CN103429252B - 膜突蛋白片段的诊断和治疗用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了用于调节血小板活性和量以及用于预防和治疗与血小板活性和量的异常相关的疾病或病症的组合物和方法。

Description

膜突蛋白片段的诊断和治疗用途

技术领域

本申请涉及对自身免疫性疾病的分子生物学和医学研究。更具体地，本申请关注膜突蛋白片段及针对膜突蛋白片段的抗体在调节血小板的活性和数量方面的用途。

背景技术

自身免疫性疾病是由免疫系统对自身物质和组织的异常应答引起的疾病。共有超过80种不同类型的自身免疫性疾病，其总的来说是导致慢性疾病的第二位的原因，在最高达64岁的所有年龄组中，其是导致女性死亡的前十位的死因之一。

人们已在医学研究方面投入了大量精力用于了解自身免疫性疾病的机制以及寻找有效的诊断和治疗方法。目前多种自身免疫性疾病的特征是自身抗体的存在并且具有不良活性。这些自身抗体通常识别并结合至正常和健康的自身抗原，进而导致相关组织和器官的明显损伤和衰竭。

免疫性血小板减少症是一种自身免疫性血液病，其特征为免疫系统攻击导致血液中的血小板被破坏，结果使得血小板计数异常降低。血小板被破坏的原因是存在抗血小板自身抗体，其是定向针对患者自身血小板的抗体。血小板计数降低可能会导致容易出现瘀伤、牙龈或鼻出血，以及不太常见的，导致严重的内出血。

血栓是在血管中形成的血块，其可能会阻碍血液在血管中的流动，从而严重干扰心血管系统的功能。据信血栓与血小板的异常活化和聚集相关。

抗磷脂综合征(APS)的特征为存在抗磷脂(aPL)抗体，特别地，存在针对心磷脂和β2糖蛋白的抗体。APS能够在动脉和静脉中导致血栓以及流产、孕产妇和胎儿发病。已描述了两种形式的APS：原发性抗磷脂综合征(PAPS)(Asherson,R.A.，等，(1989)Medicine 68:366-374)，其没有任何潜在的疾病的证据，和继发性抗磷脂综合征 (SAPS)(Alarcon-Segovia,D.等，(1989)Medicine 68:353-365)，其中APS与其他疾病如系统性红斑狼疮(SLE)相关。

发明内容

本申请提供了用于调节血小板的活性和数量以及预防和治疗与血小板的活性和数量异常相关的病症或疾病的组合物和方法。此外，本申请提供了用于诊断与血小板的活性和数量异常相关的病症或疾病的组合物和方法。在本申请的定义章节对本章节下面使用的某些相关术语进行了定义。

一方面，本申请提供了一种在样品中抑制血小板水平(即，活性和/或数量)的方法，其包括将所述样品与含针对膜突蛋白片段的第一抗体的组合物接触，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成。

另一方面，本申请提供了一种在主体中预防和/或治疗与血小板水平异常升高相关的病症或疾病的方法，包括给予所述主体药学有效量的含针对膜突蛋白片段的第一抗体的药物组合物，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成。在某些实施方式中，与血小板水平异常升高相关的病症或疾病是血栓、APS(例如，PAPS或SAPS)、流产(例如，习惯性流产)、抗磷脂(aPL)抗体介导的血栓(aPL-血栓)、抗磷脂综合征相关的妊娠并发症(APS-相关的妊娠并发症)或血小板增多症(例如，原发性血小板增多症或继发性血小板增多症)。

另一方面，本申请提供了一种在样品中调节血小板水平的方法，包括将所述样品与包含膜突蛋白片段的第一肽接触，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成。在某些实施方式中，所述样品含有或疑似含有针对人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段的自身抗体。

另一方面，本申请提供了一种在主体中预防和/或治疗与血小板水平异常降低相关的病症或疾病的方法，包括给予所述主体药学有效量的含膜突蛋白片段的第一肽的药物组合物，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成。在某些实施方式中，所述主体具有或疑似具有针对人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段的自身抗体。在某些实施方式中，所述与血小板水平异常降低相关的病症或疾病是免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜和继发性血小板减少性紫癜(例如，血栓性血小板减少性紫癜或者伴有溶血性尿毒综合症的血栓性血小板减少性紫癜)、溶血、肝酶升高和血小板降低综合症(HELLP综合症)、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮和再生障碍性贫血。

另一方面，本申请提供了一种在样品中刺激血小板水平的方法，包括将所述样品与含针对膜突蛋白片段的第二抗体的组合物接触，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成。

另一方面，本申请提供了一种在主体中刺激血小板水平的方法，包括给予所述主体药学有效量的含针对膜突蛋白片段的第二抗体的药物组合物，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成。

另一方面，本申请提供了一种在样品中抑制血小板水平的方法，包括将所述样品与包含膜突蛋白片段的第二肽接触，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成。在某些实施方式中，所述样品含有或疑似含有针对人膜突蛋白N-末端FERM结构域或其片段的自身抗体。

另一方面，本申请提供了一种在主体中抑制血小板水平的方法，包括给予所述主体药学有效量的含膜突蛋白片段的第二肽的药物组合物，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成。在某些实施方式中，所述主体具有或疑似具有针对人膜突蛋白N-末端FERM结构域或其片段的自身抗体。

另一方面，本申请提供了一种在主体中预防和/或治疗与血小板水平异常升高相关的病症或疾病，包括给予所述主体药学有效量的含膜突蛋白片段的第二肽的药物组合物，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成。在某些实施方式中，所述主体具有或疑似具有针对人膜突蛋白N-末端FERM结构域或其片段的自身抗体。在某些实施方式，与血小板水平异常升高相关的病症或疾病是血栓、APS(例 如，PAPS或SAPS)、流产(例如，习惯性流产)、aPL-血栓、APS-相关的妊娠并发症或血小板增多症(例如，原发性血小板增多症或继发性血小板增多症)。

另一个方面，本申请提供了一种诊断与血小板水平异常降低相关的病症或疾病的方法，包括(i)将来自疑似患有此类病症或疾病的主体的样品与包含能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段的第一肽接触，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成；(ii)检测所述第一肽与抗膜突蛋白自身抗体的结合。如果样品中存在的与第一肽结合的抗膜突蛋白自身抗体的水平高于来自参照样品的正常水平，则表明所述主体患有与血小板水平异常降低相关的病症或疾病的风险较高。

在另一个方面，本申请提供了一种诊断与血小板水平异常升高相关的病症或疾病的方法，包括(i)将来自疑似患有此类病症或疾病的主体的样品与包含能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段的第二肽接触，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成；(ii)检测所述第二肽与抗膜突蛋白自身抗体的结合。如果样品中存在的与第二肽结合的抗膜突蛋白自身抗体的水平高于来自参照样品的正常水平，则表明所述主体患有与血小板水平异常升高相关的病症或疾病的风险较高。

在某些实施方式中，第一肽包括人膜突蛋白C-末端尾结构域的至少八个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第一肽包括人膜突蛋白C-末端尾结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第一肽包含人膜突蛋白C-末端尾结构域的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续的氨基酸残基。

在某些实施方式中，人膜突蛋白的C-末端尾结构域由来自人膜突蛋白氨基酸残基区段大约471-577的氨基酸残基组成。在某些实施方式中，人膜突蛋白的C-末端尾结构域含有选自以下组的氨基酸残基：人膜突蛋白氨基酸残基区段471-574、471-575、471-576、471-577、472-574、472-575、472-576、472-577、473-574、473-575、473-576、473-577、474-574、474-575、474-576或474-577的氨基酸残基。在某些实施方式中，人膜突蛋白的C-末端尾结构域含有选自以下组的氨基酸残基：人膜突蛋白氨基酸残基区段471-487、488-501、502-577和471-577的氨基酸残基。在某些实施方式中，第一肽包含人膜 突蛋白整个C-末端尾结构域。在某些实施方式中，第一肽基本上由人膜突蛋白的氨基酸残基471-577或其片段组成。在某些实施方式中，第一肽不含人膜突蛋白N-末端FERM结构域的任何实质性部分。如本申请所使用的，术语“实质性部分”指能够与所述结构域(螺旋结构域或N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)竞争，特异性结合抗体的所述相关结构域(螺旋结构域或N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)的部分，所述抗体能够与所述整个相关结构域(螺旋结构域或N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)结合。

在某些实施方式中，第一肽包含人膜突蛋白氨基酸残基区段471-487的至少八个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第一肽包含人膜突蛋白氨基酸残基区段488-501的至少八个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第一肽包含人膜突蛋白氨基酸残基区段502-577的至少八个连续的氨基酸残基。

在某些实施方式中，第一肽与人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在某些实施方式中，第一肽与选自人膜突蛋白的氨基酸残基471-487、488-501、502-577和471-577之一的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的至少八个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续的氨基酸残基。

在某些实施方式中，人膜突蛋白的N-末端FERM结构域由人膜突蛋白的氨基酸残基区段1-297的氨基酸残基组成。在某些实施方式中，人膜突蛋白的N-末端FERM结构域含有选自以下组的氨基酸残基：人膜突蛋白的氨基酸残基区段1-294、1-295、1-296、1-297、2-294、2-295、2-296、2-297、3-294、3-295、3-296、3-297、4-294、4-295、4-296 或4-297的氨基酸残基。在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的整个N-末端FERM结构域。在某些实施方式中，第二肽基本上由人膜突蛋白N-末端结构域的氨基酸残基或其片段组成。在某些实施方式中，人膜突蛋白的N-末端FERM结构域含有选自以下组的氨基酸残基：人膜突蛋白的氨基酸残基区段1-94、95-201、202-297和1-297的氨基酸残基。在某些实施方式中，第二肽不含人膜突蛋白C-末端尾结构域的任何实质性部分。

在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的氨基酸残基区段1-94的至少八个连续的氨基酸。在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的氨基酸残基区段95-201的至少八个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的氨基酸残基区段202-297的至少八个连续的氨基酸残基。

在某些实施方式中，第二肽与人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在某些实施方式中，第二肽与选自人膜突蛋白的氨基酸残基1-94、95-201、202-297和1-297之一的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

另一方面，本申请中描述的第一和/或第二肽进一步包括载体多肽。术语“载体多肽”指能够与本申请肽的膜突蛋白片段偶联的任意肽或多肽。载体多肽对于本申请的肽可能是有益的，例如提高本申请肽的稳定性、溶解度、特异性或非特异性结合亲和性和/或本申请肽的功能。然而，载体多肽不需要对本申请的肽提供任何益处甚至生物学功能。常用的载体多肽包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、抗体片段如抗体的恒定区。

另一方面，本申请提供了一种与血小板水平异常相关的病症或疾病的诊断方法，包括将来自疑似患有此类病症或疾病的主体的样品与能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的第一肽和第二肽接触，其中所述第一肽包括基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成的第一膜突蛋白片段，所述第二肽包括基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成的第二膜突蛋白片段，以及检测第一肽和第二肽与抗膜突蛋白自身抗体的结合。抗膜突蛋白自身抗体分别与第一肽和第二肽结合的不同水平可能与同主体的血小板水平异常相关的病症或疾病的不同阶段和严重程度具有相关性。在某些实施方式中，在检验第二肽与抗膜突蛋白抗体结合之前，针对第一肽与抗膜突蛋白抗体的结合对所述样品进行检验。在某些实施方式中，同时针对第一肽和第二肽与抗膜突蛋白抗体的结合对所述样品进行检测。在某些实施方式中，在检验第一肽与抗膜突蛋白抗体结合之前针对第二肽与抗膜突蛋白抗体的结合对所述样品进行检验。

另一方面，本申请提供了针对膜突蛋白片段的第一抗体在生产药物组合物中的用途，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成，所述药物组合物用于在主体中预防或治疗与血小板水平异常升高有关的病症或疾病。

另一方面，本申请提供了针对膜突蛋白片段的第二抗体在生产药物组合物中的用途，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成，所述药物组合物用于在主体中预防或治疗与血小板水平异常降低相关的病症或疾病。

另一方面，本申请提供了针对膜突蛋白片段的第一肽在生产药物组合物中的用途，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成，所述药物组合物用于在主体中预防或治疗与血小板水平异常降低相关的病症或疾病。

另一方面，本申请提供了针对膜突蛋白片段的第二肽在生产药物组合物中的用途，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成，所述药物组合物用于在主体中预防或治疗与血小板水平异常升高相关的病症或疾病。

另一方面，本申请提供了针对膜突蛋白片段的第一肽在生产诊断组合物中的用途，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成，所述诊断组合物用于在主体中诊断与血小板水平异常降低相关的病症或疾病。

另一方面，本申请提供了针对膜突蛋白片段的第二肽在生产诊断组合物中的用途，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成，所述诊断组合物用于在主体中诊断与血小板水平异常升高相关的病症或疾病。

另一方面，本申请提供了一种用于在主体中诊断与血小板水平异常降低相关的病症或疾病的试剂盒，包括包含基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成的膜突蛋白片段的第一肽，和检测试剂。在某些实施方式中，检测试剂是能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的抗体。在某些实施方式中，能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的肽与固相连接。

另一方面，本申请提供了一种用于在主体中诊断与血小板水平异常升高相关的病症或疾病的试剂盒，包括包含基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成的膜突蛋白片段的第二肽，和检测试剂。

另一方面，本申请提供了一种确定患有APS(或血栓或者其他疾病或病变)的主体病理状况的方法，包括：

(i)将来自疑似患有APS(或血栓或者其他疾病或病症)的主体的样品与包括能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的肽的组合物接触，其中所述肽包括膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成；

(ii)检测所述肽与抗膜突蛋白自身抗体的结合并测量与所述肽结合的抗膜突蛋白自身抗体的水平；以及

(iii)将所述抗膜突蛋白自身抗体的水平与显示抗膜突蛋白自身抗体滴度与APS(或血栓或者其他疾病或病症)病理状况之间关系的参照数据库进行比较，所述参照数据库是从患病的参照样品得来的，根据比较结果确定所述主体的病理状况。

在某些实施方式中，参照数据库是显示抗膜突蛋白自身抗体的滴度与主体血小板计数水平之间关系的参照曲线。

另一方面，本申请提供了一种在进行APS(或血栓或者其他疾病或病症)治疗的主体中监测治疗应答的方法，包括：

(i)将来自疑似患有APS(或血栓或者其他疾病或病症)的主体的样品与能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的肽接触，其中所述肽包括基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域或其片段组成的膜突蛋白片段；

(ii)检测所述肽与抗膜突蛋白自身抗体的结合并测量与所述肽结合的抗膜突蛋白自身抗体的水平；以及

(iii)将所述抗膜突蛋白自身抗体的水平与显示抗膜突蛋白自身抗体滴度与APS(或血栓或者其他疾病或病症)病理状况之间关系的参照数据库进行比较，所述参照数据库是从患病的参照样品得来的，根据比较结果确定所述主体的病理状况，其中滴度降低表明所述主体对所述治疗产生有效应答。

在某些实施方式中，所述参照数据库含有针对治疗不同阶段的抗膜突蛋白自身抗体水平的数据。

另一方面，本申请提供了一种在主体中诊断APS(或血栓或者其他疾病或病症)的方法，包括下述步骤：(i)将肽与来自所述主体的样品接触，所述肽包括人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的至少八个连续的氨基酸残基；以及(ii)确定在所述样品中存在的抗膜突蛋白自身抗体的水平是否高于在参照样品中的所述抗膜突蛋白自身抗体的水平，以表明所述主体是否具有APS(或血栓或者其他疾病或病症)。

附图的简要说明

图1.全长人膜突蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。

图2.膜突蛋白片段的氨基酸序列：N-末端FERM结构域(SEQ ID NO:2)、螺旋和C-末端尾结构域(SEQ ID NO:3)、螺旋结构域(SEQ ID NO:4)和C-末端尾结构域(SEQ ID NO:5)。

图3.编码全长人膜突蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO:6)(其中第一个划线的部分是编码膜突蛋白N-末端FERM结构域的cDNA序列，第二个划线的部分是编码膜突蛋白C-末端尾结构域的cDNA序列)。

图4.pET32a(+)表达载体的克隆谱。

图5.pET28a(+)表达载体的克隆谱。

图6.在存在抗膜突蛋白N-末端结构域抗体、N-末端FERM结构域或ADP的情况下，CD62P和CD63表达的图示说明。

图7.在存在抗膜突蛋白N-末端结构域抗体、N-末端FERM结构域或ADP联合不同血小板活化抑制剂的情况下，CD62P和CD63表达的图示说明。

图8.在存在N-末端FERM结构域、抗膜突蛋白C-末端尾结构域抗体或RGDS联合ADP或抗膜突蛋白N-末端结构域抗体的情况下，血小板聚集抑制率的图示说明。

图9.在不同患者组的血清中，五个不同自身抗体存在情况的图示说明。

具体实施方式

除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，1984版)；Animal CellCulture(R.I.Freshney，1987版)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、多核苷酸和多肽可以采用本领域公知的标准技术制备。

除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology，第二版，J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，和March,Advanced OrganicChemistry Reactions,Mechanisms and Structure，第四版，John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)，针对本申请中使用的多个术语为本领域技术人员提供了一般性的指导。

定义

如Lankes和Furthmayr(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,88:8297-8301中所描述的，术语“膜突蛋白”指膜组织延伸刺突蛋白。全长的人膜突蛋白是577个氨基酸的多肽，其具有如图1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。根据下文中的进一步定义，膜突蛋白由三个结构域组成：N-末端FERM结构域、螺旋结构域和C-末端尾结构域。其属于ERM(埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白)家族。所述的三种ERM蛋白，主要在细胞质膜下的细胞质中表达，其具有高度的序列同源性，并作为细胞质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的连接蛋白。此外，人膜突蛋白与其他种属如小鼠和牛的膜突蛋白之间具有高度的氨基酸序列同一性。Sato等，(1992)J.CellSci.103:131-143。

术语“膜突蛋白片段”指短于全长野生型膜突蛋白的膜突蛋白多肽的一部分，其能够与抗膜突蛋白自身抗体结合。此类能够与结构域特异性抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段在本申请中是有用的。所述膜突蛋白片段的“片段”指短于此类膜突蛋白片段的膜突蛋白片段的一部分，其仍能与抗膜突蛋白自身抗体结合。

人膜突蛋白的“N-末端FERM结构域”指野生型人膜突蛋白的球状部分，其在结构上与所述蛋白的氨基末端邻近，在功能上负责将所述蛋白定位于细胞质膜并且与粘附分子相互作用。因为所述FERM结构域与蛋白具有同源性而代表了条带4.1、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白同源结构域。该FERM结构域定义了条带4.1蛋白超家族成员，其包括细胞骨架蛋白如红细胞条带4.1、踝蛋白和埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族，以及若干酪氨酸激酶和磷酸酶及肿瘤抑制蛋白merlin。特别地，该术语指人膜突蛋白成熟形式的约前297个氨基酸残基(例如，氨基酸残基1-297(SEQ ID NO:2))。在某些文献中，也将同一结构域称为N-ERM相关结构域(N-ERMAD)，其包括在本申请的定义中。Bretscher等，(1995)Biochem.34,16830-7。

人膜突蛋白的“C-末端尾结构域”指野生型人膜突蛋白的一部分，其在结构上与所述蛋白的羧基末端邻近，在功能上负责与肌动蛋白丝结合并与其相互作用。膜突蛋白的尾结构域带正电并采用延伸、弯曲的结构。特别地，该术语指人膜突蛋白的约最后107个氨基酸残基(例如，氨基酸残基471-577(SEQ ID NO:5))。在某些文献中，也将同一结构域称为C-ERM相关结构域(C-ERMAD)，其包括在本申请的定义中。Bretscher等，(1995)。C-末端尾结构域的最后34个氨基酸残基在ERM蛋白中高度保守，并形成与F-肌动蛋白结合的区段。在F-肌动蛋白结合区段内，存在苏氨酸残基(在野生型人膜突蛋白中为Thr558)，其在该蛋白活化的过程中磷酸化。

人膜突蛋白的“螺旋结构域”指位于N-末端FERM结构域和C-末端尾结构域之间的野生型人膜突蛋白的中间部分。其采用延伸的α-螺旋结构，作为两个末端结构域之间的连接子。特别地，该术语指包含人膜突蛋白大约298-470位的氨基酸残基(SEQ ID NO:4)区段。

术语“自身抗体”指由个体的免疫系统产生的，识别并结合至此类个体自身内在物质的任意抗体。术语“抗膜突蛋白自身抗体”指抗膜突蛋白抗体，其由个体的免疫系统产生的，并与此类个体自身的膜突蛋白或其片段识别和结合。抗膜突蛋白自身抗体的存在与异常的血小板水平相关，此类抗膜突蛋白自身抗体的滴度可能与异常血小板水平的病理状况相关。

本申请所使用的术语“与血小板的活性和数量异常相关的病症或疾病”或者“与血小板的水平异常升高/降低相关的病症或疾病”指由在主体中血小板的异常活化或破坏导致的血小板水平异常升高或降低引起或促进的病症或疾病。与血小板水平异常升高相关的示例性疾病，包括但不限于血栓、APS(例如，PAPS或SAPS)、流产(例如，习惯性流产)、aPL-血栓、APS-相关的妊娠并发症或血小板增多症(例如，原发性血小板增多症或继发性血小板增多症)。与血小板水平异常降低相关的示例性疾病包括，但不限于免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜和继发性血小板减少性紫癜(例如，血栓性血小板减少性紫癜或者伴有溶血性尿毒综合症的血栓性血小板减少性紫癜)、溶血、肝酶升 高和血小板降低综合症(HELLP综合症)、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮和再生障碍性贫血。

本申请所使用的术语“诊断”指鉴别分子或病理状况，疾病或状况，如鉴别自身免疫性疾病，或者指鉴别可能从特定治疗方案中获益的自身免疫性疾病患者。在一个实施方式中，诊断指鉴别异常的血小板水平。在又一个实施方式中，诊断指鉴别异常的血小板水平，所述异常的血小板水平与主体中的抗膜突蛋白自身抗体高于正常值相关。在又一个实施方式中，诊断指在主体中鉴别APS。在又一个实施方式中，诊断指在主体中鉴别习惯性流产的风险。

本申请所使用的术语“预后”指疾病症状后果的可能性预测，包括例如疾病的复发、发作和耐药性。该术语也指治疗的临床益处的可能性预测。

本申请所使用的术语“预测”指患者对药物或一组药物或特定治疗过程产生有利或不利应答的可能性。在一个实施方式中，所述预测与那些应答的程度相关。在一个实施方式中，所述预测涉及经治疗后患者是否存活或病情改善和/或其概率，例如使用特定治疗剂治疗，以及疾病某一时间段没有复发。本发明的预测方法可以在临床上使用，以便通过对任意特定患者选择最合适的治疗形式作出治疗决定。本申请的预测方法在预测患者是否可能对治疗方案产生有利应答方面是有价值的，如给定治疗方案，包括例如给予给定治疗剂或其组合、手术干预、类固醇治疗等，或者在采用治疗方案后患者是否可能长期存活。

本申请所使用的术语“药学有效量”指足以实现所期望的目的(例如，调节血小板水平的异常升高或降低)的，根据本申请(或其群体或其药物组合物)的膜突蛋白片段(例如，人膜突蛋白的N-末端FERM结构域，或人膜突蛋白的C-末端尾结构域)或抗膜突蛋白抗体(例如，针对人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的抗体，或针对人膜突蛋白的C-末端尾结构域的抗体)或其片段的任意量。

本申请所使用的术语“药学上可接受的”指适宜给药的任何组分(例如，盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂)。

如本申请所使用的，术语“血栓”指在血管内形成的血栓(血块)。该术语包括，但不限于，动脉和静脉血栓，包括深静脉血栓、门静脉血栓、颈静脉血栓、肾静脉血栓和脑静脉窦血栓。与血栓相关的疾病和状况包括，但不限于，急性静脉血栓，肺栓塞，妊娠期血栓，出血性皮肤坏死，急性或慢性弥散性血管内凝血(DIC)，手术、长期卧床、长期固定所致的血块形成，静脉血栓，爆发性脑膜炎球菌血症，急性血栓性中风，急性冠状动脉闭塞，急性外周动脉闭塞，大面积肺栓塞，腋静脉血栓，大面积髂股静脉血栓，闭塞动脉插管，闭塞静脉插管，心肌病，肝静脉闭塞病，低血压，心输出量减少，血管阻力降低，肺动脉高压，肺顺应性降低，白细胞减少症和血小板减少症，中风，心肌梗死，Budd-Chiari综合症，Paget-Schroetter病。

如本申请所使用的，术语“抗磷脂抗体介导的血栓”或“aPL-血栓”指由抗磷脂抗体介导或与之相关的免疫性血栓。

如本申请所使用的，术语“抗磷脂综合征相关的妊娠并发症”或“APS相关的妊娠并发症”指在具有抗磷脂综合征的雌性哺乳动物中胎儿的发病率、胎儿生长受限和/或流产的频率增加。在人类中，患有APS相关妊娠并发症患者的分类标准包括存在抗磷脂(aPL)抗体并且：(1)出现一次或多次妊娠10周或10周以后形态正常的胎儿原因不明的死亡；或者(2)出现一次或多次妊娠34周或34周以前形态正常的胎儿早产；或者(3)在妊娠10周以前出现三次或以上原因不明的连续自发性流产(Levine等，N.Eng.J.Med.346:752-63(2002))。

如本申请所使用的，术语“抗磷脂综合征”或“APS”指抗磷脂抗体与高凝状态综合症之间的临床关联(Levine等，N.Eng.J.Med.346:752-63(2002))。APS包括原发性抗磷脂综合征(PAPS)，其中没有任何原发性疾病的证据，和继发性抗磷脂综合征(SAPS)，其中APS与其他疾病相关。APS能够导致血栓或妊娠相关的并发症或其他疾病或状况。

如本申请所使用的，术语“流产”指在某一阶段妊娠自然或自发终止，在这一阶段胚胎或胎儿无法存活，在人类中一般定义为妊娠约20周以前。术语“习惯性流产”被广泛定义为复发性流产，特指三次或更多次的连续流产。

本申请使用的术语“血小板减少症”指因血小板产生障碍或破坏而使得主体的血小板水平低于该个体血小板数正常范围的任意疾病。在一个实施方式中，在人体内正常血小板水平的范围是每微升外周血约150.000至300.000个。如本申请所使用的，血小板减少症还指与个体在某个参照点测量的血小板数相比，该个体的血小板数减少。所述参照点可以是例如治疗如放疗或化疗开始时。

本申请所使用的术语“免疫性血小板减少症”指由定向针对个体自身血小板的自身免疫应答引起的任意类型的血小板减少症。免疫性血小板减少症包括原发性免疫性血小板减少症，其中自身免疫应答是导致血小板计数减少的根本原因。免疫性血小板减少症包括例如特发性血小板减少性紫癜。此外，还有继发性免疫性血小板减少症，其中血小板计数减少与一种或多种其他疾病有关，如再生障碍性贫血、缺铁性贫血和自身免疫性溶血性贫血、白血病、系统性红斑狼疮、HIV相关的血小板减少症、维斯科特-奥尔德里奇综合症、伊文思综合症等。在继发性免疫性血小板减少症中，其他疾病诱导或触发或者以其他原因导致个体的机体针对其自身血小板产生自身免疫性应答。

本申请中的“样品”或“待测样品”指获取自或来自所关注主体的组分，其含有细胞和/或其他分子实体，所述细胞和/或其他分子实体可以基于其性质例如物理学、生化、化学和/或生理学性质而被表征和/或鉴别。在一个实施方式中，该定义包括来源于生物的血液和其他液体样品以及组织样品如活检标本或组织培养物或从中得到的细胞或细胞培养物。组织样品的来源可以是实体组织如来自新鲜、冰冻和/或保存的器官或组织样品或者活检样品或抽出物；血液或任意血液成分如血浆或血清；体液；以及来自主体在妊娠或发育的任意时间的细胞或血浆。在另一个实施方式中，所述样品是来自主体的全血、血清或血浆。主体可以是人或动物主体。在另一个实施方式中，主体患有或疑似患有异常的血小板水平。在另一个实施方式中，该定义包括在取得后经过任意方法处理的生物样品，如使用试剂处理、增溶或对某些成分如蛋白或多核苷酸进行富集。

在一个实施方式中，样品来自在进行任何治疗以前的主体或患者。在另一个实施方式中，待测样品来自治疗中或治疗后，如调节异常的血小板水平的治疗或针对APS的治疗。在一个实施方式中，待测样品是临床样品。在另一个实施方式中，待测样品用于诊断 分析。在另一个实施方式中，在采用本申请的方法进行检测前，使用其他已知的血液检测方法对所述样品进行预试。这些血液检测方法包括例如全血计数、肝酶、肾功能、维生素B₁₂水平、叶酸水平、红细胞沉降率、外周血液涂片、骨髓活检等。

如本申请所使用的，“参照样品”指来自已知来源，或来自确信未患有使用本申请的方法或组合物鉴别的疾病或病症的主体的样品。在一个实施方式中，对照样品获取自组合物或方法鉴别的疾病或病症的同一主体或患者机体的健康部分。在一个实施方式中，参照样品来自个体身体的健康部分。所述个体是使用本申请的组合物或方法无法鉴别的疾病或病症的主体或患者。在一个实施方式中，参照样品是来自具有正常血小板计数的健康个体的样品。

如本申请所使用的，“疾病参照样品”指来自在临床上已鉴定为患有疾病或病症的来源的样品，将使用本申请的方法或组合物对所述样品进行鉴别。在一个实施方式中，疾病对照样品是获取自在临床上诊断为APS的主体或患者的样品。在一个实施方式中，在临床上诊断为APS的主体或患者正接受针对APS的治疗。

如本申请所使用的，“参照数据库”指来自一个或多个参照样品或疾病参照样品的数据、标准或水平的集合。在一个实施方式中，此类数据、标准或水平的集合是标准化的，以便可以用来比较来自一个或多个样品的数据。“标准化”或“规范化”是一种方法，通过其将测量的原始数据转换成可以直接与其他这样标准化的数据直接进行比较的数据。标准化用于克服由于不同分析之间因素变化而导致的分析特异性误差，例如上样量、结合效率、检测敏感性和其他多种误差的变异性。在一个实施方式中，参照数据库包括来自一个或多个参照样品或疾病参照样品的抗膜突蛋白自身抗体滴度、血小板计数、血细胞计数和/或其他实验室和临床数据。在一个实施方式中，参照数据库包括抗膜突蛋白自身抗体的水平，其每个均标准化为对比样品(例如，已知量的抗膜突蛋白自身抗体)的抗膜突蛋白自身抗体水平的百分率，所述对比样品的抗膜突蛋白自身抗体水平是在与参照样品或疾病参照样品相同的条件下检验得到的。为了与此类标准化的抗膜突蛋白自身抗体的水平进行比较，还对待测样品抗膜突蛋白自身抗体的水平进行测量，并计算为对比样品的抗膜突蛋白自身抗体水平的百分率，所述对比样品的抗膜突蛋白自身抗体水平是在与待测样品相同 的条件下进行检验得到的。在一个实施方式中，通过汇总来自参照样品数据建立参照数据库，所述参照样品来自健康主体和/或使用本申请的组合物或方法对其疾病或病症进行鉴别的同一主体或患者机体的未患病部分。在一个实施方式中，通过汇总疾病参照样品的数据建立参照数据库，所述疾病参照样品来自针对APS进行治疗的个体。在一个实施方式中，通过汇总疾病参照样品的数据建立参照数据库，所述疾病参照样品来自APS处于不同阶段的个体，所述APS所处的不同阶段通过例如血小板计数和其他临床指征的不同水平证实。

在某些实施方式中，术语“增加”指与参照样品或疾病参照样品相比自身抗体的水平总体升高5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，所述自身抗体的水平通过本领域公知的标准方法如本申请所描述的那些方法检测得到。在某些实施方式中，术语增加指在样品中自身抗体的水平增加，其中增加的自身抗体的水平是参照样品或疾病参照样品的至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。

在某些实施方式中，本申请中的术语“减少”指与参照样品或疾病参照样品相比自身抗体的水平总体降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，所述自身抗体的水平通过本领域公知的标准方法如本申请所描述的那些方法检测得到。在某些实施方式中，术语减少指在样品中自身抗体的水平减少，其中减少的自身抗体的水平是参照样品或疾病参照样品的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍。

术语“检测方法”指在本申请所述的ELISA中用于检测可检测抗体是否存在的部分或技术，包括检测剂，其扩增固化的标记如被酶标板捕获的标记。在一个实施方式中，检测方法是比色检测剂如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素HRP。在另一个实施方式中，检测方法是H₂O₂/TMB显色系统。

术语“捕获试剂”指在样品中能够结合并捕获靶分子的试剂，这样在适宜条件下，可以将捕获试剂-靶分子复合物与其余的样品分离。典型地，捕获试剂被固定或是可固定的。在夹心免疫分析中，捕获试剂优选是针对靶抗原的抗体或不同抗体的混合物。

所谓“关联”或“相关”指以任何方式将第一种分析或方案的表现和/或结果与第二种分析或方案的表现和/或结果进行比较。例如，可以使用第一种分析或方案的结果实施第二种方案和/或可以使用第一种分析或方案的结果确定是否应实施第二种分析或方案。就自身抗体检测的实施方式而言，可以使用检测分析或方案的结果确定是否应实施特定的治疗方案。

本申请中使用的单词“标记”指化合物或组合物，其直接或间接地偶联或融合至某种试剂如核酸探针或抗体，并使其偶联或融合的试剂易于检测。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者对于酶标记而言，其可以催化底物化合物或组合物的化学变化，所述化学变化是可检测的。

“分离的”多肽指已从其天然环境的污染组分中鉴别和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，其可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方式中，所述多肽将被纯化至(1)通过Lowry法测得多肽以重量计大于95％，或者以重量计大于99％，(2)通过使用转杯式测序仪测得达到足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或者(3)通过使用考马斯蓝或银染色法以还原或非还原条件下的SDS-PAGE测得具有同质性。分离的多肽包括在重组细胞内原位的多肽，因为多肽天然环境中的至少一种污染组分将不存在。然而，通常的，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。

与本申请的膜突蛋白结构域或片段相关的“氨基酸序列同一性百分率(％)”，其被定义为在所关注序列中与膜突蛋白结构域或片段的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分率，且且是在序列比对后，且如果必要引入间隙，以达到序列同一性的最大百分率，并且不把任何保守性氨基酸取代作为所述序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分率的比对可以通过本领域内公知的多种多种方法实现，例如使用公众可以获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。参见例如Altschul等， Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(1997)；Altschul等，Methods in Enzymology 266：460-480(1996)。本领域技术人员能够确定用于测量比对的适宜参数，包括在待比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任意算法。

术语“抗体”使用其最广泛的含义并且特别地涵盖了单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和只要展示出所需的抗原结合活性的抗体片段即可。如本申请所使用的，术语“单克隆抗体”指来自基本上同质性的抗体的群体，即包括所述群体的个体抗体除了可能存在的少量突变外是相同的，例如天然产生的突变。

“治疗”指治疗性治疗和预防或防范措施。需要治疗的主体包括已经患有疾病或病症的主体以及需要预防疾病或病症的主体。

可以使用任何表明对患者的益处的终点对患者的应答性进行评估，包括但不限于，在治疗后的给定时间点(1)在某种程度上抑制疾病的进展，包括延缓和完全阻止；(2)减少疾病发作的次数和/或减轻症状；(3)缩小损伤尺寸；(4)抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病细胞向周围邻近的器官和/或组织浸润；(5)抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病传播；(6)在某种程度上减轻与疾病相关的一个或多个症状；(7)治疗后增加无病期的长度；(8)减少自身免疫性应答，其可能，但不必须，导致疾病损伤消失或除去的结果，例如无进展生存；(9)增加总生存期；(10)提高应答率；和/或(11)降低死亡率。术语“益处”使用其最广泛的含义并且指任意令人满意的效果。

本发明的典型方法和材料

本申请提供了用于诊断、监测、预防或治疗与异常的血小板水平相关的病症或疾病的组合物和方法。本申请可以使用本领域技术人员公知的常规方法实施。

载体、宿主细胞和重组方法

本申请的多肽可以使用易于获得的技术和材料来重组生产。对于本申请多肽的重组生产而言，会将编码多肽的核酸分离并插入可复制载体中，所述载体供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。使用常规方法可以容易地对编码本申请中多肽的DNA进行分离和测序。例如，通过使用寡核苷酸探针对编码人膜突蛋白的DNA进行分离和测序，所述探针能够特异性地与编码蛋白的基因结合。可以使用多种载体。载体组分一般包括，但不限于，下述中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种选择基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

信号序列组分

本申请的多肽不仅可以直接重组生产，还可以作为带有异源多肽的融合多肽来重组生产，所述融合多肽一般地是在成熟蛋白或多肽的N-末端，具有特异性裂解位点的信号序列或其他多肽。一般选择的异源性信号序列可以被宿主细胞识别和处理(即，通过信号肽酶裂解)。对于原核宿主细胞而言，信号序列可以选自，例如原核信号序列碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导物。对于酵母分泌物，信号序列可以是例如酵母转化前导物、α因子前导物(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导物)或酸性磷酸酶前导物、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导物或WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物的信号序列以及病毒分泌前导物例如单纯疱疹gD信号。

将此类前体区的DNA在读码框中连接至编码本申请的多肽的DNA。

复制起点组分

表达和克隆载体均含有能够使载体在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。在一般情况下，在克隆载体中该序列可以使所述载体的复制独立于宿主染色体DNA，且包括复制起点或自发复制的序列。在多种细菌、酵母和病毒中，此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数的革兰氏阴性细菌、2μ质粒起点适用于酵母、以及多种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)均可在哺乳动物细胞中用于克隆载体。在一般情况下，在哺乳动物表达载体中不需要复制起点组分(一般地可以仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。

选择基因组分

表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择性标记物。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其他毒素，例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养成分，例如编码杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个例子是利用药物阻止宿主细胞生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生能赋予药物抗性的蛋白，因而在选择过程中得以存活。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

另一个用于哺乳动物细胞的适宜选择性标记物的例子是能够识别可以摄取核酸的细胞的那些，如DHFR、胸腺嘧啶激酶、金属硫蛋白-I和-II、典型的灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体，对使用DHFR选择基因转化的细胞首先进行鉴别。当引入野生型DHFR时适宜的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

或者，可以在含有针对选择性标记物如氨基糖苷类抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的选择剂的培养基中，通过细胞生长对宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)进行选择，所述宿主细胞转化或共转化了编码本申请的多肽、野生型DHFR蛋白和其他选择性标记物如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列。参见美国专利号4,965,199。

在酵母中使用的适宜选择基因是在酵母质粒Yrp7中存在的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供了针对酵母突变株的选择标记物，所述酵母突变株在色氨酸中缺乏生长能力，例如ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。在酵母宿主细胞的基因组中的trp1损伤提供了一个有效环境，所述环境用于通过在缺乏色氨酸条件下生长来检测转化。类似地，使用已知携带Leu2基因的质粒弥补Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。

启动子组分

表达和克隆载体通常含有启动子，其可被宿主生物体识别并且与编码本申请多肽的核酸可操作性地连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子如tac启动子。但是，其他已知的细菌启动子也是适官的。在细菌系统中使用的启动子还含有与编码本申请多肽的DNA可操作性地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

用于真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有真核基因在转录起点上游约25至30个碱基的位置均具有富含AT的区段。多个基因的转录起点上游70至80个碱基处存在另一个序列，所述序列是CNCAAT区段，在该区段中N可以是任意核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，所述序列可能是在编码序列的3’末端添加polyA尾的信号。所有这些序列均适宜插入真核表达载体。

供酵母宿主使用的适宜启动子序列的例子包括3-磷酸甘油激酶或其他糖解酶如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸-果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。

其他酵母启动子，其是具有转录的附加优势的诱导型启动子，所述转录由生长条件控制，所述酵母启动子是针对乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区段。在EP 73,657中对适宜在酵母表达中使用的载体和启动子作了进一步的描述。将酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利地。

通过来自病毒基因组的启动子，在哺乳动物宿主细胞的载体中控制本申请多肽的转录，所述病毒基因组例如多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)，所述启动子还来自异源性哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克的启动子，所提供的此类启动子与宿主细胞系统具有相容性。

SV40病毒的早期和晚期启动子能够方便地以SV40限制性片段的形式获得，所述限制性片段也含有SV40病毒的复制起点。人巨细胞病毒的即刻早期启动子能够方便地以HindIII E限制性片段的形式获得。在美国专利号4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中描述了对该系统的改进。在来自单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶启动子的控制下，人β-干扰素cDNA在小鼠细胞中的表达亦可参见Reyes等，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

增强子元件组分

通过将增强子序列插入载体通常会增加高等真核细胞对编码本申请多肽的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的多个增强子序列。典型地，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点后侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。用于真核启动子活化的增强元件亦可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。增强子可以在多肽编码序列的5’或3’位点连接至载体，但是其一般位于启动子的5’位点。

转录终止组分

在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或者来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还将含有转录终止和稳定mRNA所必须的序列。此类序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的非转译区5’位点，有时来自3’位点。这些区段含有核苷酸片段，所述核苷酸片段转录为在编码本申请多肽的mRNA非转译部分中的聚腺苷酸片段。牛生长激素聚腺苷酸化区段是一种有用的转录终止组分。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。

宿主细胞的选择和转化

用于在本申请所述的载体中克隆或表达编码本申请多肽DNA的适宜宿主细胞为上文所述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。适宜的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科如埃希杆菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属例如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌属、以及杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如，在1989年4月12日公开的DD 266,710中披露的地衣芽胞杆菌)、假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌属。典型地，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但是其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是适宜的。这些例子是说明性的而非限制性的。

除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适宜用于编码本申请多肽的载体(编码载体)的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母或普通的面包酵母是最常用的。但是，多种其他的属、种和菌株通常在本申请中也是可用的和有用的，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母菌属宿主例如克鲁维乳酸酵母、脆弱克鲁维酵母(ATCC 12,424)、克鲁维保加利亚酵母(ATCC 16,045)、维克拉姆克鲁维酵母(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；耶氏酵母属(EP 402,226)；毕赤酵母属(EP 183,070)；念珠菌属；瑞氏木霉(EP244,234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母属如许旺酵母；和丝状真菌例如链孢霉菌、青霉菌、弯颈霉菌，和曲霉宿主如构巢曲霉和黑曲霉。

用于表达本申请多肽的适宜宿主细胞可以来自多细胞生物体。非脊椎动物细胞包括植物和昆虫细胞。已鉴定了多种杆状病毒菌株及其变体和对应许可的昆虫宿主细胞，其来自宿主如草地夜蛾(幼虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。用于转染的多种病毒菌株是可以公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，此类病毒可以在此作为根据本申请的病毒使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛和番茄的植物细胞培养物也能够作为宿主。

然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，在培养基(组织培养基)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(用于在悬浮培养物中生长的亚克隆293或 293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。

使用上文所述的用于生产本申请多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中对其进行培养，所述培养基被修饰以适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

培养宿主细胞

用于生产本申请的多肽的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham’s F10(Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(Sigma)均适于培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审号30,985中描述的任意培养基也可以作为宿主细胞的培养基。必要时可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源补充这些培养基中的任意一种。还可以补充本领域技术人员公知的适宜浓度的任意其他必要的添加剂。培养条件如温度、pH等均是此前被选择用于表达宿主细胞的那些，其对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。

肽的化学合成

本申请的多肽还可以通过化学合成生产，例如Merrifield in J.A.C.S.85：2149-2154(1963)中描述的固相合成法，或Bodanszky等，第二版，John Wiley and Sons，1976的《肽合成》中描述的标准溶液合成方法。这些书籍整体参考并入本申请。

采用肽合成的固相合成法一般步骤涉及首先将肽被保护的C-末端氨基酸与树脂连接。连接后，过滤、洗涤树脂并除去C-末端氨基酸α氨基基团上的保护基团(例如叔丁氧羰基)。当然，除去该保护基团必须在不破坏氨基酸与树脂之间连接的前提下进行。然后在得到的树脂肽上偶联倒数第二个C-末端被保护的氨基酸。进行这一偶联时，在第二个氨基酸的游离羧基与连接在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键。用连续的氨基酸重复这一反应过程，直到肽全部的氨基酸均与树脂连接。最后，从树脂上裂解下被保护的肽，除去保护基团，得到所需的肽。用于从树脂上分离肽和除去保护基团的裂解技术取决于所选择的树脂和保护基团，这些技术对熟悉肽合成领域的人来说是已知的。

上述树脂可以是任意适宜的聚合物并且其含有能够通过共价键与第一个被保护的氨基酸牢固连接的官能团。多种聚合物均适用于这一目的，如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。可以在固相合成中使用的适宜保护基团包括叔丁氧羰基(BOC)、苄基(BZL)、叔戊氧羰基(AOC)、对甲苯磺酰基(TOS)、邻溴苯基甲氧羰基(BrZ)、2，6-二氯苄基(BZLCl₂)和苯基甲氧羰基(Z或CBZ)。其他保护基团亦可参见J.F.W.McOmie，″ProtectiveGroups in Organic Chemistry″，Plenum Press，New York，1973中的描述。这本书整体参考并入本申请。

可以通过使用形成酰胺键的化学或酶学方法分步或嵌段偶联的方式进行标准溶液合成方法。这些溶液合成方法是本领域公知的。

多肽的纯化

可以从主体中回收本申请的多肽或蛋白。当使用重组技术时，本申请的多肽可能在细胞内、细胞周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。可以从培养基或从宿主细胞的裂解物中回收本申请的多肽。如果是膜结合的，可以使用适宜的去垢剂溶液(例如，Triton-X 100)或通过酶解将其从膜上释放。可以通过多种物理或化学方法破坏本申请多肽表达中使用的细胞，如反复冻融、超声、机械破坏、或细胞溶解剂。

如果肽是化学合成的，可以通过任意适宜的技术将本申请的肽从反应基质中回收，所述技术能够将所需的多肽与基质中的其他组分分离。对于固相合成而言，首先使用适宜的裂解溶液将被保护的肽从树脂上裂解。裂解溶液的选择依赖于树脂以及与其结合的氨基酸的性质(如FMOC法使用三氟乙酸)。裂解通常在酸性条件下进行。裂解完成后，获得分离的肽，并使用任意适宜的技术对其进一步纯化(如下文中描述的方法)。

下述方法是示例性的适宜的蛋白纯化方法：在离子交换柱上分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅上层析、在肝素SEPHAROSE^TM上层析、在阴离子或阳离子交换树脂上层析(如聚天冬氨酸柱、DEDA等)；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；除去污染物如IgG的蛋白A琼脂糖柱；以及与本申请的多肽以表位标记的形式结合的金属螯合柱。可以采用多种蛋白纯化方法，此类方法是本领域公知的并且已在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中描述。纯化步骤的选择将依赖于例如所使用的生产工艺和所生产的本申请特定蛋白的性质。

检测方法

在本申请的方法中，生物样品获取自疑似患有与异常的血小板水平(例如APS)相关疾病的主体，针对一种或多种抗膜突蛋白自身抗体(例如，针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体，用于APS的检测)的表达对其进行检查。可以通过多种方法对样品中不同抗膜突蛋白自身抗体的表达进行分析，其中的多种方法是本领域公知和本领域技术人员了解的，包括但不限于酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶联免疫流分析(ELIFA)、免疫印迹、Western印迹分析、免疫组化分析、免疫沉淀、分子结合分析等。多重免疫分析如从Rules BasedMedicine或Meso Scale Discovery(MSD)获得的那些也可以使用。这些方法包括非竞争性类型的单一位点和双位点或“夹心”检测，以及常规的竞争性结合分析。检测可以在体外、体内或离体进行。

夹心分析是最有用和最常用的分析之一。夹心分析技术存在的多种变体，均包含在本申请中。简言之，在一般的正向夹心分析中，将未标记的捕获试剂(例如膜突蛋白片段)固定在固体底物上，将针对靶蛋白(例如，抗膜突蛋白自身抗体)的待测样品与底物中结合的分子接触。经过一段适宜时间的培养后，即一段足以形成抗体-抗原复合物的时间，然后加入对靶蛋白具有特异性的检测抗体(例如，通过与抗膜突蛋白自身抗体的Fc区结合)，所述检测抗体标记了能够产生检测信号的报告分子，并进行培养，培养时间要足以形成另一个捕获试剂-靶蛋白-检测抗体的复合物。洗涤除去所有未反应的材料，通过观察报告分子产生的信号确定靶蛋白的存在。可以是通过对可视信号的简单观察得到的定性结果，或者可以是通过与含有已知量报告分子的对照样品进行比较得到的定量结果。

在一般的正向夹心检测中，对靶蛋白具有特异性的捕获试剂与固体支持物形成共价或被动的结合。固体支持物一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以以小管、小珠、微板盘或适于进行免疫检测的任意其他表面。

正向分析的变体包括同时分析，其中将样品和检测抗体同时加入捕获试剂中。这些技术均是本领域技术人员公知的，包括任何微小的变化也是显而易见的。另一种替代方法包括固定样品中的靶蛋白，然后将固定的靶蛋白暴露于本申请的肽，其可以使用或不使用报告分子标记。根据靶蛋白的量和报告分子信号的强度，可以通过使用捕获试剂(例如，膜突蛋白片段)直接标记来检测结合的靶蛋白。或者，将另一个特异性针对捕获试剂的检测抗体暴露于靶蛋白-捕获试剂复合物，以便形成靶蛋白-捕获试剂-检测抗体三重复合物。通过报告分子发出的信号对复合物进行检测。

如本申请所使用的，术语“报告分子”指通过其化学性质提供分析上可识别信号的分子，其允许对抗原-结合的抗体的检测。在这一类型的分析中最常用的报告分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

在某些实施方式中，报告分子是与检测抗体偶联的酶。酶一般催化显色底物的化学变化，能够使用多种技术对所述显色变化进行测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，能够通过分光光度法对其进行测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。通过用特定波长的光照射激发荧光染料，其吸收光能，染料分子处于激发态，随后发射出使用光学显微镜可以目测检测的具有特征颜色的光。化学发光底物通过化学反应处于电子激发态，然后可以发射能够被测量(例如，使用化学发光计)或向荧光受体提供能量的光。酶标记的例子包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪基二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶与抗体偶联的技术在O′Sullivan et ah，Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Co njugates for use in Enzyme Immunoassay，inMethods in Enzym.(ed.J.Langone&H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)中进行了描述。

酶-底物组合的例子包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和底物过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前驱体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)和显色底物对-硝基苯磷酸盐；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和显色底物(例如，p-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基伞形-β-D-半乳糖苷酶)。本领域技术人员还可以采用多种其他的酶-底物组合。对这些组合的一般性综述见美国专利号4,275,149和4,318,980。

在某些实施方式中，报告分子是荧光团，包括但不限于，稀土螯合物(铕螯合物)、德州红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形花内酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白或可购买获得的荧光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一种或多种的衍生物。例如，可以使用在Current Protocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等，Wiley-Interscience，New York，Pubs.(1991)版中披露的技术将荧光团与抗体偶联。可以使用荧光计对荧光进行定量。

在某些实施方式中，报告分子是放射性同位素，如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵1、³H、和¹³¹I。例如可以使用上文所述的Current Protocols in Immunology中描述的技术对检测抗体或捕获试剂进行标记，并且使用闪烁计数测量放射活性。

有时，将标记间接地与检测抗体或捕获试剂偶联。本领域技术人员知晓实现此目标的多种技术。例如，检测抗体可以与生物素偶联，标记可以与抗生物素蛋白偶联，反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，这样标记就可以通过这种间接方式与检测抗体偶联。或者，为实现将标记与检测抗体间接偶联，将检测抗体与较小的半抗原偶联，将标记与抗-半抗原的抗体偶联。这样，可以实现标记与抗体的间接偶联。

在某些实施方式中，检测方法是竞争结合分析，其中使用竞争性抗膜突蛋白抗体。此类竞争性抗体能够与膜突蛋白自身抗体竞争结合至本申请的肽。在竞争结合分析中，结合信号减弱可以表明存在相应的自身抗体及其滴度。

诊断试剂盒

对于在本申请上文描述的或建议的用途，本申请还提供了生产的试剂盒和产品。此类试剂盒可以包括被分隔成用于密封收纳一个或多个容器如小瓶、小管等的载体，每个容器均包括将在所述方法中使用的一个独立元件。例如，其中一个容器可以包括探针，其是或者可能是可检测标记的。此类探针可以是对抗膜突蛋白自身抗体具有特异性的膜突蛋白片段。

典型地，本申请的试剂盒将包括上文所述的容器和一个或多个其他容器，所述容器包括从商业和用户的角度看所需的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插入包装中的使用说明书。可以在容器上使用标签，以便说明所述组分用于特定的治疗或非治疗应用，并且还可以说明是在体内或体外使用，如上文所述的那些。

本申请的试剂盒具有多种实施方式。一个典型的实施方式是试剂盒，其包括容器、在所述容器上的标签和在所述容器内的组分；其中所述组分包括能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的本申请的肽，在所述容器上的标签表明可以使用所述组分评估样品中是否存在抗膜突蛋白自身抗体，并针对使用本申请的肽评估样品中是否存在抗膜突蛋白自身抗体进行说明。该试剂盒可以进一步包括一组说明和用于制备组织样品和将本申请的肽应用于样品的材料。该试剂盒可以包括第二抗体，其中第二抗体与标记偶联，例如酶标记。

在试剂盒中的其他可选组分包括一种或多种缓冲剂(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂如底物(例如，显色体)，所述底物是通过酶标签化学改变的、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照片等。

治疗或预防应用

本申请的膜突蛋白片段和抗膜突蛋白抗体及其组合物可以在体外或体内被用作治疗性调节血小板水平异常的药物组合物。

一方面，本申请的N-末端FERM结构域或其片段和针对C-末端尾结构域或针对C-末端尾结构域的片段的抗体及其组合物可以用于在主体中抑制血小板的水平，以治疗与血小板水平异常升高相关的病症或疾病。

另一方面，本申请的C-末端尾结构域或其片段和针对N-末端FERM结构域或针对其片段的抗体或其组合物可以用于在主体中刺激血小板的水平，以治疗与血小板水平异常降低相关的病症或疾病。

可以预期本申请的膜突蛋白片段和抗膜突蛋白抗体及其组合物可以用于治疗哺乳动物。在一个实施方式中，例如给予非人哺乳动物本申请的膜突蛋白片段或抗膜突蛋白抗体或其组合物以获得临床前数据。待治疗的示例性非人哺乳动物包括非人灵长类、犬、猫、啮齿类和在其中进行临床前研究的其他哺乳动物。此类哺乳动物可以用于建立使用本申请的膜突蛋白片段或抗膜突蛋白抗体或其组合物治疗的疾病的动物模型，或者用于研究本申请所关注的膜突蛋白片段或抗膜突蛋白抗体或其组合物的毒性。在这些实施方式的每一个中，可以在哺乳动物中进行渐增剂量的研究。此外，或者在替代方案中，使用本申请的膜突蛋白片段或抗膜突蛋白抗体或其组合物治疗人类，例如罹患疾病或病症的患者将从所述组合物的给药中获益。

与血小板水平异常升高相关的病症或疾病的例子包括，但不限于APS(例如，PAPS或SAPS)、流产(例如，习惯性流产)、aPL-血栓、APS-相关的妊娠并发症或血小板增多症(例如，原发性血小板增多症或继发性血小板增多症)。与血小板水平异常降低相关的疾病或病症的例子包括，但不限于免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜和继 发性血小板减少性紫癜(例如，血栓性血小板减少性紫癜或者伴有溶血性尿毒综合症的血栓性血小板减少性紫癜)、溶血、肝酶升高和血小板降低综合症(HELLP综合症)、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮和再生障碍性贫血。

药物制剂

可以将多种物质或分子(例如，本申请的膜突蛋白片段或抗膜突蛋白抗体或其组合物)作为治疗剂。根据本领域公知的方法可以将这些物质或分子制成药学上有用的组合物，以使得所述产品与药学上可接受的载体混合。通过将具有所需纯度的活性成分与视情况选择的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合制备以冻干剂型或水溶液形式储存的治疗剂型。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体无毒性，并包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN.TM.、PLURONICS.TM.或PEG。

供体内给药使用的制剂必须是无菌的。通过在冻干或复溶前后利用无菌滤膜过滤能够很容易地实现。

本申请中的治疗组合物一般置于具有无菌入口的容器中例如静脉溶液袋，或具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞的小瓶中。

可以预期的是，当用于治疗多种疾病如APS和血栓时，本申请的物质或分子可以与其他适用于相同或类似疾病的治疗剂联用。当用于治疗APS或血栓时，本申请的物质或分子可以与常规的APS或血栓治疗联用。

在某些其他方面，用于与本申请的物质或分子(例如，膜突蛋白的N-末端FERM结构域或针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体)联合治疗血栓的其他治疗剂包括，但不限于，血小板抑制剂2a、低分子量肝素和类肝素以及普通肝素2b、因子Xa抑制剂2c、凝 血酶/因子Xa抑制剂2d的组合、纤维蛋白原受体拮抗剂(糖蛋白Ilb/IIa拮抗剂)2e和维生素K拮抗剂2f。

在某些其他方面，用于与本申请的物质或分子(例如，膜突蛋白的N-末端FERM结构域或针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体)联合治疗APS的其他治疗剂包括，但不限于肝素、低分子量肝素、阿司匹林和华法林。

给药途径为公知方法，例如通过静脉、腹腔、脑内、肌内、眼内、动脉或病灶内途径注射或输液，局部给药，或者通过持续释放系统。

本申请药物组合物的剂量和所需药物浓度可以依据预计的特定用途而改变。如何确定适宜给药的剂量或途径是普通医师所公知的。动物实验为人类治疗有效剂量的确定提供了可靠的指引。在种属间对有效剂量进行按比例的缩放可以根据在下文中描述的原则实施，Mordenti，J.和Chappell，W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″In Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等，Eds.，Pergamon Press，New York 1989，第42-96页。

当在体内给予本申请的物质或分子时，正常剂量可以在每日以哺乳动物体重计约10ng/kg至高达100mg/kg或以上范围内改变，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天，视给药途径而定。在文献中提供了针对特定给药剂量和递送方法的指导原则；参见例如美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212。预计不同制剂将对不同治疗化合物和不同病症有效，例如向某一器官或组织的靶向给药可能需要以不同方式向另一个器官或组织递送。

当制剂中需要物质或分子的持续释放给药，可以使用所述物质或分子的微囊。所述制剂具有释放特性，所述释放特性适于治疗任意需要给予所述物质或分子的疾病或病症。已成功在人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MN rgp120中实现了持续释放的重组蛋白微囊。Johnson等，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology，8：755-758(1990)；Cleland，″Design andProduction of Single Immunization Vaccines Using Polylactide PolyglycolideMicrosphere Systems，″in Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach，Powell and Newman，eds， (Plenum Press：New York，1995)，第439462页；WO 97/03692、WO96/40072、WO 96/07399；和美国专利号5,654,010。

由于其具有生物相容性和广泛的生物可降解性质，因而可以使用聚乳酸羟基乙酸(PLGA)共聚物开发持续释放制剂。PLGA的降解产物乳酸和羟基乙酸可以在人体内被迅速清除。而且，依据其分子量和组成可以在数月至数年范围内调节该聚合物的降解度。Lewis，″Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer，″in：M.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker：New York，1990)，第1-41页。

组合物(例如，药物组合物)可以与给药说明书一并包括在试剂盒、容器、包装或分配器内。当以试剂盒形式提供时，可以将所述组合物的不同组分包装在独立容器中并在使用前混合。所述组分的这种独立包装可以使其长期贮存且不会导致活性成分功能的损失。试剂盒还可以包括置于独立容器中便于进行特定检验的试剂，所述特定检验如诊断检验或组织分型。

试剂盒中的试剂可以置于任意种类的容器中，以使得不同的组分得以保存且不会被容器的材料吸附或改变。例如，密封玻璃安瓿中可以含有冻干调节底物/分子和/或缓冲剂，其在中性、非反应性气体如氮气下包装。安瓿可以由任意适宜的材料组成如玻璃，有机聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷、金属或一般用于存放试剂的任意其他材料。适宜容器的其他例子包括简单的瓶子，其可以由与安瓿类似的物质制造，和封套，其可以由金属箔内衬组成，如铝或合金。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可能具有无菌入口，如具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞的瓶子。其他容器可以具有两个室，其被易于除去的膜所分隔，将膜除去后可以使所述组分混合。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。

试剂盒还可以与说明性材料一并提供。说明书可以被印刷于纸上或其他基材上，和/或以电子可读介质的形式提供，如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘、光盘、录音带等。详细的说明书可以不在实物上与试剂盒相关联；作为替代，可以引导使用者到试剂盒的生产厂商或经销商指定的网站，或以电子邮件形式提供说明。

在本申请的另一个实施方式中，提供了含有用于治疗上文所述病症的材料的制品。所述制品包括容器和标签。适宜的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料制成如玻璃或塑料。所述容器存放有效治疗病症的组合物且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或小瓶，其具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞)。组合物中的活性剂是抗体。在容器上或与之关联的标签表明所述组合物用于治疗选定的疾病。所述制品可以进一步包括第二个容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，如磷酸缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和使用者的角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插有使用说明书的包装。

下文是本申请方法和组合物的实施例。可以理解，结合上文所提供的一般性说明，可以实施多种其他的实施方式。

实施例

实施例1 抗膜突蛋白单克降抗体的产生

采用常规的杂交瘤方法制备针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的单克隆抗体和针对膜突蛋白C-末端尾结构域的单克隆抗体。首先，使用PCR技术制备膜突蛋白的N-末端FERM结构域和膜突蛋白的C-末端尾结构域。

为产生具有序列SEQ ID NO：2的N-末端FERM结构域，使用PCR扩增与N-末端FERM结构域对应的cDNA片段(参见图3所示的SEQ ID NO：6，其中第一个划线的部分是N-末端尾结构域的cDNA序列)。为产生具有序列SEQ ID NO：5的C-末端尾结构域，使用PCR扩增与C-末端尾结构域对应的cDNA片段(参见图3所示的SEQ ID NO：6，其中第二个划线的部分是C-末端尾结构域的cDNA序列)。

将PCR扩增的膜突蛋白cDNA片段(即，C-末端尾结构域的cDNA片段或N-末端FERM结构域的cDNA片段)克隆至选自pET32a(+)和pET28a(+)的表达载体。然后使用已构建的载体转化用于培养和表达的大肠杆菌宿主细胞系BL21(DE3)。pET32a(+)和pET28a(+)的限制性和克隆谱分别见图4和5。使用限制性酶切反应对针对膜突蛋白片段 构建的表达系统进行验证，所述限制性酶切反应通过测序以确认膜突蛋白片段表达的正确阅读框。

充分培养后，收获已表达膜突蛋白片段的宿主细胞，根据标准蛋白表达方案收集和纯化膜突蛋白片段。使用SDS-PAGE对最终得到的蛋白片段进行分析，以确认其种类和纯度。

然后通过杂交瘤方法利用BALB/C小鼠，使用已表达的膜突蛋白N-末端FERM结构域和膜突蛋白的C-末端尾结构域分别制备针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的单克隆抗体和针对膜突蛋白C-末端尾结构域的单克隆抗体。

杂交瘤方法首先由Kohler和Milstein描述，Nature，256：495(1975)，其通过引用整体并入本申请。在典型的杂交瘤方法中，使用抗原(例如，N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)免疫小鼠(例如，BALB/C小鼠)，然后将已免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。将融合细胞收集至使杂交瘤选择性生长的培养基中，存活的杂交瘤集落生长起来。经过足够长的时间后，通过使用所述抗原的ELISA检验和免疫组化分析对上清液进行筛选。将阳性细胞选定做进一步亚克隆。通过有限稀释法将选定的克隆亚克隆。进行亚克隆直至所有的克隆均为ELISA阳性。然后选择所述阳性克隆以获得杂交瘤，所述杂交瘤产生针对所述抗原的单克隆抗体。

实施例2 血小板活化的刺激

CD62P和CD63的表达与血小板的活化相关。因此，可以使用这两种蛋白作为表征血小板活化谱的指示器。在存在不同试剂的情况下通过使用CD62P单克隆抗体和CD63单克隆抗体检测CD62P和CD63的表达水平在体外进行这项实验，以评估血小板活化的刺激。

从12名健康个体中收集血浆样品，在存在下表1中所述不同试剂的情况下，在室温下培养若干分针(例如，5分钟)。选择培养条件以使得血小板在约10分钟内能够全部活化。随后，使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD62P单克隆抗体和CD63单克隆抗体检测血浆样品中表达的CD62P和CD63，使用Beckman Coulter EPICS-XL流式细胞仪 检测血浆样品的荧光密度(“FD”)。以所检测的荧光密度的平均值表示CD62P和CD63的表达水平。

在该分析中被检测的试剂列于下表1，包括ADP，已知其是刺激血小板活化的试剂(第1组、抗膜突蛋白N-末端结构域抗体(第2组)和膜突蛋白的N-末端FERM结构域(第3组)，所述抗膜突蛋白N-末端结构域抗体和和膜突蛋白的N-末端FERM结构域均依据实施例1制备。

表1中列出的试剂的浓度是试剂在血浆样品中的最终浓度。将不含任何检验剂的血浆样品作为对照组检验。结果列于下表1，亦图示于图6。

表1 不同试剂对CD62P和CD63表达的作用

表1和图6中的结果显示，针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的单克隆抗体导致CD62P的表达最高(约为对照组表达水平的6倍)和CD63的表达最高(约为对照组表达水平的4倍)。其表明针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的单克隆抗体能够明显促进血小板的活化。

如表1和图6所示，膜突蛋白N-末端FERM结构域导致CD62P和CD63的表达水平与对照组的表达水平接近。其表明膜突蛋白的N-末端FERM结构域不刺激血小板的活化。

实施例3 血小板活化的抑制

进行本实验以评估不同抑制剂(即，检验剂)对由多种不同活化剂诱导的血小板活化的阻断作用。

从12名健康个体中收集血浆样品，在存在下表2中所述抑制剂的情况下培养若干分钟(例如，5分钟)，随后将使血小板活化的活化剂加入其中，将血浆样品再培养若干分钟(例如，5分钟)。培养条件与实施例2相同。随后，使用FITC标记的CD62P单克隆抗体和CD63单克隆抗体检测血浆样品中表达的CD62P和CD63，使用Beckman Coulter EPICS-XL流式细胞仪检测血浆样品的荧光密度。以所检测的荧光密度的平均值表示CD62P和CD63的表达水平。还对使用0.01M PBS代替任意抑制剂的对照组进行检测。

在本实验中检验的血小板活化的抑制剂和活化剂列于下表2。肽RGDS是公知的血小板活化的抑制剂，其通过与组合-1(PAC-1)的血小板活化剂竞争和血小板表面的糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物的结合，来抑制血小板的活化。根据常规的固相肽合成方法制备RGDS，所述RGDS在本申请中使用的浓度是在0.01M PBS中10mg/ml。在本实验中使用的膜突蛋白片段和抗膜突蛋白抗体依据实施例1制备。在本实验中所使用的，抗膜突蛋白N-末端结构域抗体在0.01M PBS中的浓度为20μg/ml、N-末端FERM结构域在0.01MPBS中的浓度为2mM、以及抗膜突蛋白C-末端结构域在0.01M PBS中的浓度为20μg/ml。本申请中使用的ADP在0.01M PBS中的浓度为5μM。结果列于下表2，亦图示于图7。

表2 不同抑制剂对CD62P和CD63表达的作用

表2和图7中的结果显示，与预期结果一致，RGDS能够基本上抑制ADP诱导的血小板活化(见第1组)；但是，RGDS对针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体诱导的血小板活化没有阻断作用(见第2组)。而与之相反的是，膜突蛋白的N-末端FERM结构域能够明显阻断针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体诱导的血小板活化(见第3组)。其表明针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体和RGDS通过不同途径抑制血小板活化。

其还显示针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体(即，抗膜突蛋白C-末端结构域)对血小板活化具有抑制作用(见第4组)。其提示膜突蛋白的C-末端尾结构域和N-末端尾结构域对血小板的活化具有相反作用。

另一方面，与对照组相比，N-末端FERM结构域对ADP诱导的血小板活化没有明显作用(见第5组)。

实施例4 血小板聚集分析

从6名健康个体中收集血浆样品，按照9∶1(v/v)的比例与3.8％的柠檬酸钠混合，以防止血浆凝固。然后将混合的血浆样品离心以获得一部分富含血小板的血浆(“PRP”)和另一部分乏血小板的血浆(“PPP”)。使用PPP对PRP进行稀释以获得血小板计数为5×10⁸每毫升的血浆样品，作为随后使用的检验血浆样品。

在存在下表3中描述的血小板活化抑制剂的情况下，将检验血浆样品培养若干分钟，随后将下表3中描述的使血小板活化的活化剂加入其中，再将血浆样品培养若干分钟以获得最终的混合物。依据Born法使用TYXN-91智能血液凝集仪测量样品的透明度，对最终混合物的血液聚集进行检测。还在存在ADP或针对膜突蛋白N-末端结构域的抗体的情况下，对PRP的透明度进行检测作为阳性对照。对不含抑制剂的阴性对照也进行了检验。

以血小板聚集率(“PAR”)和血小板聚集抑制率(“PAIR”)表示的检验结果列于下表3。

通过下述步骤计算PAR，1)PPP的透明度减去检验组的透明度，以及2)用步骤1)的结果除以PPP的透明度，再乘以100％。通过下述步骤计算PAIR，1)PRP组的PAR减去检验组的PAR，以及2)用步骤1)的结果除以PRP组的PAR，再乘以100％。

根据常规的固相肽合成方法制备RGDS，所述RGDS在本申请中使用的浓度是在0.01M PBS中10mg/ml。在本实验中使用的膜突蛋白片段和抗膜突蛋白抗体依据实施例1制备。下表3中描述的抑制剂的浓度是抑制剂在检验血浆样品中的最终浓度，ADP和针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体活化剂的浓度也指在检验血浆样品中的最终浓度。

以PAR和PAIR表示的结果列于下表3。图8还显示了检验组1-3和阴性对照组的PAIR。

表3 在存在不同活化剂的情况下不同抑制剂的抑制率(n＝6)

表3中的结果显示，膜突蛋白的N-末端FERM结构域能够显著抑制由针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体诱导的血小板聚集(PAIR约为90％)，而所述膜突蛋白的N-末端FERM结构域抑制ADP诱导的血小板聚集的能力则少得多(见第2组)。针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体能够明显抑制ADP-诱导的血小板聚集(PAIR约为62％) (见第3组)。而与之相反的是，RGDS能够明显抑制ADP-诱导的血小板聚集(PAIR约为76％)，但RGDS对由针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体诱导的血小板聚集的抑制作用低得多(见第1组)。

该检测结果表明膜突蛋白的N-末端FERM结构域能够用于调节异常的血小板聚集(例如，血栓)，所述异常的血小板聚集由针对膜突蛋白N-末端FERM结构域的抗体的水平异常升高诱导；和针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体也能够用于调节异常的血小板聚集。

实施例5 在患者组的血清中对特定自身抗体的检测和测量

从患有具有异常血小板水平的多种疾病的患者中收集血清样品，并检验与此类疾病相关的多种自身抗体的存在情况。使用患者的档案资料和临床信息基于其疾病的类型和阶段对其进行分类。

检验血清样品中存在的自身抗体，包括1)抗膜突蛋白N-末端结构域抗体，2)抗血小板抗体，3)抗心磷脂抗体(包括IgM、IgG和IgA亚型)，4)抗-β2糖蛋白1抗体(包括IgM、IgG和IgA亚型)，和5)抗-dsDNA抗体。抗体2)、3)和4)均是已知的、与选定的待测疾病相关的指示器。

使用PAIG ELISA试剂盒对抗血小板抗体进行检测，其从Shanghai Jiemen Bio-Tech Co.，Ltd.，PRC购得。使用Zeus抗心磷脂IgG/IgA/IgM ELISA试剂盒对抗心磷脂抗体进行检验，所述试剂盒从ZEUS Scientific，Inc购得。使用抗-β2糖蛋白1ELISA试剂盒(IgG/IgA/IgM)对抗-β2糖蛋白1抗体进行检验，所述试剂盒从Euroimmun MedizinischeLabordiagnostika AG购得。使用针对抗双链DNA(抗-DsDNA)的ELISA试剂盒对抗-dsDNA抗体进行检测，所述试剂盒从Shanghai Kexin Biotech Co.，Ltd.，PRC购得。根据生产厂商提供的各试剂盒的说明书进行检验。如下文所述，根据ELISA分析对存在的抗膜突蛋白N-末端结构域抗体进行检验。

将从实施例1中获得的膜突蛋白N-末端FERM结构域作为针对抗膜突蛋白N-末端结构域抗体的ELISA分析中的抗原。特别地，在2℃至8℃条件下使用约400ng膜突蛋白 N-末端FERM结构域将ELISA板的各微孔包被12-16小时，然后用PBS洗涤一次，随后使用封闭溶液封闭并真空干燥贮存备用。这样，在自然保存抗原的条件下，将经高度纯化的抗原(即，膜突蛋白的N-末端FERM结构域)与聚苯乙烯微孔板的孔结合。

收集来自3个患者组的血清样品，包括临床上诊断为APS的180个患者(在180个患者中，100个患者在临床上诊断为PAPS，80个患者在临床上诊断为SAPS)，诊断为aPL-血栓的50个患者，诊断为APS-相关妊娠并发症的20个患者。还从100个健康个体中收集血清样品并作为健康对照对其检验。

使用PBS-T缓冲液(即，含有0.05％(v/v)吐温-20的PBS缓冲液)对对照和患者血清进行稀释，然后在各孔中分别加入100μl此类已稀释的对照样品和已稀释的患者血清，以使得存在的抗膜突蛋白N-末端结构域抗体与固定的抗原结合。使用PBS-T缓冲液洗去未结合的样品，将酶标记的抗人IgG偶联物加入各孔。再次进行孵育，使得酶标记的抗人IgG与已同微孔连接的任意抗体结合。洗去未结合的酶标记的抗人IgG后，通过加入显色底物(H₂O₂/TMB)测量保留的酶活性并测量显色强度。然后将100μl HRP终止液(例如，2M H₂SO₄)加入各孔中。根据显色体确定HRP终止溶液加入的顺序和保持的时间。使用手指轻轻敲击各ELISA板，以便将孔彻底混匀。

通过使用分光光度计测量并比较患者孔显色和对照孔颜色的颜色强度，对分析进行评估。特别地，使用双色测量以测量和比较颜色强度，其中在终止反应15分钟内读取各孔的OD₄₅₀值和OD₆₃₀值(作为参照)。通过OD₄₅₀值减去OD₆₃₀值计算各待测或对照样品的OD值。

在各批次样品中采用ELISA低阳性对照样品、ELISA高阳性对照样品和ELISA阴性对照样品，以确保所有试剂和程序均正确地进行。ELISA阴性对照样品是采集自健康个体的血清。分别测量并采集自100个健康个体的血清的OD值，计算这100个样品的平均OD值(“对照OD值”)和标准偏差(“对照标准偏差”)。此类对照OD值和对照标准偏差用于确定ELISA低阳性对照和高阳性对照样品的浓度。ELISA低阳性对照样品包含来自PAPS或SAPS患者的血清，已对所述对照样品进行足够稀释以显示出等于对照OD值加三倍对照标准偏差的OD值。ELISA高阳性对照样品包含来自PAPS或SAPS患 者的血清，已对所述对照样品进行足够稀释以显示出等于三倍ELISA低阳性对照OD值的OD值。使用0.01M PBS-T缓冲液进行稀释。

首先确定样品各重复试验的平均OD值，如果该平均OD值高于ELISA低阳性对照样品的平均OD值，则确定样品为阳性(如表4所示)。

本领域技术人员应理解，可以通过不同方式来实施和实现确定PAPS和SAPS存在与否与标记物水平之间关系的步骤。一般选择参照人群并建立正常范围。使用适宜的参照人群确立抗膜突蛋白N-末端结构域抗体的正常范围是非常常规的做法。人们通常认为，在某种但是有限的程度上，正常范围依赖于确立其的参照人群。一方面，参照人群数量较多例如成百上千，并且按年龄、性别和视情况选取其他所关注的变量来匹配。依据绝对值的正常范围如给定的浓度，也依赖于所采用的分析和在实施所述分析的过程中使用的标准化方法。

可以使用在实施例部分给出的分析程序测量和建立抗膜突蛋白N-末端结构域抗体的水平。应理解，不同分析可能会导致不同的界值。

实验室检验临床表现依赖于其诊断准确度，或者将主体正确分类至临床相关亚组的能力。诊断准确度用于衡量所述检验正确区分被研究主体不同状况的能力。此类状况例如为健康和疾病或者良性对恶性疾病。也就是说，从某个患者人群中获得显著升高的值表明相应抗膜突蛋白N-末端结构域自身抗体的阳性存在。

实验结果如图9所示，同时列于下表4，其对不同患者组中不同自身抗体的阳性存在进行了比较：

表4 在患者组和对照组的血清中对不同自身抗体的阳性存在进行比较

表4中的结果显示，在PAPS和SAPS亚组中抗膜突蛋白N-末端结构域的阳性存在显著升高(分别约66％和62％)，在五个已检验的自身抗体中PAPS和SAPS亚组具有次高的阳性存在。因此，该结果表明抗膜突蛋白N-末端结构域与APS的发生率之间具有显著的相关性。

在五个已检验的自身抗体中，aPL-血栓和APS-相关的妊娠并发症组具有最高的抗膜突蛋白N-末端结构域的阳性存在。该结果表明抗膜突蛋白N-末端结构域与aPL-血栓和APS-相关的妊娠并发症之间也具有显著的相关性。

Claims (10)

1.一种非治疗目的的刺激样品中血小板水平的方法，包括将所述样品与包括针对膜突蛋白片段的抗体的组合物接触，其中所述膜突蛋白片段由人膜突蛋白N-末端FERM结构域组成，其中所述人膜突蛋白N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成。

2.包括针对膜突蛋白片段的抗体的药物组合物在制备用于刺激血小板水平的药物中的用途，其中所述膜突蛋白片段由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成，其中所述人膜突蛋白N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成。

3.包括膜突蛋白片段的药物组合物在制备用于预防或治疗与血小板水平异常升高相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述膜突蛋白片段由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成，其中所述人膜突蛋白N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述药物用于预防或治疗的主体具有或疑似具有针对人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的自身抗体。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述与血小板水平异常升高相关的疾病或病症为血栓、抗磷脂综合征、流产、抗磷脂抗体介导的血栓、抗磷脂综合征相关的妊娠并发症或血小板增多症。

6.能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段在制备用于诊断与血小板水平异常升高相关的疾病或病症的诊断组合物中的用途，其中所述膜突蛋白片段由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成，所述人膜突蛋白N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成，所述诊断包括(i)将来自疑似患有此类疾病或病症的主体的样品与诊断组合物接触；(ii)检测所述膜突蛋白片段与抗膜突蛋白自身抗体的结合。

7.能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的第一肽和第二肽在制备用于诊断与血小板水平异常相关的疾病或病症的诊断组合物中的用途，其中所述第一肽由人膜突蛋白的C-末端尾结构域组成，所述人膜突蛋白的C-末端尾结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段471-577组成，所述第二肽由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成，所述人膜突蛋白的N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成，所述诊断包括将来自疑似此类疾病或病症的主体的样品与诊断组合物接触，以及检测所述第一肽和第二肽与抗膜突蛋白自身抗体的结合。

8.由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成的膜突蛋白片段在制备用于诊断与血小板水平异常升高相关的疾病或病症的试剂盒中的用途，其中所述人膜突蛋白的N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成。

9.包括能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段的组合物在制备用于确定患有抗磷脂综合征的主体病理状况的诊断组合物中的用途，其中所述膜突蛋白片段由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成，其中所述人膜突蛋白的N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成，所述确定患有抗磷脂综合征的主体病理状况包括下述步骤：

(i)将来自疑似患有抗磷脂综合征的主体的样品与诊断组合物接触；

(ii)检测所述膜突蛋白片段与抗膜突蛋白自身抗体的结合并测量与所述膜突蛋白片段结合的抗膜突蛋白自身抗体的水平；以及

(iii)将所述抗膜突蛋白自身抗体的水平与显示抗膜突蛋白自身抗体滴度与抗磷脂综合征病理状况之间关系的对照数据库进行比较，所述对照数据库是从患病的对照样品得来的，根据比较结果确定所述主体的病理状况。

10.能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段在制备用于在进行抗磷脂综合征治疗的主体中监测治疗应答的诊断组合物中的用途，其中所述膜突蛋白片段由人膜突蛋白的N-末端FERM结构域组成，所述人膜突蛋白的N-末端FERM结构域由人膜突蛋白氨基酸残基区段1-297组成，所述监测治疗应答包括：

(i)将来自疑似患有抗磷脂综合征的主体的样品与诊断组合物接触；

(ii)检测所述膜突蛋白片段与抗膜突蛋白自身抗体的结合并测量与所述膜突蛋白片段结合的抗膜突蛋白自身抗体的水平；以及

(iii)将所述抗膜突蛋白自身抗体的水平与显示抗膜突蛋白自身抗体滴度与抗磷脂综合征病理状况之间关系的对照数据库进行比较，所述对照数据库是从患病的对照样品得来的，根据比较结果确定所述主体的病理状况，其中滴度降低表明所述主体对所述治疗产生有效应答。