PL188408B1 - Lecznicze zastosowanie technologii BAM (CD40L) doleczenia chorób dotyczących komórek mięśni gładkich - Google Patents

Lecznicze zastosowanie technologii BAM (CD40L) doleczenia chorób dotyczących komórek mięśni gładkich

Info

Publication number
PL188408B1
PL188408B1 PL97331104A PL33110497A PL188408B1 PL 188408 B1 PL188408 B1 PL 188408B1 PL 97331104 A PL97331104 A PL 97331104A PL 33110497 A PL33110497 A PL 33110497A PL 188408 B1 PL188408 B1 PL 188408B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
smooth muscle
cells
muscle cells
agent
ligand
Prior art date
Application number
PL97331104A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331104A1 (en
Inventor
Michael J. Yellin
Leonard Chess
Mihail KARPUSAS
David W. Thomas
Original Assignee
Biogen
Univ Columbia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen, Univ Columbia filed Critical Biogen
Publication of PL331104A1 publication Critical patent/PL331104A1/xx
Publication of PL188408B1 publication Critical patent/PL188408B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

1 Sposób zahamowania aktywacji przez ligand CD40 komórek miesni gladkich niosacych CD40 na po- wierzchni, znamienny tym, ze obejmuje etap kontaktowania komórek miesni gladkich z czynnikiem zdolnym do zaha- mowania oddzialywania pomiedzy ligandem CD40 1 CD40, przy czym komórki niosace CD40 sa komórkami miesni gladkich pecherza moczowego, komórkami miesni gladkich naczyn, komórkami miesni gladkich aorty, komórkami miesni gladkich naczyn wiencowych, komórkami miesni gladkich pluc albo komórkami miesni gladkich przewodu pokarmowego 19 Sposób wedlug zastrz 1 albo 2, znamienny tym, ze czynnik wybierany jest metoda przesiewowa, która obejmuje (a) izolowanie próbki komórek miesni gladkich, przy czym komórki miesni gladkich sa komórkami miesni gladkich pecherza moczowego, komórkami miesni gladkich naczyn, komórkami miesni gladkich aorty, komórkami miesni gladkich naczyn wiencowych, komórkami miesni gladkich pluc albo komórkami miesni gladkich przewodu pokarmowego, (b) hodowanie próbki w warunkach umozliwiajacych aktywacje komórek miesni gladkich w próbce, które sa komórkami niosacymi CD40, (c) kontaktowanie próbki z komórkami wyrazajacymi bialko, które jest swoiscie rozpoznawane przez przeciw- cialo monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostepu ATCC HB 10916, albo kontaktowanie próbki z bialkiem swoiscie rozpoznawanym przez przeciwcialo monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostepu ATCC HB 10916, przy czym te komórki lub bialko skutecznie aktywuja komórki miesni gladkich niosace CD40, (d) kontaktowanie próbki z czynnikiem w ilosci skutecznej do zahamowania aktywacji komórek miesni glad- kich niosacych CD40, jezeli czynnik jest zdolny do zahamowania aktywacji zaleznej od CD40-CD40L komórek miesni gladkich niosacych CD40, 1 (e) okreslanie czy komórki wyrazajace bialko, które jest swoiscie rozpoznawane przez przeciwcialo monoklo- nalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostepu ATCC HB 10916, czy bialko, które jest swoiscie rozpo- znawane przez przeciwcialo monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostepu ATCC HB 10916, aktywuje komórki miesni gladkich niosace CD40 w obecnosci czynnika PL PL PL PL PL

Description

CD40 jest cząsteczką powierzchniową wyrażaną przez wiele różnych komórek i oddziałuje z ligandem wielkości 30-33 kDa na pobudzonych limfocytach T CD4+, określanym jako CD40L. Oddziaływania CD40L-CD40 badano szeroko podczas oddziaływania limfocytów T z limfocytami B i są one kluczowe dla różnicowania limfocytów B zależnego od limfocytów T oraz wytwarzania IgG, IgA i IgE. CD40 ulega również ekspresji na monocytach, komórkach dendrytycznych, komórkach nabłonkowych i fibroblastach. Ekspresja CD40 na tych komórkach ulega dodatniej regulacji in vitro pod wpływem cytokin, szczególnie IFN-y. Co ciekawe, badania in vivo wykazały istotnie zwiększoną ekspresję CD40 w miejscach zapalnych, takich jak błona maziowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów albo zmianach łuszczycowych. Badania in vitro wykorzystujące przeciwciała monoklonalne przeciwko CD40 albo komórki CD40L+ wykazały, ze CD40 ulega funkcjonalnej ekspresji na monocytach, komórkach dendrytycznych, komórkach nabłonkowych, komórkach śródbłonkowych i fibroblastach.
Przykładowo, oddziaływanie CD40L-CD40 powoduje wydzielanie przez monocyty cytokin zapalnych IL-la, IL-1 β, IL-6 i TNF-a oraz wydzielanie TNF-a z komórek dendrytycznych. Oddziaływania CD40L-CD40 ułatwiają wydzielanie przez monocyty i komórki dendrytyczne chemokin IL-8 i MIP-la. Ponadto, wiązanie CD40 wzmaga wytwarzanie GM-CSF za pośrednictwem IL-1 przez komórki nabłonkowe grasicy. Oprócz tego, sygnały za pośrednictwem CD40L powodują wydzielenie przez monocyty IL-10 i tlenku azotu oraz wspomagają wytwarzanie IL-6 przez fibroblasty. Fibroblasty proliferują również w wyniku oddziaływania CD40L-CD40. Na koniec, komórki śródbłonka i fibroblasty zwiększają ekspresję cząsteczek adhezyjnych po związaniu CD40.
188 408
Choroby naczyniowe, takie jak miażdżyca, leczy się różnymi lekami, w tym lekami obniżającymi poziom cholesterolu, beta-blokerami, blokerami kanałów wapniowych i lekami przeciwkrzepliwymi. Obecnie wykazano, że komórki mięśni gładkich potrafią wyrażać CD40. Dostarcza to podstaw do leczenia chorób naczyniowych przez zahamowanie oddziaływania pomiędzy CD40 i ligandem CD40 (znanym również jako T-BAM, 5c8 Ag, gp39 i TRAP). Inne choroby dotyczące mięśni gładkich można również leczyć przez zahamowanie oddziaływania CD40-CD40L.
Streszczenie wynalazku
Wynalazek dostarcza sposobu zahamowania aktywacji ligandem CD40 komórek mięśni gładkich niosących na powierzchni CD40, obejmującego doprowadzenie do kontaktu komórek z czynnikiem zdolnym do hamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym występuje on w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek.
Wynalazek dostarcza również sposobu zahamowania aktywacji przez ligand CD40 komórek mięśni gładkich niosących na powierzchni CD40 u osobnika, obejmującego podanie osobnikowi czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym czynnik występuje w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek u osobnika.
Wynalazek dostarcza również sposobu leczenia u osobnika choroby dotyczącej komórek mięśni gładkich, obejmującego podanie osobnikowi czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym czynnik występuje w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek u osobnika i w ten sposób do leczenia choroby dotyczącej komórek mięśni gładkich.
Opis Figur
Figura 1A. Analiza FACS spoczynkowych komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty. Linia kropkowana przedstawia kontrolę izotypu przeciwciał monoklonalnych; linia kreskowana przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko CD54; zaś linia ciągła przedstawia przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40. Figura pokazuje, że komórki mięśni gładkich nie wyrażają konstytutywnie CD40.
Figura IB Analiza FACS komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty w obecności IFN-y (1000 jedn./ml) po 72 godzinach w hodowli. Figura ta pokazuje dodatnią regulację ekspresji CD40 na komórkach mięśni gładkich w reakcji na IFN-y.
Figura 1C. Analiza FACS komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty w obecności IL-la (1 ng/ml) po 72 godzinach w hodowli. Nie obserwowano zwiększenia ekspresji CD40 na komórkach mięśni gładkich.
Figura ID' Analiza FACS komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty w obecności TNF-a (200 jedn./ml) po 72 godzinach w hodowli. Nie obserwowano zwiększenia ekspresji CD40 na komórkach mięśni gładkich.
Figury 2A-Y: Współrzędne atomowe struktury krystalicznej rozpuszczalnego fragmentu zewnątrzkomórkowego ludzkiego CD40L zawierającego reszty Glyll 6-Leu26 1 (w formacie Brookhaven Protein Data Bank) (Id. Sekw. nr 1).
Figury 3A-3B. CD40 ulega ekspresji in situ na komórkach mięśni gładkich i makrofagach w zmianach miażdżycowych przeszczepu. Pokazano mikrofotografie dwukolorowych badań immunohistochemicznych wykazujących ekspresję CD40 (brązowe zabarwienie) na komórkach mięśni gładkich (czerwone zabarwienie) na figurze 3A i makrofagach (czerwone zabarwienie) na figurze 3B u pacjenta z miażdżycą przeszczepu.
Figury 4A-4B. Normalna tętnica wieńcowa pacjenta z kardiomiopatią idiopatyczną, zabarwiona hematoksyliną i eozyną (fig. 4A) i przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40 (fig. 4B). Fig. 4A: Brak zgrubienia błony środkowej czy nacieku zapalnego. Fig. 4B: ekspresja CD40 ograniczona jest do komórek śródbłonka wyściełającego światło naczynia. Nie było reakcji z kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym o swoistym izotypie (nie pokazano) (fig. 4A, fig. 4B x25).
Figury 5A-5B. Płytka włóknisto-miażdżycowa w tętnicy wieńcowej pacjenta z kardiomiopatią niedokrwienną, zabarwiona hematoksyliną i eozyną (fig. 5A) i przeciwciałami mo188 408 noklonalnymi przeciwko CD40 (fig. 5B). Fig. 5A: Włóknik pokrywający częściowo zwapniały rdzeń miażdżycowy zawiera liczne komórki zapalne (strzałki). Fig. 5B: Większość komórek zapalnych w włókniku jest silnie CD40+ (strzałki). Sąsiadujące komórki mięśni gładkich błony środkowej i komórki śródbłonka są również CD40+ (fig. 5A, fig. 5B x25).
Figury 6A-6C' Wczesne zmiany błony środkowej bogate w komórki piankowate u pacjenta z chorobą wieńcową związaną z przeszczepem (TCAD) zabarwione hematoksyliną i eozyną (fig. 6A) i przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40 (fig. 6B, fig. 6C). Fig. 6A: Zmiany w błonie środkowej zawierają liczne komórki piankowate, makrofagi i komórki mięśni gładkich. Fig. 6B: CD40 ulega silnej ekspresji na wielu komórkach błony środkowej we wczesnych zmianach w TCAD. Fig. 6C: W szczególności, komórki piankowate wykazują częste znakowanie na CD40. (fig. 6A x25, fig. 6B x50, fig. 6C x400).
Figury 7A-7D' Naciek zapalny obecny we włókniku pokrywającym zmianę w błonie środkowej w natywnej CA, znakowany przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40L (fig. 7A), kontrolnymi przeciwciałami monoklonalnymi (fig. 7B), przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD4 (fig. 7C) i przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD8 (fig. 7D). Fig. 7A: Charakterystyczna immunoreaktywność CD40L w cytoplazmie i na powierzchni komórek, którąjest ograniczona do limfocytów. Fig. 7B: Ta sama zmiana zabarwiona innym kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym o tym samym izotypie nie wykazuje znakowania. Fig. 7C: Praktycznie wszystkie limfocyty w natywnych zmianach CA (jak również w wielu makrofagach i komórkach pianko watych) były CD4+, wskazując że limfocyty CD40L+ są limfocytami T CD4+. Fig. 7D: limfocyty CD8+ występują rzadko w płytkach błony środkowej natywnej CA. (Fig. 7A, 7B xl000, Fig. 7C, 7D x400).
Figury 8A-8C- Skupiska limfoidalne głęboko w błonie środkowej w TCAD znakowane przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD40L (fig. 8A), przeciwciało monoklonalne kontrolne (fig. 8B) i przeciwciało monoklonalne przeciwko CD4 (fig. 8C). Fig. 8A: Większość komórek CD40L+ w TCAD (strzałki) spotyka się w skupiskach limfoidalnych błony środkowej, z dala od powierzchni śródbłonka. Fig. 8B: Inne, kontrolne przeciwciało monoklonalne o dobranym izotypie nie wykazuje znakowania komórek w tych skupiskach limfoidalnych. Fig. 8C: To samo skupisko limfoidalne jak wyżej, zawiera niemal wyłącznie limfocyty T CD4+ wskazując, że CD40L w tych zmianach ulega ekspresji na limfocytach T CD4+. (fig. 8A-8C x400).
Figury 9A-9B. Ognisko zapalne w śródbłonku w TCAD znakowane przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD8 (fig. 9A) i przeciwko CD40L (fig. 9B). Fig. 9A: limfocyty T CD8+ przylegające do komórek śródbłonka od strony światła w TCAD charakterystycznym dla zapalenia śródbłonka. Większość limfocytów T CD8+ występuje w ogniskach zapalenia śródbłonka, podczas gdy są one bardzo rzadkie w skupiskach limfoidalnych w błonie środkowej z dala od powierzchni śródbłonka. Fig. 9B; Komórki zapalne w ogniskach zapalenia śródbłonka są CD40L-. Podobnie, nie wykrywano ekspresji CD40L na komórkach śródbłonka (fig. 9A-9B x400).
Figury 10A-10B: Fig. 10A: Podwójne znakowanie immunologiczne zmian w błonie środkowej natywnej CA przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD40 (brązowe) i przeciwko CD68 (czerwone), znacznikowi makrofagów. Centralne skupisko komórek (strzałki) wykazuje silne barwienie na zarówno CD40, jak i CD68. Fig. 10B: Podwójne znakowanie immunologiczne TCAD przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40 (brązowe) i przeciwko aktynie mięśni gładkich (czerwone) wykazuje komórki mięśni gładkich CD40+ (strzałki). Reaktywność CD40 jest ograniczona do komórek mięśni gładkich błony środkowej (strzałki), podczas gdy monocyty błony środkowej sąCD40-. (fig. 10A i 10B x400).
Figury (11A-11D): szereg skrawków natywnej CA, wykazujących naczyniotworzenie w błonie środkowej i zabarwionych przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD34 (fig. 11 A), przeciwko CD40 (fig. 1 IB), przeciwko IGAM-1 (fig. 11C) i przeciwko VCAM-1 (fig. 11D). Fig. 11 A: Komórki śródbłonka nowych naczyń krwionośnych błony środkowej wyróżnione znakowaniem na CD34. Fig. 11B: Komórki śródbłonka nowych naczyń krwionośnych silnie wyrażają CD40. Sąsiadujące komórki zapalne również silnie znakują się CD40.
188 408
Fig. 11C, 11D: Ogniska naczyniotworzenia również wykazują silną reaktywność śródbłonka naICAM-1 (fig. 11C) i VCAM-1 (fig. 11D). (fig. 11 A-l ID x400).
Figury 12A-12C: Podwójne znakowanie immunologiczne aktywnego zapalenia w zmianach błony środkowej natywnej CA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD40 (brązowe) i przeciwko cząsteczkom adhezyjnym ICAM-1 (czerwone) (fig. 12A), VCAM-1 (fig. 12B) i nieznaczącym kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym (fig. 12C). Fig. 12A: Niemal wszystkie komórki CD40+ (brązowe), głównie makrofagi (długie strzałki) i miocyty błony środkowej (krótkie strzałki) silnie reagują z ICAM-1 (czerwone). Fig. 12B: Znaczna liczba komórek zapalnych i miocytów CD40+ (brązowe) błony środkowej reaguje również z VCAM-1 (czerwone). Fig. 12C: Ta sama zmiana w błonie środkowej podwójne znakowana na CD40 (brązowe) i niezwiązanym kontrolnym przeciwciałem, zastępującym przeciwciała monoklonalne przeciwko ICAM-1 i VCAM-1 (czerwone). Obserwuje się wyłącznie brązowe zabarwienie i brak czerwonego, co wskazuje na brak zakłócania w technikach wykrywania dla kolejno stosowanych przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD40, ICAM albo VCAM (patrz, Materiały i Metody), (fig. 12A-12C x400).
Figura 13: Podwójne znakowanie immunologiczne zmian w błonie środkowej natywnej CA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko p65, znakujących aktywowany NFkB (brązowe) i CD40 (czerwone). Aktywowany NF-kB ograniczony był jedynie do jąder komórek CD40+ (strzałki), z których większość to makrofagi (x400).
Szczegółowy opis
Wynalazek dostarcza sposobu zahamowania aktywacji ligandem CD40 komórek mięśni gładkich niosących na powierzchni CD40, obejmującego doprowadzenie do kontaktu komórek z czynnikiem zdolnym do hamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym występuje on w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek.
Wynalazek dostarcza również sposobu zahamowania aktywacji przez ligand CD40 komórek mięśni gładkich niosących na powierzchni CD40 u osobnika, obejmującego podanie osobnikowi czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym czynnik występuje w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek u osobnika. W jednym wykonaniu wynalazku, czynnik jest zdolny do zahamowania jakiegokolwiek oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40. „Oddziaływanie pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórce” dotyczy jednego albo wielu aspektów, funkcjonalnych albo strukturalnych zalezności ligand CD40 - CD40. Stąd, w jednym z wykonań, czynnik który hamuje oddziaływanie może kompetycyjnie wiązać ligand CD40 w taki sposób, że blokuje albo zmniejsza wiązanie liganda Cd40 z komórkowym CD40. W innym wykonaniu, czynnik który hamuje oddziaływanie może wiązać się z CD40 albo ligandem CD40 w sposób, który nie hamuje wiązania liganda CD40 z komórkowym CD40, ale który wpływa na reakcję komórki na związanie CD40, jak np. przez zmianę obrotu komórkowego CD40 albo kompleksu czynnik-CD40, przez zmianę kinetyki wiązania CD40 z ligandem CD40, albo przez zmianę tempa albo wielkości aktywacji komórki w reakcji na związanie CD40. ... . , .
W konkretnych wykonaniach, komórki mięśni gładkich niosące CD40 są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich oskrzeli, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego. W bardziej konkretnym wykonaniu komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego są komórki mięśni gładkich przełyku, żołądka albo jelit, w tym komórki mięśni gładkich jelita cienkiego albo grubego.
W jednym wykonaniu wynalazku, czynnik hamuje wiązanie liganda CD40 z CD40 na komórkach.
W jednym z wykonań wynalazku czynnikiem jest białko.
W innym wykonaniu wynalazku czynnik nie jest białkiem. W znaczeniu tu zastosowanym określenie „nie jest białkiem” obejmuje dowolny i każdy związek albo czynnik, który obejmuje elementy inne niż proste albo sprzęgnięte łańcuchy polipeptydowe. Obejmuje to elementy takie jak aminokwasy nie posiadające wiązań peptydowych; aminokwasy niebiał188 408 kowe, takie jak aminokwasy β, γ albo δ, aminokwasy w konfiguracji D albo inne aminokwasy niebiałkowe obejmujące homocysteinę, homoserynę, cytrulinę, omitynę, kwas γ-aminomasłowy, kanawalinę, kwas djenkolowy albo β-cyjanoalaninę; monosacharydy, polisacharydy albo cząsteczki węglowodanowe; kwasy tłuszczowe albo cząsteczki lipidowe; cząsteczki nukleotydowe; cząsteczki mineralne albo inne elementy niebiałkowe.
W innym wykonaniu wynalazku czynnik jest związkiem peptydomimetycznym. Związek peptydomimetyczny może być przynajmniej częściowo pochodzenia nienaturalnego. Związek peptydomimetyczny może być drobnocząsteczkowym związkiem naśladującym. Związki mogą mieć zwiększoną stabilność, skuteczność, siłę i dostępność biologiczną dzięki związkom naśladującym. Dalej, związki mogą mieć zmniejszoną toksyczność. Związek peptydomimetyczny może mieć zwiększoną przenikalność przez śluzówkę jelita. Związek można wytworzyć syntetycznie. Związki według wynalazku mogą obejmować aminokwasy L-, Dalbo nienaturalne, aminokwasy podstawione w pozycji alfa, dipodstawione w pozycji alfa, aminokwasy N-alkilowane, kwas mlekowy (izoelektryczny analog alaniny). Szkielet peptydowy związku może mieć przynajmniej jedno wiązanie zastąpione przez PSI-[CH=CH] (Kempf i in., (1991) Intl. J. Peptide and Prot. Res. 38:237-241). Związek może dalej obejmować trifluorotyrozynę, p-Cl-fenyloalaninę, p-Br-fenyloalaninę, poli-L-propargyioglicynę, poliD,L-alliloglicynę albo poli-L-alliloglicynę.
W innym wykonaniu wynalazku, związek peptydomimetyczny o aktywności biologicznej hamującej oddziaływanie pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach może mieć wiązanie, szkielet peptydowy albo składnik aminokwasowy zastąpiony odpowiednim związkiem naśladującym. Przykłady aminokwasów nienaturalnych, które mogą być przydatnymi związkami naśladującymi aminokwasy obejmują β-alaninę, kwas L-a-aminomasłowy, kwas I ,-γ-aminomasłowy, kwas L-a-aminoizomasłowy, kwas L-s-aminokapronowy, kwas 7-aminoheptanowy, kwas L-asparaginowy, kwas L-glutaminowy, cysteinę (acetaminodometyl), N-εBoc-N-a-CBZ-L-lizynę, Ν-ε-Boc-N-a-Fmoc-L-lizynę. sulfono-L-metioninę, L-norleucynę, Lnorwalinę, N-a-Boc-NACBZ-L-omitynę, N-5-Boc-N-a-CBZ-L-omitynę, Boc-p-nitro-Lfenyloalaninę, Boc-hydroksyprolinę, Boc-L-tioprolinę (Bondelle i in., (1994) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38:2280-2286; Pinilla i in., (1995) Peptide Science 37:221-240).
W konkretnym wykonaniu białko obejmuje przeciwciało albo jego część zdolną do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach. Przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne albo poliklonalne. W bardziej konkretnym wykonaniu przeciwciało monoklonalne swoiście wiąże się z epitopem, z którym swoiście wiąże się przeciwciało monoklonalne 5c8 (ATCC nr dostępu HB 10916). Przykładem takiego przeciwciała monoklonalnego jest przeciwciało monoklonalne 5c8 (ATCC nr dostępu HB 10916). W innym wykonaniu, przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD40 jest przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD40, dostępne z Genzyme Customer Service (produkt nr 80-3702-01, Cambridge, MA). W innych wykonaniach, przeciwciałem monoklonalnym są: przeciwciało chimeryczne, przeciwciało prymatyzowane, przeciwciało humanizowane albo przeciwciało obejmujące region CDR od jednego człowieka i rusztowanie przeciwciała od drugiego człowieka.
Określenia przeciwciało „chimeryczne”, „prymatyzowane” i „humanizowane” i sposoby ich wytwarzania są dobrze znane specjalistom. Patrz, przykładowo, publikacja międzynarodowa PCT nr WO 90/07861, opublikowana 26 czerwca, 1990 (Queen i in.); oraz Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029. Sposoby wytwarzania przeciwciał prymatyzowanych ujawnione są, przykładowo, w międzynarodowej publikacji PCT WO _/02108, odpowiadającej międzynarodowemu zgłoszeniu nr PCT/US92/06194 (Idee Pharmaceuticals); oraz Newman i in., Biotechnol. (1992) 10:1455-1460, które załączono tu jako odnośniki.
Ogólnie, przeciwciało humanizowane jest przeciwciałem obejmującym jeden albo wiele regionów zapewniających komplementarność (CDR) przeciwciała nie pochodzącego od człowieka, połączonych funkcjonalnie z ludzkimi segmentami regionu zrębowego. Dodatkowo mogą występować reszty ewentualnie związane z przeciwciałem nie pochodzącym od człowieka. Zwykle, przynajmniej jeden łańcuch ciężki, albo jeden łańcuch lekki obejmuje ludzkie CDR. Zwykle, CDR nie pochodzącymi od człowieka są CDR mysie. Ogólnie, przeciwciałem prywatyzowanym jest przeciwciało obejmujące jeden albo wiele regionów zapewniających
188 408 komplementamość (CDR) przeciwciała gatunku innego niż naczelny nie będący człowiekiem, połączonych funkcjonalnie z segmentami regionu zrębowego naczelnego nie będącego człowiekiem. Dodatkowo mogą występować reszty ewentualnie związane z gatunkiem od którego pochodzą CDR. Zwykle, przynajmniej jeden łańcuch ciężki albo jeden łańcuch lekki obejmuje CDR gatunku naczelnych nie będących człowiekiem. Zwykle, CDR są ludzkimi CDR. Ogólnie, przeciwciałem chimerycznym jest przeciwciało, którego łańcuchy lekkie i/lub ciężkie zawierają regiony z innych gatunków. Przykładowo, jeden albo wiele segmentów regionów zmiennych V) jednego gatunku można połączyć z jednym albo wieloma segmentami regionów stałych (C) innego gatunku. Zwykle, przeciwciało chimeryczne zawiera segmenty regionów zmiennych myszy połączone z segmentami regionów stałych człowieka, jakkolwiek można zastosować inne gatunki ssaków.
Przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane jest przez linię hybrydoma zdeponowaną 14 listopada 1991 w American Type Culture Collection, Parklawn Drive 12301 Rockville, Maryland 20852, USA według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego o międzynarodowym uznawaniu depozytów drobnoustrojów do celów postępowania patentowego. Hybrydoma nadano numer dostępu ATCC HB 10916.
W konkretnym wykonaniu część przeciwciała obejmuje region zapewniający komplementamość albo region zmienny łańcucha lekkiego albo ciężkiego. W innym konkretnym wykonaniu, część przeciwciała obejmuje Fab albo przeciwciało jednołańcuchowe. Przeciwciało jednołańcuchowe wytwarza się z regionów zmiennych połączonych odstępnikami białkowymi w postaci pojedynczego łańcucha białkowego.
W innym wykonaniu, białko obejmuje rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo jego część, albo jego odmiany zdolne do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach; albo rozpuszczalny region CD40, albo jego część albo jego odmianę zdolną do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach. W konkretnym wykonaniu rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 jest monomerem. W innym wykonaniu rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40 jest oligomerem.
Odmiany mogą różnić się od naturalnie występującego CD40 albo ligandu CD40 sekwencją aminokwasową albo w sposób, który nie dotyczy sekwencji albo jednym i drugim. Odmiany sekwencji aminokwasowej tworzy się gdy jeden albo wiele aminokwasów w naturalnie występującym CD40 albo ligimdzie CD40 zastępuje się różnymi aminokwasami naturalnymi, pochodnymi aminokwasów albo aminokwasami nienaturalnymi. Szczególnie korzystne odmiany obejmują naturalnie występujący CD40 albo ligand CD40, albo biologicznie czynne fragmenty naturalnie występującego CD40 albo ligandu CD40, których sekwencje różnią się od sekwencji typu dzikiego jednym albo wieloma konserwatywnymi zastąpieniami aminokwasowymi, które zwykle mają minimalny wpływ na strukturę drugorzędową i hydrofobową naturę białka albo peptydu. Odmiany mogą również mieć sekwencje, które różnią się jednym albo wieloma niekonserwatywnymi zastąpieniami, delecjami albo insercjami, które nie znoszą aktywności biologicznej CD40 albo liganda CD40. Zastąpienia konserwatywne zwykle obejmują zastąpienie jednego aminokwasu innym, o podobnej charakterystyce, jak zastąpienia w obrębie następujących grup: walina, glicyna; alanina; asparagina, glutaminą; seryna, treonina; lizyna, arginina i fenyloalanina, tyrozyna. Aminokwasy niepolarne (hydrofobowe) obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne obojętne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Aminokwasy naładowane dodatnio (zasadowe) obejmują argininę, lizynę i histydynę. Aminokwasy naładowane ujemnie (kwasowe) obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. ... . .
Inne konserwatywne zastąpienia można wziąć z tabeli 1, zaś jeszcze inne są opisane w Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).
188 408
Tabela 1 Zakonserwowane zastąpienia aminokwasów
Aminokwas Kod Zastąpienie przez
Alanina A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagina N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Kwas asparaginowy D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cysteina C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met. Thr, D-Thr
Glutamina Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kwas glutaminowy E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Glicyna G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, beta-Ala, Acp
Izoleucyna I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucyna L D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lizyna K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Orn
Metionina M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, NorLeu
Fenyloalanina F D-Phe, Tyr, D-Tyr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 albo 5-fenyloprolina, cis 3,4 albo 5 fenyloprolina
Prolina P D-Pro, kwas L-1-tiazolidyno-4-karboksylowy, kwas D- albo L-1-oksazolidyno-4-karboksylowy
Seryna S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), Val, D-Val
Treonina T D-Thr, ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Tyrozyna Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Walina V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
Inne odmiany według wynalazku są takimi modyfikacjami, które zwiększają stabilność peptydu. Odmiany takie mogą zawierać, przykładowo, jedno albo wiele wiązań niepeptydowych (które zastępują wiązania peptydowe) w sekwencji białka. Obejmuje to: odmiany, które zawierają reszty inne niż naturalnie występujące L-aminokwasy, takie jak D-aminokwasy albo α-minokwasy nienaturalne albo syntetyczne takie jak beta albo gamma aminokwasy i odmiany cykliczne. Włączenie aminokwasów D zamiast L do polipeptydu może zwiększyć jego odporność na proteazy, patrz, np. patent USA 5,219,990.
Peptydy według wynalazku można również modyfikować różnymi zmianami takimi jak insercje, delecje i zastąpienia, konserwatywne albo niekonserwatywne, przy czym takie zmiany mogą dostarczyć pewnych korzyści z ich zastosowania.
W innych wykonaniach, odmiany zastąpień aminokwasowych, które są mniej konserwatywne mogą również dać pożądane pochodne, np. przez spowodowanie zmian w ładunku, konformacji i innych właściwościach biologicznych. Takie zastąpienia powinny obejmować, przykładowo, zastąpienie reszty hydrofitowej resztą hydrofobową, zastąpienie cysteiny albo proliny inną resztą, zastąpienie reszty posiadającej krótki łańcuch boczny resztą posiadającą długi łańcuch boczny albo zastąpienie reszty o ładunku dodatnim, resztą o ładunku ujemnym. Jeżeli nie można przewidzieć dokładnie wyniku zastąpienia, pochodne można łatwo badać ujawnionymi tu sposobami w celu określenia obecności albo braku pożądanej charakterystyki.
Odmiany w zakresie wynalazku obejmują białka i peptydy o sekwencjach aminokwasowych wykazujących przynajmniej 80% homologii z regionem zewnątrzkomórkowym CD40
188 408 albo regionem zewnątrz komórkowym liganda CD40. Korzystnie, homologia sekwencji wynosi przynajmniej 90%, albo przynajmniej 95%.
Podobnie jak możliwe jest zastąpienie podstawników w rusztowaniu, możliwe jest zastąpienie grup funkcyjnych połączonych z rusztowaniem przy użyciu grup charakteryzujących się podobnymi cechami. Zastąpienia te początkowo są konserwatywne, tj. zastępująca grupa ma podobną wielkość, kształt, hydrofobowość i ładunek co oryginalna grupa. Modyfikacje nie dotyczące sekwencji mogą obejmować, przykładowo, derywatyzację chemiczną in νινο albo in vitro części naturalnie występującego CD40 albo liganda CD40, jak również zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji albo glikozylacji.
W dalszym wykonaniu białko, w tym region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo CD40 modyfikuje się chemicznie w taki sposób, że aktywność jest zachowana. Przykładowo, białko można amidować, siarczanować, chlorowcować pojedynczo albo wielokrotnie, alkilować, karboksylować albo fosforylować. Białko może być również pojedynczo albo wielokrotnie acylowane, jak np. grupą acetylową grupą famezylową albo kwasem tłuszczowym, który może być nasycony, jednonienasycony albo wielonienasycony. Kwas tłuszczowy może być jedno- albo wielofluorowany. Wynalazek obejmuje również analogi metioninowe białka, przykładowo, analogi sulfonometioninowe i siarczanowe. Wynalazek obejmuje również sole białek, takie jak sole amonowe, w tym alkilowe albo arylowe sole amonowe, sole siarczanowe, wodorowe, fosforanowe, wodorofosforanowe, dihydrofosforanowe, tiosiarczanowe, węglanowe, diwęglanowe, benzoesowe, sulfonowe, tiosulfonowe, mezylowe, etylosulfonowe i benzosulfonowe.
Rozpuszczalne, monomeryczne białko CD40-L może obejmować całość albo część regionu zewnątrzkomórkowego CD40-L. Zewnątrzkomórkowy region CD40-L zawiera domenę, która wiąże CD40. Tak więc, rozpuszczalne CD40-L może hamować oddziaływanie pomiędzy CD40L i komórką niosącą CD40. Wynalazek uwzględnia, że sCD40-L może stanowić cały region zewnątrzkomórkowy CD40-L albo fragment czy pochodną zawierającą domenę, która wiąże CD40.
Rozpuszczalne białko CD40 (sCD40) obejmuje region zewnątrzkomórkowy CD40. sCD40 hamuje oddziaływanie pomiędzy CD40L i komórkami niosącymi CD40. sCD40 może być w postaci monomerycznej albo oligomerycznej.
W innym wykonaniu wynalazku białko obejmujące rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40, albo jego część, dalej obejmuje region Fc poddany fuzji z regionem zewnątrzkomórkowym CD40 albo jego częścią. W konkretnym wykonaniu, region Fc może wiązać białko A albo białko G. W innym wykonaniu, region Fc obejmuje IgG IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAl, IgA2, Ig-M, IgD albo IgE.
Rozpuszczalne białko fuzyjne CD40/Fc można wytworzyć stosując konwencjonalne techniki cięcia enzymami i ligacji fragmentów pożądanej sekwencji. Odpowiednimi regionami Fc do białek fuzyjnych są regiony, które mogą wiązać się z białkiem A albo białkiem G albo są zdolne do rozpoznania przez przeciwciało, które można zastosować do oczyszczania albo detekcji białka fuzyjnego obejmującego region Fc. Przykładowo, region Fc może obejmować region Fc z ludzkiego przeciwciała I-gGl albo mysiego IgGl. Wynalazek dostarcza również cząsteczki kwasu nukleinowego, który koduje białko fuzyjne CD40/Fc.
Znany jest sposób wytwarzania rozpuszczalnych postaci cząsteczek błonowych metodami rekombinacji, w których usuwa się sekwencje kodujące domeny śródbłonowe i cytoplazmatyczne. Patrz, ogólnie Hammonds i in., patent USA nr 5,057,417. Oprócz tego, sposoby wytwarzania sCD40 i białek fuzyjnych CD40/Fc są dobrze znane. Patrz, np. publikacja międzynarodowa PCT WO 93/08207; Fanslow i in., J. Immunol. 149:655-60 (lipiec 1992).
W jednym wykonaniu wynalazku, czynnik jest wybrany sposobem przesiewowym.
W konkretnym wykonaniu wynalazku, czynnik jest wybrany sposobem przesiewowym, który obejmuje izolowanie próbki komórek hodowanie próbki w warunkach umożliwiających aktywację komórek niosących CD40, kontaktowanie próbki z komórkami wyrażającymi białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo z białkiem swoiście rozpoznawanym przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916 skuteczne do aktywacji komórek niosących CD40, kontaktowanie próbki
188 408 z czynnikiem w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek niosących CD40 jeżeli czynnik jest zdolny do zahamowania aktywacji komórek niosących CD40, i określanie czy komórki wyrażające białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo białko które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916 aktywuje komórki niosące CD40 w obecności czynnika. Próbkę komórek można izolować z różnych tkanek, w tym linii komórkowych w hodowli i komórek izolowanych od zwierząt, takich jak komórki rozproszone z tkanek litych, komórki pochodzące z biopsji szpiku albo komórki izolowane z płynów ustrojowych takich jak krew czy chłonka.
W innym wykonaniu, czynnik (cząsteczka) wybrana jest w oparciu o trójwymiarową strukturę rozpuszczalnego regionu liganda CD40 albo jego części zdolnej do swoistego zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach. Czynnik można wybrać z biblioteki znanych czynników, zmodyfikować znane czynniki w oparciu o strukturę trójwymiarową, albo zaprojektować i syntetyzować de novo w oparciu o strukturę trójwymiarową. W konkretnych wykonaniach, czynnik (cząsteczka) zaprojektowana jest przez optymalizację struktury wiodącego czynnika hamującego, w oparciu o strukturę trójwymiarową kompleksu rozpuszczalnego regionu zewnątrzkomórkowego liganda CD40 albo jego części z wiodącym czynnikiem hamującym. Wiodący czynnik hamujący jest cząsteczką, co do której stwierdzono, ze po skontaktowaniu jej z rozpuszczalnym regionem zewnątrzkomórkowym liganda CD40, CD40 albo jego części, zmniejszając w ten sposób zdolność skompleksowanego albo związanego liganda CD40 albo części liganda CD40 do aktywacji komórek niosących CD40. W innym wykonaniu, wiodący czynnik hamujący może działać przez oddziaływanie z regionem zewnątrzkomórkowym liganda CD40, CD40 albo z trzeciorzędowym kompleksem z częścią liganda CD40 albo CD40 zmniejszając zdolność kompleksu ligand CD40 - CD40 do aktywacji komórek niosących CD40. W sposobach według wynalazku ligand CD40 może być rozpuszczalny albo związany z komórkami takimi jak aktywowane limfocyty T i może być albo pełnej długości natywnym ligandem CD40 albo jego częścią. Zmniejszoną zdolność do aktywowania komórek można stwierdzić różnymi sposobami. Jednym ze sposobów jest wykazanie, że ligand CD40 w obecności inhibitora powoduje aktywację komórek niosących CD40 w mniejszym stopniu niż bez inhibitora w podobnych warunkach. Zmniejszona zdolność do aktywacji komórek niosących CD40 można również wykazać wyższym stężeniem kompleksu inhibitor-ligand CD40 wymaganym do wywołania podobnego stopnia aktywacji komórek niosących CD40 w podobnych warunkach, w porównaniu z nie związanym ligandem CD40. W ostateczności, ligand CD40 skontaktowany z inhibitorem może nie być zdolnym do aktywowania komórek niosących CD40 w stężeniach i w warunkach, które umożliwiają aktywację tych komórek przez nie związany ligand CD40 albo jego dana część.
Czynnik (cząsteczkę) można wybrać metodą skomputeryzowanego przesiewania z użyciem struktury krystalicznej rozpuszczalnego fragmentu domeny zewnątrzkomórkowej ludzkiego CD40L zawierającego reszty Glyl 16-Leu261 (sCD40(l 16-261)).
Budowę krystaliczną zastosowaną w metodzie przesiewowej określa się przy rozdzielczości 2 A metodą zastępowania cząsteczkowego. Pokrótce, rozpuszczalny fragment domeny zewnątrzkomórkowej ludzkiego liganda CD40 zawierającego reszty aminokwasowe od Glyl 16 w kierunku reszty Leu261 na końcu C, wytwarza się w postaci rozpuszczalnej, następnie oczyszcza i poddaje krystalizacji. Kryształy stosuje się do zebrania danych dyfrakcyjnych. Zastępowanie cząsteczkowe i dopracowywanie przeprowadza się stosując oprogramowanie XPLOR i QUANTA (Molecular Simulations, Inc.). W szczególności, trójwymiarowy model ludzkiego sCD40L skonstruowano stosując model mysiego CD40L z użyciem oprogramowania modelującego homologię białek QUANTA. Model ten zastosowano jako sondę do obliczeń krystalograficznych i dopracowano stosując XPLOR. Ten sposób określania struktury krystalicznej sCD40L opisano szczegółowo w Karpusas i in., Structure (październik 1995) 3(10:1031-1039. Współrzędne atomowe sCD40L( 116-261) pokazano na figurach 2A-Y. Sposób przesiewowy do wybierania czynnika obejmuje skomputeryzowane projektowanie leku i iteracyjnąoptymalizację struktury, jak to opisano niżej.
188 408
Czynnik może być inhibitorem wybranym przy użyciu skomputeryzowanego projektowania leku. Stosując tę metodę, współrzędne struktury krystalicznej sCD40L stosuje się jako dane wejściowe dla programu komputerowego, takiego jak DOCK, który podaje listę struktur cząsteczkowych, które powinny wiązać się z CD40L. Zastosowanie takich programów komputerowych jest dobrze znane. Patrz, np. Kuntz, Science 257:1078 (1992). Listę struktur cząsteczkowych można następnie badać przesiewowe testami biochemicznymi wiązania CD40L. Można zastosować testy biochemiczne typu kompetycyjnego, które są dobrze znane. Patrz, np. Bajorath i in., Biochemistry 34:1833 (1995). Struktury, które wiążą, jak stwierdzono, CD40L można więc zastosować jako czynniki według wynalazku. Czynnik może być również modyfikowaną albo zaprojektowaną cząsteczką, określoną w iteracyjnych cyklach optymalizacji struktury. Stosując to podejście, drobnocząsteczkowy inhibitor CD40L, znaleziony metodą komputerową albo innymi podejściami, można współkrystalizować z sCD40L i badać strukturę kompleksu metodą zastępowania cząsteczkowego. Informację uzyskaną przez zastępowanie cząsteczkowe można zastosować do optymalizacji struktury inhibitorów przez wyjaśnienie jak cząsteczka oddziałuje z CD40L. Cząsteczkę można modyfikować w celu poprawienia jej właściwości fizykochemicznych, w tym swoistości i powinowactwa wobec CD40L.
W jednym z wykonań wynalazku, czynnik jest związkiem drobnocząsteczkowym. W znaczeniu tu zastosowanym, związek drobnocząsteczkowy ma wielkość cząsteczki od 20 Da do około 1x106 Da, korzystnie od 50 Da do 2 kDa.
Wynalazek dostarcza również sposobu zahamowania aktywacji liganda CD40 komórek mięśni gładkich niosących CD40 na powierzchni u osobnika, obejmującego podanie osobnikowi czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym czynnik występuje w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek u osobnika.
W konkretnych wykonaniach, komórki mięśni gładkich niosące CD40 są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich oskrzeli, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego. W bardziej konkretnym wykonaniu komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego są komórki mięśni gładkich przełyku, żołądka albo jelit, w tym komórki mięśni gładkich jelita cienkiego albo grubego.
W jednym z wykonań wynalazku czynnik hamuje wiązanie liganda CD40 z CD40 na komórkach.
W jednym z wykonań wynalazku, czynnik jest białkiem. W innym wykonaniu wynalazku czynnik nie jest białkiem.
W konkretnym wykonaniu białko obejmuje przeciwciało albo jego część zdolną do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach. Przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne albo poliklonalne. W bardziej konkretnym wykonaniu przeciwciało monoklonalne swoiście wiąże się z epitopem, z którym swoiście wiąże się przeciwciało monoklonalne 5c8 (ATCC nr dostępu HB 10916). Przykładem takiego przeciwciała monoklonalnego jest przeciwciało monoklonalne 5c8 (ATCC nr dostępu HB 10916). W innych wykonaniach, przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało chimeryczne albo przeciwciało humanizowane.
W konkretnym wykonaniu część przeciwciała obejmuje region zapewniający komplementamość albo region zmienny łańcucha lekkiego albo ciężkiego. W innym konkretnym wykonaniu część przeciwciała obejmuje region zapewniający komplementamość albo region zmienny. W innym konkretnym wykonaniu część przeciwciała obejmuje Fab albo przeciwciało jednolańcuchowe.
W innym wykonaniu, białko obejmuje rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo jego część zdolną do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach; albo rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40 albo jego część zdolną do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach. W konkretnym wykonaniu rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo CD40 jest monomerem. W innym wykonaniu, rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40 jest oligomerem.
188 408
W innym wykonaniu wynalazku, białko obejmujące rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40 albo jego część dalej obejmuje region Fc poddany fuzji z regionem zewnątrzkomórkowym CD40 albo jego częścią. W konkretnym wykonaniu, region Fc jest zdolny do wiązania białka A albo białka G W innym wykonaniu, region Fc obejmuje IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAl, IgA2, IgM, IgD albo IgE.
Po podaniu, białka często są szybko usuwane z krążenia i stąd mogą wywierać względnie krótką aktywność farmakologiczną. W następstwie, w celu utrzymania skuteczności klinicznej konieczne może być częste wstrzykiwanie względnie wysokich dawek białka biologicznie czynnego. Białka zmodyfikowane przez kowalencyjne przyłączenie polimerów rozpuszczalnych w wodzie takich jak poliglikol etylenowy, kopolimery glikolu polietylenowego i poliglikolu propylenowego, karboksymetyloceluloza, dekstran, polialkohol winylowy, poliwinylopirolidon albo poliprolina, znanych z zasadniczo dłuższego czasu trwania w krwiobiegu po wstrzyknięciu dożylnym w porównaniu z białkami nie modyfikowanymi (Abuchowski i in., Enzymes as Drugs, wyd. Holcenberg i in., Willey-Interscience, New York, NY, 367-383 (1981); Aiiderson (1992) Human Gene Therapy, Science 256:808-813; Newmark i in., (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189; i Katre i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1487-1491 (1987)). Takie modyfikacje mogą również zwiększyć rozpuszczalność białka w roztworach wodnych, wyeliminować agregację, zwiększyć stabilność fizyczną i chemiczną białka oraz istotnie zmniejszyć immunogenność i antygenowość białka. W wyniku, można osiągnąć pożądaną aktywność biologiczną in vivo przez podanie takiego połączenia polimer-białko rzadziej albo w niniejszych dawkach w porównaniu z białkiem nie modyfikowanym.
Przyłączenie poliglikolu etylenowego (PEG) do białek jest szczególnie korzystne, ponieważ PEG jest bardzo mało toksyczny dla ssaków (Cerpenter i in., 1971). Przykładowo, połączenia PEG z dezaminazą adenozyny zatwierdzono w Stanach Zjednoczonych do stosowania u ludzi do leczenia zespołu ciężkiego, złożonego niedoboru odporności. Drugą zaletą koniugacji z PEG jest skuteczne zmniejszenie immunogenności i antygenowości białek heterologicznych. Przykładowo, połączenia PEG z białkami ludzkimi mogą być przydatne do leczenia chorób u innych gatunków ssaków, bez ryzyka wywołania ciężkiej reakcji odpornościowej. W jednym wykonaniu, białka można dostarczać w urządzeniu mikrokapsułkowanym w celu zapobieżenia albo zmniejszenia reakcji odpornościowej gospodarza przeciwko białku. Białko może być również dostarczane w postaci mikrokapsułkowanej w błonach takich jak liposomy.
Polimery takie jak PEG można łączyć kowalencyjnie z jedną albo wieloma reaktywnymi resztami aminokwasowymi w białku, jak np. grupami alfa-aminowymi aminokwasów końca N, grupami epsilon łańcuchów bocznych lizyny, grupami karboksylowymi łańcuchów bocznych asparaginianu i glutaminianu, grupami alfa-karboksylowymi aminokwasów końca C, łańcuchami bocznymi tyrozyny albo z aktywowanymi pochodnymi łańcuchów glikozylowych przyłączonych do niektórych reszt asparaginianowych, se-rynowych albo treoninowych.
Opisano wiele aktywowanych postaci PEG, przydatnych do bezpośredniej reakcji. Przydatne reagenty PEG do reakcji z grupami aminowymi białek obejmują aktywne estry kwasów karboksylowych, albo pochodne węglanowe, szczególnie takie, których grupami opuszczającymi są grupy: N-hydroksysukcymidowa, p-nitrofenolowa, imidazolowa albo 1 -hydroksy-2nitrobenzeno-4-sulfonianowa. Pochodne PEG zawierające grupy maleimidowe i haloacetylowe są przydatnymi reagentami do modyfikacji wolnych grup sulfohydrylowych białka. Podobnie, reagenty PEG zawierające grupy aminohydrazynowe albo hydrazydowe są przydatne w reakcjach z aldehydami wytworzonymi przez utlenianie nadjodowe grup węglowodanowych białek.
Osobnikiem, który moze być leczony wyzej opisanymi sposobami jest zwierzę. Korzystnie zwierzęciem jest ssak. Przykłady ssaków, które można leczyć obejmują, choć nie są ograniczone do ludzi, naczelnych z wyłączeniem ludzi, gryzoni (w tym szczurów, myszy, chomików i świnek morskich), krów, koni, owiec, kóz, świń, psów i kotów.
W jednym z wykonań wynalazku, czynnik wybrany jest sposobem przesiewowym.
W konkretnym wykonaniu wynalazku, czynnik jest wybrany sposobem przesiewowym, który obejmuje izolowanie próbki komórek hodowanie próbki w waninkach umożliwiających aktywację komórek niosących CD40, kontaktowanie próbki z komórkami wyrażającymi biał16
188 408 ko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo z białkiem, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, skuteczne do aktywacji komórek niosących CD40, kontaktowanie próbki z czynnikiem w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek niosących CD40 jeżeli czynnik jest zdolny do zahamowania aktywacji komórek niosących CD40, i określanie czy komórki wyrażające białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo białko które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916 aktywuje komórki niosące CD40 w obecności czynnika. Próbkę komórek można izolować z różnych tkanek, w tym linii komórkowych w hodowli i komórek izolowanych od zwierząt, takich jak komórki rozproszone z tkanek litych, komórki pochodzące z biopsji szpiku albo komórki izolowane z płynów ustrojowych takich jak krew czy chłonka.
W innym wykonaniu, cząsteczka (czynnik) wybrana jest w oparciu o trójwymiarową strukturę rozpuszczalnego regionu liganda CD40 albo jego części zdolnej do swoistego zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach. Czynnik można wybrać z biblioteki znanych czynników, zmodyfikować znane czynniki w oparciu o strukturę trójwymiarową, albo zaprojektować i syntetyzować de novo w oparciu o strukturę trójwymiarową. W konkretnych wykonaniach, czynnik (cząsteczka) zaprojektowana jest przez optymalizację struktury wiodącego czynnika hamującego, w oparciu o strukturę trójwymiarową kompleksu rozpuszczalnego regionu zewnątrzkomórkowego liganda CD40 albo jego części z wiodącym czynnikiem hamującym.
Sposób leczenia
Wynalazek dostarcza sposobu leczenia u osobnika choroby dotyczącej komórek mięśni gładkich, obejmującego podanie osobnikowi czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 na komórkach, przy czym czynnik występuje w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek u osobnika.
W jednym z wykonań wynalazku, chorobą komórek mięśni gładkich jest choroba naczyniowa. W konkretnym wykonaniu chorobą naczyniową jest miażdżyca.
W innym wykonaniu chorobą komórek mięśni gładkich jest choroba przewodu pokarmowego. W konkretnym wykonaniu choroba przewodu pokarmowego jest z grupy obejmującej zaburzoną ruchliwość (ahalazję) przełyku, chorobę zapalnąjelita grubego i twardzinę.
W jednym wykonaniu chorobą komórek mięśni gładkich jest choroba pęcherza moczowego.
Związki według wynalazku można podawać w dowolny, dopuszczalny medycznie sposób. Obejmuje to wstrzykiwanie, drogami pozajelitowymi takim jak dożylnie, dotętniczo, podskórnie, domięśniowo, doguzowo, dootrzewnowo, dokomorowo, do przestrzeni podtwardówkowej albo inaczej, jak również doustnie, donosowo, doocznie, doodbytniczo, miejscowo albo wziewnie. Do wynalazku włączone jest również podawanie przez przedłużone uwalnianie, w taki sposób jak wstrzyknięcia depot wszczepów ulegających rozkładowi wprowadzonych podczas zabiegu chirurgicznego.
Związki podaje się w dowolnej dawce przeliczonej na ciężar ciała oraz z dowolną częstością, dopuszczalnymi medycznie. Dopuszczalne dawkowanie obejmuje zakres od około 0,01 do 200 mg/kg ciężaru ciała osobnika. Korzystny zakres dawkowania zawiera się od około 0,1 do około 50 mg/kg. Szczególnie korzystne jest dawkowanie w zakresie od około 1 do 30 mg/kg. Dawki powtarza się w odstępach zawierających się od codziennej do co drugi miesiąc. Korzystnym schematem dawkowania jest podawanie związku według wynalazku przez pierwsze trzy dni leczenia, po czym związek podawany jest co 3 tygodnie, przy czym każde podanie obejmuje dawkę 5 albo 10 mg/kg podana dożylnie. Innym korzystnym schematem jest podawanie związku według wynalazku codziennie dożylnie w dawce 5 mg/kg ciężaru ciała przez pierwsze trzy dni leczenia, po czym związek podaje się podskórnie albo domięśniowo co tydzień w dawce 10 mg. Innym korzystnym schematem jest podawanie pojedynczej dawki związku według wynalazku pozajelitowo w dawce 20 mg/kg ciężaru ciała, a następnie przez podawanie związku podskórnie albo domięśniowo co tydzień w dawce 10 mg.
188 408
Związki według wynalazku można podawać w pojedynczej dawce w pewnych wskazaniach, jak np. zapobieganie reakcji odpornościowej na antygen, na który osobnik jest eksponowany przez krótki czas, jak np. antygen egzogenny podany przez jeden dzień leczenia. Przykłady takiego antygenu obejmować będą podawanie związku według wynalazku wraz z wektorem do terapii genowej albo czynnikiem leczniczym takim jak antygenowy produkt farmaceutyczny albo krwiopochodny. We wskazaniach, w których antygen obecny jest przewlekle, takich jak kontrolowanie reakcji odpornościowej na przeszczepioną tkankę albo przewlekłe podawanie leków antygenowych, związki według wynalazku podaje się w odstępach przez czas dłuzszy według wskazań, w zakresie od dni albo tygodni do podawania przez całe życie osobnika.
Reakcje zapalne charakteryzują się zaczerwienieniem, obrzękiem, podwyższoną temperaturą i bólem, w wyniku rozszerzenia naczyń z obrzękiem i migracją leukocytów fagocytujących. Zapalenie jest dalej zdefiniowane przez Gallin (rozdz. 26, Fundamental Immunology, wyd. 2, Raven Press, Nowy York, 1989, str. 721-733), załączony tu jako odnośnik.
Wynalazek będzie lepiej zrozumiały w odniesieniu do poniższych szczegółów doświadczalnych. Jednakże, specjalista zauwazy z pewnością, że konkretne sposoby i dyskutowane wyniki są jedynie podane w celu zilustrowania wynalazku, jak w pełni opisany w zastrzeżeniach, które nastąpią po opisie.
Szczegóły doświadczalne
Przykłady 1 i 2 pokazują, że cytokiny zapalne indukują ekspresję CD40 przez komórki mięśni gładkich. Ponadto, pokazują one, że sygnały za pośrednictwem CD40L regulują funkcje komórek mięśni gładkich.
Przykład 1 Analizę FACS wykorzystano do zbadania czy komórki mięśni gładkich wyrażają CD40.
W 6-studzienkowych płytkach hodowano komórki mięśni gładkich ludzkiej aorty, w pożywce M199 z dodatkiem 25% FCS, 5% surowicy ludzkiej, 90 pg/ml heparyny, 15 pg/ml śródbłonkowego czynnika wzrostowego i 1% penicyliny-steptomycyny. Pożywkę zmieniano co 2-3 dni, zaś gdy komórki wzrosły niemal do zlewności hodowano je w obecności albo pod nieobecność IFN-y (1000 U/ml), IL-la (1 ng/ml) albo TNF-a (200 U/ml) przez 72 godziny. Komórki zebrano przez traktowanie trypsyną-EDTA i określono ekspresję CD40 analizą FACS z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych G28.5 przeciwko CD40. Komórki barwiono również przeciwciałami stanowiącymi kontrolę izotypu i przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD54 (ICAM-1) jako kontrola pozytywna.
Komórki mięśni gładkich nie wyrażają konstytutywnie CD40 jak pokazano na fig. 1A. Jednakże, IFN-y, w przeciwieństwie do IL-la i TNF-a reguluje dodatnio ekspresję CD40 na komórkach mięśni gładkich (fig. 1A, IB i 1C). Badanie to pokazuje, że IFN-y dodanie reguluje ekspresję CD40 na komórkach mięśni gładkich ludzkiej aorty.
Przykład 2 Ekspresję CD40 na komórkach mięśni gładkich badano in situ.
Komórki znalezione w błonie środkowej normalnych naczyń, które morfologicznie przypominały komórki mięśni gładkich nie reagowały z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD40. Jednakże komórki, które morfologicznie przypominały komórki mięśni gładkich spotykane w zmianach zapalnych w przyspieszonej miażdżycy związanej z przeszczepem wyrażały CD40 in situ. Badania te sugerują, że cytokiny zapalne indukują ekspresję CD40 na komórkach mięśni gładkich. Ponadto, badania te wykazują, że sygnały za pośrednictwem CD40L regulują funkcje komórek mięśni gładkich.
Przykład 3 Limfocyty T CD4+CD40L+ i docelowe komórki CD40+ występują w miażdżycy i chorobie naczyń wieńcowych spowodowanej przeszczepem
Aktywowane komórki śródbłonka (EC), makrofagi (Mac) i limfocyty T CD4+ występują we wczesnej fazie zmian miażdżycowych tętnic wieńcowych (CA) i miażdżycy serca w wyniku przeszczepienia (TA). Ponieważ CD40L jest cząsteczką powierzchniową limfocytów T Cd4 + indukowaną pod wpływem pobudzenia, która dostarcza sygnałów aktywacji zaleznych od kontaktu, docelowym komórkom CD40+, w tym również EC (zwiększa ekspresję ICAM, VCAM i selektyny E) oraz Mac (indukuje wytwarzanie NO, TNF-a i IL-1 badano
188 408 in situ ekspresję CD40L i CD40 w CA *n=5) i TA (n=5). Ekspresję CD40L i CD40 badano przy użyciu przeciwciał monoklonalnych 5c8 przeciwko CD40L, G28.5 przeciwko CD40 i odpowiednich kontrolnych przeciwciał monoklonalnych. Mrożone skrawki normalnych tętnic wieńcowych (n=3) nie zawierały limfocytów T, zaś ekspresja CD40 ograniczona była do EC. W przeciwieństwie, zmiany związane z CA i TA zawierały limfocyty T CD40L+CD4+, jak określono znakowaniem immunologicznym skrawków seryjnych. Oprócz tego, ekspresja CD40 w mrożonych skrawkach od pacjentów z CA i TA jest znacznie podwyższona na EC, naciekających komórkach jednojądrzastych, komórkach piankowatych i komórkach mięśni gładkich błony środkowej (SMC). Dwukolorowa analiza immunohistochemiczna tkanek utrwalonych w parafinie z wykorzystaniem znaczników charakterystycznych dla SMC (aktyna mięśni gładkich) albo Mac (HAM-56) potwierdziła ekspresję CD40 na tych komórkach. Co ciekawe, SMC błony wewnętrznej odległe od komórek zapalnych i SMC błony środkowej są CD40-, co wskazuje, że miejscowe mediatory stanu zapalnego dodatnio regulują ekspresję CD40 na SMC in vivo Dodatnia regulacja CD40 i limfocyty T CD40L+CD4+ spotyka się we wszystkich etapach TA i są one najsilniej zaznaczone we wczesnych zmianach CA, w tym w tzw. „fatty streaks”. Podsumowując, badania te wskazują że limfocyty T CD40L+ mogą oddziaływać z komórkami docelowymi CD40+ w CA i TA oraz przyczyniać się do patogenezy tych chorób, przez promowanie wytwarzania cytokin zapalnych.
Przykład 4: CD40 ulega ekspresji na komórkach mięśni gładkich i makrofagach w zmianach miażdżycowych związanych z przeszczepem
Ekspresję CD40 in situ w natywnej miażdżycy albo miażdżycy związanej z przeszczepem badano dwukolorową analizą immunohistochemiczną. Badania z podwójnym znakowaniem przeprowadzono na tętnicach wieńcowych, które utrwalono w 10% buforowanej formalinie i zatopiono w parafinie. Skrawki odparafinowano w ksylenie, uwodniono i usunięto endogenną peroksydazę przy użyciu 0,2% H2O2 w 80% etanolu. Skrawki trawiono 0,01% pepsyną w HCl (pH 1,5) przez 15 minut w 37°C. Skrawki płukano PBS i inkubowano z 10% surowicą końską przez 20 minut w celu zablokowania miejsc nieswoistego znakowania. Następnie, wykrywano znakowanie anty-CD40 przy użyciu zestawu Vector ABC Elitę Kit (Vector) wykorzystując kolejno biotynowane przeciwciało wtórne, kompleks awidynaperoksydaza i 3,3'-diaminobenzydynę jako wywoływacz. Obecność CD40 zaznaczała się jako brązowe zabarwienie. Następnie, skrawki płukano PBS i blokowano 10% surowicą końską. Następnie skrawki inkubowano przez godzinę z przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi wobec komórek mięśni gładkich (aktyna mięśni gładkich) albo makrofagów (HAM 56). Przeciwciała pierwotne poddano koniugacji z fosfatazą alkaliczną stosując układ awidyna-biotyna (Vector). W celu wykrywania aktywności fosfatazy alkalicznej zastosowano Vector Red (Vector), dającą czerwone zabarwienie. Tak więc, podwójne znakowanie barwiło na brązowo (CD40) i czerwono (komórki mięśni gładkich albo makrofagi). W celu skontrolowania interferencji pomiędzy obiema reakcjami immunohistochemicznymi zastosowanymi do analizy podwójnego znakowania, seryjne skrawki każdej z próbek znakowano również w kierunku CD40, aktyny mięśni gładkich albo HAM 56. Patrz, fig. 3A i 3B. Skrawki kontrolne wykazywały to samo rozmieszczenie immunoreaktywności dla każdego z przeciwciał pierwotnych, co w znakowaniu podwójnym.
Przykład 5: Rozmieszczenie CD40L i CD40 w natywnej miażdżycy oraz chorobie naczyń wieńcowych związanej z przeszczepieniem: Korelacja ekspresji CD40 z obecnością cząsteczek adhezji międzykomórkowej, aktywowanego NF-κΒ i obecnością limfocytów T
Limfocyty T odgrywają rolę w patogenezie natywnej miażdżycy wieńcowej (CA) i miażdżycy tętnic wieńcowych związanej z przeszczepieniem (TCAD), jednakże, mechanizm dzięki któremu limfocyty T oddziałują z innymi komórkami w tych zmianach nie jest w pełni poznany. CD40L jest cząsteczką powierzchniową limfocytów T CD4+ indukowaną przez aktywację, która oddziałuje z komórkami docelowymi CD40+, w tym z makrofagami i komórkami śródbłonka, i indukuje wytwarzanie cząsteczek zapalnych takich jak IGAM-1 i VCAM-1. Ponadto, związanie CD40 aktywuje czynnik transkrypcyjny NF-κΒ. W celu zbadania czy oddziaływanie CD40L-CD40 może odgrywać rolę w patogenezie CA albo TCAD, przeprowadzono badania immunohistochemiczne ekspresji CD40L i CD40 na mrożonych
188 408 skrawkach tętnic wieńcowych pochodzących od biorców allogenicznych przeszczepów serca z CA (n=10) albo TCAD (n=9). Wykorzystując dwa różne przeciwciała monoklonalne przeciwko CD40L stwierdzono, ze ekspresja CD40L ograniczona była do naciekających limfocytów w CA i TCAD. Ekspresja CD40 była istotnie podwyższona w komórkach śródbłonka błony wewnętrznej, komórkach piankowatych, makrofagach i komórkach mięśni gładkich w obu jednostkach chorobowych. Podwójne znakowanie wykazało wiele komórek CD40+ równocześnie wyrażających ICAM-1, VCAM-1 czy aktywowaną postać NF-kB. Wielkość ekspresji CD40, ICAM-1 i VCAM-1 wykazuje istotną statystycznie Korelację z ciężkością choroby i ilością limfocytów w błonie środkowej. Podsumowując, badania te wykazują obecność aktywowanych komórek CD40L+ i CD40+ w zmianach CA i TCAD i wskazują, że oddziaływania za pośrednictwem CD40L z makrofagami CD40+, Komórkami piankowatymi, komórkami mięśni gładkich i/lub komórkami śródbłonka może spowodować patogenezę tych chorób.
Kilka poszlak dowodowych wskazuje, ze komórkowe mechanizmy odpornościowe odpowiedzialne są za zmiany zapalne (1-5) charakterystyczne dla natywnej miażdżycy naczyń wieńcowych (CA) (5-10) i chorobę naczyń wieńcowych związaną z przeszczepem (TCAD) (11-13). Przykładowo, naciekające błonę środkową limfocyty T wyrażające znaczniki aktywacji, takie jak CD25 i cząsteczki MHC Klasy II są obecne wcześnie w rozwoju zmian naczyniowych w obu chorobach (5, 14). Aktywowane makrofagi są powszechnie spotykane w zmianach w obu chorobach, podobnie jaK cytokiny związane reakcją odpornościową zależną od limfocytów T, w tym IFN-y, IL-1 i TNF-a (5-17). Jako dalszy dowód, że limfocyty T mogą odgrywać patogenną rolę w CA, wyizolowano Klony limfocytów T CD4+ z ludzkich włóknisto-miażdżycowych zmian CA, Które proliferują i wydzielają IFN-y poddane ekspozycji na utlenione LDL (18), główny składnik zmian natywnej CA i TCAD (1, 19, 20). Ponadto, zmiany miażdżycowe wywołane hiperlipidemią są zmniejszone u myszy leczonych przeciwciałami przeciwko CD4 (21). Podobnie, zmiany naczyniowe TCAD są istotnie złagodzone, gdy przeszczepy allogeniczne umieszczane są w organizmach myszy szczepów z uwarunkowanym genetycznie niedoborem limfocytów T (13) albo leczonych przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD413 albo przeciwko IFN-y (22). Podsumowując, dane te silnie sugerują, że limfocyty T i cząsteczki efektorowe pochodzące z limfocytów T związane są z patogenezą tych chorób (9, 23, 24).
CD40Ljest cząsteczką powierzchniową o ciężarze cząsteczkowym 30-33 KDa, wyrażaną na aktywowanych limfocytach T CD4+, Które dostarczają sygnałów zaleznych od Kontaktu Komórkom docelowym CD40+, takim jak limfocyty B (25-29). Sygnały dostarczane przez CD40L są Krytycznie ważne w rozwoju humoralnej reakcji odpornościowej zależnej od limfocytów T in vitro i in vivo (30). Oddziaływania CD40L-CD40, jaK wiadomo, odgrywają również rolę w Komórkowej reakcji odpornościowej in vitro i in vivo (31, 32). Co ciekawe, maKrofagi i Komórki śródbłonka, typy Komórek jak wiadomo biorące udział w patogenezie CA i TCAD, również wyrażają CD40 (33-37). Ponadto, związanie CD40 na makrofagach i komórkach śródbłonka in vitro wywołuje wytwarzanie cząsteczek, które zwiększają reakcje odpornościowe i/lub wywołują działanie zapalne. Przykładowo, oddziaływanie CD40L-CD40 dodatnio reguluje ekspresję MHC Klasy II i cząsteczki CD86 na makrofagach in vitro (38). Ponadto, związanie CD40 na mąKrofagach wywołuje wytwarzanie cytokin (TNF-a, IL-1 (3, IL-12), chemokin (IL-8, MIP-la), tlenku azotu (NO) przez indukcję syntazy 2 NO, tkankowego czynnika Krzepliwości i metaloproteinaz macierzy (33, 34, 39-42). Oddziaływanie CD40L-CD40 dodatnio reguluje cząsteczki adhezyjne CD54 (ICAM-1), CD106 (VCAM-1) i CD62E (seleKtyna E) na Komórkach śródbłonka (35-37). Wiele z tych efektów związania CD40 zalezy od aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-KB (43-45).
Podsumowując, odKycia te wskazują, że związanie CD40 na różnych komórkach docelowych może wspomagać reakcje zapalne za pośrednictwem limfocytów T CD4 + in vivo Jako argument na korzyść tej hipotezy, ekspresja CD40 ulega dodatniej regulacji w nerkach pacjentów z liszajowatym zapaleniem Kłębuszków nerkowych, nefropatią IgA i zapaleniem Kłębuszków nerkowych ANCA+ oraz w skórze pacjentów z łuszczycą (35, 46). Ponadto, limfocyty T CD40L+ naciekają nerki pacjentów z chorobą zapalną nerek (46). Ponieważ oddziaływanie limfocytów T z makrofagami, Komórkami śródbłonka i prawdopodobnie z innymi Komórkami odgrywa rolę w patogenezie CA i TCAD, obecne badanie ekspresji CD40L
188 408 i CD40 w tych chorobach bada się przy użyciu immunohistochemii. CD40L ulega ekspresji na limfocytach T, zaś ekspresja CD40 ulega dodatniej regulacji na komórkach śródbłonka, komórkach mięśni gładkich, makrofagach i komórkach piankowatych w zmianach w błonie środkowej w obu chorobach. Ponadto, stosując podwójne znakowanie immunologiczne stwierdzono, ze wiele komórek CD40+ w tych zmianach równocześnie wyraża CD54, CD 106 i aktywowaną postać NF-kB.
Metody, ludzkie tętnice wieńcowe
Segmenty głównej tętnicy wieńcowej lewej albo część bliższą tętnicy zstępującej lewej przedniej uzyskano z eksplantów serca 23 biorców przeszczepów allogenicznych serca. 9 pacjentów poddanych było ponownemu przeszczepowi z podwodu rozwinięcia ciężkiej choroby naczyń wieńcowych związanej z przeszczepem (TCAD). U pacjentów tych, przeżycie pierwszego przeszczepu allogenicznego trwało od 38 do 103 miesięcy. 10 pacjentów otrzymało przeszczepy allogeniczne serca z powodu rozwinięcia ciężkiej choroby wieńcowej i kardiomiopatii niedokrwiennej. Kontrolne tętnice wieńcowe bez zmian miażdżycowych otrzymano z serc 4 pacjentów, z których 3 miało kardiomiopatię idiopatyczną, zaś jeden mięsaka serca. Części tych naczyń raptownie zamrożono w izopentanie w -80°C i cięto skrawki seryjne na kriostacie (Reichert Histostat) na grubość 4 mm. Skrawki umocowano na szkiełkach pokrytych sialiną, suszono na powietrzu, utrwalano w zimnym acetonie przez minutę i w zimnej mieszaninie 1:1 acetonu/chloroformu przez dodatkowe 7 minut i przechowywano w -80°C. Jeden skrawek z każdej z tętnic utrwalano w 10% formalinie i barwiono hematoksyliną i eozyną w celu badania histologicznego.
Przeciwciała pierwotne
Hybrydoma G28.5 przeciwko CD40 (IgGl) zakupiono w z American Type Culture Collection (Rockville, MD). Przeciwciała monoklonalne 5c8 (IgG2a) przeciwko CD40L wytworzono, jak to opisano uprzednio (28). Oba przeciwciała monoklonalne, G28.5 i 5c8 oczyszczono z wysięku otrzewnowego z użyciem kolumny białka G (Pharmacia, Piscataway, NJ). Dodatkowe przeciwciała przeciwko CD40L (IgGl) zakupiono w Całbiochem (San Diego, CA). Przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40 (IgM) zakupiono w Caltag (Burlingame, CA) i zastosowano do podwójnego znakowania immunologicznego. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CD3, CD4, CD8, CD34, CD68 (Novocastra, Burlingame, CA, IgGl) i przeciwko aktynie mięśni gładkich (SMA) (DAKO, Carpinteria, CA, IgG2a) zastosowano do rozróżnienia wśród różnych rodzajów komórek w płytkach błony środkowej, w tym limfocytów T (CD3, CD4 albo CD8), komórek śródbłonka (CD34), makrofagów (Cd68) i komórek mięśni gładkich (SMA). Przeciwciała monoklonalne przeciwko IGAM-1 (IgGl) i VCAM-1 (IgGl) zakupiono z CHEMICON™ (Temecula, CA). Rozmieszczenie aktywowanych NF-κΚΒ wykazano przeciwciałem przeciwko p65 (IgG3) (Boehringer Mannheim), które wiązało się z epitopem na podjednostce p65 NK-kB zablokowanego IkB, a stąd dostępnego jedynie gdy NF-κΒ jest aktywowany przez dysocjację z IkB (47). Przeciwciała monoklinalne stanowiące kontrolę izotypu (Mopec 21, 22) zakupiono z SIGMA™ (St. Louis, MO).
Immunohistochemia
Skrawki mrożone płukano w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) i usunięto endogenną peroksydazę przy użyciu 0,5% H2O2. Skrawki blokowano 10% surowicą kozią i agregowanymi ludzkimi IgG (80 mg/ml) w PBS, a następnie inkubowano przez godzinę ze wskazanym pierwotnym przeciwciałem monoklonalnym albo odpowiednim kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym. Skrawki mrożone migdałków z hiperplazją pęcherzykową zastosowano jako kontrolę pozytywną w celu określenia optymalnego rozcieńczenia każdego z przeciwciał monoklonalnych. Pierwotne przeciwciała monoklonalne związane z antygenem docelowym związano z kozim przeciw-mysim przeciwciałem monoklonalnym swoistym izotypowo, znakowanym biotyną IgGl, IgG2a, IgG3 i IgM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), które sprzęgnięto z kompleksami awidyna-biotyna-peroksydaza (Vector Elitę Kit™, Vector, Burlingame, CA). Aktywność peroksydazową wykrywano chromogenem (czerwonym), 3-amino9-etylokarbazolem (AEC, Vector, Burlingame, CA) i podbarwiani skrawki hematoksylina Mayera (Sigma, St. Louis, MO).
188 408
Podwójne znakowanie immunohistochemiczne zastosowano w celu identyfikacji rodzajów komórek wyrażających CD40 oraz w celu określenia rozmieszczenia CD40 względem ICAM-1, VCAM-1 albo aktywowanego NF-kB w zmianach miażdżycowych. Wszystkie skrawki znakowano najpierw przeciwciałem monoklonalnym IgM przeciwko CD40. Wtórnym przeciwciałem były biotynowane kozie przeciwciała przeciwko mysim IgM, które następnie sprzęgnięto z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza. Chromogenem zastosowanym do wykrywania obecności przeciwciał IgM przeciwko CD40 była 3,3'-diaminobenzydyna (brązowa). Skrawki płukano intensywnie i inkubowano z drugim przeciwciałem pierwotnym skierowanym przeciwko swoistym komórkowe znacznikom komórek mięśni gładkich (SMA) albo makrofagom (CD68), cząsteczkom adhezyjnym leukocytów (ICAM-1, VCAM-1) albo aktywowanej postaci NF-kB. Wszystkie drugie przeciwciała pierwotne były izotypów IgGl, IgG2 albo IgG3. Nakraplano wtórne biotynowane przeciwciało swoiste wobec odpowiedniego izotypu i poddano sprzęganiu z kompleksem awidyna-biotyna-fosfataza alkaliczna (Vector, Burlingame, CA). Aktywność fosfatazy alkalicznej wykazano chromogenem Vector Red (Vector, Burlingame, CA). Interferencji pomiędzy nakładanymi kolejno przeciwciałami zapobiegano stosując różne techniki immunoenzymatyczne (peroksydazą wobec fosfatazy alkalicznej) i wtórne przeciwciała swoiste wobec izotypu dla każdego z antygenów···. Ponadto, wykonano podwójnie znakowane skrawki kontrolne w których jedno z dwóch przeciwciał pierwotnych zastąpiono dobranym pod względem izotypu przeciwciałem kontrolnym.
Pół-ilościowa analiza zmian
Wielkość zmian miażdżycowych w każdym skrawku oznaczano ilościowo stopniem zwęzenia światła naczynia w skali od 0 do 4, w której 0 oznaczało brak zwęzenia, 1 zwęzenie poniżej 25%, 2 poniżej 50%, 3 poniżej 90% i 4 ponad 90% zwężenia. Każdą zmianę w naczyniu wieńcowym oceniano również pod względem zawartości makrofagów, komórek mięśni gładkich, komórek piankowatych, komórek śródbłonka (naczyniotworzenie) i limfocytów T, przy czym 0 oznaczało brak odpowiednich rodzajów komórek, 1 - pojedyncze izolowane komórki, 2 - niewielkie skupiska komórek, 3 - obecność ogniskowych gęstych skupisk i 4 - gęste skupiska obecne w całej płytce. Podobnie, obecność CD40, ICAM-1 i VCAM-1 oceniano w skali od 0 do 4, w której 0 oznaczało brak odpowiedniej cząsteczki, 2 - jej obecność na poniżej 50% komórek, 3 - na poniżej 90% komórek i 4 - na ponad 90% wszystkich komórek (49). Ponieważ ekspresja CD40L w próbkach pozytywnych ograniczona była do izolowanych komórek, jej obecność nie była możliwa do zmierzenia ilościowo.
Analiza statystyczna
Różnice w ocenie histologicznej pomiędzy grupami próbek analizowano stosując nieparametryczny test Kruskala-Wallisa.
Związek pomiędzy zmiennymi oceniano stosując korelację Spearmana.
Wyniki, normalne tętnice wieńcowe
Segmenty tętnic wieńcowych od 4 kontrolnych pacjentów nie wykazywały zgrubienia błony środkowej albo stanu zapalnego, jak wykazano barwieniem HE (figury 4A-4B). Konkretnie, makrofagi, komórki mięśni gładkich, komórki piankowate albo limfocyty nie występowały w błonie środkowej i żadne komórki nie reagowały w tym badaniu z przeciwciałem monoklionalnym przeciwko CD40L. Immunoreaktywność z CD40 występowała i dotyczyła komórek śródbłonka wyściełających światło kontrolnej tętnicy (fig. 4B). VCAM-1 i aktywowany NF-kB nie ulegały ekspresji w kontrolnych naczyniach, zaś IGAM-1 ulegał słabej ekspresji na rzadkich komórkach śródbłonka.
Histologia natywnej CA i TCAD
U 7 spośród 10 pacjentów z CA, segmenty tętnic wieńcowych wykazały wyraźne płytki włóknisto-miazdżycowe z ekscentrycznymi zwężeniami, bezkomórkowymi rdzeniami bogatymi w lipidy, szczelinami cholesterolu i pokrywającymi włóknikowymi skrzepami. Komórki w zmianach występowały głównie w regionie „grzbietowym”, który zawierał makrofagi i limfocyty (fig. 5A). Występowały również rozproszone komórki mięśni gładkich, makrofagi, komórki piankowate i ogniska naczyniotworzenia w zmianach błony środkowej. Płytki od 3 pacjentów z łagodnymi wczesnymi zmianami naczyniowymi były ekscentryczne, małe, bogate w makrofagi, komórki piankowate i limfocyty.
188 408
Zmiany w tętnicach wieńcowych w 9 pacjentów z TC AD wykazywały pierścieniowate zgrubienia błony środkowej z zaznaczonymi zwężeniami światła (tabela 2).
Tabela 2: Pół-ilościowa ocena (0-4) składu komórek w zmianach błony środkowej natywnej miażdżycy wieńcowej (CA) i chorobie tętnic wieńcowych spowodowanej przeszczepem (TCAD) oraz immunoreaktywność z CD40, ICAM-1 i VCAM-1. Wartości wyrażone są jako średnia ± odchylenie standardowe
Płytka błony środkowej Kontrola (n = 4) CA (n = 10) TCAD (n = 9)
Grubość 0,3 ± 0,5 2,1 ±0,9* 3,1 ±0,8*
limfocyty CD4+ 0 1,3 ±0,9* 3,2 ±0,8*
limfocyty CD 8+ 0 0,3 ± 0, 5 2,6 ± 1,1*
makrofagi (CD68) 0,5 ± 0,6 2,1 ±0,8* 3,8 ± 0,4*
komórki piankowate 0 1,2 ±0,8* 2,4 ± 1,3*
komórki mięśni gładkich 0,8 ± 1 1,7 ±0,7 2,9 ±0,8*
naczyniotworzenie 0 1,8 ±0,7* 2,6 ± 0,9*
CD40 0,5 ± 0,6 2,2 ± 0,7* 3,3 ±0,9*
ICAM-1 0,5 ± 0,6 2,3 ± 1,7* 3,6 ±0,7*
YCAJM-l 0,3 ± 0,5 1,7 ±0,7* 2,9 ± 0,9*
* p, 0,05 dla CA albo TCAD względem kontroli, badane testem Kruskala-Wallisa.
Zmiany zbudowane były z koncentrycznych warstw komórek mięśni gładkich i macierzy śródmiąższowej oraz gęstego nacieku makrofagów i limfocytów, wraz z obszarami naczyniotworzenia. W 4 tętnicach wieńcowych oprócz koncentrycznych warstw komórek mięśni gładkich występowały bogate w lipidy zmiany kaszo watę i komórki pianko watę (fig. 6 A-C). Podśródbłonkowe skupiska limfocytów („zapalenie śródbłonka”) i agregaty limfocytów w przydance były również cechami charakterystycznymi w zmianach TCAD.
Analiza immunohistochemiczna ekspresji CD40L w CA i TCAD
W silnym kontraście z normalnymi tętnicami wieńcowymi, które pozbawione są naciekających limfocytów albo komórek wyrażających CD40L, zarówno zmiany w CA, jak i w TCAD zawierały komórki CD40L+. W natywnej miażdżycy tętnic pozytywne znakowanie immunologiczne na CD40L ograniczone było do mniejszości limfocytów błony środkowej. Znakowanie CD40L było zwykle słabe i obserwowane w postaci małych złogów cytoplazmatycznych albo na powierzchni komórek (fig. 7A-D). W natywnej CA, większość limfocytów błony środkowej było limfocytami T CD4+; limfocyty T CD8+ występowały jedynie rzadko (fig. 7 A-D). Analiza seryjnych skrawków znakowanych przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD4 i CD8 sugeruje, że limfocyty CD40L+ były głównie limfocytami T CD4+. Komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, makrofagi i komórki piankowate nie reagowały z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40L zastosowanymi w tym badaniu. Nie zauważono znakowania przeciwciałami kontrolnymi.
W zmianach TCAD, pozytywne znakowanie immunologiczne na CD40L związane było również wyłącznie z limfocytami (fig. 8A-C). W przeciwieństwie do CA, w zmianach TCAD występowały zarówno limfocyty T CD4 +, jak i CD8+. Jednakże, limfocyty T CD8+ występowały przede wszystkim w obszarach podśródbłonkowych „zapalenia śródbłonka” (fig. 9A-B), podczas gdy limfocyty T CD4+ umiejscowione były głównie w skupiskach głęboko w błonie środkowej w sąsiedztwie wewnętrznej błony elastycznej (fig. 8A-C) i przydance naczyń wieńcowych. W TCAD, ekspresja CD40L korelowała przestrzennie z limfocytami T CD4+ w błonie środkowej i przydance tętnic wieńcowych. Liczba limfocytów T CD40L+ była większa w zmianach TCAD niż w CA. Podobnie do CA, komórki śródbłonka, komórki mięśni
188 408 gładkich, makrofagi albo komórki piankowate w zmianach TCAD nie reagowały z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40L zastosowanymi w tym badaniu (fig. 9A-B). Dane te wskazują, że komórki wyrażające CD40L, prawdopodobnie limfocyty T CD4+ obecne są w zmianach CA i TCAD.
Analiza immunohistochemiczną ekspresji CD40 w CA i TCAD
W przeciwieństwie do słabej ekspresji CD40 ograniczonej do komórek śródbłonka normalnych naczyń wieńcowych (fig. 4A-B), immunoreaktywność CD40 była podwyższona i rozpowszechniona w zmianach Ca (fig. 5A-B). Ekspresję CD40 zauważono na komórkach śródbłonka, komórkach mięśni gładkich, makrofagach i komórkach piankowatych. W zmianach w błonie środkowej CA w porównaniu z tętnicami kontrolnymi występowała istotnie większa liczba komórek CD40+ (2,2 ± 0,7 wobec 0,5 ± 0,6, tabela 2). Podwójne znakowanie immunologiczne, na znaczniki swoiste wobec makrofagów albo komórek mięśni gładkich potwierdziło, że komórki te oraz komórki piankowate wyrażają CD40 (fig. 10A-B). Co ciekawe, komórki mięśni gładkich CD40+ występowały w błonie środkowej w pobliżu nacieków zapalnych, podczas gdy komórki mięśni gładkich w błonie środkowej tętnic nie wykazywały znakowania pozytywnego na CD40 (fig, 10A-B). Analiza skrawków seryjnych znakowanych CD40 albo śródbłonkowym znacznikiem CD34 sugeruje, ze komórki śródbłonka wyściełające nowe naczynia krwionośne błony środkowej i naczynia naczyń przydanki były również silnie CD40+ (fig. 11 A-D).
W tętnicach od pacjentów z TCAD, wzorzec rozmieszczenia ekspresji CD40 był podobny do natywnej CA. Jednakże, przeciętna ocena immunoreaktywności CD40 była istotnie wyższa w TCAD niz w natywnej CA albo tętnicach kontrolnych (tabela 2). Podwójne znakowanie immunologiczne wskazywało, że komórki mięśni gładkich błony środkowej i makrofagi wyrażają CD40 (fig. 10A-B). Ponadto, komórki piankowate (fig. 6A-B) i komórki śródbłonka wyściełające światło naczyń, nowe naczynia błony środkowej i naczynia naczyń przydanki były silnie CD40+. Podsumowując, dane te pokazują, ze komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich i makrofagi wyrażają CD40 zarówno w natywnej CA, jak i w TCAD.
Zależność ekspresji CD40 od cząsteczek adhezji międzykomórkowej i aktywacji NF-kB w zmianach CA i TCAD.
Makrofagi i komórki śródbłonka w CA i TCAD wyrażają cząsteczki adhezji międzykomórkowej, które regulują migrację leukocytów do zmian. Ponieważ związanie CD40 wywołuje dodatnią regulację cząsteczek adhezji międzykomórkowej i aktywację NF-kB w komórkach in vitro, postanowiono sprawdzić, czy ekspresja CD40 związana była z równoczesną ekspresją cząsteczek adhezji międzykomórkowej albo NF-kB w zmianach w CA i TCAD. Po pierwsze wykazano w natywnej CA, ze komórki śródbłonka wykazują ogniskowe pozytywne znakowanie immunologiczne na ICAM-1, z rzadkimi komórkami śródbłonka wyrażającymi VCAM-1. W przeciwieństwie, komórki śródbłonka wyściełające nowe naczynia krwionośne błony środkowej i naczynia naczyń przydanki były silnie pozytywne na ICAM-1 i VCAM-1 (fig. 11 A-D). Komórki mięśni gładkich błony środkowej, makrofagi i komórki piankowate były również umiarkowanie silnie pozytywne na IGAM-1 i VCAM-1 (fig. 12A-C). Występowała istotna korelacja (p < 0,05) pomiędzy oceną CD40 i IGAM-1 (r=0,85) i VCAM-1 (r=0,72). Liczba limfocytów w błonie środkowej korelowała w istotny sposób z oceną dla CD40 i cząsteczek adhezji leukocytów (tabela 3).
Tabela 3: Korelacja ocen (0-4) dla różnych rodzajów komórek zmian w błonie środkowej CA (n=10) albo TCAD (n=9) z ocenami (0-4) ekspresji CD40 i cząsteczek adhezyjnych (ICaM-1, VcAM-1). Wartości wyrażano jako współczynnik Korelacji Spearmana (zakres -1 do 1, z „0” = braK Korelacji i „-1” i „1” = doskonała korelacja)
Rodzaj Komórek Grupa CD40 ICAM-1 YCAM-1
1 2 3 4 5
Limfocyty T (CD4+ i CD8+) CA 0,78* 0,77* 0,83**
TCAD 0,79* 0,87** 0,77*
Makrofagi (CD68+) CA 0,93*** 0,84** 0,77*
TCAD 0,81** 0,68* 0,55
188 408
c.d. tabeli 3
1 2 3 4 5
Komórki pianKowate CA 0,81** 0,68* 0,36
TCAD 0,44 0,33 0,26
Komórki mięśni gładkich (SMA+) CA 0,12* 0, 81** 0,56
TCAD 0,72 0,38 0,02
Nowe naczynia (CD34+) CA 0,69* 0,72* 0,53
TCAD 0,85** 0, 87** 0,77
* p<0,05, ** p<0,01 i *** p<0,001 poziom istotności dla współczynnika Spearmana
Wśród wszystkich wymienionych komórek, jedynie ocena dla limfocytów błony środkowej korelowała w istotny sposób z ekspresją CD40 i nasileniem ICAM-1 i VCAM-1 w płytkach błony środkowej w CA i TCAD sugerując, że limfocyty są związane z indukcją CD40 i cząsteczek adhezyjnych w obu chorobach. Wykazano również, że makrofagi i naczyniotworzenie koreluje w istotny sposób z ekspresją CD40 w CA i TCAD.
Podwójne znakowanie immunologiczne zmian CA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD40 i przeciwko IGAM-1 albo VCAM-1 wykazało, że CD40 umiejscowiony jest wraz z tymi cząsteczkami adhezyjnymi na wielu komórkach (fig. 12A-C). Oprócz tego, aktywowany NF-kB (fig. 13) obserwowano w jądrach komórek śródbłonka, makrofagach i Komórkach mięśni gładkich nowej błony środkowej, zaś podwójne znakowanie immunologiczne wykazało, ze wiele Komórek CD40L+ również wyraża aktywowany NF-kB.
W TCAD, silnie pozytywne znakowanie immunologiczne na IGAM-1 i VCAM-1 występowało na Komórkach śródbłonka naczyń, szczególnie w pobliżu ognisk zapalenia śródbłonKa Komórki śródbłonka nowych naczyń błony środkowej i naczyń przydanKi były silnie immunoreaktywne na ICAM-1 i VCAM-1. Oceny dla znakowania immunologicznego cząsteczek adhezyjnych w TCAD były wyższe niż w CA albo normalnych tętnicach wieńcowych (tabela 2). Występowała istotna Korelacja (p<0,05) pomiędzy ocenami CD40 i ICAM-1 (r=0,82) i VCAM-1 (r=0,89). Liczba limfocytów błony środkowej również Korelowała istotnie z ekspresją CD40, ICaM-1 i VCAM-1 (tabela 3). Podobnie do CA, dwukolorowe badanie immunohistochemiczne wykazało, że wiele Komórek CD40L+ w TCAD równocześnie wyraża ICAM-1 albo VCAM-1 (fig. 12A-C). Znakowanie immunologiczne aktywowanej postaci jądrowej NF-kB było szerzej rozpowszechnione w TCAD niż w CA. Makrofagi pozytywne pod względem NF-kB i Komórki mięśni gładkich były CD40+ (fig. 13). Podsumowując, badania te wykazały, ze w zmianach w CA oraz TCAD CD40 ulega równoczesnej ekspresji na wielu Komórkach z Komórkami adhezji międzyKomórkowej i/lub NF-kB.
Dyskusja
Natywna miażdżyca (CA) i miażdżyca związana z przeszczepem (TCAD) są chorobami zapalnymi wywołanymi złożonymi oddziaływaniami aktywowanych limfocytów T, Komórek śródbłonka, makrofagów i Komórek mięśni gładkich (2, 8, 12, 13, 17). Wydaje się, że limfocyty T odgrywają rolę w patogenezie CA i TCAD, jednakże mechanizm według Którego uczestniczą w tych procesach nie jest w pełni znany (5, 9, 50). Badania wykazały, że CD40L, cząsteczka powierzchniowa limfocytów T CD4+ indukowana aktywacją, dostarcza sygnałów aktywacji za pośrednictwem Kontaktu, komórkom śródbłonka i makrofagom wyrażającym CD40, co powoduje wytwarzanie cząsteczek zapalnych, takich jaK cząsteczki adhezji międzyKomórKowej ICAM-1 i VCAM-1 (31, 32, 35-37) oraz aktywację czynnika transKrypcyjnego NF-kB (43-45, in vitro) Co ciekawe, TCAD na modelu mysim jest przynajmniej częściowo zależna od oddziaływania CD40L-CD40 (51). W badaniu Larsona i in., terapia przeciwciałami monoKlonalnymi przeciwko CD40L hamowała odrzucanie heterotopowego przeszczepu allogenicznego i częściowo blokowała związaną z tym patologię naczyń. Ponadto, TCAD w tym modelu można było całkowicie zapobiec przez podawanie Kombinacji przeciwciała monoklo188 408 nalnego przeciwko CD40L i białka fuzyjnego CTLA4-Ig, cząsteczki, która blokuje szlak pobudzenia limfocyta T (51).
Możliwe jest, ze oddziaływanie CD40L-CD40 może brać udział w patogenezie CA i/lub TCAD u ludzi.
W celu zbadania tej hipotezy, zastosowano dalsze techniki immunohistochemiczne wobec normalnych i zmienionych miazdżycowo tętnic wieńcowych, w celu zbadania ekspresji i rozmieszczenia komórkowego CD40L i CD40. Normalne tętnice wieńcowe nie zawierają komórek wyrażających CD40L, zaś immunoreaktywność CD40 ograniczona jest do komórek śródbłonka tych naczyń. W przeciwieństwie, CD40L ulega ekspresji na limfocytach w zmianach CA i TCAD. Stwierdzono, ze zmiany CA zawierają nieco limfocytów T CD8+, podczas gdy zmiany TCAD zawierają limfocyty T CD8+ w pobliżu śródbłonka („zapalenie śródbłonka”), zaś limfocyty T CD4+ głębiej w błonie środkowej i przydance. W oparciu o lokalizację i znakowanie seryjnych skrawków przeciwciałami przeciwko CD4 i CD8 wywnioskowano, że limfocyty CD40L+ najprawdopodobniej są limfocytami T CD4+ w zmianach obu chorób. Wykorzystując dwa różne przeciwciała monoklonalne przeciwko CD40L stwierdzono, że immunoreaktywność CD40L jest słaba i związana z ziamistościami i cytoplazmą albo powierzchnią komórki. Podobny wzorzec immunoreaktywności CD40L zaobserwowano w badaniu ekspresji CD40L i CD40 w kłębuszkowym zapaleniu nerek (46). Słaby i często cytoplazmatyczny wzorzec znakowania ekspresji CD40L w tkankach zapalnych może być związany z przejściową naturą ekspresji CD40L na aktywowanych limfocytach T (27-29) oraz faktem, ze związanie CD40L na komórkach docelowych wywołuje gwałtowną ujemną modulację CD40L przez endocytozę za pośrednictwem receptorów (52) oraz złuszczanie (53). Te mechanizmy regulacyjne prawdopodobnie służą do skupienia zjawisk sygnalizacji za pośrednictwem CD40L na odpowiedniej komórce docelowej.
Stwierdzono, że ekspresja CD40 była istotnie zwiększona na wielu komórkach w zmianach obu chorób. Makrofagi i komórki piankowate wyrażające CD40 były szczególnie wyraźne w nacieku zapalnym regionów „grzbietowych” płytek bogatych w lipidy, które jak wiadomo, zawierają gęste nacieki zapalne (54, 55). Ekspresja CD40 ulegała również dodatniej regulacji na komórkach śródbłonka w obu chorobach, i było to szczególnie wyraźne w TCAD. Komórki naczyń błony środkowej i naczyń przydanki w obu chorobach były silnie CD40+. Komórki mięśni gładkich wyrażające CD40 występowały w błonie środkowej CA i TCAD, zwykle w sąsiedztwie nacieków zapalnych. Co ciekawe, komórki mięśni gładkich w błonie środkowej tych samych naczyń były CD40-. IFN-γ dodatnio regulował ekspresję CD40 w wielu rodzajach komórek in vitro (33, 35-37, 56) w tym komórek mięśni gładkich, zaś ten efekt zwiększany jest przez cytokiny, takie jak IL-1 β i TNF-a (36).
Stąd, zaznaczona dodatnia regulacja ekspresji CD40 na wielu rodzajach komórek w tych zmianach może być konsekwencją uwalniania cytokin przez limfocyty T, makrofagi i inne komórki w zmianach. Podwójne znakowanie wskazuje, ze wiele komórek CD40+ również równocześnie wyraża cząsteczki adhezji międzykomórkowej ICAM-1 i VCAM-1, jak również aktywowaną postać NF-κΒ. Podsumowując, niniejsze badanie wykazuje obecność limfocytów T CD40L+ i aktywowanych docelowych komórek CD40+ w zmianach naczyniowych natywnej CA i TCAD.
Wczesne badania pokazały, że CD40 ulega ekspresji na niektórych nowotworach nabłonkowych i z limfocytów B (57, 58). Ostatnio zauważono, że CD40 ulega konstytutywnej albo indukowalnej ekspresji na wielu rodzajach komórek in vitro (33-37, 56). Ponadto, staje się coraz bardziej oczywiste, że oddziaływanie CD40L-CD40 odgrywa główną rolę w komórkowych reakcjach zapalnych in vivo (31, 32). W tym względzie, ostatnie doniesienia wykazują in situ ekspresję CD40L i/lub CD40 w ludzkich chorobach zapalnych (35, 46, 59). Przykładowo, ekspresja CD40 ulega regulacji dodatniej na makrofagach naciekających mózgi pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (59), komórkach nabłonkowych skóry i keratynocytach w łuszczycy (35) i wielu różnych komórkach nerek pacjentów z kłębuszkowym zapaleniem nerek (46). Ponadto, nacieki zapalne w mózgach pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (59) oraz nerkach pacjentów z kłębuszkowym zapaleniem nerek (46) zawierają limfocyty T CD40L+. Stąd prawdopodobne jest, że ekspresja CD40 ulega dodatniej regulacji w wielu chorobach zapalnych i stanowi molekularny mechanizm, który umożliwia limfocytom T dostar26
188 408 czenie sygnałów pro-zapalnych do wielu komórek docelowych. Pod tym względem, przedstawione tu odkrycie, że ekspresja CD40 ulega dodatniej regulacji w CA i TCAD, oraz, że naciekające limfocyty T CD40L+ spotyka się w zmianach, służy jako dowód na potwierdzenie hipotezy, że reakcje zapalne odgrywają główną rolę w patogenezie tych chorób (5-7, 9, 18, 21, 23, 50).
Obserwacje dotyczące aktywacji komórek śródbłonka i makrofagów in vitro za pośrednictwem CD40L oraz badania oddziaływania CD40L-CD40 w patogenezie mysich modeli TCAD sugerują możliwą patogenną rolę oddziaływania CD40L-CD40 w CA i TCAD. Przykładowo, sygnały za pośrednictwem CD40L dodatnio regulują ekspresję ICAM-1 i VCAM-1 na komórkach śródbłonka in vitro (35-37). Te cząsteczki adhezji międzykomórkowej, które regulują wnikanie i zatrzymywanie leukocytów w miejscu stanu zapalnego ulegają dodatniej regulacji na komórkach śródbłonka w CA i TCAD, oraz są szczególnie wyraźne na komórkach śródbłonka w nowych naczyniach błony środkowej i naczyniach naczyń (49, 60). Stąd interesujące jest, że w zmianach CA i TCAD stwierdza się wiele komórek CD40+, szczególnie w komórkach śródbłonka błony środkowej i naczyniach naczyń, które równocześnie wyrażają ICAM-1 i/lub VCAM-1. Wiadomo, że dodatnia regulacja ICAM-1 i VCAM-1 jest zależna od aktywacji NF-kB (61). W niniejszym badaniu wykazano, że makrofagi, komórki mięśni gładkich i komórki śródbłonka CD40L+ błony środkowej wyrażają aktywowaną postać NFkB. Badania te sugerują, że limfocyty T CD4+ CD40L+ mogą indukować dodatnią regulację cząsteczek adhezji międzykomórkowej na komórkach docelowych CD40+ w CA i TCAD, prawdopodobnie częściowo przez aktywację NF-kB.
Sygnały za pośrednictwem CD40L również indukują komórki śródbłonka do wydzielania IL-6 i IL-8 (62) i promują powierzchnię ułatwiającą krzepnięcie przez zwiększanie ekspresji czynnika tkankowego i zmniejszanie ekspresji trombomoduliny. W odniesieniu do makrofagów, oddziaływanie CD40L-CD40 indukuje te komórki do wydzielania cytokin zapalnych (IL-1 a, IL-1 β, IL-6 i TNF-a), chemokin, metaloproteinaz macierzy i wyrażania czynnika tkankowego in vitro (33, 34, 38, 41, 42). Wszystkie te cząsteczki zapalne prawdopodobnie odgrywają rolę w patogenezie CA i TCAD (10, 17, 63-66). Związanie CD40 na makrofagach wywołuje również wytwarzanie NO (39, 40). Co ciekawe, zablokowanie oddziaływania CD40LCD40 na modelu mysim TCAD związane jest z ujemną regulacją ekspresji iNOS i zmniejszeniem zmian TCAD (51). Wykazano, ze iNOS ulega ekspresji w zmianach CA (67, 68), odrzucaniu allogenicznego przeszczepu serca (69, 70) i TCAD (71, 72). Sygnały za pośrednictwem CD40L mogą być związane z promowaniem wytwarzania którejkolwiek z tych cząsteczek w CA albo TCAD. Oddziaływania CD40L-CD40 wyraźnie mają działanie pro-zapalne w mysim modelu TCAD (51), jak również w zapaleniu stawów wywołanym kolagenem (73), zapaleniu kłębuszków nerkowych przypominającym liszaj (74) i doświadczalnym alergicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (59).
Przeprowadzono badanie (62) ekspresji CD40L i CD40 w miażdżycy ludzkich naczyń szyjnych. Stwierdzono, że CD40 ulega dodatniej regulacji w zmianach i ma szerokie rozmieszczenie komórkowe. Opisywano, ze CD40L ulega szeroko ekspresji na komórkach mięśni gładkich, komórkach śródbłonka i makrofagach w zmianach miażdżycowych, podczas gdy w niniejszym badaniu z użyciem dwóch różnych przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD40L, ekspresja CD40L ograniczona była do limfocytów T. Ekspresja CD40L in situ na makrofagach, komórkach śródbłonka czy komórkach mięśni gładkich nie była obserwowano w żadnej z badanych chorób. Podobnie stwierdzono, że immunoreaktywność CD40L ograniczona jest do limfocytów T w innych chorobach zapalnych, w tym w kłębuszkowym zapaleniu nerek (46), reumatoidalnym zapaleniu stawów i przewlekłym zapaleniu zatok. Oprócz tego, Gerritse i in., donieśli, ze ekspresja CD40L ograniczona jest do limfocytów T CD4+ w blaszkach w stwardnieniu rozsianym (59). Rozbieżności pomiędzy niniejszymi wynikami i wynikami Mach i in. są obecnie niejasne, ale mogą dotyczyć subtelnych różnic w technikach immunohistochemicznych albo natury zmian.
188 408
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Yellin, Michael J.
Lederman, Seth Chess, Leonard Karpusas, Mihail N. Thomas, David W.
(ii) TYTUŁ WYNAL2AKU:
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 1 (iv) ADRES DO KORESONDENCJI:
(A) ADRESAT: Cooper & Dunham LLP (B) ULICA: 1185 Avenue of the Americas (C) MIASTO: New York (D) STAN: New York (E) KRAJ: USA (F) KOD: 10036 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS <D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release#1.0, Version #1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJE O RZECZNIKU:
(A) NAZWISKO: White Esq., John P.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 28,678 (C) NUMER SPRAWY: 48559/JPW/JML (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYiJE:
(A) TELEFONE: (212) 278-0400 (B) TELEFAX: (212) 391-0525 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR :1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 146 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR : 1:
Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser 15 10 15
188 408
Ser Lys Thr Thr 20 Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
25 30
Met Ser Asn Asn 35 Leu Val Thr Leu Glu 40 Asn Gly Lys Gln Leu 45 Thr Val
Lys Arg 50 Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr 55 Ala Gln Val Thr Phe 60 Cys Ser
Asn 65 Arg Glu Ala Ser Ser Gln AlLa Pro 70 Phe Ile Ala Ser Leu 75 Cys Leu 80
Lys Ser Pro Gly Arg 85 Phe Glu Arrg Ile Leu Leu Arg Ala Ala 90 Asn 95 Thr
His Sse Ser Ala 100 Lys Pro Cys Gly Gln 105 Gln Ser Ile His Leu 110 Gly Gly
Val Phe Glu Leu 115 Gln Pro Gly Ala Ser 120 Val Phe Val Asn Val 125 Thr Asp
Pro Ser 130 Gln Val Ser His Gly Thr Gly 335 Phe Thr Ser Phe Gly 140 Leu Leu
Lys Leu 145
188 408

Claims (41)

1. Sposób zahamowania aktywacji przez ligand CD40 komórek mięśni gładkich niosących CD40 na powierzchni, znamienny tym, że obejmuje etap kontaktowania komórek mięśni gładkich z czynnikiem zdolnym do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40, przy czym komórki niosące CD40 są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego.
2. Sposób zahamowania aktywacji przez ligand CD40 komórek mięśni gładkich niosących CD40 na powierzchni, znamienny tym, że obejmuje etap kontaktowania komórek mięśni gładkich in vitro z czynnikiem zdolnym do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40, przy czym komórki mięśni gładkich są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego są komórki mięśni gładkich przełyku, komórki mięśni gładkich żołądka, komórki mięśni gładkich jelita cienkiego albo grubego.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik swoiście hamuje wiązanie ligandu CD40 z CD40 na komórkach mięśniowych.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik swoiście wiąże się z epitopem, z którym swoiście wiąże się przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik swoiście wiąże się z CD40.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik wybrany jest z grupy obejmującej: białka, nie-białka i związki peptydomimetyczne.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że białko obejmuje przeciwciało albo jego część.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że przeciwciało wybrane jest z grupy obejmującej przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane, przeciwciała prymatyzowane i przeciwciała, które obejmują region CDR od jednego człowieka i rusztowanie przeciwciała od innego człowieka.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że przeciwciało monoklonalne jest przeciwciałem monoklonalnym 5c8 wytwarzanym przez hybrydoma o nr dostępu ATCC HB 10916.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że białko obejmuje rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo jego odmianę w tym konserwatywne zastąpienia, albo ich część, albo rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40, albo jego odmianę obejmującą zastąpienia konserwatywne, albo ich część.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo CD40 jest monomerem lub oligomerem.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40 albo jego część, dalej obejmuje region Fc poddany fuzji z regionem zewnątrzkomórkowym CD40 albo jego częścią albo ligandem CD40 albo jego częścią.
14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik jest wybrany albo zaprojektowany przez optymalizację struktury wiodącego czynnika hamującego, w oparciu o trójwymiarową strukturę kompleksu rozpuszczalnego regionu zewnątrzkomórkowego CD40 albo jego części z wiodącym czynnikiem hamującym.
188 408
15. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik swoiście hamuje aktywację komórek przez ligand CD40 komórek mięśni gładkich niosących CD40, które są związane z chorobą zależną od komórek mięśni gładkich.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że choroba zależna od komórek mięśni gładkich wybrana jest z grupy obejmującej: chorobę naczyniową, chorobę pęcherza moczowego i chorobę przewodu pokarmowego.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że choroba przewodu pokarmowego wybrana jest z grupy obejmującej: ahalazję przełyku, chorobę zapalnąjelita grubego i twardzinę.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że chorobą naczyniową jest miażdżyca.
19. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że czynnik wybierany jest metodą przesiewową, która obejmuje:
(a) izolowanie próbki komórek mięśni gładkich, przy czym komórki mięśni gładkich są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego;
(b) hodowanie próbki w warunkach umożliwiających aktywację komórek mięśni gładkich w próbce, które są komórkami niosącymi CD40;
(c) kontaktowanie próbki z komórkami wyrażającymi białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo kontaktowanie próbki z białkiem swoiście rozpoznawanym przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, przy czym te komórki lub białko skutecznie aktywują komórki mięśni gładkich niosące CD40;
(d) kontaktowanie próbki z czynnikiem w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek mięsni gładkich niosących CD40, jeżeli czynnik jest zdolny do zahamowania aktywacji zależnej od CD40-CD40L komórek mięśni gładkich niosących CD40; i (e) określanie czy komórki wyrażające białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, czy białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, aktywuje komórki mięśni gładkich niosące CD40 w obecności czynnika.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że próbka komórek mięśni gładkich wybrana jest z grupy obejmującej: linie komórkowe w hodowli, komórki izolowane od zwierzęcia, komórki izolowane z tkanek litych, komórki pochodzące z biopsji szpiku i komórki izolowane z płynów ustrojowych.
21. Zastosowanie czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem CD40 i CD40 do wytwarzania leku do zahamowania aktywacji przez ligand CD40 komórek niosących CD40 na powierzchni, przy czym komórki niosące CD40 są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego.
22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego są komórki mięśni gładkich przełyku, komórki mięśni gładkich żołądka, komórki mięśni gładkich jelita cienkiego albo grubego.
23. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że czynnik swoiście hamuje wiązanie ligandu CD40 z CD40 na komórkach mięśni gładkich.
24. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że czynnik swoiście wiąże się z epitopem, z którym swoiście wiąże się przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916.
25. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że czynnik swoiście wiąże się z CD40.
26. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że czynnik wybrany jest z grupy obejmującej: białka, nie-białka i związki peptydomimetyczne.
27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że białko obejmuje przeciwciało albo jego część.
188 408
28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że przeciwciało wybrane jest z grupy obejmującej przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane, przeciwciała prymatyzowane i przeciwciała, które obejmują region CDR od jednego człowieka i rusztowanie przeciwciała od innego człowieka.
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne jest przeciwciałem monoklonalnym 5c8 o nr dostępu ATCC HB 10916.
30. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, ze białko obejmuje rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo jego odmiany w tym konserwatywne zastąpienia, albo ich części albo rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40, albo jego odmiany obejmujące zastąpienia konserwatywne, albo ich części.
31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, ze rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy liganda CD40 albo CD40 jest monomerem albo oligomerem.
32. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, ze rozpuszczalny region zewnątrzkomórkowy CD40 albo jego część dalej obejmuje region Fc poddany fuzji z regionem zewnątrzkomórkowym CD40 albo jego częścią albo ligandem CD40 albo jego częścią
33. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że czynnik jest wybrany albo zaprojektowany przez optymalizację struktury wiodącego czynnika hamującego, w oparciu 0 trójwymiarową strukturę kompleksu rozpuszczalnego regionu zewnątrzkomórkowego ligandu CD40 albo jego części z wiodącym czynnikiem hamującym.
34. Zastosowanie według ząstrz. 21, znamienne tym, że czynnik swoiście hamuje aktywację komórek przez ligand CD40 komórek mięśni gładkich niosących CD40, które są związane z chorobą zależną od komórek mięśni gładkich.
35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, ze choroba zależna od komórek mięśni gładkich wybrana jest z grupy obejmującej: chorobę naczyniową, chorobę pęcherza moczowego i chorobę przewodu pokarmowego.
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, ze choroba przewodu pokarmowego wybrana jest z grupy obejmującej: ahalazję przełyku, chorobę zapalną jelita grubego i twardzinę.
37. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że chorobą naczyniową jest miażdżyca.
38. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, ze czynnik wybierany jest metodą przesiewową, która obejmuje:
(a) izolowanie próbki komórek mięśni gładkich, przy czym komórki mięśni gładkich są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego;
(b) hodowanie próbki w warunkach umożliwiających aktywację komórek mięśni gładkich w próbce, które są komórkami niosącymi CD40;
(c) kontaktowanie próbki z komórkami wyrażającymi białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo kontaktowanie próbki z białkiem swoiście rozpoznawanym przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, skutecznie aktywującym komórki niosące CD40;
(d) kontaktowanie próbki z czynnikiem w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek mięśni gładkich niosących CD40, jeżeli czymiik jest zdolny do zahamowania aktywacji zaleznej od CD40-CD40L komórek mięśni gładkich niosących CD40; i (e) określanie czy komórki wyrażające białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, czy białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, aktywuje komórki mięśni gładkich niosące CD40 w obecności czynnika.
39. Sposób selekcji czynnika zdolnego do zahamowania oddziaływania liganda CD40 na komórki mięśni gładkich przy czym komórki mięśni gładkich są komórkami mi^ęśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo
188 408 komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego niosącymi na powierzchni CD40, metodą przesiewową obejmującą etapy:
(a) izolowania próbki komórek mięśni gładkich, przy czym komórki mięśni gładkich są komórkami mięśni gładkich pęcherza moczowego, komórkami mięśni gładkich naczyń, komórkami mięśni gładkich aorty, komórkami mięśni gładkich naczyń wieńcowych, komórkami mięśni gładkich płuc albo komórkami mięśni gładkich przewodu pokarmowego;
(b) hodowania próbki w warunkach umożliwiających aktywację komórek mięśni gładkich w próbce, które są komórkami niosącymi CD40;
(c) kontaktowania próbki z komórkami wyrażającymi białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, albo kontaktowanie próbki z białkiem swoiście rozpoznawanym przez przeciwciało monoklonalne 5c8, wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, skutecznie aktywującym komórki niosące CD40;
(d) kontaktowania próbki z czynnikiem w ilości skutecznej do zahamowania aktywacji komórek mięśni gładkich niosących CD40, jeżeli czynnik jest zdolny do zahamowania aktywacji zależnej od CD40-CD40L komórek mięśni gładkich niosących CD40; i (e) określania czy komórki wyrażające białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, czy białko, które jest swoiście rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne 5c8 wytwarzane przez hybrydoma o numerze dostępu ATCC HB 10916, aktywują komórki mięśni gładkich niosące CD40 w obecności czynnika.
40. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, ze próbka komórek mięśni gładkich wybrana jest z grupy obejmującej: linie komórkowe w hodowli, komórki izolowane od zwierzęcia, komórki izolowane z tkanek litych, komórki pochodzące z biopsji szpiku i komórki izolowane z płynów ustrojowych.
41. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, ze próbka komórek mięśni gładkich wybrana jest z grupy obejmującej: linie komórkowe w hodowli, komórki izolowane od zwierzęcia, komórki izolowane z tkanek litych, komórki pochodzące z biopsji szpiku i komórki izolowane z płynów ustrojowych.
PL97331104A 1996-07-08 1997-07-03 Lecznicze zastosowanie technologii BAM (CD40L) doleczenia chorób dotyczących komórek mięśni gładkich PL188408B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67773096A 1996-07-08 1996-07-08
PCT/US1997/012925 WO1998001145A1 (en) 1996-07-08 1997-07-03 Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331104A1 PL331104A1 (en) 1999-06-21
PL188408B1 true PL188408B1 (pl) 2005-01-31

Family

ID=24719894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97331104A PL188408B1 (pl) 1996-07-08 1997-07-03 Lecznicze zastosowanie technologii BAM (CD40L) doleczenia chorób dotyczących komórek mięśni gładkich

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20030219437A1 (pl)
EP (1) EP0956030A4 (pl)
JP (1) JP2000515507A (pl)
CN (1) CN1242809C (pl)
AU (1) AU731299B2 (pl)
BG (1) BG63489B1 (pl)
BR (1) BR9710264A (pl)
CA (1) CA2259962C (pl)
CZ (1) CZ297300B6 (pl)
EA (1) EA004401B1 (pl)
EE (1) EE9900010A (pl)
HU (1) HUP9904669A3 (pl)
IL (1) IL127884A0 (pl)
IS (1) IS4935A (pl)
NO (1) NO990019L (pl)
NZ (1) NZ333602A (pl)
PL (1) PL188408B1 (pl)
SK (1) SK499A3 (pl)
TR (1) TR199900029T2 (pl)
WO (1) WO1998001145A1 (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6158501A (en) 2000-05-12 2001-11-26 Beth Israel Hospital Compositions and methods for achieving immune suppression
US20020173053A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-21 Bassam Damaj Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
UY32802A (es) * 2009-07-23 2011-01-31 Provimi Holding B V Composiciones para reducir la metanogénesis gastrointestinal en rumiantes
CA3022636A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Medimmune, Llc Cd40l-fc fusion polypeptides and methods of use thereof
CN110546164B (zh) * 2016-11-11 2023-10-20 锦湖Ht株式会社 特异性结合cd40的抗体及其用途
US11793854B2 (en) 2019-03-21 2023-10-24 Op-T Llc Methods for reducing symptoms of multiple sclerosis using a six-amino acid long peptide that inhibits CD40-CD150 interaction
US12048734B2 (en) 2020-04-17 2024-07-30 Op-T Llc Bioactive peptides and methods of use thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
CA2089229C (en) * 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6340459B1 (en) * 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US6822070B2 (en) * 1996-03-11 2004-11-23 David Baltimore Truncated CRAF1 inhibits CD40 signaling

Also Published As

Publication number Publication date
US20030219437A1 (en) 2003-11-27
BG103148A (en) 1999-10-29
EA004401B1 (ru) 2004-04-29
AU4229297A (en) 1998-02-02
JP2000515507A (ja) 2000-11-21
EP0956030A4 (en) 2001-11-28
AU731299B2 (en) 2001-03-29
CA2259962C (en) 2002-01-22
EE9900010A (et) 1999-06-15
IS4935A (is) 1998-12-23
NO990019L (no) 1999-03-08
US20080050369A1 (en) 2008-02-28
CZ297300B6 (cs) 2006-11-15
CN1242809C (zh) 2006-02-22
NZ333602A (en) 2000-06-23
BR9710264A (pt) 1999-08-10
HUP9904669A3 (en) 2001-06-28
CN1227494A (zh) 1999-09-01
WO1998001145A1 (en) 1998-01-15
CZ2699A3 (cs) 1999-05-12
IL127884A0 (en) 1999-10-28
HUP9904669A2 (hu) 2000-05-28
EP0956030A1 (en) 1999-11-17
TR199900029T2 (xx) 1999-04-21
NO990019D0 (no) 1999-01-04
SK499A3 (en) 1999-08-06
EA199900091A1 (ru) 1999-08-26
PL331104A1 (en) 1999-06-21
BG63489B1 (bg) 2002-03-29
CA2259962A1 (en) 1998-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2257247C (en) Novel protein binding to osteoclastogenesis inhibitory factor and process for producing the same
AU709550B2 (en) Thereapeutic applications for the anti-T-bam (CD40-L) monoclonal antibody 5c8
US20080050369A1 (en) Therapeutic applications of T-BAM (CD40L) technology to treat diseases involving smooth muscle cells
EP1261643A1 (en) Composition for inhibiting macrophage activity
KR100567998B1 (ko) 치료용 단백질 저해제 증후군에 대한 ｃｄ154 차단 요법
JP4713733B2 (ja) リンホトキシン（ｌｔ）経路のインヒビターを使用する濾胞性リンパ腫の処置
US20060088501A1 (en) Duffy antigen receptor for chemokines and use thereof
KR100478322B1 (ko) 평활근세포와관련된질병을치료하기위한t－bam(cd４０l)기법의치료적용도
CA2243531A1 (en) Therapeutic applications of t-bam (cd40-l) technology to treat inflammatory kidney diseases______________________________________
WO1997026000A9 (en) Therapeutic applications of t-bam (cd40-l) technology to treat inflammatory kidney diseases______________________________________
US20030099642A1 (en) Therapeutic applications for the anti-t-bam (cd40l) monoclonal antibody 5c8 in the treatment of vasculitis
MX2007004843A (es) Receptor de antigeno duffy para quimocinas y uso del mismo
MXPA98004342A (en) Therapeutic applications for the monoclonal antibody 5c8 anti-t-bam (cd40

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080703