MX2007004843A - Receptor de antigeno duffy para quimocinas y uso del mismo - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con receptor del antígeno Duffy para quimocinas y usos del mismo. En una forma de realización, la invención proporciona un método para seleccionar fármacos candidatos que inhiben la angiogénesis. El método comprende poner en contacto una molécula con un receptor del antígeno Duffy para quimocinas y determinar si la molécula se liga al receptor de antígeno Duffy para quimocinas. En otra forma de realización, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de tumores. En una otra forma de realización, la invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis. En una forma de realización adicional, la invención proporciona un método para promover la necrosis de tumores.

Description

RECEPTOR DE ANTÍGENO DUFFY PARA QUIMOCINAS Y USO DEL MISMO Antecedentes de la Invención La proteína del grupo sanguíneo Duffy es un miembro de la familia de receptores de quimocina del dominio de 7-transmem-brana (Chaudhuri y colaboradores, PNAS, 1993, 90:10793-10797) . La proteína es capaz de ligar quimocinas, tales como quimocinas CXC y CC. Por lo tanto, la proteína también es referida como un receptor del antígeno Duffy para quimocinas (DARC) (Chaudhuri y colaboradores, J". Biol . Chem. 1994, 269:7835-7838 y Horuk y colaboradores, Immunol . Today 1994, 15:169-174) . Además de expresarse en células eritroides, DARC también está presente en células endoteliales. Por ejemplo, DARC está presente en células endoteliales micro-vasculares de varios órganos no eritroides tales como hígado, pulmones, tiroide, y bazo; así como en células epiteliales de pulmones y conductos recolectores de riñon (Chaudhuri y colaboradores, Blood 1997, 89:701-712) . Células Purkinje del cerebro también contienen DARC (Horuk y colaboradores, J. Leukocyte Biol. 1996, 59:29-38) . La angiogénesis es el proceso para desarrollar nuevos vasos sanguíneos. El proceso involucra la proliferación, migración e infiltración de tejido de células endoteliales capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes . Sin embargo, el endotelio vascular es usualmente quiescente en adultos saludables, y su activación es fuertemente regulada durante la angiogénesis . La angiogénesis es importante en procesos fisiológicos normales incluyendo desarrollo embrional, crecimiento folicular, y sanado de heridas, así como en condiciones patológicas que involucran crecimiento de tumores, metástasis, neo-vascularización ocular anormal, artritis, psoriasis, y varios desórdenes del sistema reproductivo femenino. Por ejemplo, ha sido reportado que un tumor creciente requiere una vasculatura rápidamente creciente para suministrar nutrientes al tumor. Así, la regulación y/o inhibición de angiogénesis sería benéfica en condiciones patológicas, tales como cáncer. Los ligandos de la familia de receptores de quimocina son citocinas quimotácticas , también llamadas quimocinas. Las quimocinas son péptidos que generalmente contienen cuatro residuos Cys altamente conservados que forman dos enlaces de disulfuro (Baggiolini y colaboradores, New England Journal oí Medicine 1998, 338:436-445) . Existen varias familias de quimoci-ñas. Las dos familias mas grandes son las quimocinas CXC y las quimocinas CC . Otras familias de quimocinas incluyen las quimocinas C y las quimocinas CX3C. La familia CXC de quimocinas contiene dos residuos Cys altamente conservados en la terminal amino de péptido separados por cualquier aminoácido. Las quimocinas que pertenecen a la familia CC tienen dos residuos Cys próximos entre sí. Las quimocinas inducen la migración y activación celular mediante ligar los receptores de quimocina en un gran número de células objetivo. Se ha reportado que las quimocinas están involucradas en una variedad de enfermedades . Para una revisión, ver Luster, New England Journal of Medicine 1998, 338:436. Varias quimocinas, incluyendo IL-8, han sido reportadas teniendo un efecto estimulatorio en angiogénesis (Dawson y colaboradores, Blood 2000, 96:1681-1684). Por ejemplo, Debsai-llets y colaboradores (J". Exp. Med. 1997, 186:1201-1212) investigaron si IL-8 aumentada promovería directamente y/o indirectamente la angiogénesis mediante ligarse a DARC . Los autores concluyen que estudios in vivo posteriores tendrán que establecer si IL-8 y otras quimocinas angiogénicas son contribuyentes esenciales a la respuesta angiogénica, y si esta respuesta es mediada por DARC. Mas aun, la patente US 6,365,356 otorgada a Gershengorn reporta que la señalización celular para angiogénesis y angiósta-sis involucra la co-expresión de DAR y un receptor de quimocina en una célula endotelial. Sin embargo, la función precisa de DARC no se reporta. Además, un artículo reciente reporta un incremento en la necrosis de tumores y una disminución en la angiogénesis asociada con tumor en tumores expresando DARC. Ver Addison y colaboradores (BMC Cáncer 2004, 4:28) . De las referencias anteriormente descritas que atienden el rol de DARC en angiogénesis , Debsaillets y colaboradores reportan que estudios in vivo adicionales se requieren; Gershen-gorn no reporta la función precisa de DARC, y Addison y colaboradores reportan que tumores expresando DARC exhiben una disminución en angiogénesis asociada con tumores. Así, el rol de DARC en angiogénesis no es claro. Existe una necesidad para métodos mejorados para inhibir angiogénesis y crecimiento de tumores, y para promover necrosis de tumores. Existe también una necesidad para seleccionar métodos para descubrir fármacos candidatos que inhiben angiogénesis . Compendio de la Invención Estos y otros objetivos se han logrado por la presente invención la cual proporciona un método para seleccionar fármacos candidatos que inhiben angiogénesis. El método comprende poner en contacto una molécula con un receptor de antígeno Duffy para quimocinas y determinar si la molécula se liga al receptor de antígeno Duffy para quimocinas. Moléculas que se ligan al receptor de antígeno Duffy para quimocinas son fármacos candidatos que inhiben angiogénesis. En otra forma de realización, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de tumores en un mamífero en necesidad del mismo. El método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica al receptor de antígeno Duffy para quimocinas. En aun otra forma de realización, la invención proporciona un método para inhibir angiogénesis en un mamífero en necesidad del mismo. El método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica al receptor de antígeno Duffy para quimocinas . En una forma de realización adicional, la invención proporciona un método para promover necrosis de tumores en un mamífero en necesidad del mismo. El método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica al receptor de antígeno Duffy para quimocinas. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Pesos de Tumor en Ratones Dfy (-/-) y Dfy (+/+ ) · Figura 2. Crecimiento de Tumor inyectado con LLC en Ratones WT[Dfy(+/+)] & DKO . (A) Necrosis en ratones Dfy (-/-) se muestra con flecha. (B) Tumores en ratones WT son mas sólidos y densos comparados con aquellos de ratones DKO. (C) Histología de tejidos de tumores muestra la densidad de tumores y mayor formación micro-capilar (flecha) comparada con aquella en ratones DKO.

Figura 3. Efecto de Anti-Cuerpo Anti-Duffy en Crecimiento de Tumores Inducido por LLC . Descripción Detallada de la Invención La invención se basa en el descubrimiento sorprendente por el inventor que la inhibición de DARC inhibe el crecimiento de tumores y angiogénesis . El inventor también inesperadamente descubrió que los inhibidores de DARC promueven la necrosis de tumores . Inhibición de Crecimiento de Tumores En una forma de realización, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de tumores en un mamífero en necesidad del mismo. Mamíferos en necesidad de inhibir el crecimiento de tumores son aquellos mamíferos que sufren de un tumor. Cualquier tipo de tumor que requiere angiogénesis puede tratarse de acuerdo con el método de la presente invención. Un tumor es típicamente una masa anormal de tejido o células que generalmente resulta de división celular excesiva. El tumor puede surgir de cualquier tejido o células. Ejemplos de tejidos o células incluyen células epiteliales, tejido endocrino, células de huesos, células de próstata, tejido cerebral, células de ríñones, células de pulmones, tejido de pecho, tejido de ovarios, tejido de colon, tejido de retina, etc. El tumor puede ser benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) . El método es especialmente efectivo cuando el tumor es maligno. El método para inhibir el crecimiento de tumores comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica a DARC . DARC es bien conocida en la materia. Ver sección de antecedentes para una breve descripción de DARC. DARC inhibido en los métodos de la presente invención puede ser cualquier DARC presente en cualquier célula, especialmente células endoteliales y células epiteliales. Ejemplos de células endoteliales incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales de venas, células endoteliales de arterias, y células endoteliales micro-vasculares. Ejemplos de células epiteliales incluyen células en alveolos de pulmones y conductos colectores de ríñones. DARC es capaz de ligarse a quimocinas, especialmente quimocinas angiogénicas . El término "quimocina angiogénica" como se usa en la presente se refiere a quimocinas que estimulan o promueven angiogénesis . Las quimocinas angiogénicas pueden pertenecer a cualquier familia de quimocinas, tales como C, CC, CXC, y CX3C. Ejemplos de quimocinas CC que pueden ligarse a DARC y son angiogénicas incluyen, pero no se limitan a, proteína 1 de monocito quimotáctico (MCP-1, también conocida como CCL2 ) , MCP-3 (CCL7) , RANTES (CCL5), y Eotaxina (CCL11). Las quimocinas CXC pueden sub-dividirse en péptidos que contienen la secuencia Glu-Leu-Arg (ELR+) en sus terminales amino (ELR+ } ) , y aquellos que no (ELR-) . Generalmente, las quimocinas CXC angiogénicas son ELR+ . Ejemplos de quimocinas CXC ELR+ angiogénicas que pueden ligarse a DARC incluyen Gro-a (CXCL1) , Gro-ß (CXCL2) , ENA-78 (CXCL5) , I-TAC (CXCL11) , interleucina- 8 (IL-8, también conocida como CXCL8), y quimocinas homeostáticas , tales como TARC (CCL17) . Cualquier molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica a DARC es útil en los métodos de la presente invención. Cualquier mecanismo para bloquear la ligadura se puede emplear. La molécula puede, por ejemplo, bloquear la ligadura de la quimocina angiogénica a DARC mediante ligarse a DARC o a la quimocina angiogénica. La molécula puede ser una molécula pequeña o una molécula biológica. Moléculas pequeñas típicamente son compuestos orgánicos, incluyendo compuestos organometálicos y de organosili-cio, y similares, y generalmente tienen pesos moleculares de aproximadamente 450 o menos. Moléculas pequeñas pueden además incluir moléculas que de otra manera serían consideradas moléculas biológicas, excepto que sus pesos moleculares no son mayores que 450. Así, moléculas pequeñas pueden incluir, monosacáridos , oligosacáridos , aminoácidos, oligopéptidos , nucleótidos, oligonucleótidos , y sus derivados, teniendo un peso molecular de 450 o menos. Se enfatiza que una molécula pequeña puede tener cualquier peso molecular. Meramente son llamadas moléculas pequeñas debido a que no califican como moléculas biológicas, y típicamente tienen pesos moleculares menores que 450. Moléculas biológicas son moléculas que contienen un pol iaminoácido , un polinucleótido, o un pol isacárido , y generalmente tienen un peso molecular de mas de 450. Pol iaminoácidos incluyen proteínas, polipéptidos , y péptidos. Ejemplos de poliaminoácidos útiles en los métodos de la presente invención incluyen anti-cuerpos que se ligan a DARC o a quimocinas angiogénicas , y que inhiben ligadura de quimocinas angiogénicas a DARC. En esta especificación, un anti -cuerpo se define ampliamente con una proteína que se liga específicamente a un epítrope. Anti-cuerpos que se ligan específicamente a un epítrope pueden comprender una región hiper-variable de anti-cuerpo. La proteína que comprende una región hiper-variable de anti-cuerpo puede ser un anti-cuerpo entero o un fragmento de anti-cuerpo. Por e emplo, la región hiper-variable puede comprender una región variable de anti-cuerpo entera. La región variable de anti-cuerpo puede además comprender una región constante de anticuerpo. El anti-cuerpo puede ser policlonal o monoclonal . Regiones variables e hiper-variables adecuadas de anticuerpos no humanos pueden derivarse de anti-cuerpos producidos por cualquier mamífero no humano en el cual anti-cuerpos monoclonales se hacen. Ejemplos adecuados de mamíferos diferentes a humanos incluyen, por ejemplo, conejos, ratas, ratones, caballos, cabras, o primates.

De preferencia, los anti-cuerpos son anti-cuerpos humanos. Anti-cuerpos humanos pueden producirse en un ratón transgénico. Un ejemplo de tal un ratón es el así llamado XenoMouse (Abgenix, Freemont , California, Estados Unidos) descrito por Green, LL, "Antibody Engineering Via Genetic Engineering of the Mouse : XenoMouse Strains are a Vehicle for the Facile Generation of Therapeutic Human Monoclonal Antibodies" , J. Im unol. Methods, 10 : 231 (1-2 ) : 11-23 (1999) . Fragmentos de anti-cuerpos tienen características de ligadura que son las mismas que, o son comparables a, aquellas del ant i -cuerpo entero. Fragmentos adecuados del ant i -cuerpo incluyen cualquier fragmento que comprende una porción suficiente de la región hiper-variable (es decir, determinante complementaria) para ligarse específicamente, y con suficiente afinidad a, por ejemplo, DARC o una quimocina angiogénica. Los fragmentos preferidos son anti-cuerpos de una sola cadena. Los anti-cuerpos de una sola cadena son polipéptidos que comprenden al menos la región variable de la cadena pesada del anti-cuerpo y la región variable de la cadena ligera, con o sin un enlazador de interconexión. Un anti-cuerpo no humano puede ser quimerizado. Un anti-cuerpo quimerizado comprende la región variable de un anticuerpo no humano y la región constante de un anti-cuerpo humano. Un anti-cuerpo no humano es mas preferentemente un anti-cuerpo humanizado. Un anti-cuerpo humanizado comprende la región hiper-variable (CDRs) de un anti-cuerpo no humano. La región variable diferente a la región hiper-variable , v.gr., la región variable de esqueleto, y la región constante de un anticuerpo humanizado son aquellas de un anti-cuerpo humano. Los anti -cuerpos pueden ser miembros de cualquier clase de inmunoglobinas , tales como: IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y las subclases de las mismas. Los anti-cuerpos se pueden hacer por cualquier método conocido en para los técnicos en la materia. Métodos para hacer anti-cuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, el método inmunológico descrito por Kohler y Milstein 1975, Nature 256:495-497 y por Campbell en "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" en Burdon y colaboradores, editores, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volumen 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985) . El método de ADN recombinante descrito por Huse y colaboradores, 1989 Science 246:1275-1281 también es adecuado. Anti-cuerpos o fragmentos de anti-cuerpos se pueden aislar de las librerías de bacteriófagos de anti-cuerpos generadas usando técnicas, por ejemplo, descritas en McCafferty y colaboradores 1990, Nature 348:552-554, usando el antígeno de interés para seleccionar un anti-cuerpo o fragmento de anticuerpo adecuado. Clackson y colaboradores 1991, Nature 352:624-628 y Marks y colaboradores 1991, J. Mol. Biol . 222:581-597 describen el aislamiento de anti-cuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando librerías de bacteriófagos. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anti-cuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por intercambio de cadena (Mark y colaboradores 1992, Bio/Technol . 10:779-783), así como infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir librerías de bacteriófagos muy grandes (Waterhouse y colaboradores 1993, Nuc . Acids Res. 21:2265-2266). Métodos para hacer anti-cuerpos quiméricos y humanizados también se conocen en la materia. Por ejemplo, métodos para hacer anti-cuerpos quiméricos incluyen aquellos descritos en las patentes US por Boss (Celltech) y por Cabilly (Genetech) . Ver las patentes US 4,816,397 y 4,816,567, respectivamente. Métodos para hacer anti-cuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en inter, patente US 5,225,539. El método preferido para la humanización de anticuerpos es llamado injertado CDR. En el injertado CDR, las regiones de anti-cuerpos de mamíferos no humanos, de preferencia un anti-cuerpo de ratón, que se involucran directamente en ligar a antígeno, la región determinante complementaria o CDRs , se injertan en las regiones variables humanas para crear regiones variables "humanas reconfiguradas" . Estas regiones variables completamente humanizadas entonces se unen a regiones constantes humanas para crear anti-cuerpos "completamente humanizados" completos .

Para crear anti -cuerpos completamente humanizados que se ligan bien a un antígeno, es ventajoso diseñar las regiones variables humanas reconfiguradas cuidadosamente. Las regiones variables humanas en las cuales los CDRs serán injertados deberán seleccionarse cuidadosamente, y es usualmente necesario hacer algunos cambios de aminoácidos en posiciones críticas dentro de las regiones de esqueleto (FRs) de las regiones variables humanas . Métodos para hacer anti -cuerpos de usa sola cadena también se conocen en la materia. Tales métodos incluyen examinar librerías de bacteriófagos transfectados con genes de inmunoglo-bulina descritos en la patente US 5,565,332; la patente US 5,837,242; la patente US 5,855,885; la patente US 5,885,793; y la patente US 5,969,108. Otro método incluye el uso de un sistema a base de computador para designar péptidos enlazadores para convertir dos cadenas de polipéptidos separadas en una sola cadena de anti-cuerpos descrita en la patente US 4,946,778; la patente US 5,260,203; la patente US 5,455,030; y la patente US 5, 518, 889. Otros métodos para producir anti-cuerpos descritos anteriormente se divulgan por Wels y colaboradores en la solicitud de patente europea EP 5Ó2 812 y en Int. J. Cáncer 60:137-144 (1995); solicitud PCT WO 93/21319; solicitud de patente europea 239 400, solicitud PCT WO 89/09622; solicitud de patente europea 338 745; patente US 5,658,570; patente US ,693,780; y la solicitud de patente europea EP 332 424. Otros ejemplos de moléculas biológicas que inhiben ligadura de quimocinas angiogénicas a DARC incluyen quimocinas angiogénicas mutadas, tales como los mutantes de quimocinas CXC o CC angiogénicas descritas anteriormente. El término "quimocina angiogénica mutada" como se usa en esta especificación se refiere a un análogo de una quimocina angiogénica natural (v.gr., no mutada) . El análogo es capaz de ligarse a DARC, pero tiene habilidad disminuida para estimular o promover angiogénesis . La habilidad de la quimocina angiogénica mutada para estimular o promover angiogénesis se considera disminuida si la angiogénesis se inhibe por al menos alrededor de 10%, de preferencia al menos alrededor de 25%, mas preferentemente alrededor de 50%, aun mas preferentemente al menos alrededor de 75%, y lo mas preferible al menos alrededor de 90% comparada con aquella de la quimocina angiogénica no mutada. La quimocina angiogénica puede mutarse por cualquier método conocido para los técnicos en la materia. Por ejemplo, la quimocina angiogénica mutada puede comprender un fragmento de la quimocina angiogénica natural . El fragmento de una quimocina angiogénica es activo (v.gr., capaz de ligarse a DARC, pero tiene habilidad disminuida para estimular o promover angiogénesis) . El fragmento puede ser de las terminales N, las terminales C, o entre las terminales N y C de la quimocina angiogénica. El fragmento puede, por ejemplo, contener al menos alrededor de 10%, de preferencia alrededor de 25%, mas preferentemente alrededor de 50%, aun mas preferentemente alrededor de 75%, y lo mas preferible alrededor de 90% de los aminoácidos en la quimocina angiogénica. Por ejemplo, si la quimocina angiogénica es de 100 aminoácidos de longitud, el fragmento puede contener al menos alrededor de diez, de preferencia alrededor de 25, mas preferentemente alrededor de 50, aun mas preferentemente alrededor de 75, y lo mas preferible alrededor de 90 aminoácidos. Alternativamente, uno o mas aminoácidos de la quimocina angiogénica natural pueden reemplazarse con otros aminoácidos. Un ejemplo de una quimocina angiogénica mutada capaz de ligarse a DARC es actividad estimulante de crecimiento de melanoma (MGSA) E6A. MGSA contiene una alanina en la posición 6 de los aminoácidos en lugar de ácido glutámico. MGSA E6A se divulga en, por ejemplo, Hesselgesser y colaboradores , JBC 1995, 270:11472-11476. Ejemplos adicionales de moléculas biológicas que inhiben la ligadura de quimocinas angiogénicas a DARC incluyen ligandos de parásitos de malaria no inmunogénicos . Ligandos del parásito de malaria son capaces de ligarse a DARC. Tales ligandos son conocidos para los técnicos en la materia e incluyen, por ejemplo, proteína de ligadura a Duffy (DBP, 135 kd) del ligando del parásito de malaria Plasmodium vivax o su equivalente del ligando de Plasmodium falciparum (v.gr., antígeno 175 de ligadura a eritrocito (EBA-175) conteniendo dominios similares a ligadura a Duffy (DBL) ) . El término "no inmunogénico" como se usa en esta especificación se refiere a la propiedad de análogos de ligandos a partir del parásito de malaria que son capaces de ligarse a DARC, pero que carecen inmunogenicidad . Ligandos a partir del parásito de malaria se pueden hacer no inmunogénicos por cualquier método conocido para los técnicos en la materia. Por ejemplo, el ligando del parásito de malaria no inmunogénico puede comprender un fragmento de un ligando del parásito de malaria inmunogénico. Alternativamente, uno o mas aminoácidos del ligando del parásito de malaria se pueden reemplazar con otros aminoácidos . El fragmento de un ligando del parásito de malaria es activo (v.gr., capaz de ligarse a DARC, pero no inmunogénico) . El fragmento puede ser de las terminales N, las terminales C, o entre las terminales N y C de un ligando del parásito de malaria. El fragmento puede, por ejemplo, contener al menos alrededor de 10%, de preferencia alrededor de 25%, mas preferentemente alrededor de 50%, aun mas preferentemente alrededor de 75%, y lo mas preferible alrededor de 90% de los aminoácidos en el ligando del parásito de malaria. Por ejemplo, si el ligando del parásito de malaria es de 100 aminoácidos de longitud, el fragmento puede contener al menos alrededor de diez, de preferencia alrededor de 25, mas preferentemente alrededor de 50, aun mas preferentemente alrededor de 75, y lo mas preferible alrededor de 90 aminoácidos.

Otros ejemplos de moléculas que inhiben la ligadura de quimocinas angiogénicas a DARC incluyen péptido-miméticos de cualquiera de los poliaminoácidos descritos anteriormente. Como se usa en la presente, el término "péptidomimético" significa una molécula, especialmente una molécula biológica, que recrea las propiedades estéreo-espaciales de los elementos de ligadura de un poliaminoácido . Además, peptidomiméticos típicamente mejoran alguna propiedad del poliaminoácido original. Tales propiedades incluyen, por ejemplo, estabilidad incrementada, ligadura incrementada, actividad incrementada, eficacia incrementada, entrega mejorada, media vida incrementada, etc. Métodos para hacer peptidomiméticos con base en una secuencia de poliaminoácidos conocida se describen, por ejemplo, en las patentes US 5,631,280; 5,612,895; y 5,579,250. La síntesis de peptidomiméticos puede involucrar la incorporación en un poliaminoácido, un residuo de aminoácido con enlaces no de amida en una posición dada. Por ejemplo, para obtener un péptidomimético de un poliaminoácido, un enlace, esqueleto o residuo de aminoácido puede reemplazarse con un mimetismo adecuado. Algunos ejemplos no limitativos de residuos de aminoácidos no naturales que pueden ser mimetismos de aminoácidos adecuados incluyen ß-alanina, ácido L-a-amino butírico, ácido L-y-amino butírico, ácido L-a-amino isobutírico, ácido L-e -amino caproico, ácido 7-amino heptanoico, ácido L- aspártico, ?-e -Boc-N-a-CBZ-L-lisina, N- e -Boc -?-a-Fmoc-L- lisina , L-metionina sulfona , L-norleucina , L-norvalina, ?-a-Boc-N- 5CBZ-L-ornitina, ?-d-Boc-N- -CBZ-L-ortinina, Boc-p-nitro-L-fenilalanina, Boc-hidroxiprolina , y Boc-L- tioprolina . Inhibición de Angiogénesis En otra forma de realización, la invención proporciona un método para inhibir angiogénesis en un mamífero en necesidad de lo mismo. Como se discute en la sección de antecedentes, la angiogénesis se refiere al crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. La inhibición de angiogénesis puede ocurrir en cualquier tipo de célula, especialmente células endoteliales y células epiteliales, tales como aquellas descritas anteriormente. El método para inhibir angiogénesis comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica a DARC . La molécula, quimocina angiogénica, y DARC incluyen aquellos descritos anteriormente . Mamíferos en necesidad de inhibir angiogénesis son aquellos mamíferos que sufren de una enfermedad o condición donde la angiogénesis no es benéfica al mamífero. Cualquier tal enfermedad o condición puede tratarse de acuerdo con el método de la presente invención. Ejemplos de enfermedades o condiciones apropiadas incluyen, pero no se limitan a, crecimiento de tumores benigno o maligno, metástasis, neo-vascularización ocular anormal, artritis, psoriasis, y varios desórdenes del sistema reproductivo femenino incluyendo sangrado excesivo debido a crecimiento vascular mejorado en condiciones tales como endome-triosis, dismenorrea, cáncer endometrial y uterino. Promoción de Necrosis de Tumores En una forma de realización adicional, la invención proporciona un método para promover necrosis de tumores en un mamífero en necesidad de lo mismo. La necrosis de tumores se refiere a la muerte de las células de un tumor. Típicamente, la necrosis de un tumor ocurre a partir de la carencia de suministro de sangre. La promoción de necrosis de tumores puede ocurrir en cualquier tipo de tumor que requiere suministro sanguíneo, tal como aquellos descritos anteriormente. El método para promover la necrosis de tumores comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica a DARC . La molécula, quimocina angiogénica, y DARC incluyen aquellos descritos anteriormente. Mamíferos en necesidad de promover necrosis de tumores son aquellos mamíferos que sufren de un tumor. Cualquier tipo de tumor que requiere un suministro sanguíneo se puede tratar de acuerdo con el método de la presente invención. Ejemplos de tales tumores incluyen aquellos descritos anteriormente. Selección de Fármacos Candidatos En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para selección de fármacos candidatos que inhiben angiogénesis . Un fármaco candidato es una molécula que tiene el potencial de ser un medicamento útil, a reserva de pruebas biológicas adicionales. El primer paso en el método para seleccionar fármacos candidatos es poner en contacto una molécula con DARC. La molécula puede ser cualquier molécula, incluyendo aquellas descritas anteriormente. Como se discute anteriormente, DARC es bien conocido para los técnicos en la materia. DARC útil en el método de selección puede estar presente en una célula. Ejemplos de células que contienen DARC incluyen células endoteliales y células epiteliales, tales como aquellas descritas anteriormente, y células eritroides. La célula puede, por ejemplo, fijarse ex vivo. Métodos para fijar células son bien conocidos para los técnicos en la materia. Típicamente, células se fijan con una solución conteniendo formalina o paraformaldehido . Preparaciones de membrana celular comprendiendo DARC también se pueden usar. Alternativamente, DARC se puede preparar in vi tro por métodos que son bien conocidos en la materia. Un tal método incluye aislar o sintetizar ADN que codifica DARC, y producir la proteína recombinante mediante expresar el ADN, opcionalmente en un vector recombinante, en una célula hospedera adecuada. Otros métodos para preparar DARC incluyen aislar DARC de células o sintetizar DARC. Métodos adecuados para preparar DARC se describen a continuación. La molécula y DARC se pueden poner en contacto entre sí por cualquier método conocido para los técnicos en la materia. Típicamente, ya sea DARC o la molécula se inmoviliza en un soporte sólido. Por ejemplo, DARC puede inmovilizarse en un soporte sólido, tal como en una resina en una columna. DARC se puede poner en contacto con una molécula mediante extraer la molécula a través de la columna conteniendo DARC inmovilizado en la resina . Alternativamente, la molécula se puede inmovilizar en una superficie sólida, tal como en un pozo de una placa de micro-titulación. DARC se puede poner en contacto con la molécula mediante añadir DARC en el pozo e incubar la placa. Muchas moléculas diferentes se pueden inmovilizar en una placa, con ello permitiendo la selección rápida de la moléculas. El siguiente paso en la selección es determinar si la molécula se liga a DARC. La ligadura se puede determinar por cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, una etiqueta se puede ligar a la molécula o a DARC, dependiendo de cual de ellos está inmovilizado al soporte sólido. Usualmente, el componente que no se inmoviliza es el componente que es etiquetado. Así, si la molécula se inmoviliza, DARC se etiqueta. Si DARC se inmoviliza, la molécula se etiqueta .

Después de poner en contacto la molécula y DARC, la detección de ligadura de la molécula y DARC, por ejemplo mediante detectar la etiqueta, indica que la molécula es un fármaco candidato que inhibe la angiogénesis . El método para seleccionar fármacos candidatos opcionalmente comprende el paso adicional de determinar si el fármaco candidato inhibe angiogénesis. Cualquier método conocido por los técnicos en la materia se puede emplear para determinar si el fármaco candidato inhibe angiogénesis. Por ejemplo, un cultivo in vitro de células endoteliales se puede incubar con el fármaco candidato. El cultivo entonces se puede ensayar, por cualquier método conocido por los técnicos en la materia, para determinar si el fármaco candidato inhibió la proliferación y migración de las células endoteliales y la formación de capilares comparado con un cultivo de control sin el fármaco candidato. Alternativamente, ensayos de angiogénesis in vivo se pueden emplear. Tales ensayos son bien conocidos para los técnicos en la materia. Por ejemplo, un matrigel se puede implantar en un mamífero, tal como una rata, seguido por la administración de un fármaco candidato o compuesto de control. Después de la incubación por un periodo dado, el matrigel se remueve y se ensaya para determinar si vasos sanguíneos están presentes en el matrigel en los animales tratados y se compara con el control Una cantidad mas pequeña de vasos sanguíneos presentes o ningún vaso presente en el matrigel de animales tratados con el fármaco candidato comparados con aquellos de los animales de control indica que el fármaco candidato inhibe angiogénesis . La angiogénesis se considera inhibida si la angiogénesis se inhibe por al menos alrededor de 10%, de preferencia al menos alrededor de 25%, mas preferentemente al menos alrededor de 50%, aun mas preferentemente al menos alrededor de 75%, y aun mas preferentemente al menos alrededor de 90%. De manera óptima, angiogénesis se inhibe al 100%. Administración de Molécula La cantidad efectiva de una molécula administrada de acuerdo con los métodos de la invención es cualquier cantidad efectiva para su propósito, v.gr. , inhibición de crecimiento de tumores, inhibición de angiogénesis o promoción de necrosis de tumores. Tales cantidades efectivas son aquellas cantidades que imparten un efecto benéfico (v.gr., inhibición de crecimiento de tumores, inhibición de angiogénesis o promoción de necrosis de tumores) . Las cantidades actuales de una molécula variarán de acuerdo con varios factores que son bien conocidos en la materia, tales como la molécula particular utilizada, el modo de aplicación, sujeto particular a ser tratado, el tamaño del tumor, el grado de angiogénesis, etc. La cantidad apropiada de la molécula puede fácilmente determinarse por los técnicos en la materia y durante pruebas pre-clínicas y clínicas. La cantidad mínima de una molécula administrada a un mamífero es la cantidad mas baja capaz de lograr su propósito. La cantidad máxima administrada a un mamífero es la cantidad mas alta efectiva que no ocasiona efectos secundarios no deseables. Una molécula se considera que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica a DARC si la molécula ocasiona una reducción significativa en tal ligadura. Una molécula se considera que inhibe el crecimiento de tumores o inhibe la angiogénesis si la molécula ocasiona una reducción significativa en el crecimiento de tumor o angiogénesis. Una reducción en la ligadura, crecimiento de tumor o angiogénesis se considera significativa, por ejemplo, si la ligadura, crecimiento de tumor o angiogénesis es al menos alrededor de 10%, de preferencia al menos alrededor de 25%, mas preferentemente al menos alrededor de 75%, y lo mas preferible al menos alrededor de 90% de la ligadura, crecimiento de tumor o angiogénesis se inhibe en la ausencia de la molécula. En otra forma de realización, una molécula se considera que ocasiona una promoción significativa en la necrosis de tumores si el tamaño del tumor se reduce por al menos alrededor de 10%, de preferencia al menos alrededor de 25%, mas preferentemente al menos alrededor de 75%, y lo mas preferible al menos alrededor de 90%. Cualquier mamífero se puede tratar de acuerdo con los métodos de la presente invención. Mamíferos incluyen, por ejemplo, humanos, mandriles, y otros primates, así como animales de mascota tales como perros y gatos, animales de laboratorio tales como ratas y ratones, y animales de granja tales como caballos, ovejas y vacas. La molécula puede administrarse por cualquier método conocido en la materia. Algunos ejemplos de modos de administración adecuados incluyen administración oral y sistémica. La administración sistémica puede ser enteral o parenteral . Formulaciones líquidas o sólidas (v.gr., tabletas, cápsulas de gelatina) se pueden emplear. La administración parenteral de la molécula incluye, por ejemplo, inyecciones intravenosas, intramusculares, y subcutáneas. Por ejemplo, una molécula puede administrarse a un mamífero por liberación sostenida, como se conoce en la materia. La administración de liberación sostenida es un método de entrega de fármacos para lograr un cierto nivel del fármaco sobre un periodo de tiempo particular. Otras rutas de administración incluyen administración oral, tópica, intra-bronquial , o intra-nasal . Para administración oral, formulaciones líquidas o sólidas pueden usarse. Algunos ejemplos de formulaciones adecuadas para administración oral incluyen tabletas, cápsulas de gelatina, pildoras, trociscos, elíxires, suspensiones, siropes, y pastillas. La administración intra-bronquial puede incluir un rocío para inhalador. Para administración intra-nasal, la administración de una molécula puede lograrse por un nebulizador o rocío líquido. La molécula puede formularse en un portador farmacéutico adecuado. En esta especificación, un portador farmacéutico se considera siendo sinónimo con un vehículo o un excipiente como se entiende por los técnicos en la materia. Ejemplos de portadores incluyen almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sus sales, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas y glicoles. La molécula se puede formular en una composición conteniendo uno o mas de los siguientes: un estabilizante, un surfactante, de preferencia un surfactante no iónico, y opcional-mente una sal y/o un agente de amortiguamiento. El estabilizante puede, por ejemplo, ser un aminoácido, tal como por ejemplo, glicina; o un oligosacárido, tal como por ejemplo, sacarosa, tetralosa, lactosa o un dextrano. Alternativamente, el estabilizante puede ser un alcohol de azúcar, tal como por ejemplo, manitol; o una combinación de los mismos. De preferencia el estabilizante o combinación de estabilizantes constituye de alrededor de 0.1% a alrededor de 10% por peso del peso de la molécula. El surfactante de preferencia es un surfactante no iónico, tal como un polisorbato. Algunos ejemplos de surfactantes adecuados incluyen Tween 20, Tween 80; un polietileno glicol o un polioxietileno polioxipropileno glicol, tal como Pluronic F-68 a de alrededor de 0.001% (peso/volumen) a alrededor de 10% (peso/volumen) . La sal o agente de amortiguamiento puede ser cualquier sal o agente de amortiguamiento, tal como por ejemplo cloruro de sodio, o fosfato de sodio/potasio, respectivamente. De preferencia, el agente de amortiguamiento mantiene el pH de la formulación de molécula en el rango de alrededor de 5.5 a alrededor de 7.5. La sal y/o agente de amortiguamiento también es útil para mantener la osmolalidad en un nivel adecuado para administración a un mamífero. De preferencia la sal o agente de amortiguameinto está presente en una concentración un tanto isotónica de alrededor de 150 mM a alrededor de 300 mM. La molécula se puede formular en una composición la cual puede contener adicionalmente uno o mas aditivos convencionales. Algunos ejemplos de tales aditivos incluyen un solubiliza-dor tal como, por ejemplo, glicerol; un antioxidante tal como, por ejemplo, cloruro de benzalconio (una mezcla de compuestos de amonio cuaternario, conocidos como "cuart"), alcohol bencílico, cloretona o clorobutanol ; agente anestésico tal como por ejemplo un derivado de morfina; o un agente isotónico, etc., tal como se describe anteriormente. Como una precaución adicional contra oxidación u otra descomposición, la composición se puede almacenar bajo gas nitrógeno en frascos sellados con tapones impermeables . Métodos Generales para Preparar DARC Ácidos nucleicos que codifican DARC se pueden sintetizar in vi tro. El cADN para DARC se divulga en, por ejemplo, Chaudhuri y colaboradores, PNAS 1993, 90:10793-10797. Métodos adecuados para sintetizar ADN se describen por Caruthers y colaboradores Science 1985, 230:281-285 y DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Lilley, D. M . J. y Dahlberg, J. E. (editores), Methods Enzymol . 211 , Academic Press, Inc., Nueva York (1992). ADN de DARC se puede replicar y expresar en una célula hospedera adecuada. Células hospederas adecuadas incluyen células hospederas procarióticas y células hospederas eucarióticas. Una célula hospedera procariótica adecuada es E. coli. Células hospederas eucarióticas adecuadas incluyen células de levadura, células de insectos y células de mamíferos. El DARC puede aislarse a partir de, por ejemplo, fracciones de membrana celular por métodos estándar de aislamiento y purificación de proteínas. Algunos métodos adecuados incluyen protocolos de precipitación y líquidos/cromatográficos tales como, por ejemplo, cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrófoba, inmuno-precipitación, extracción de lípidos, cromatografía de afinidad y filtración de gel, etc. Ver, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Deutscher, M. P. (editor) Methods Enzymol., 182 , Academic Press, Inc., Nueva York (1990) y también Scopes, R. K. y Cantor, C. R. (editores), Protein Purification (3d) , Springer-Verlag, Nueva York (1994) . DARC también se puede hacer sintéticamente, es decir, a partir de aminoácidos individuales, o semisintéticamente , es decir, a partir de unidades de oligopéptidos o una combinación de unidades de oligopéptidos y aminoácidos individuales. Métodos adecuados para sintetizar proteínas se describen por Stuart y Young en "Solid Phase Peptide Synthesis" , segunda edición, Pierce Chemical Company (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Methods Enzymol . , 298, Academic Press, Inc., Nueva York (1997) . Muchas técnicas estándar bien conocidas de clonación y expresión y aislamiento/purificación que reflejan el estado de la técnica en métodos de ADN recombinante y proteínas se describen en detalle en Sambrook & Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001) . Ej emplos Ej emplo 1 ; Materiales y Métodos. Cepas de ratones: La construcción de ratones abatidos Duffy (DKO) previamente se ha descrito (Luo y colaboradores, Genome Research 1997, 7:932-941). Ratones abatidos heterózigos [Dfy(+/-)] se cruzó para producir progenie homózigos Dfy (+/+) y Dfy (-/-) . Experimentos se llevaron a cabo con animales de edad y sexo equivalentes. Ratones C57BL/6J se adquirieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, Estados Unidos) . Desarrollo de Tumor: Células de Carcinoma Pulmonar de Lewis (LLC) se hicieron crecer a fase logarítmica, se cosecharon y se suspendieron en PBS a lxlO7 células/ml. 100 µ? de suspensión celular se inyectaron de manera sub-cutánea cerca del dorso de línea media de cada animal (n=5) . El crecimiento y la necrosis de tumor en cada grupo de ratones se monitoreó por catorce días post - inyección . Después de sacrificar los ratones, el tamaño de los tumores se registró por fotografía digital y se pesó para crecimiento de tumor total . Histoquímica : Para evaluar necrosis y formación de vasos sanguíneos, tumores se fijaron en 10% de formalina amortiguada con fosfato. Tumores se incrustaron en parafina de acuerdo con procedimientos histológicos estándar. Secciones transversales de tumor (5 pm de grosor) se mancharon con hematoxilina y eosina para estudio histológico. Inhibición de Anti -Cuerpos de Tumor: Tres días después de la inyección de células de LLC, cinco grupos de ratones WT C57BL/6J (n=5) se inyectaron intraperitonealmente con ya sea 1 mi de PBS, sueros pre- inmunes , anti -glicoforina (Gyp) , suero anti-Kell o anti-Dfy (dilución 1:1) . Se le permitió crecer a los tumores por catorce días. Los ratones se eutanizaron y los tumores se pesaron. Los pesos promedios se trazaron para comparación . Ei emplo 2 : Crecimiento de Tumores en Ratones Salvajes Duffy y Ratones Abatidos Duffy Tumores sólidos en ratones tanto Dfy (+/+) (tipo salvaje, WT) y Dfy (-/-) (abatidos Duffy, DKO) se desarrollaron mediante inyectar células de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) . En los ratones de tipo salvaje y abatidos, el tumor inicialmente creció a la misma tasa. De manera interesante, los tumores en los ratones abatidos comenzaron a exhibir señales de necrosis mas temprano que aquellos de los ratones de tipo salvaje. Después de catorce días, los ratones se sacrificaron. Los tumores se removieron, pesaron y compararon. Los resultados indicaron que los tumores sólidos crecieron mas lentamente (por tamaño y peso) en ratones abatidos DARC comparados con aquellos de ratones de tipo salvaje (figura 1) . Los tumores en ratones abatidos sufrieron necrosis severa (ver la flecha en la figura 2a) mientras que no se observó necrosis en tumores en ratones de tipo salvaje (figura 2a) . Hubo mas necrosis y enajenamiento vascular en tumores en ratones abatidos Duffy comparados con aquellos en ratones Dfy(+/+) (figura 2b) . Mas aun, los estudios inmuno-histológicos indicaron que hubo menos formación de capilares micro-vasculares en los tumores de ratones abatidos Duffy comparada con aquella en tumores de ratones Dfy(+/+) (ver flecha en figura 2c) . Para determinar si el anti-cuerpo contra proteína Duffy tuvo un efecto similar en reducir el crecimiento de tumores, se inyectó peritonealmente el anti-cuerpo anti-Duffy hecho contra el dominio de terminal N de la proteína. El tumor creció mas lentamente en el ratón inyectado con anti-cuerpo comparado con el grupo de ratones inyectados con PBS o suero pre-inmune. Para determinar que el efecto del anti -cuerpo es no específico, se inyectó al grupo de ratones con anti-cuerpos contra dos otros antígenos de grupo sanguíneo, tales como glicoforina y Kell . De manera interesante, ninguno de los anticuerpos contra los otros antígenos de grupo sanguíneo tuvo algún efecto en el crecimiento de tumores (figura 3) . Necrosis de tumor mejorada se observó cuando los ratones de tipo salvaje se inyectaron con anti-cuerpo anti-Duffy (datos no mostrados) . Los resultados demuestran que DARC juega un rol importante en la angiogénesis durante el crecimiento de tumores.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para seleccionar fármacos candidatos que inhiben angiogénesis , el método comprendiendo: (i) poner en contacto una molécula con un receptor del antígeno Duffy para quimocinas; (ii) determinar si la molécula se liga al receptor de antígeno Duffy para quimocinas; donde las moléculas que se ligan al receptor del antígeno Duffy para quimocinas son fármacos candidatos que inhiben angiogénesis.
2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además determinar si el fármaco candidato inhibe angiogénesis .
3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la molécula es una molécula pequeña.
4. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la molécula es una molécula biológica.
5. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde la molécula biológica es un poliaminoácido .
6. 6. Un método para inhibir el crecimiento de tumores en un mamífero en necesidad del mismo, el método comprendiendo administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica al receptor de antígeno Duffy para quimocinas.
7. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la molécula se liga a un receptor de antígeno Duffy para quimocinas .
8. 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la molécula es una molécula biológica.
9. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la molécula biológica es un poliaminoácido .
10. 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, donde el poliaminoácido es un anti-cuerpo al receptor de antígeno Duffy para quimocinas.
11. 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde el mamífero es un humano.
12. 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la quimocina es una quimocina CXC .
13. 13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, donde la quimocina CXC es una quimocina CXC/ELR+ .
14. 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la quimocina es una quimocina CC .
15. 15. Un método para inhibir angiogénesis en un mamífero en necesidad del mismo, el método comprendiendo administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica al receptor de antígeno Duffy para quimocinas.
16. 16. Un método para promover necrosis de tumores en un mamífero en necesidad del mismo, el método comprendiendo administrar al mamífero una cantidad efectiva de una molécula que inhibe la ligadura de una quimocina angiogénica al receptor de antígeno Duffy para quimocinas.