PAIR은 대략 90%), ADP에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제시킬 수 있는 그의 능력은 훨씬 더 작은 것으로 나타났다 (2군 참조). 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체는 ADP-유도성 혈소판 응집을 유의적으로 억제시킬 수 있었다 (PAIR은 대략 62%) (3군 참조). 대조적으로, RGDS는 ADP-유도성 혈소판 응집을 유의적으로 억제시킬 수 있지만 (PAIR은 대략 76%), 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체에 의해 유도된 혈소판 응집에 대해서 미치는 억제 효과는 훨씬 더 작은 것으로 나타났다 (1군 참조).

상기 시험 결과는 비정상적인 고 수준의, 모에신의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체에 의해 유도된 비정상적인 혈소판 응집 (예컨대, 혈전증)을 조절하는 데 모에신의 N-말단 FERM 도메인이 사용될 수 있으며; 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체 또한 비정상적인 혈소판 응집을 조절하는 데 사용될 수 있다는 것을 제안한다.

실시예 5. 환자군의 혈청 중 특이적인 자가항체의 검출 및 측정

비정상적인 수준의 혈소판을 가진 다양한 질환을 앓는 환자로부터 혈청 샘플을 수집하고, 상기 질환과 관련된 다양한 자가항체의 존재에 대해서 시험하였다. 환자의 프로파일과 임상적 정보를 사용하여 그의 질환의 유형 및 단계에 기초하여 환자를 분류하였다.

혈청 샘플 중의 존재에 대하여 시험된 자가항체로는 1) 항-모에신 N-말단 도메인 항체, 2) 항-혈소판 항체, 3) 항-카디오리핀 항체 (IgM, IgG 및 IgA의 서브군 포함), 4) 항-베타2 당단백질 1 항체 (IgM, IgG, 및 IgA의 서브군 포함), 및 5) 항-dsDNA 항체를 포함하였다. 항체 2), 3) 및 4)는 모두 시험을 위해 선택된 질환과 관련된 공지의 지시제였다.

상하이 지에멘 바이오-테크 컴퍼니 리미티드, PRC(Shanghai Jiemen Bio-Tech Co., Ltd., PRC)로부터 상업적으로 입수한 PAIG ELISA 키트를 사용하여 항-혈소판 항체를 시험하였다. 항-카디오리핀 항체는, 모두 제우스 사이언티픽, 인코퍼레이티드(ZEUS Scientific, Inc.)로부터 상업적으로 입수한 제우스(Zeus) 항-카디오리핀 IgG/IgA/IgM ELISA 키트를 사용하여 시험하였다. 항-베타2 당단백질 1 항체는 유로이뮨 메디치니쉬 라보르디아그노스티카 아게(Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG)로부터 상업적으로 입수한 항-베타2 당단백질 1 ELISA 키트 (IgG/IgA/IgM)를 사용하여 시험하였다. 항-dsDNA 항체는 상하이 켁신 바이오테크 컴퍼니 리미티드, PRC(Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd., PRC)로부터 상업적으로 입수한 항-이중 가닥 DNA (항-DsDNA)용 ELISA 키트를 사용하여 시험하였다. 시험은 제조사에 의해 제공된 각각의 키트 설명서에 따라 수행하였다. 하기 기술되는 ELISA 검정법에 따라 존재에 대하여 항-모에신 N-말단 도메인 항체를 시험하였다.

실시예 1로부터 수득된 모에신의 N-말단 FERM 도메인을 항-모에신 N-말단 도메인 항체에 대한 ELISA 검정법에서 항원으로서 사용하였다. 구체적으로, ELISA 플레이트의 각각의 마이크로웰을 2℃ 내지 8℃에서 12-16시간 동안 약 400 ng의 모에신의 N-말단 FERM 도메인으로 코팅한 후, 차단 용액으로 차단시키기 전에 PBS로 1회에 걸쳐 세척하고, 보관 및 추후 사용을 위해 진공 건조시켰다. 그렇게 고도로 정제된 항원 (즉, 모에신의 N-말단 FERM 도메인)을, 그 항원을 그의 천연 상태 그대로 보존할 수 있는 조건하에서 폴리스티렌 마이크로웰 플레이트의 웰에 결합시켰다.

APS인 것으로 임상적으로 진단을 받은 180명의 환자 (180명의 환자 중 100명의 환자는 PAPS인 것으로 임상적으로 진단을 받은 환자이고, 80명의 환자는 SAPS인 것으로 임상적으로 진단을 받은 환자였다), aPL-혈전증인 것으로 임상적으로 진단을 받은 50명의 환자, APS-관련 임신 합병증인 것으로 임상적으로 진단을 받은 20명의 환자를 포함하는 3개의 환자군으로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 100명의 건강한 개체로부터도 혈청 샘플을 수집하고, 이를 건강한 대조군으로서 시험하였다.

대조군 및 환자 혈청을 PBS-T 완충제 (즉, 0.05% (v/v)의 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제)를 이용하여 희석시키고, 이어서, 상기와 같이 희석된 대조군 및 희석된 환자 혈청 100 ㎕를 별개의 웰에 첨가하여 존재하는 항-모에신 N-말단 도메인 항체가 고정화된 항원에 결합할 수 있도록 하였다. PBS-T 완충제를 이용하여 비결합 샘플은 세척하여 제거하고, 효소 표지된 항-인간 IgG 접합체를 각각의 웰에 첨가하였다. 2차 인큐베이션을 통해 효소 표지된 항-인간 IgG가, 마이크로웰에 부착되어 있는 임의의 항체에 결합할 수 있도록 하였다. 임의의 비결합 효소 표지된 항-인간 IgG를 세척하여 제거한 후, 발색성 기질 (H₂O₂/TMB)을 첨가하고, 발색되는 색상의 강도를 측정함으로써 남아있는 효소의 활성을 측정하였다. 이어서, 100 ㎕의 HRP 정지 용액 (예컨대, 2 M H₂SO₄)을 각각의 웰에 첨가하였다. HRP 정지 용액을 첨가하고 유지시키는 순서 및 시간은 TMB 크로모겐(TMB Chromogen)에 따라 진행되었다. 손가락으로 가볍게 각각의 ELISA 플레이트를 톡톡 두드림으로써 웰이 완전하게 혼합될 수 있도록 하였다.

분광광도측정계를 이용하여 검정을 평가하여 환자 웰에서 발색된 색상 강도를 측정하고, 이를 대조군 웰에서의 색상과 비교하였다. 구체적으로, 이색성 측정법을 사용하여 색상 강도를 측정하고, 비교하였는데, 여기서, 각 웰의 OD₄₅₀ 값 및 OD₆₃₀ 값 (참조로서의 값) 둘 모두 반응 종결로부터 15 min 이내에 판독하였다. OD₆₃₀ 값에서 OD₄₅₀ 값을 감산함으로써 각 시험군 또는 대조군 샘플의 OD 값을 계산하였다.

모든 배치의 샘플을 이용하여 ELISA 저 양성 대조군, ELISA 고 양성 대조군 및 ELISA 음성 대조군에 대해 진행함으로써 모든 시약과 방법이 적절히 수행될 수 있도록 하였다. ELISA 음성 대조군을 위해 건강한 개체로부터 혈청을 수집하였다. 100명의 건강한 개체로부터 수집된 혈청의 OD 값을 각각 측정하고, 상기 100개의 샘플로부터의 평균 OD 값 ("대조군 OD 값") 및 표준 편차 ("대조군 표준 편차")를 계산하였다. 상기 대조군 OD 값 및 대조군 표준 편차를 사용하여 ELISA 저 양성 대조군 및 고 양성 대조군의 농도를 측정하였다. ELISA 저 양성 대조군은 대조군 OD 값 + 3 X 대조군 표준 편차와 동일한 OD 값을 나타내도록 충분히 희석된, PAPS 또는 SAPS 환자로부터의 혈청을 포함하였다. ELISA 고 양성 대조군은 3 X ELISA 저 양성 대조군의 OD 값과 동일한 OD 값을 나타내도록 희석된, PAPS 또는 SAPS 환자로부터의 혈청을 포함하였다. 희석은 0.01 M PBS-T 완충제를 사용하여 수행하였다.

먼저, 샘플당 2벌로 이루어진 각 세트에 대한 평균 OD 값을 측정하고, 그의 평균 OD 값이 ELISA 저 양성 대조군의 평균 OD 값보다 높다면, 샘플은 양성인 것으로 결정지었다 (하기 표 4에 제시된 바와 같음).

당업자가 이해하는 바와 같이, 마커 수준과 PAPS 및 SAPS의 존부와의 상관관계를 보여주는 단계는 상이한 방식으로 수행 및 달성될 수 있다. 일반적으로, 참조 집단을 선택하고, 정상 범위를 확립한다. 적절한 참조 집단을 사용하여 항-모에신 N-말단 도메인 항체에 대한 정상 범위를 확립하는 것은 상당히 통상적이다. 정상 범위는 어느 정도까지, 그러나, 제한적으로 그 범위가 확립되는 참조 집단에 따라 달라질 수 있다는 것은 일반적으로 받아들여지고 있는 사실이다. 한 측면에서, 참조 집단의 개체수는 예컨대, 수백 내지 수천에 이르기까지 많고, 연령, 성별 및 임의로 관심의 대상이 되는 다른 변수에 대해 매치된다. 주어진 농도와 같이, 절대값에 있어서 정상 범위는 또한 사용되는 검정법, 및 검정법을 만들어 내는 데 사용되는 표준화에 따라 달라질 수 있다.

항-모에신 N-말단 도메인 항체에 대한 수준은 실시예 섹션에서 주어진 검정 방법을 이용하여 측정되고 확립될 수 있다. 상이한 검정법은 상이한 컷-오프 값으로 이어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실험실 시험의 임상적 성능은 그의 진단 정확도, 또는 대상체를 임상적으로 관련된 서브군으로 정확하게 분류할 수 있는 능력에 따라 달라질 수 있다. 진단 정확도는 조사되는 대상체의 상이한 상태를 정확하게 구별해 낼 수 있는 시험의 능력을 평가한다. 상기 상태는 예를 들어, 건강 및 질환 또는 양성 대 악성 질환이다. 즉, 특정 환자 집단으로부터 수득된 값이 유의적으로 더 높다면, 이는 상응하는 항-모에신 N-말단 도메인 자가항체의 존재가 양성임을 시사하는 것이다.

본 실험의 결과는 도 9에 도시되어 있고, 이는 또한 다양한 환자군에서의 상이한 자가항체의 양성 존재에 관하여 비교한 하기 표 4에 열거되어 있다:

표 4의 결과를 보면, 항-모에신 N-말단 도메인의 양성 존재는 PAPS 및 SAPS 서브군 둘 모두에서 유의적으로 높았고 (각각 대략 66% 및 62%), 그의 양성 존재는 5개의 시험된 자가항체 중에서 PAPS 및 SAPS 서브군 둘 모두에서 두번째로 가장 높게 나타났다. 그러므로, 이는 항-모에신 N-말단 도메인이 APS의 발병률과 유의적인 상관관계에 있다는 것을 시사한다.

항-모에신 N-말단 도메인의 양성 존재는 5개의 시험된 자가항체 중에서 aPL-혈전증 군 및 APS-관련 임신 합병증 군 둘 모두에서 가장 높았다. 이는 항-모에신 N-말단 도메인은 또한 aPL-혈전증 및 APS-관련 임신 합병증의 발병률과 유의적인 상관관계에 있다는 것을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Kexin Biotech Co. Ltd. <120> DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES OF MOESIN FRAGMENTS <130> 034569-8008WO01 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> the Full Length Human Moesin Protein <400> 1 Met Pro Lys Thr Ile Ser Val Arg Val Thr Thr Met Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ala Ile Gln Pro Asn Thr Thr Gly Lys Gln Leu Phe Asp Gln 20 25 30 Val Val Lys Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Phe Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Gln Asp Thr Lys Gly Phe Ser Thr Trp Leu Lys Leu Asn Lys Lys 50 55 60 Val Thr Ala Gln Asp Val Arg Lys Glu Ser Pro Leu Leu Phe Lys Phe 65 70 75 80 Arg Ala Lys Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Asp 85 90 95 Ile Thr Gln Arg Leu Phe Phe Leu Gln Val Lys Glu Gly Ile Leu Asn 100 105 110 Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr 115 120 125 Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln 145 150 155 160 His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His 165 170 175 Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile 195 200 205 Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240 Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val 245 250 255 Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro 260 265 270 Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His 275 280 285 Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln 290 295 300 Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys His Gln Lys Gln Met Glu Arg 305 310 315 320 Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu 325 330 335 Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys 340 345 350 Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln 355 360 365 Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser 370 375 380 Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln 405 410 415 Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu 420 425 430 Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys 435 440 445 Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys 450 455 460 Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln 465 470 475 480 Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala 485 490 495 Asp Ala Met Ala Lys Asp Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala 500 505 510 Glu Lys Asn Glu Arg Val Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu 515 520 525 Leu Ala Asn Ala Arg Asp Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile 530 535 540 His Ala Glu Asn Met Arg Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg 545 550 555 560 Gln Ile Arg Gln Gly Asn Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser 565 570 575 Met <210> 2 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminal FERM domain of human moesin protein <400> 2 Met Pro Lys Thr Ile Ser Val Arg Val Thr Thr Met Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ala Ile Gln Pro Asn Thr Thr Gly Lys Gln Leu Phe Asp Gln 20 25 30 Val Val Lys Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Phe Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Gln Asp Thr Lys Gly Phe Ser Thr Trp Leu Lys Leu Asn Lys Lys 50 55 60 Val Thr Ala Gln Asp Val Arg Lys Glu Ser Pro Leu Leu Phe Lys Phe 65 70 75 80 Arg Ala Lys Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Asp 85 90 95 Ile Thr Gln Arg Leu Phe Phe Leu Gln Val Lys Glu Gly Ile Leu Asn 100 105 110 Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr 115 120 125 Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln 145 150 155 160 His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His 165 170 175 Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile 195 200 205 Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240 Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val 245 250 255 Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro 260 265 270 Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His 275 280 285 Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro 290 295 <210> 3 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> helical and C-terminal tail domains of human moesin protein <400> 3 Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys 1 5 10 15 His Gln Lys Gln Met Glu Arg Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys 20 25 30 Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu 35 40 45 Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala 50 55 60 Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg 85 90 95 Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu 130 135 140 Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu 145 150 155 160 Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala 165 170 175 Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu 180 185 190 Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala Asp Ala Met Ala Lys Asp Arg Ser Glu 195 200 205 Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala Glu Lys Asn Glu Arg Val Gln Lys His 210 215 220 Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu Leu Ala Asn Ala Arg Asp Glu Ser Lys 225 230 235 240 Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile His Ala Glu Asn Met Arg Leu Gly Arg 245 250 255 Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Gln Ile Arg Gln Gly Asn Thr Lys Gln 260 265 270 Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser Met 275 280 <210> 4 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> helical domain of human moesin protein <400> 4 Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys 1 5 10 15 His Gln Lys Gln Met Glu Arg Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys 20 25 30 Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu 35 40 45 Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala 50 55 60 Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg 85 90 95 Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu 130 135 140 Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu 145 150 155 160 Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys Thr Ala Met Ser Thr Pro 165 170 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminal tail domain of human moesin protein <400> 5 His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln Asp Glu Gln Asp Glu Asn 1 5 10 15 Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala Asp Ala Met Ala Lys Asp 20 25 30 Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala Glu Lys Asn Glu Arg Val 35 40 45 Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu Leu Ala Asn Ala Arg Asp 50 55 60 Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile His Ala Glu Asn Met Arg 65 70 75 80 Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Gln Ile Arg Gln Gly Asn 85 90 95 Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser Met 100 105 <210> 6 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA Sequence encoding for the Full Length Human Moesin Protein <400> 6 atgcccaaaa cgatcagtgt gcgtgtgacc accatggatg cagagctgga gtttgccatc 60 cagcccaaca ccaccgggaa gcagctattt gaccaggtgg tgaaaactat tggcttgagg 120 gaagtttggt tctttggtct gcagtaccag gacactaaag gtttctccac ctggctgaaa 180 ctcaataaga aggtgactgc ccaggatgtg cggaaggaaa gccccctgct ctttaagttc 240 cgtgccaagt tctaccctga ggatgtgtcc gaggaattga ttcaggacat cactcagcgc 300 ctgttctttc tgcaagtgaa agagggcatt ctcaatgatg atatttactg cccgcctgag 360 accgctgtgc tgctggcctc gtatgctgtc cagtctaagt atggcgactt caataaggaa 420 gtgcataagt ctggctacct ggccggagac aagttgctcc cgcagagagt cctggaacag 480 cacaaactca acaaggacca gtgggaggag cggatccagg tgtggcatga ggaacaccgt 540 ggcatgctca gggaggatgc tgtcctggaa tatctgaaga ttgctcaaga tctggagatg 600 tatggtgtga actacttcag catcaagaac aagaaaggct cagagctgtg gctgggggtg 660 gatgccctgg gtctcaacat ctatgagcag aatgacagac taactcccaa gataggcttc 720 ccctggagtg aaatcaggaa catctctttc aatgataaga aatttgtcat caagcccatt 780 gacaaaaaag ccccggactt cgtcttctat gctccccggc tgcggattaa caagcggatc 840 ttggccttgt gcatggggaa ccatgaacta tacatgcgcc gtcgcaagcc tgataccatt 900 gaggtgcagc agatgaaggc acaggcccgg gaggagaagc accagaagca gatggagcgt 960 gctatgctgg aaaatgagaa gaagaagcgt gaaatggcag agaaggagaa agagaagatt 1020 gaacgggaga aggaggagct gatggagagg ctgaagcaga tcgaggaaca gactaagaag 1080 gctcagcaag aactggaaga acagacccgt agggctctgg aacttgagca ggaacggaag 1140 cgtgcccaga gcgaggctga aaagctggcc aaggagcgtc aagaagctga agaggccaag 1200 gaggccttgc tgcaggcctc ccgggaccag aaaaagactc aggaacagct ggccttggaa 1260 atggcagagc tgacagctcg aatctcccag ctggagatgg cccgacagaa gaaggagagt 1320 gaggctgtgg agtggcagca gaaggcccag atggtacagg aagacttgga gaagacccgt 1380 gctgagctga agactgccat gagtacacct catgtggcag agcctgctga gaatgagcag 1440 gatgagcagg atgagaatgg ggcagaggct agtgctgacc tacgggctga tgctatggcc 1500 aaggaccgca gtgaggagga acgtaccact gaggcagaga agaatgagcg tgtgcagaag 1560 cacctgaagg ccctcacttc ggagctggcc aatgccagag atgagtccaa gaagactgcc 1620 aatgacatga tccatgctga gaacatgcga ctgggccgag acaaatacaa gaccctgcgc 1680 cagatccggc agggcaacac caagcagcgc attgacgaat ttgagtctat gtaa 1734

Claims (28)

1. 샘플을, 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 활성을 억제시키는 방법.
2. 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체를 포함하며, 여기서 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로 이루어진 것인,
   대상체에서 혈전증, APS, 유산, aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증 또는 고혈소판증인 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물.
3. 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 자가항체를 함유하거나, 함유할 것으로 의심되는 샘플을, 모에신 단편을 포함하는 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인으로 이루어지고, 상기 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 활성을 증가시키는 방법.
4. 모에신 단편을 포함하는 펩티드를 포함하며, 여기서 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인으로 이루어지고, 상기 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로 이루어진 것인,
   인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 자가항체를 가지거나, 가지는 것으로 의심되는 대상체에서 면역성 혈소판 감소증, 혈소판 감소 자반증, 용혈, HELLP 증후군, 파종 혈관내 응고, 전신 홍반 루푸스 또는 재생불량 빈혈인 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물.
5. 샘플을, 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 활성을 증가시키는 방법.
6. 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인에 대한 항체를 포함하며, 여기서 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인, 대상체에서 면역성 혈소판 감소증, 혈소판 감소 자반증, 용혈, HELLP 증후군, 파종 혈관내 응고, 전신 홍반 루푸스, 또는 재생불량 빈혈인 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물.
7. 샘플을, 모에신 단편을 포함하는 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어지고, 상기 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인, 샘플 중 혈소판의 활성을 억제시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 샘플이 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인에 대한 자가항체를 함유하거나, 함유할 것으로 의심되는 것인 방법.
9. 모에신 단편을 포함하는 펩티드를 포함하며, 여기서 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어지고, 상기 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인,
   대상체에서 혈전증, APS, 유산, aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증 또는 고혈소판증인 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 대상체가 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인에 대한 자가항체를 가지거나, 가지는 것으로 의심되는 것인 제약 조성물.
11. (i) 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 단편을 포함하는 펩티드와 접촉시키며, 여기서 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인으로 이루어지고, 상기 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로 이루어진 것인 단계; (ii) 상기 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하는 단계를 포함하는,
    혈소판 감소 자반증, 용혈, HELLP 증후군, 파종 혈관내 응고, 또는 전신 홍반 루푸스인 비정상적인 저 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
12. (i) 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 단편을 포함하는 펩티드와 접촉시키며, 여기서 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어지고, 상기 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인 단계; (ii) 상기 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하는 단계를 포함하는,
    혈전증, APS, 유산, aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증 또는 고혈소판증인 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
13. 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 제1 및 제2 펩티드와 접촉시키며, 여기서 제1 펩티드는 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인으로 이루어진 제1 모에신 단편을 포함하고, 상기 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577 사이의 영역으로 이루어진 것이며, 제2 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어진 제2 모에신 단편을 포함하고, 상기 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인 단계, 및 제1 및 제2 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하는 단계를 포함하는,
    혈전증, APS, 유산, aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증, 고혈소판증, 면역성 혈소판 감소증, 혈소판 감소 자반증, 용혈, HELLP 증후군, 파종 혈관내 응고, 전신 홍반 루푸스 또는 재생불량 빈혈인 비정상적인 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
14. 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어진 모에신 단편을 포함하는 펩티드 및 검출용 시약을 포함하고, 여기서 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인,
    대상체에서 혈전증, APS, 유산, aPL-혈전증, APS-관련 임신 합병증, 또는 고혈소판증인 비정상적인 고 수준의 혈소판과 관련된 장애 또는 질환을 진단하기 위한 키트.
15. (i) APS를 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 펩티드를 포함하는 조성물과 접촉시키며, 여기서 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어진 모에신 단편을 포함하고, 상기 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인 단계;
    (ii) 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하고, 펩티드에 결합된 항-모에신 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
    (iii) 항-모에신 자가항체의 수준을, 항-모에신 자가항체의 역가와 APS의 병리학적 상태의 상관관계를 보여주는 이환된 참조 샘플로부터 수득된 참조 데이터베이스와 비교하는 단계
    를 포함하는, APS를 앓는 대상체의 병리학적 상태를 결정하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
16. (i) APS를 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 펩티드와 접촉시키며, 여기서 펩티드는 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인으로 이루어진 모에신 단편을 포함하고, 상기 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 1-297 사이의 영역으로 이루어진 것인 단계;
    (ii) 상기 펩티드의 항-모에신 자가항체에의 결합을 검출하고, 펩티드에 결합된 항-모에신 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
    (iii) 항-모에신 자가항체의 수준을, 항-모에신 자가항체의 역가와 APS의 병리학적 상태의 상관관계를 보여주는 이환된 참조 샘플로부터 수득된 참조 데이터베이스와 비교하며, 여기서 역가의 감소는 대상체가 APS에 대한 치료에 대하여 양성 반응을 보임을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, APS에 대한 치료를 받고 있는 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법.
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