SK499A3 - Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells - Google Patents

Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells Download PDF

Info

Publication number
SK499A3
SK499A3 SK4-99A SK499A SK499A3 SK 499 A3 SK499 A3 SK 499A3 SK 499 A SK499 A SK 499A SK 499 A3 SK499 A3 SK 499A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
smooth muscle
cells
muscle cells
protein
cd40l
Prior art date
Application number
SK4-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael J Yellin
Seth Lederman
Leonard Chess
Mihail N Karpusas
David W Thomas
Original Assignee
Univ Columbia
Biogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Columbia, Biogen Inc filed Critical Univ Columbia
Publication of SK499A3 publication Critical patent/SK499A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Description

Použitie činidla, ktoré inhibuje interakciu CD40 a ligandu na prípravu liečiva a spôsob selekcie takéhoto činidla
Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu inhibície aktivácie buniek hladkého svalstva, ktoré na svojom povrchu nesú CD40, ligandom CD40.
Doterajší stav techniky
CD40 je molekula vyskytujúca sa na bunkovom povrchu, je exprimovaná na celom rade a buniek a interaguje s príslušným protireceptorom CD4+ T buniek nazývaným CD40L (ligand CD40) s veľkosťou 30-33 kD, ktorý je indukovaný aktiváciou. Interakcie CD40L-CD40 sa široko študovali v bunkových interakciách T a B buniek a sú podstatné pre bunkovú diferenciáciu B bunky závislej na T bunke a tiež na produkciu IgG, IgA a IgE. CD40 sa tiež exprimuje na monocytoch, endotelových bunkách a fibroblastoch. Expresia CD40 na týchto bunkách je aktivovaná in vitro cytokínmi, najvýznamnejšie IFN-γ. Je zaujímavé, že štúdia in vivo dokázali výraze zvýšenú reguláciu expresie CD40 na miestach zápalu, ako je napr. Synoviálna membrána pri reumatoidnej artritíde alebo psoriatické ložiská. Štúdie in vitro využívajúce monoklonálne protilátky (mAb) anti-CD40 alebo bunky CD40L+ dokazujú, že CD40 je funkčne exprimovaný na monocytoch, dendritických bunkách, epitelových bunkách, endotelových bunkách a fibroblastoch.
Napríklad interakcie CD40L-CD40 indukujú monocyty, aby secernovali prozápalové cytokíny IL-Ia, IL-Ιβ, IL-6 a TNF-α a dendritické bunky, aby secernovali TNF-α. Interakcie CD40L-CD40 tiež podporujú monocyty a dendritické buky, aby secernovali chemokíny IL-8 a ΜΙΡΙα. Okrem toho, väzba CD40 zvyšuje produkciu IL-1 sprostredkovanú GM-CSF epitelovými bunkami týmusu. Navyše signály sprostredkované CD40L indukujú monocyty, aby secernovali
IL-10 a oxid dusnatý a zosilňujú produkciu IL-6 fibroblastmi. Fibroblasty tiež proliferujú po interakciách CD40L-CD40. A nakoniec endotelové bunky a fibroblasty aktivujú intercelulárne adhezívne molekuly po väzbe CD40.
Vaskulárne choroby, ako je ateroskleróza, sú liečené celým radom liekov, vrátane liekov znižujúci hladinu cholesterolu, beta-blokátorov, blokátorov vápnikového kanála a antikoagulačných liekov. Teraz sa ukazuje, že bunky hladkého svalstva sú schopné exprimovať CD40. To poskytuje základ na liečbu vaskulárnych chorôb inhibiciou interakcii medzi CD40 a ligandom CD40 (tiež známym ako T-BAM, 5c8 Ag, gp39 a TRAP) . Ďalšie choroby postihujúce hladké svalstvo sú tiež liečené inhibiciou interakcií CD40-CD40L.
Podstata vynálezu
Táto prihláška si nárokuje prioritu patentovej prihlášky Spojených Štátov č. 08/677 730, podanej 8. júla 1996, na ktorej obsah sa týmto odvolávame.
Predkladaný vynález vznikol s podporou vládnych grantov NIH č. K08-AR-01904, RO1-AI-28367, RO1-AI-14969, HL21006, HL42833, HL50629 a RO1-AI-14969 (Department of Health and Human Services). Teda vláda Spojených Štátov má na tento vynález určité práva.
V prihláške sú v zátvorkách uvádzané rôzne odkazy. Prínos týchto publikácií ja zahrnutý do prihlášky, aby bol úplnejšie opísaný doterajší stav techniky, ktorého sa prihláška týka. Úplné bibliografické údaje o týchto citovaných publikáciách je možné nájsť buď priamo v texte alebo sú uvedené na konci opisu v zozname pod príslušným číslom.
Predkladaný vynález poskytuje spôsob ako inhibovať aktiváciu buniek hladkého svalstva, ktoré na svojom povrchu zahrňuje kontakt buniek s prípravkom schopným inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, keď je prípravok prítomný v množstve, ktoré účinne inhibuje aktiváciu buniek.
Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob, ako inhibovať u pacienta aktiváciu buniek hladkého svalstva, ktoré na svojom povrchu nesú CD40 ligandom CD40, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie prípravku, ktorý je schopný inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, pacientovi a prípravok sa podáva v množstve účinnom na inhibíciu aktivácie buniek pacienta.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob liečenia pacienta s chorobou závislou na bunkách hladkého svalstva, tento spôsob zahrňuje podávanie prípravku, ktorý je schopný inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, pacientovi, v množstve účinnom inhibovať aktiváciu buniek u pacienta a tým je liečená choroba závislá na bunkách hladkého svalstva.
Podrobný opis vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje spôsob, ako inhibovať ligandom CD40 aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40 na svojom povrchu. Tento spôsob zahrňuje kontakt buniek s prípravkom schopným inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, pričom prípravok je prítomný v množstve, ktoré je účinné pre inhibíciu aktivácie buniek. V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu je prípravok schopný inhibovať akúkolvek interakciu medzi ligandom CD40 a CD40. Interakcia medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách sa týka jedného alebo viacerých aspektov, funkčných alebo štrukturálnych, vzájomného vzťahu CD40-ligand CD40. Preto sa môže v jednom uskutočnení prípravok, ktorý inhibuje interakciu, kompetitívne viazať na ligand CD40 tak, že blokuje alebo zmenšuje väzbu ligandu CD40 na bunkový CD40. V inom uskutočnení sa môže prípravok, ktorý inhibuje interakciu, spájať s CD40 alebo ligandom CD40 spôsobom, ktorý neinhibuje väzbu ligandu CD40 na bunkový CD40, ale ktorý má vplyv na bunkovú odpoveď na väzbu CD40, ako je zmena rýchlosti metabolického obehu bunkového CD40 alebo komplexu CD40prípravok, zmenou väzbovej kinetiky CD40 s ligandom CD40, alebo zmenou rýchlosti alebo rozsahu bunkovej aktivácie ako odpoveď na väzbu CD40.
V špecifickom uskutočnení predkladaného vynálezu bunky hladkého svalstva nesúce CD40 sú bunky hladkého svalstva močového mechúra, bunky hladkého svalstva ciev, bunky hladkého svalstva priedušiek, bunky hladkého svalstva aorty, bunky hladkého svalstva pľúcnych žíl alebo bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu. V špecifickejších uskutočneniach sú bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu bunky hladkého svalstva pašeráka, žalúdku alebo čriev, vrátane buniek hladkého svalstva tenkého alebo hrubého čreva.
V uskutočnení predkladaného vynálezu prípravok inhibuje väzbu ligandu CD40 na CD40 na bunkách.
V uskutočnení predkladaného vynálezu je prípravok proteín.
V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu je prípravok neproteínovej povahy. Termín neproteínový sa v tomto opise používa tak, že zahrňuje akékoľvek zlúčeniny alebo prípravky, ktoré obsahujú prvky iné ako jednoduché alebo konjugované polypeptidové reťazce. To zahrňuje prvky, ako sú aminokyseliny majúce iné ako peptidové väzby, neproteínové aminokyseliny, ako sú β, γ alebo δ aminokyseliny, aminokyseliny v D konfigurácii alebo iné neproteínové (ktoré nie sú bežnou súčasťou proteínov), aminokyseliny zahrňujúce homocysteín, homoserín, citrulin, ornitín, γ-aminomaslová kyselina, kanavalin, kyselina djekolová alebo β-kyanoalanín, monosacharidy, polysacharidy alebo ďalšie skupiny cukrov, mastných kyselín alebo skupiny lipidov, nukleotidov, minerálne skupiny alebo ďalšie neproteínové prvky.
V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu je prípravok peptidomimetická zlúčenina. Peptidomimetická zlúčenina môže byť aspoň čiastočne neprirodzená. Peptidomimetická zlúčenina môže byť malá molekula mimetika. Zlúčenina môže mať zvýšenú stabilitu, účinnosť, potenciál a biologickú dostupnosť danú mimetikom. Ďalej môže mať zlúčenina zvýšenú permeabilitu pre črevnú sliznicu. Zlúčenina sa môže pripraviť synteticky. Zlúčenina podľa predkladaného vynálezu môže zhrňovať L-, Dalebo aminokyseliny nevyskytujúce sa prirodzene, alfa-, alfadisubstituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselinu mliečnu (izoelektrický analóg alanínu). Peptidová kostra zlúčeniny môže mať aspoň jednu väzbu nahradenú PSI-[CH=CH] (Kempf a kol., Intl. J. Peptide and Prot. Res. 38, 273-241, 1991). Zlúčenina môže ďalej zahrňovať trifluorotyrozín, p-Clfenylalanín, p-Br-fenylalanín, poly-L-propargylglycín, poly-D,Lallylglycín alebo poly-L-allylglycín. V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu peptidomimetická zlúčenina, ktorá á biologickú aktivitu pre inhibíciu interakcie medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, môže mať väzbu, peptidovú kostru alebo aminokyselinovú zložku nahradenú vhodným mimetikom. Príklady aminokyselín nevyskytujúcich sa prirodzene, któré môžu byť vhodnými aminokyselinovými mimetikami, zahrňujú β-alanín, L-aaminomaslovú kyselinu, L-y-aminomaslovú kyselinu, L-aaminoizomaslovú kyselinu, L-e-aminokaprónovú kyselinu, 7aminoheptánovú kyselinu, L-asparágovú kyselinu, L-glutámovú kyselinu, cysteín (acetamidometyl), Ν-ε-Boc-N-a-CBZ-L-lyzín, Ν-εBoc-N-a-Fmoc-L-lyzín, L-metionínsulfón, L-norleucín, L-norvalín, N-a-Boc-N-ÔCBZ-L-ornitín, Ν-δ-Boc-N-a-CBZ-L-ornitín, Boc-p-nitroL-fenylalanín, Boc-hydroxyprolín, Boc-L-tioprolín (Blondelle,
S.E. a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38, 22802286, 1994, Pinilla, C. a kol., Peptide Science 37, 221-240, 1995).
V špecifickom uskutočnení predkladaného vynálezu proteín predstavuje protilátku alebo jej časť schopnú inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách. Protilátka je monoklonálna alebo polyklonálna protilátka. V špecifickejšom uskutočnení sa monoklonálna protilátka špecificky viaže na epitop, ku ktorému sa špecificky viaže monoklonálna protilátka 5c8 (prístupové č. ATCC HB 10916). Príklad takejto monoklonálnej protilátky je monoklonálna protilátka 5c8 (prístupové č. ATCC HB
10916). V ďalšom uskutočnení vynálezu sa protilátka špecificky viaže na CD40. Príklad protilátky anti-CD40 je monoklonálna myšacia anti-ľudská CD40, dostupná od Genzyme Customer Service (produkt č. 80-3701-01, Cambridge, MA, USA). V ďalších uskutočneniach vynálezu je monoklonálna protilátka, chimérická protilátka, primatizovaná protilátka, humanizovaná protilátka alebo protilátka, ktorá obsahuje oblasť CDR jedného človeka a protilátkovú kostru druhého človeka.
Pojmy chimérická, primatizovaná a humanizovaná protilátka a spôsoby ako takéto protilátky vytvárať, sú odborníkom dobre známe. Pozri napríklad publikáciu medzinárodnej prihlášky PCT č. WO 90/07861, publikovanú 26. júla 1990 (Queen a kol.) a Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029, 1989. Spôsoby prípravy primatizovaných protilátok sú opísané napríklad v medzinárodnej prihláške PCT č. WO . _/02108, zodpovedajúcej medzinárodnej prihláške č. PCT/US92/06194 (Idec Pharmaceuticals) a v publikácii Newman a kol. (Biotechnology 10, 1455-1460, 1992), ktoré sú zahrnuté v odkazoch tejto prihlášky.
Všeobecne humanizovaná protilátka je protilátka obsahujúca jednu alebo viac oblastí určujúcich komplementaritu (complementarity determining región, CDR) z protilátky inej ako ľudskej, ktoré sú funkčne spojené so segmentmi kostry (rámca) ľudskej protilátky. Voliteľne môžu byť prítomné ďalšie zvyšky spojené s protilátkou inou ako ľudského pôvodu. Typicky CDR iného ako ľudského pôvodu sú myšacie CDR. Všeobecne primatizovaná protilátka je protilátka obsahujúca jednu alebo viac oblastí určujúcich komplementaritu (CDR) z protilátky druhu iného ako primáta iného ako ľudského pôvodu, ktorá je funkčne spojená so segmentmi kostry protilátky primáta iného ako ľudského pôvodu. Voliteľne môžu byť prítomné ďalšie zvyšky spojené s druhom, z ktorého pochádza CDR. Typicky aspoň jeden ťažký reťazec alebo jeden ľahký reťazec protilátky obsahuje CDR druhu, ktorý nie je primát iného ako ľudského pôvodu. Typicky CDR sú ľudské CDR. Všeobecne chimérická protilátka je protilátka, ktorej ľahké alebo ťažké reťazce obsahujú úseky protilátok z rôznych druhov. Napríklad jeden alebo viac segmentov variabilnej (V) oblasti jedného druhu môžu byť spojené s jedným alebo viac segmentmi konštantnej (C) oblasti iných druhov. Typicky chimérická protilátka obsahuje segmenty variabilnej oblasti myši pripojené k segmentom Iudskej konštantnej oblasti, aj keď sa môžu použiť protilátky aj z ďalších druhov cicavcov.
Monoklonálna protilátka 5c8 je produkovaná hybridómovými bunkami, ktoré sa uložili 14. novembra 1991 v Americkej zbierke bunkových kultúr (American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive ,Rockville, Maryland 20852, USA) podľa Budapeštianskej zmluvy o medzinárodnom uznávaní uložení mikroorganizmov pre účely patentového riadenia. Hybridómu sa priradilo prístupové číslo ATCC HB 10916.
V špecifickom uskutočnení vynálezu časť protilátky obsahuje oblasť určujúcu komplementaritu alebo variabilnú oblasť ľahkého či ťažkého reťazca. V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu časť protilátky obsahuje Fab alebo protilátku jednoduchého reťazca. Protilátka jednoduchého reťazca je vytvorená z variabilných oblastí spojených proteínovými spojkami do jedného proteínového reťazca.
V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu proteín obsahuje rozpustnú extracelulárnu oblasť ligandu CD40 alebo jeho časť alebo jeho variant, schopný inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách alebo rozpustnú extracelulárnu oblasť CD40 alebo jeho časť alebo jeho variant, schopný inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách. V špecifickom uskutočnení vynálezu je rozpustná extracelulárna oblasť ligandu CD40 alebo CD40 monomér. V ďalšom uskutočnení je rozpustná extracelulárna oblasť CD40 oligomér.
Varianty sa môžu od prirodzene sa vyskytujúceho CD40 alebo ligandu CD40 líšiť v aminokyselinovej sekvencii alebo spôsoby, ktoré sa netýkajú sekvencie alebo platia obe možnosti. Varianty v aminokyselinovej sekvencii sú tvorené, keď je jedna alebo viac aminokyselín v prirodzene sa vyskytujúcom CD40 alebo ligandu CD40 nahradená odlišnou prirodzenou aminokyselinou, aminokyselinovým derivátom alebo aminokyselinou, ktorá sa prirodzene nevyskytuje. Mimoriadne výhodné varianty zahrňujú konkrétne prirodzene sa vyskytujúce CD40 alebo ligand CD40, alebo biologicky aktívne fragmenty prirodzene sa vyskytujúceho CD40 alebo ligandu CD40, ktorých sekvencie sa líšia od sekvencie divého typu substitúciami jednej alebo viacerých konzervatívnych aminokyselín, ktoré typicky majú minimálny vplyv na sekundárnu štruktúru a hydrofóbnu povahu proteínu alebo peptidu. Varianty môžu mať tiež sekvencie, ktoré sa líšia substitúciami jednej alebo viacerých nekonzervatívnych aminokyselín, deléciami alebo inzerciami, ktoré nerušia biologickú aktivitu CD40 alebo ligandu CD40. Konzervatívne substitúcie typicky zahrňujú substitúcie jednej aminokyseliny inou s podobnými vlastnosťami, ako sú substitúcie v nasledujúcich skupinách: valín, glycín; glycín, alanín; valín, izoleucín; kyselina asparágová, kyselina glutámová; asparagín, glutamín; serín, treonín; lýzín, arginín; a fenylalanín, tyrozín. Nepoláme (hydrofóbne) aminokyseliny zahrňujú alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryptofán a metionín, polárne neutrálne aminokyseliny zahrnujú glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Pozitívne nabité (bázické) aminokyseliny zahrňujú arginín, lyzín a histidín. Negatívne nabité (kyslé) aminokyseliny zahrnujú kyselinu asparágovú a kyselinu glutámovú.
Ďalšie konzervatívne substitúcie, ktoré sa môžu použiť, sú uvedené v tab. 1 a ešte ďalšie sú opísané Dayhoffom v Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).
Tabuľka 1
Zámeny konzervatívnych aminokyselín
Aminokyselinu kód možno nahradiť ľubovoľnou z:
Alanín A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginín R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagín A D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparágová D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cysteín C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, DThr
Glutamín Q D-Gln, AsnD-Asn, Glu, D-Glu, Asp, DAsp
Kyselina glutámová E D-Glu, D-Asp, Asp. Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycín G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Izoleucín I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucín L D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lyzín K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homoArg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Orn, DOrn
Metionín M D-Met, S-Me-Cys, íle, D-Ile, Leu, DLeu, Val, D-Val, Norleu
Fenylalanín F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, DHis, Trp, D-Trp, Trans 3,4 alebo 5fenylprolín, Cis 3, 4 alebo 5- fenylprolín
Prolín P D-Pro, L-I-tioazolidín-4-karboxylová kyselina, D- alebo L-l-0xazolidin-4karboxylová kyselina
Serín S D-Ser, Thr, D-Thr. Allo-Thr, Met, DMet. Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Treonín T D-Thr, Ser, D-Ser, Allo-Thr, Met, DMet, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrozín Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, DHis
Valín v D-Val, Leu, D-Leu, íle, D-Ile, Met, D-Met
Ďalšie varianty zlúčeniny podlá vynálezu sú také modifikácie, ktoré zvyšujú peptidovú stabilitu. Tieto varianty môžu obsahovať napríklad jednu alebo viac väzieb iných ako peptidových (ktoré nahrádzajú peptidové väzby) v peptidovej sekvencii. Patria sem tiež varianty, ktoré obsahujú zvyšky iných ako prirodzene sa vyskytujúcich L-aminokyselín, ako sú Daminokyseliny alebo neprirodzene sa vyskytujúce alebo syntetické aminokyseliny, ako sú β- alebo γ-aminokyseliny a cyklické varianty. Inkorporácia D- miesto a L-aminokyselín do polypeptidu môže zvýšiť jeho rezistenciu voči proteázam. Pozri napr. patent Spojených Štátov 5,219,990.
Peptidy podľa tohto vynálezu môžu byť tiež modifikované rôznymi zmenami, ako sú inzercie, delécie a substitúcie, buď konzervatívne alebo nekonzervatívne, tam, kde takéto zmeny môžu pri použití poskytnúť určité výhody.
V ďalších uskutočneniach môžu varianty so substitúciami aminokyselín, ktoré sú menej konzervatívne, tiež spôsobiť požadované deriváty, napr. spôsobením zmien v náboji, konformácii a ďalších biologických vlastnostiach. Takéto substitúcie by zahrňovali napríklad substitúcie hydrofilného zvyšku hydrofóbnym, substitúcia zvyšku cysteínu alebo prolínu iným zvyškom, substitúcia zvyšku majúceho malý bočný reťazec zvyškom majúcim rozsiahly bočný reťazec alebo substitúcia zvyšku majúceho čistý pozitívny náboj zvyškom majúcim čistý negatívny náboj. Ak sa nemôže výsledok danej substitúcie s istotu predpovedať, deriváty sa môžu ľahko testovať podlá spôsobov opísaných v tejto prihláške, aby sa určilo, či majú alebo nemajú požadované vlastnosti.
Varianty v rozsahu vynálezu zahrňujú proteíny a peptidy s aminokyselinovou sekvenciou, ktoré majú aspoň 80% homológie a extracelulárne oblasti CD40 alebo extracelulárne oblasti ligandu CD40. Výhodnejšie je sekvenčná homológia aspoň 90% alebo ešte výhodnejšie aspoň 95%.
Tak ako sa môžu nahradiť substituenty kostry, môžu sa tiež substituovať funkčné skupiny, ktoré rozširujú skelet, konkrétne skupinami charakterizovanými podobnými vlastnosťami. Tieto substitúcie budú spočiatku konzervatívne, t.j. náhradná skupina bude mať približne rovnakú veľkosť, tvar, hydrofobicitu a náboj ako pôvodná skupina. Nesekvenčné modifikácie môžu zahrňovať napríklad in vivo alebo in vitro chemické derivovanie časti prirodzene sa vyskytujúceho CD40 alebo ligandu CD40 a tiež zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii.
V ďalšom uskutočnení je proteín, zahrňujúci extracelulárnu oblasť ligandu CD40 a CD40, modifikovaný chemickými modifikáciami, v ktorých je zachovaná jeho aktivita. Napríklad proteíny sa môžu amidovať, sulfatovať, jednoducho alebo niekoľkonásobne halogenovať, alkylovať, karboxylovať alebo fosforylovať. Proteín sa môže tiež jednoducho alebo niekoľkonásobne acylovať, ako s acetylovou skupinou, so skupinou farnesylu alebo s mastnou kyselinou, ktorá môže byť nasýtená alebo jednonásobne alebo viacnásobne nenasýtená. Mastná kyselina môže byť tiež jednoducho alebo niekoľkonásobne fluorovaná. Vynález tiež zahrňuje metionínové analógy proteinu, napríklad sulfónové a sulfoxidové analógy metionínu. Vynález tiež zahrňuje soli proteínov, ako sú soli amóniové, vrátane alkylamóniových alebo arylamóniových soli a ďalej solí ako síran, hydrogénsíran, fosforečnan, hydrogénfosforečnan, dihydrogénfosforečnan, tiosíran, uhličitan, hydrogénuhličitan, benzoát, sulfonát, tiosulfonát, mezylát, etylsulfonát a benzénsulfonát.
Rozpustný monomérny proteín CD40-L môže obsahovať celú alebo časť extracelulárnej oblasti CD40-L. Extračelulárna oblasť CD40-L obsahuje doménu, ktorá sa viaže na CD40. Teda rozpustný CD40-L môže inhibovať interakciu medzi CD40L a bunkou nesúcou CD40. Tento vynález predpokladá, že SCD40-L (rozpustný CD40-L) môže tvoriť celú extracelulárnu oblasť CD40-L alebo fragment alebo derivát obsahujúci doménu, ktorá viaže CD40.
Rozpustný proteín CD40 (sCD40) obsahuje extracelulárnu oblasť CD40. sCD40 inhibuje interakciu medzi CD40L a bunkami nesúcimi CD40. sCD40 môže byť v monomérnej alebo oligomérnej forme.
V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu proteín, obsahujúci rozpustnú extracelulárnu oblasť CD40 alebo jej časť, ďalej obsahuje oblasť Fc fúzovanú k extracelulárnej oblasti CD40 alebo jeho časti. V špecifickom uskutočnení je oblasť Fc schopná väzby k proteínu A alebo proteínu G. V ďalšom uskutočnení oblasť Fc obsahuje IgG, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, AgAi, IgA2, IgM, IgD alebo IgE.
Rozpustný fúzny proteín CD40/Fc sa môže pripraviť s použitím zvyčajných techník enzýmového štiepenia a ligácie fragmentov so žiaducich sekvencií. Vhodné oblasti Fc pre fúzny proteín sú oblasti Fc, ktoré sa môžu viazať na proteín A alebo proteín G, alebo ktoré sú spôsobilé na to, aby boli rozpoznávané protilátkou, ktorá sa môže použiť pri purifikácii -alebo detekcii fúzneho proteínu obsahujúceho oblasť Fc. Napríklad oblasť Fc môže zahrňovať oblasť ľudského IgGx alebo myšacieho IgGi. Predkladaný vynález tiež poskytuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje fúzny proteín CD40/Fc.
Spôsob prípravy rozpustných foriem membránových molekúl rekombinantnými technikami, pri ktorých sú sekvencie kódujúce transmembránové a cytoplazmatické domény deletované, je dobre známy. Pozri všeobecne Hammonds a kol., patent USA č. 5,057,417. Okrem toho sú známe spôsoby prípravy fúzneho proteínu sCD40 a CD40/Fc. Pozri napr. medzinárodná prihláška PCT č. W093/08207 a
tiež Fanslow a kol ., Soluble I ľorms o f CD40 Inhibit Biológie
Responses of Human B Cells, J. Immunol., volume 149, ss. 655-
60, júl 1992.
V uskutočnení predkladaného vynálezu je prípravok vybraný
testovacou metódou.
V špecifickom uskutočnení vynálezu je prípravok vybraný
testovacou metódou, ktorá obsahuje izoláciu vzorky buniek, kultiváciu vzorky pri podmienkach umožňujúcich aktiváciu buniek nesúcich CD40, kontakt vzorky s bunkami exprimujúcimi proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové č. ATCC HB 10916 alebo s proteínom, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové číslo ATCC HB 10916, účinným aktivovať bunky nesúce CD40, kontakt vzorky s množstvom prípravku účinným inhibovať aktiváciu buniek nesúcich CD40, ak je prípravok schopný inhibovať aktiváciu buniek nesúcich CD40 a určenie, či bunky exprimujúce proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové č. ATCC HB10916 alebo s proteínom, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové č. ATCC HB 10916, aktivujú bunky nesúce CD40 v prítomnosti prípravku. Bunkový vzor sa môže izolovať z rôznych tkanív, vrátane bunkových línií v tkanivových kultúrach, alebo buniek izolovaných zo· zvieraťa, ako sú rozptýlené bunky z pevného tkaniva, bunky pochádzajúce z biopsie kostnej drene, alebo bunky izolované z telesnej tekutiny, ako je krv alebo lymfatická tekutina.
V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je prípravok (molekula) vybraná na základe trojrozmernej štruktúry rozpustnej extracelulárnej oblasti ligandu CD40 alebo jej časti schopnej inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách. Prípravok sa môže vybrať z knižnice známych prípravkov, modifikovať zo známeho prípravku na základe trojrozmernej štruktúry alebo navrhnúť a syntetizovať de novo na základe trojrozmernej štruktúry V špecifických uskutočneniach vynálezu je prípravok (molekula) navrhnutý štruktúrnou optimalizáciou základného (vedúceho) inhibičného prípravku na podklade trojrozmernej štruktúry komplexu rozpustnej extracelulárnej oblasti ligandu CD40 alebo jej časti so základným inhibičným prípravkom. Základný inhibičný prípravok je molekula, ktorá sa pozná tak, že ak je v kontakte s ligandom CD40, naviaže sa a vytvorí komplex s rozpustnou extracelulárnou oblasťou ligandu CD40, CD40 alebo jej časťou a tým znižuje schopnosť komplexného alebo naviazaného ligandu alebo časti ligandu CD40 aktivovať purifikoval difrakčných bunky nesúce CD40. V ďalšom uskutočnení vynálezu môže základný inhibičný prostriedok pôsobiť prostredníctvom interakcie buď s extracelulárnou oblasťou ligandu CD40, CD40 alebo v terciárnom komplexe tak s časťou ligandu CD40 ako aj s CD40 a tým znižovať schopnosť komplexu ligandu CD40-CD40 aktivovať bunky nesúce CD40. V spôsoboch podlá predkladaného vynálezu môže byť ligand CD40 buď rozpustný alebo naviazaný na bunky, ako sú aktivované T bunky a môže byť buď neskrátený natívny ligand CD40 alebo jeho časti. Znížená schopnosť aktivovať bunky nesúce CD40 sa môže merať rôznymi spôsobmi. Jeden spôsob, ako sa môže merať , je dokázať, že ligand CD40 v prítomnosti inhibítora spôsobí menší stupeň aktivácie buniek nesúcich CD40 v porovnaní s pôsobením množstva ligandu CD40 na bunky bez inhibítora pri podobných podmienkach. Znížená schopnosť aktivovať bunky nesúce CD40 môže byť tiež indikovaná vyššou koncentráciou komplexu inhibítorligand CD440, ktorá je vyžadovaná pre tvorbu podobného stupňa aktivácie buniek nesúcich CD40 pri porovnaní s nenaviazaným ligandom CD40 pri podobných podmienkach. V krajnom prípade môže byť ligand CD40 kontaktovaný inhibítorom neschopný aktivovať bunky nesúce CD40 v koncentráciách a pri podmienkach, ktoré umožňujú aktiváciu týchto buniek nenaviazaných ligandom alebo jeho danou časťou.
Prípravok (molekula) sa môže vybrať výpočtovou testovacou metódou na základe kryštalickej štruktúry rozpustného fragmentu extracelulárnej domény ľudského CD40L obsahujúceho zvyšky Glyn6L®U26i (sekvencia SEQ ID NO.: 1) (sCD40L 116-261).
Kryštalická štruktúra vhodná na použitie pri testovaní sa určila v rozlišovacej schopnosti 2 Ä metódou molekulovej náhrady. V skratke ide o to, že rozpustný fragment extracelulárnej domény ľudského ligandu CD40, obsahujúci aminokyselinové zvyšky Glyue až po zvyšok Leu26i na C-koncovej časti, sa prvý krát vytvoril v rozpustnej forme, potom a kryštalizoval. Kryštály sa použili na zber údajov. Nahradzovanie molekúl a upresňovanie sa uskutočňovalo s programami XPLOR a QUANTA (Molecular Simulations, Inc.). Konkrétne, skonštruoval sa trojrozmerný model ľudského SCD40L pomocou programu QUANTA modelujúceho proteínovú homológiu. Tento model sa použil ako sonda pre kalkulácie kryštalografickej analýzy a spresnil s použitím
XPLOR. Táto metóda určovania kryštalickej štruktúry SCD40L je detailnejšie opísaná v Karpusas a kol., 2 A crystal structure of an extracellular fragment of human CD40 ligand, Structure, 3(10), 1031-1039, október 1995. Atómové súradnice sCD40L (116216) sú v tejto prihláške uvedené na obrázkoch 2A-Y. Testovacia metóda na výber prípravku zahrňuje výpočtový návrh prípravku a opakovanú optimalizáciu štruktúry, ako bude opísané ďalej.
Prípravok môže byť inhibítor vybraný s použitím výpočtového návrhu prípravku. Pri použití tejto metódy sú použité súradnice kryštalickej štruktúry sCD40L ako vstup pre počítačový program ako je DOCK, ktorého výstupom je zoznam molekulových štruktúr, v ktorých sa očakáva väzba k CD40L- Použitie takýchto počítačových programov je odborníkovi dobre známe. Pozri napr. Kuntz, Structure-Based Strategies for drug design and discovery, Science, volume 257, s. 1078, 1992. Zoznam molekulových štruktúr sa môže potom testovať biochemickými testami na väzbu CD40L. Môžu sa použiť biochemické testy kompetitívneho typu, ktoré sú v odbore dobre známe. Pozri napr. Bajorath a kol., Identical of residues of CD40 and its ligand which are critical for the receptor-ligand interaction, Biochemistry, 34, s. 1833, 1995. Štruktúry, u ktorých sa zistilo, že sa viažu na CD40L, sa teda môžu použiť ako prípravky podlá predkladaného vynálezu. Prípravok sa môže tiež modifikovať alebo navrhnutá molekula inhibítora CD40L, nájdená z použitím vyššie uvedeného výpočtového prístupu alebo iného prístupu, spoločne kryštalizovaná s SCD40L a kryštalická štruktúra komplexu sa môže riešiť nahradzovaním molekúl. Informácia získaná prostredníctvom molekulového nahradzovania sa môže použiť na optimalizáciu štruktúry inhibítora tak, že vedie k objasneniu toho, ako molekuly interagujú s CD40L. Molekula sa môže modifikovať tak, aby sa zlepšili jej fyzikálnochemické vlastnosti, vrátane špecificity a afinity pre CD40L.
V uskutočnení tohto vynálezu je prípravok malá molekula. Malá molekula je v tomto opise vynálezu zlúčenina majúca molekulovú hmotnosť medzi 20 Da až lxlO6 Da, výhodne od 50 Da do 2 kDa.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob, ako inaktivovať aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40 na povrchu buniek ligandom CD40 u pacienta, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie pacientovi prípravku schopného inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, pričom prípravok je prítomný v množstve, ktoré účinne inhibuje aktiváciu buniek pacienta.
V špecifickom uskutočnení vynálezu bunky hladkého svalstva nesúce CD 40 sú bunky hladkého svalstva mechúra, bunky hladkého svalstva ciev, bunky hladkého svalstva priedušiek, bunky hladkého svalstva aorty, bunky hladkého svalstva koronárnych artérií, bunky hladkého svalstva pľúcnych žíl alebo bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu. V špecifickejších uskutočneniach vynálezu sú bunky hladkého svalstva, gastrointestinálneho traktu bunky hladkého svalstva pažeráka, žalúdka alebo čriev, vrátane buniek hladkého svalstva tenkého alebo hrubého čreva.
V uskutočnení predkladaného vynálezu prípravok inhibuje väzbu ligandu CD40 na CD40 na bunkách.
V uskutočnení predkladaného vynálezu je prípravok proteín. V ďalšom uskutočnení vynálezu je prípravok neproteínovej povahy.
V špecifickom uskutočnení vynálezu proteín zahrňuje protilátku alebo jej časť schopnú inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách. Protilátka je monoklonálna alebo polyklonálna. V špecifickejšom uskutočnení vynálezu sa monoklonálna protilátka špecificky viaže na epitop, ku ktorému sa špecificky viaže monoklonálna protilátka 5c8 (prístupové č. ATCC HB 10916). Príklad takejto monoklonálnej protilátky je monoklonálna protilátka 5c8 (prístupové č. ATCC HB 10916). V ďalších uskutočneniach vynálezu je monoklonálna protilátka chimérna alebo humanizovaná protilátka.
V špecifickom uskutočnení vynálezu časť protilátky obsahuje oblasť určujúcu komplementaritu alebo variabilnú oblasť ľahkého alebo ťažkého reťazca. V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu časť protilátky obsahuje oblasť určujúcu komplementaritu alebo variabilnú oblasť. V ďalšom špecifickom uskutočnení časť protilátky obsahuje Fab alebo jednoduchý reťazec protilátky.
V ďalšom uskutočnení vynálezu proteín obsahuje rozpustnú extracelulárnu oblasť ligandu CD40 alebo jeho časť schopnú inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách, alebo rozpustnú extracelulárnu oblasť CD40 alebo jeho časť schopnú inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách. V špecifickom uskutočnení vynálezu je rozpustná extracelulárna oblasť ligandu CD40 alebo CD40 monomér'. V ďalšom uskutočnení rozpustná extracelulárna oblasť CD40 je oligomér.
V ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu proteín obsahujúci rozpustnú extracelulárnu oblasť CD40 alebo jej časť ďalej obsahuje oblasť Fc fúzovanú k extracelulárnej oblasti CD40 alebo jej časti. V špecifickom uskutočnení vynálezu je oblasť Fc schopná väzby na proteín A alebo proteín G. V ďalšom uskutočnení oblasť Fc obsahuje IgG, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAi, IgA2, IgM, IgD alebo IgE.
Ak sú podávané, sú proteíny často rýchlo odstránené z obehu a môžu teda vyvolať iba relatívne krátkodobý farmakologický účinok. Následkom toho sa môžu vyžadovať pre udržanie liečebného účinku časté injekcie aktívnych proteínov. 0 pripojením vo vode polyetylénglykol, polypropylénglykolu, relatívne veľkých dávok proteínoch modifikovaných rozpustných polymérov, kolopolymérov polyetylénglykolu a karboxylmetylcelulózy, dextránu, biologicky kovalentným ako je polyvinylalkoholu, polyvinylpyrolidónu alebo polyprolínu, je známe, že majú podstatne dlhšie polčasy po intravenóznej injekcii v sére ako majú zodpovedajúce nemodifikované proteíny (Abuchowski a kol., v: Enzymes as Drugs, Holcenberg a kol., eds. Wiley-Interscience, New York, NY, 367-383, 1981, Anderson, W.F., Human Gene Therapy, Science, 256, 808-813, 1992, Newmark a kol., J. Appl. Biochem. 4, 185-189, 1982 a Katre a kol·., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487-1491, 1987). Takéto modifikácie môžu tiež zvýšiť rozpustnosť proteínu vo vodných roztokoch, eliminovať agregáciu, zvýšiť fyzikálnu a chemickú stabilitu proteínu a výrazne znížiť imunogénne a antigénne pôsobenie proteínu. Výsledkom je, že u takýchto adičných zlúčenín polymérproteín sa dosiahne požadovaná biologická aktivita in vivo menej častým podávaním alebo v nižších dávkach ako pri použití nemodifikovaného proteínu.
Pripojenie polyetylénglykolu (PEG) k proteínom je užitočné mimoriadne preto, že PEG je pre cicavce veľmi málo toxický (Carpenter a kol., 1971). Napríklad adičná zlúčenina PEGadenozíndeamináza sa v Spojených Štátoch schválila na použitie pre ľudí na liečbu vážneho kombinovaného imunodeficientného syndrómu. Druhá výhoda poskytnutá konjugáciou PEG je, že účinne znižuje imunogénne a antigénne pôsobenie heterologických proteínov. Napríklad adičná zlúčenina PEG-ľudský protein sa môže použiť na liečenie choroby u ďalších druhov cicavcov bez rizika vyvolania vážnej imunitnej odpovede. V jednom uskutočnení tohto vynálezu sa môže protein podávať v mikropuzdre (microencapsulation device) aby sa znížilo riziko alebo zabránilo imunitnej odpovedi hostiteľa proti proteínu. Protein sa môže tiež podávať v membránovom mikropuzdre ako je lipozóm.
Polyméry, ako je PEG, sa môžu pohodlne pripojiť k jednému alebo viacerým reaktívnym aminokyselinovým zvyškom v proteíne, ako je napríklad α-aminoskupina aminokyseliny N-koncovej časti, ε-aminoskupiny lyzínových bočných reťazcov, sulfhydrylové skupiny cysteínových bočných reťazcov, karboxylové skupiny asparagylových a glutamylových bočných reťazcov, a-karboxylová skupina aminokyseliny C-koncovej časti, tyrozínové bočné reťazce alebo aktivované deriváty glykozylových reťazcov pripojené k určitým asparagínovým, serínovým alebo treonínovým zvyškom.
Opísalo sa množstvo aktivovaných foriem PEG vhodných na priamu reakciu s proteínmi. Použiteľné PEG reagencie na reakciu s proteínovými aminoskupinami zahrňujú aktívne estery karboxylovej kyseliny alebo uhličitanové deriváty, konkrétne tie, v ktorých východiskové skupiny sú N-hydroxylsukcínimid, pnitrofenol, imidazol alebo l-hydrozy-2-nitrobenzén-4-sulfonát. Deriváty PEG obsahujúce maleimidové alebo haloacetylové skupiny sú použiteľné reagencie na modifikáciu proteínových voľných sulfhydrylových skupín. Podobne PEG reagencie obsahujúce aminohydrazínové alebo hydrazínové skupiny sú použiteľné na reakciu s aldehydmi vzniknutými jodistanovou oxidáciou uhličitanových skupín v proteínoch.
Subjekt, ktorý sa môže liečiť opísanými spôsobmi, je živočích. Vhodne je živočích cicavec. Príklady cicavcov, ktoré sa môžu liečiť zahrňujú ale nie sú obmedzené na ľudí, primáty iného ako ľudského pôvodu, hlodavce (vrátane potkanov, myší, škrečkov a morčiat), kravu, koňa, ovcu, kozu, prasa, psa a mačku.
V uskutočnení vynálezu je prípravok vybraný testovacou metódou.
V špecifickom uskutočnení vynálezu je prípravok vybraný testovacou metódou, ktorá obsahuje izoláciu vzorky buniek, kultiváciu vzorky pri podmienkach umožňujúcich aktiváciu buniek nesúcich CD40, kontakt vzorky s bunkami exprimujúcimi proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové č. ATCC HB 10916 alebo s proteínom, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové č. ATCC HB 10916, účinným aktivovať bunky nesúce CD40, kontakt vzorky s množstvom prípravku účinným inhibovať aktiváciu buniek nesúcich CD40, ak je prípravok schopný inhibovať aktiváciu buniek nesúcich CD40 a určenie, či bunky exprimujúce proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom majúcim prístupové č. ATCC HB 10916, aktivujú bunky nesúce CD40 v prítomnosti prípravku. Vzorka buniek sa môže izolovať z rôznych tkanív, vrátane bunkových línií v tkanivových kultúrach alebo buniek izolovaných zo zvieraťa, ako sú rozptýlené bunky z pevného tkaniva, bunky pochádzajúce z biopsie kostnej drene, alebo bunky izolované z telesnej tekutiny, ako je krv alebo lymfatická tekutina.
V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je molekula (prípravok) vybraný na základe trojrozmernej štruktúry rozpustnej extracelulárnej oblasti ligandu CD40 alebo jej časti schopnej inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách. Molekula sa môže vybrať z knižnice známych molekúl, modifikovať zo známej molekuly na základe trojrozmernej štruktúry alebo navrhnúť a syntetizovať de novo na základe trojrozmernej štruktúry. V špecifických uskutočneniach vynálezu sú prípravok alebo molekula navrhnuté štruktúrnou optimalizáciou základného inhibičného prípravku na základe trojrozmernej štruktúry komplexu rozpustnej extracelulárnej oblasti ligandu CD40 alebo jeho časti so základným inhibičným prípravkom.
Spôsob liečenia
Predkladaný vynález poskytuje spôsob liečenia choroby závislej na bunkách hladkého svalstva u subjektu. Spôsob liečenia obsahuje vyššie opísaný spôsob, ako inhibovať aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40 na svojom povrchu ligandom CD40, čo spočíva v podávaní prípravku schopného inhibovať interakciu medzi ligandom CD40 a CD40 na bunkách subjektu, pričom prípravok sa podáva v množstve, ktoré účinne inhibuje aktiváciu buniek v subjekte.
V uskutočnení vynálezu je chorobou závislou na bunkách hladkého svalstva cievna choroba. V špecifickom uskutočnení vynálezu je cievna choroba ateroskleróza.
V ďalšom uskutočnení vynálezu je choroba závislá na bunkách hladkého svalstva choroba gastrointestinálneho traktu. V špecifickom uskutočnení vynálezu je choroba gastrointestinálneho traktu vybraná zo skupiny obsahujúcej poruchy motility pažeráka, zápalové črevné choroby a sklerodermie.
V uskutočnení vynálezu je choroba závislá bunkách hladkého svalstva ochorenie mechúra.
Zlúčeniny podía predkladaného vynálezu môžu byť podávané akýmkoľvek spôsobom, ktorý je lekársky prijateľný. To môže zahrňovať injekcie parenterálnymi cestami, ako je intravenózna, intravaskulárna, intraarteriálna, subkutánna, intramuskulárna, intraperitoneálna, intraventrikulárna, alebo ďalšie a tiež perorálna, nazálna, oftalmická, topická alebo inhalačná. Podávanie s predĺženým uvoľňovaním je vo vynáleze tiež špecificky zahrnuté spôsobom ako sú depotné injekcie rozpadavých implantátov aplikovaných priamo počas chirurgického výkonu.
intratumorová, intraepidurálna
Zlúčeniny sú podávané v akejkoľvek dávke na kg telesnej hmotnosti a pri akejkoľvek početnosti dávkovania, aké sú lekársky prijatelné. Prijateľné dávkovanie zahrňuje rozsah medzi 0,01 až 200 mg/kg telesnej hmotnosti pacienta. Výhodný rozsah dávkovania je medzi 0,1 až 50 mg/kg. Mimoriadne výhodná je dávka medzi asi 1 až 30 mg/kg. Dávkovanie sa opakuje v intervaloch v rozsahu od každý deň po každý druhý mesiac. Jeden výhodný dávkovací režim je podávanie zlúčeniny vynálezu denne tri dni liečenia, po ktorých je zlúčenina podávaná každé tri týždne, pričom každé podávanie je intravenózne v dávke 5 alebo 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Ďalší výhodný režim je podávanie zlúčeniny podľa vynálezu denne intravenózne v dávke 5 mg/kg telesnej hmotnosti počas prvých troch dní liečby, po ktorých je zlúčenina podávaná subjektu subkutánne alebo intrámuskulárne každý týždeň v dávke 10 mg. Ďalší výhodný režim je podávanie jednej dávky zlúčeniny vynálezu parenterálne v dávke 20 mg/kg telesnej hmotnosti, čo je nasledované podávaním zlúčeniny subjektu subkutánne alebo int rámus kulárne každý týždeň v dávke 10 mg.
Zlúčeniny podía vynálezu sa môžu podávať ako jedna dávka pre určité indikácie, ako je prevencia imunitnej odpovede na antigén, ktorému je subjekt vystavený krátky čas, napr. exogénny antigén, podaný jedene deň liečby. Príklady antigénov by zahrňovali spoločné podávanie zlúčeniny vynálezu spolu s vektorom génovej terapie alebo liečebným prípravkom, ako je antigénny farmaceutický alebo krvný produkt. V indikáciách, kde je antigén prítomný chronicky, ako je kontrola imunitnej reakcie na transplantované tkanivo alebo na chronicky podávané antigénne liečivá, sú zlúčeniny vynálezu podávané v intervaloch tak dlhý čas, ako je lekársky indikované, v rozsahu dní alebo týždňov až do konca života.
Zápalové odpovede sú charakterizované začervenaním, opuchom teplotou a bolesťou, ako následky kapilárnej dilatácie s opuchom a migráciou fagocytujúcich leukocytov. Zápal je ďalej definovaný Gallinom (kapitola 26, Fundamental Immunology, 2. Vyd., Raven Press, New York, s. 721-733, 1989), čo je zahrnuté v odkazoch.
Pre lepšie porozumenie vynálezu uvádzame v 'nasledujúcich príkladoch rad experimentálnych detailov. Avšak odborníkovi je zrejmé, že uvádzané špecifické metódy a výsledky iba ilustrujú vynález, ktorý je úplne opísaný v patentových nárokoch, ktoré potom nasledujú.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1A: Analýza pokojových buniek hladkého svalstva ľudskej aorty pomocou prietokovej cytometrie (FACS). Bodkovaná čiara predstavuje izotypovú kontrolnú protilátku, prerušovaná čiara predstavuje anti-CD54 mAb a plná čiara predstavuje antiCD40 mAb. Tento obrázok ukazuje, že bunky hladkého svalstva neexprimujú konštitutívne CD40.
Obrázok 1B: FACS analýza buniek hladkého svalstva ľudskej aorty v prítomnosti IFN-γ (1000 U/cm3) po 72 hodinách tkanivovej kultúry. Tento obrázok ukazuje aktiváciu expresie CD40 bunkami hladkého svalstva ako odpoveď na IFN-γ.
Obrázok 1C: FACS analýza buniek hladkého svalstva ľudskej aorty v prítomnosti IL-la (1 ng/cm3) po 72 hodinách tkanivovej kultúry. Aktivácia expresie CD40 bunkami hladkého svalstva sa nepozorovala.
Obrázok 1D: FACS analýza buniek hladkého svalstva ľudskej aorty v prítomnosti TNF-a (200 U/cm3) po 72 hodinách tkanivovej kultúry. Aktivácia expresie CD40 bunkami hladkého svalstva sa nepozorovala.
Obrázky 2A až 2Y: Súradnice atomárnej kryštalickej štruktúry rozpustného extracelulárneho fragmentu ľudského CD40L obsahujúceho zvyšky Glyn6-Leu26i (vo formáte podľa Brookhaven Protein Data Bank (pozri sekvencia SEQ ID NO.: 1).
Obrázky 3A a 3B: CD40 je exprimovaný in situ na bunkách hladkého svalstva a makrofágoch v léziách aterosklerózy po transplantácii. Ukázané sú mikrofotografie štúdií dvojfarebnej imunohistochemickej štúdie ukazujúce expresiu CD40 (hnedé označenie) na bunkách hladkého svalstva (červené označenie) na obrázku 3A a makrofágov (červené označenie) na obrázku 3B u pacienta s aterosklerózou po transplantácii.
Obrázky 4A a 4B: Normálna koronárna artéria pacienta s idiopatickou kardiomyopatiou, zafarbené hematoxylínom a eozínom (obr. 4A) a mAb anti-CD40 (obr. 4B).
Obr. 4A: Stojí za pozornosť neprítomnosť zhrubnutia intimy alebo zápalového infiltrátu.
Obr. 4B.: Expresia CD40 je obmedzená na endotelové bunky ohraničujúce vaskulárny lúmen. Žiadna reaktivita s izotypovou špecifickou kontrolnou mAb nebola (neuvedené) (Obr. 4A, obr. 4B x25) .
Obrázky 5A a 5B: Fibroateromatózne pláty v koronárnej artérii pacienta s ischemickou kardiomyopatiou zafarbené hematoxylínom a eozínom (obr. 5A) a mAb anti-CD40 (obr. 5B).
Obrázky 6A až 6C: Skorá intimálna lézia bohatá na penové bunky u pacienta s ischemickou chorobou srdca po transplantácii srdca (TCAD) zafarbená hematoxylínom a eozínom (obr. 6A) a mAb anti-CD40 (obr. 6B, obr. 6C) .
Obr. 6A: Intimálna lézia početnej penovej bunky, makrofágy a bunky hladkého svalstva.
Obr. 6B: CD40 je silno exprimovaná na mnohých bunkách intimy v tejto skorej lézii u TCAD.
Obr. 6C: konkrétne penové bunky ukazovali bohaté značenie na CD40 (Obr. 6A x25, obr. 6B x50, obr. 6C x400).
Obrázky 7A až 7D: Zápalový infiltrát prítomný vo fibróznom kryte intimálnej lézie u natívnej CA značený mAb anti-CD40L (obr. 7A) , kontrolnou mAb (obr. 7B), mAb anti CD4 (obr. 7C) a mAb anti-CD8 (obr. 7D) .
Obr. 7A: Charakteristická imunoreaktivita a imunoreaktivita bunkového povrchu pre CD40L, ktorá je obmedzená na lymfocyty.
Obr. 7B: Rovnaká lézia označená kontrolnou mAb irelevantného súhlasného izotypu nemala žiadne imunologické značenie.
Obr. 7C: Fakticky všetky lymfocyty v natívnych CA léziách (a tiež mnoho makrofágov a penových buniek) boli CD4+, čo svedčí o tom, že CD40L+ lymfocyty sú CD4+ T bunky.
Obr. 7D: CD8+ T bunky sú v intimálnych plakoch natívne CA ojedinelé (Obr. 7A, 7B x 1000, obr. 7C, 7D x400).
Obrázky 8A a 8B: Hlboké intimálne lymfoidné agregáty v TCAD značené mAb anti-CD40L (obr. 8A), kontrolná mAb (obr. 8A) a mAb anti-CD4 (obr. 8C).
Obr. 8A: Väčšina CD40L+ buniek u TCAD (šípky) sa našla v lymfoidných agregátoch v intime a ďaleko od endotelového povrchu.
Obr. 8B: V týchto intimálnych lymfoidných agregátoch neukazovala kontrolná mAb irelevantného súhlasného izotypu žiadne bunkové značenie.
Obr. 8C: Tie isté intimálne lymfoidné agregáty ako vyššie obsahovali takmer výhradne CD4+ T bunky, čo svedčí o tom, že CD40L je v týchto léziách exprimovaný na CD4+ T bunkách (obr. 8A8C x400).
Obrázky 9A a 9B: Ložisko zápalu endotelu (endotelitis) v TCAD značené mAb anti-CD8 (obr. 9A) a anti-CD40L (obr. 9B).
Obr. 9A: CD8+ T bunky prichytené k endotelovým bunkám lumina v TCAD charakteristické pre zápal endotelu. Väčšina CD8+ T buniek bola prítomná v ložiskách zápalu endotelu, pokým v intimálnych lymfoidných agregátoch ďaleko od endotelového povrchu boli ojedinelé.
Obr. 9B: zápalové bunky v ložiskách zápalu endotelu sú CD40L+. Podobne nebola na endotelových bunkách detegovaná expresia CD40L (Obr. 9A-9B x400) .
Obrázky 10A a 10B:
Obr. 10A: dvojité imunologické značenie intimálnej lézie v natívnej CA s mAb anti-CD40 (hnedá) a mAb anti-CD68 (červená), marker pre makrofágy. Centrálny zhluk buniek (šípky) ukazuje silné značenie pre CD40 a CD68.
Obr. 10B: dvojité imunologické značenie TCAD s mAb antiCD40 (hnedá) a proti aktínu hladkého svalstva (červená) ukazuje bunky hladkého svalstva CD40+ (šípky). Reaktivita CD40 je obmedzená na bunky hladkého svalstva intimy (šípky), pokým myocyty medie boli CD40 (obr. 10A-B x400).
Obrázky 11A až 11D: Sériové rezy natívnej CA demonštrujúce intimálnu neovaskurizáciu a označené s mAb anti-CD34 (obr. 11A), anti-CD40 (obr. 11B), anti-ICAM-1 (obr. 11C) a anti-VCAM-1 (obr. 11D) .
Obr. 11A: Endotelové bunky novovytvorených ciev intimy zdôraznenej značením na CD34.
Obr. 11B: Endotelové bunky intimálnej neovaskularizácie silne exprimujú CD40. Susedné zápalové bunky sú tiež značené CD40.
Obr. 11C a 11D: Ložiská neovaskularizácie tiež ukazujú silnú reaktivitu endotelu pre ICAM-1 (obr. 11C) a VCAM-1 (obr. 11D) (obr. 11A-11D x400).
Obrázky 12A až 12C: Dvojité imunologické značenie aktívne zapálenej intimálnej lézie natívnej CA s mAb anti-CD40 (hnedá) a mAb proti adhezívnym molekulám (červená) anti-ICAM-1 (obr. 12A) , anti-VCAM-1 (obr. 12B) a irelevantné kontrolné mAb (obr. 12C).
Obr. 12A: V podstate všetky CD40+ (hnedá) bunky, prevažne makrofágy (dlhé šípky) a myocyty intimy (krátke šípky) sú reaktívne na ICAM-1 (červená).
Obr. 12B: Velký počet CD40+ (hnedá) zápalových buniek a myocytov intimy (šípky) sú tiež reaktívne na VCAM-1 (červená).
Obr. 12C: Tie isté intimálne dvojito značené na CD40 (hnedá) a irelevantná kontrolná Ab súhlasného izotypu nahradzujúca mAb anti-ICAM-1 a anti-VCAM-1 (červená). Môže sa rozoznať iba hnedé a nie červené značenie, čo naznačuje neprítomnosť interferencie detekčnej techniky pre postupne aplikované mAb anti-CD40 a anti-ICAM alebo anti-VCAM (podrobnejšie pozri Materiál a metódy) (obr. 12A-Cx400).
Obrázok 13: Dvojité imunologické značenie intimálnej lezie natívnej CA s mAb anti-p65 značiace aktivovaný NF-κΒ (hnedá) a CD40 (červená). Aktivovaný NF-κΒ sa rozpoznal výhradne v jadrách buniek CD40+ (šípky), väčšina z nich sú makrofágy (x400).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklady 1 a 2
Ďalej uvedené príklady 1 a 2 demonštrujú,, že zápalové cytokíny vyvolávajú v bunkách hladkého svalstva expresiu CD40. Okrem toho dokazujú, že signály sprostredkované CD40L regulujú funkcie hladkého svalstva.
Príklad 1
Aby sa zistilo, či bunky hladkého svalstva exprimujú CD40, použila sa analýza FACS. NA 6 jamkových doštičkách sa kultivovali bunky hladkého svalstva ľudskej aorty v živnom médiu M199 doplnenom 25% FCS, 5% ľudským sérom, heparínom 90 pg/ml, rastovým faktorom endotelových buniek 15 gg/ml a 1% penicilínomstreptomycínom. Médiá sa menili každé 2-3 dni a keď bunky boli blízko konfluencie, pestovali sa 72 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti IFN-γ (1000 U/cm3) , IL-la (1 ng/cm3) alebo TNF-a (200 U/cm3) . Bunky sa zbierali opracovaním trypsín-EDTA a expresia CD40 sa určovala analýzou FACS pomocou mAb anti-CD40 G28.5. Bunky sa tiež označili izotypovou negatívnou kontrolnou mAb a ako pozitívna kontrola sa použila mAb anti-CD54 (ICAM-1).
Bunky hladkého svalstva neexprimujú konštitutívne CD40, ako je uvedené na obrázku 1A. Avšak IFN-γ na rozdiel od IL-Ια alebo
TNF-α vyvoláva expresiu CD40 bunkami hladkého svalstva (obrázky ΙΑ, 1B a 1C). Tieto štúdie dokazujú, že IFN-γ vyvoláva expresiu CD40 na bunkách hladkého svalstva ľudskej aorty.
Príklad 2
Expresia CD40 na bunke hladkého svalstva sa skúmala in situ. Bunky nájdené v médiu normálnych ciev, ktoré sú morfologicky podobné bunkám hladkého svalstva, nereagujú s mAb anti-CD40. Avšak bunky, ktoré sa morfologicky podobajú bunkám hladkého svalstva, nájdené v zápalových léziách pri akcelerovanej aterozkleróze po transplantácii, exprimujú CD40 in situ. Tieto štúdie svedčia o tom, že zápalové cytokíny indukujú bunky hladkého svalstva, aby exprimovali CD40. Okrem toho tieto štúdie dokazujú, že signály sprostredkované GD40Ľ regulujú funkcie hladkého svalstva.
Príklad 3
CD40L* CD4+ bunky a CD40+ cieľové bunky sú prítomné pri ateroskleróze a ischemickej chorobe srdca po transplantácii srdca.
Aktivované endotelové bunky (EC), makrofágy (Mac) a CD4+ T bunky sú prítomné v léziách koronárnej aterosklerózy (CA) a aterosklerózy po transplantácii srdca (TA) . Pretože CD40L je CD4+ povrchová molekula T bunky indukovaná aktiváciou, ktorá prenáša aktivačné signály závislé na kontakte CD40+ cieľovým bunkám, vrátane EC (vyvolaná expresia ICAM, VCAM a E-selektínu) a Mac (indukuje tvorbu NO, TNF-α a IL-1), skúmali sme in situ expresiu CD40L a CD40 pri CA (n=5) a TA (n=5) . Expresia CD40L a CD40 sa určovala s použitím mAb anti-CD40L 5c8, mAb anti-CD40 G28.5 alebo príslušných kontrolných mAb. Zmrazené rezy normálnych koronárnych artérií (n=3) neobsahujú T bunky a expresia CD40 je obmedzená na EC. Na rozdiel od toho lézie spojené s CA a TA obsahujú CD40L+ CD4+ T bunky, ako sa určilo imunologickým značením sériových rezov. Okrem toho expresia CD40 na zmrazených rezoch od pacientov s CA a TA je výrazne na EC, infiltrujúcich mononukleárnych bunkách, penových bunkách a bunkách hladkého svalstva intimy (SMC). Dvojfarebná imunohistochemická analýza (t.j. s dvojitým značením) tkaniva fixovaného v parafíne s použitím špecifických markerov pre SMC (aktín hladkého svalstva) alebo Mac (HAM-56) potvrdila expresiu CD40 na týchto bunkách a SMC medie sú CD40, čo potvrdzuje to, že miestne zápalové mediátory vyvolávajú expresiu CD40 na SMC in vivo. Aktivácia CD40 a CD40L* CD4+ T buniek sa zistila vo všetkých štádiách TA a bola najviditeľnejšia v skorých léziách CA, vrátane lipidových pásikov. Tieto štúdie súhrnne potvrdzujú to, že CD40L+ T bunky môžu interagovať s CD40+ cieľovými bunkami pri CA a TA a prispieť k patogenéze týchto chorôb podporovaním tvorby protizápalových molekúl.
Príklad 4
CD40 je exprimovaný na bunkách hladkého svalstva a makrofagoch v léziách aterosklerózy po transplantácii
Expresia CD40 in situ pri natívnej ateroskleróze alebo ateroskleróze po transplantácii sa študovala dvojfarebnou imunohistochemickou analýzou. Štúdie s dvojitým imunohistochemickým značením sa uskutočňovali na koronárnych artériách, ktoré sa fixovali v 10% pufrovanom formalíne a zaliali sa parafínom. Parafín sa z rezov odstránil xylénom, rezy sa hydratovali a endogénna peroxidáza sa utlmila s 1,5% H2O2 v 80% alkohole. Rezy sa potom opracovali s 0,01% pepsínom v HC1 (pH 1,5) 15 minút pri 37 °C. Potom sa rezy prepláchli s PBS a inkubovali s 10% konským sérom 20 minút, aby sa blokovalo nešpecifické značenie. Potom sa detegovalo anti-CD40 značenie pomocou súpravy Vector ABC Elite Kit (Vector) používajúcej postupne biotinylovanú sekundárnu protilátku, komplex avidínperoxidáza a ako vývoj ku 3,3'-diaminobenzidín. Výskyt CD40 sa pozoroval ako hnedé značenie. Potom sa rezy opláchli s PBS a opäť blokovali 10% konským sérom. Rezy sa potom inkubovali 1 hodinu s mAb špecifickou pre bunky hladkého svalstva aktín hladkého svalstva) alebo pre makrofágy (HAM 56). Primárne protilátky sa potom konjugovali s alkalickou fosfatázou s použitím systému avidín-biotín (Vector). Na detekciu aktivity alkalickej fosfatázy sa použil vektor Red (Vector) a reakcia poskytla červené značenie. Preto dvojito značené bunky mali hnedé (CD40) a červené (bunky hladkého svalstva alebo makrofágy) značenie. Na kontrolu interferencie medzi týmito dvoma imuhistohemickými postupmi použitými na analýzu dvojitým značením sa sériové rezy každej vzorky značili tiež buď na CD40 aktín hladkého svalstva alebo HAM 56. Pozri obrázky 3A a 3B. Kontrolné rezy mali rovnakú distribúciu imunoreaktivity pre každú z primárnych mAb ako dvojito označené rezy.
Príklad 5
Distribúcia CD40L a CD40 pri natívnej koronárnej ateroskleróze a ischemickej chorobe srdca po transplantácii srdca: korelácia expresie CD40 s výskytom intercelulárnych adhezívnych molekúl, aktivovaného NF-κΒ a výskytom T lymfocytov.
T bunky hrajú úlohu v patogenéze natívnej koronárnej aterosklerózy (CA) a ischemickej choroby srdca po transplantácii srdca (TCAD), avšak mechanizmus, ktorým T bunky interagujú s ďalšími bunkami v týchto léziách, nie je úplne známy. CD40L je povrchová molekula CD4+ T bunky indukovaná aktiváciou, ktorá interaguje s CD40+ cielovými bunkami, vrátane makrofágov a endotelových buniek a indukuje tvorbu prozápalových molekúl, vrátane ICAM-1 a VCAM-1. Okrem toho je známe, že väzba CD40 aktivuje transkripčný faktor NF-κΒ. Aby sa zistilo, či interakcia CD40L-CD40 môžu hrať úlohu v patogenéze CA alebo TCAD, uskutočňovala sa imunohistochemická štúdia expresie CD40L a CD40 na zmrazených rezoch koronárnych artérií získaných z príjemcov srdcového aloštepu s CA (n=10) alebo TCAD (n=9). S použitím dvoch rôznych mAb anti-CD40L sa zistilo, že expresia CD40L bola pri CA a TCAD obmedzená na infiltrujúce lymfocyty. Expresia CD40 bola výrazne aktivovaná na endotelových bunkách intimy, penových bunkách, makrofágoch a bunkách hladkého svalstva pri obidvoch chorobách. Dvojité imunologické značenie dokázalo, že mnoho CD40+ buniek exprimovalo spoločne ICAM-1, VCAM-1 alebo aktivovanú formu NF-κΒ. Rozsah expresie CD40, ICAM-1 a VCAM-1 mal štatisticky významnú koreláciu s vážnosťou ochorenia a množstvom intimálnych lymfocytov. Tieto štúdie súhrnne dokazujú výskyt aktivovaných buniek CD40L* a CD40+ pri obidvoch léziách, CA aj TCAD a svedčia o tom, že CD40L sprostredkovaná interakcia s CD40+ makrofágmi, penovými bunkami, bunkami hladkého svalstva a alebo
endotelovými bunkami môže prispieť k patogenéze týchto ochorení.
Niekoľko línií dôkazov naznačuje, že imunitné mechanizmy sprostredkované bunkami prispievajú k zápalovým léziám (1-4) charakteristickým pre natívnu koronárnu aterosklerózu (CA) (510) a ischemickú chorobu srdca po transplantácii srdca (TCAD (11-13). Napríklad infiltrujúce T bunky intimy exprimujú aktivačné markery, ako sú CD25 a molekuly MHC II. triedy, sú prítomné skoro pri vývoji vaskulárnych lézií pri obidvoch chorobách (5, 14). Aktivované makrofágy sú všeobecne nachádzané v léziách pri obidvoch chorobách, rovnako ako cytokíny spojené s > imunitnou odpoveďou závislou na T bunkách, vrátane IFN-γ, IL-1 a
TNF-a (5-17). Ako ďalší dôkaz, že T bunky môžu hrať patogénnu úlohu pri CA, sa izolovali CD4+ T bunkovú klony z ľudských fibroateromatóznych plátov pri CA, ktoré proliferujú a secernujú IFN-γ, ak sú privedené do kontaktu s oxidovanými LDL (18)), hlavnou zložkou lézií pri obidvoch chorobách, natívnej CA a TCAD (1, 19, 20) . Okrem toho, hyperlipidémiou vyvolané aterosklerotické lézie sú redukované u myší opracovaných s mAb anti-CD4 (21). Podobne vaskulárne lézie pri TCAD sa významne zlepšia, keď sa kmeňom myší geneticky deficitných na T bunky (13) transplantujú aloštepy alebo sú tieto kmene opracované s mAb anti-CD413 alebo anti-IFN-γ (22). Tieto údaje súhrnne silne svedčia o tom, že v patogenéze týchto ochorení sú zapojené T bunky a tiež efektorové molekuly pochádzajúce z T buniek (9, 23, 24) .
CD40L je povrchová molekula s molekulovou hmotnosťou 30-33 kDa exprimovaná na aktivovaných CD4+ T bunkách, ktorá prináša signály závislé na kontakte k CD40+ cieľovým bunkám, ak sú B bunky (25-29). CD40L sprostredkované signály sú kriticky dôležité vo vývoji humorálnej imunitnej odpovede in vitro a in vivo závislé na T bunkách (30) . Nie je známe, či interakcie CD40L-CD40 hrajú tiež úlohu v imunitnej odpovedi in vitro a in vivo sprostredkovanej bunkami (31, 32) . Je zaujímavé , že makrofágy a endotelové bunky, bunkové typy, o ktorých je známe, že sa zúčastňujú patogenézy CA a TCAD, tiež exprimujú CD40 (33— 37) . Okrem toho väzba CD40 na makrofágy a endotelové bunky in vitro vyvoláva tvorbu molekúl, ktoré zosilňujú imunitné odpovede alebo majú prozápalové účinky. Napríklad interakcie CD40L-CD40 vyvolávajú expresiu molekuly MHC II. triedy a spoločné stimulačné molekuly CD86 na makrofágoch in vitro (.38) . Okrem toho väzba CD40 na makrofágy vyvoláva tvorbu cytokínov (TNF-a, IL-Ιβ, IL-12), chemokínov (IL-8, ΜΙΡ-la), oxidu dusnatého (NO) prostredníctvom indukcie NO-syntetázy 2, prokoagulačného proteínového tkanivového faktora a metaloproteináz medzibunkovej hmoty (33, 34, 39-42). Interakcie CD40L-CD40 aktivujú intercelulárne adhezívne molekuly CD54 (ICAM-1), CD106 (VCAM-1) a CD62E (E-selektín) na endotelových bunkách (35-37). Mnoho účinkov väzby CD40 závisí na aktivácii transkripčného faktora NF-kB (43-45).
Tieto nálezy nasvedčujú predstave, že väzba CD40 na celý rad cieľových buniek môže zosilňovať CD4+ T bunkami in vivo. Túto hypotézu v obličkách pacientov s nefropatiou
IgA a zápalovými buniek s sprostredkovanú zápalovú reakciu podporuje aktivácia expresie CD40 lupoidnou glomerulonefritídou, glomerulonefritídou ANCA+ Tav koži pacientov so renálnymi chorobami (46). Pretože interakcia T makrofágmi, endotelovými bunkami a možno ďalšími bunkami hrá úlohu v patogenéze CA a TCAD, je v súčasnej štúdii skúmaná expresia CD40L a CD40 pri týchto dvoch ochoreniach s použitím imunohistochemických metód. CD401 je exprimovaný na T bunkách a expresia CD40 je aktivovaná na endotelových bunkách, bunkách hladkého svalstva, makrofágoch a penových bunkách v intimálnych léziách pri obidvoch chorobách. Okrem toho, pri použití dvojitého značenia sa zistilo, že mnoho CD40+ buniek v týchto léziách exprimuje spoločne CD54, CD106 a aktivovanú formu NF-kB.
Opis použitých metód
Ľudské koronárne artérie
Z explantovaných sŕdc 23 príjemcov srdcového aloštepu sa získali segmenty ľavej koronárnej artérie alebo proximálna časť rámus interventricularis anterior. Deväť pacientov sa podrobilo retransplantácii, pretože sa u nich vyvinula ťažká ischemická choroba srdca po transplantácii srdca (TCAD). Prežitie prvého aloštepu u týchto pacientov bolo v rozsahu medzi 38 a 103 mesiacov. Desať pacientov dostalo srdcové aloštepy, pretože sa u nich vyvinula ťažká ischemická choroba srdca a ischemická kardiomyopatia. Kontrolné koronárne artérie bez aterosklerotických zmien sa získali z explantovaných sŕdc 4 pacientov, 3 mali idiopatickú kardiomyopatiu a jeden srdcový sarkóm. Časti každej cievy sa rýchle zmrazili v izopentáne pri 80 °C a na kryostate (Reichert Histostat) sa rezali sériové rezy s hrúbkou 4 mm. Rezy sa upevnili na podložných sklíčkach potiahnutých sialínom, sušili na vzduchu, 1 minútu fixovali v studenom acetóne, ďalších 7 minút v zmesi studený acetón/chloroform 1:1 a uskladnili pri -80 °C. Jeden rez z každej koronárnej artérie sa fixoval v 10% formalíne a zafarbil hematoxylínom a eozínom pre histologické vyhodnotenie.
Primárne protilátky
Anti-CD40 z hybridómu G28.5 (IgGl) sa získala zo Zbierky bunkových kultúr (American Type Culture Collection, Rockville, MD) . Protilátka mAb anti-CD40L 5c8 (IgG2a) sa pripravila ako sa už opísalo (28). Obidve mAb G28.5 5c8 sa purifikovali z ascitu s použitím kolóny pre proteín g (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ďalšia mAb anti-CD40L (IgGl) sa získala z firmy Calbiochem (San Diego, CA) . Z firmy Caltag (Burlingame, CA) sa získala IgM mAb anti-CD40 a použila sa štúdie s dvojitým imunologickým značením. Monoklonálna Ab proti CD3, CD4, CD8, CD34, CD68 (Novocastra, Burlingham, CA, všetky IgGl) a proti aktínu buniek hladkého svalstva (SMA) (DÁKO, Carpinteria, CA, IgG2a) sa použili na rozlíšenie rôznych bunkových typov v intimálnych plakoch, vrátane T buniek (CD3, CD4 alebo CD8), endotelových buniek (CD34), makrofágov (CD68) a buniek hladkého svalstva (SMA).mAb anti-ICAM-1 (IgGl) a anti-VCAM-1 (IgGl) sa získali od CHEMICONtm (Temecula, CA). Distribúcia aktivovaného NF-κΒ sa detegovala pomocou mAb p65 (IgG3 (BOEHRINGER MANNHEIM™), ktorá sa viaže na epitop podjednotky p65 NF-κΒ blokovaný IkB, tento epitop je potom prístupný iba ak je NF-κΒ aktivovaný disociáciou IkB (47). Izotypová kontrolná mAb (Mopec 21, 22) sa získala od SIGMA™ (St. Louis, MO).
Imunohistochemická metóda
Zmrazené rezy sa premyli vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosforečnanmi (PBS) a endogénna peroxidáza sa utlmila s 0,5% peroxidom vodíka. Rezy sa blokovali 10% kozím a agregovaným ľudským Ig (80 mg/ml) v PBS a potom sa jednu hodinu inkubovali s indikovanou primárnou mAb alebo zodpovedajúcou kontrolnou mAb. Ako pozitívne kontroly na určenie optimálneho riedenia každej mAb sa použili zmrazené rezy tonzíl s folikulárnou hyperpláziou. Primárna mAb naviazaná na cieľový gén sa spojila s biotínom značeným, izotypovo špecifickým kozím anti-myším IgGl, IgG2a, IgG3 alebo IgM (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) . Peroxidázová aktivita sa detegovala chromogénom (červená) 3-amino-9-etylkarbazolom (AEC, VECTOR™, Burlingham, CA) a rezy sa kontrastne zafarbili Mayerovým hematoxylinom (SIGMA™, St. Louis, MO).
Imunohistochemické vyšetrenie s dvojitým značením sa použilo na identifikáciu bunkových typov exprimujúcich CD40 a na analýzu distribúcie CD40 vo vzťahu k ICAM-1, VCAM-1 alebo aktivovanému NF-κΒ v aterosklerotických léziách. Všetky rezy sa najskôr imunologický značili mAb IgM anti-CD40. Sekundárna Ab sa biotinylovala kozím anti-myším IgM, ktorý sa potom konjugoval s komplexom avidín-biotín-peroxidáza. Chromogén použitý na detekciu výskytu mAb anti-CD40 IgM bol 3,3' diaminobenzidín (hnedý). Rezy boli potom dôkladne premyté a inkubovali sa s druhou primárnou mAb, ktorá označovala buď bunkovo špecifický marker pre bunky hladkého svalstva (SMA) alebo makrofágy (CD68), leukocytové adhezívne molekuly (ICAM-1, VCAM-1) alebo aktivovanou formou NF-κΒ. Všetky tieto druhé primárne mAb boli izotyp IgGl, IgG2a alebo IgG3. Aplikovala sa príslušná izotypovo špecifická biotinylovaná sekundárna protilátka a konjugovaná s komplexom avidín-biotín-alkalická fosfatáza (VECTOR™, Burlingham, CA) . Intereferencii medzi postupne aplikovanými značiacimi postupmi sa zabránilo použitím rôznych imunoenzýmových techník (peroxidáza a alkalická fosfatáza) a izotypovo špecifickou sekundárnou Ab pre každý delový antigén. Okrem toho sa pripravili dvojito značené kontrolné rezy, v ktorých jedna z dvoch primárnych mAb sa nahradila izotypovo rovnakou kontrolnou mAb.
Semikvantitatívna analýza lézií
Rozsah aterosklerotických lézií sa kvantifikoval v každom reze stupňom zúženia vaskulárneho lumina v rozsahu o 0 po 4, v ktorom 0 znamenala žiadne zúžením, 1 menej ako 25%, 2 menej ako 50%, 3 menej ako 90% a 4 cez 90% zúženia lumina. Každá lézia koronárnej artérie sa tiež hodnotila na obsah makrofágov, buniek hladkého svalstva, endotelových buniek (neovaskularizácia) (48) znamenala neprítomnosť príslušného bunkového typu, 1 ojedinelé izolované bunky, 2 malé súbory buniek, 3 výskyt ložiskových denzných agregátov a 4 denzné agregáty prítomné v celom pláte.
intimálnych penových buniek, a T buniek, keď 0
Podobne bol v rozsahu 0 do 4 hodnotený výskyt CD40, ICAM-1 a VCAM-1, keď 0 znamenala neprítomnosť príslušnej molekuly, 1 jej výskyt na ojedinelých bunkách, 2 výskyt na menej ako 50%, 3 na menej ako 90% a 4 na viac ako 90% zo všetkých buniek (49) . Pretože expresia CD40L v pozitívnych vzorcoch bola obmedzená na izolované bunky, nebol jeho výskyt prístupný kvantitatívnemu hodnoteniu.
Štatistická analýza
Rozdiely v histologickom hodnotení medzi skupinami vzoriek sa analyzovali s použitím neparametrického Kruskal-Wallisovho testu. Závislosť medzi premennými sa stanovila s použitím Spearmanovej korelácie.
Výsledky
Normálne koronárne artérie
Segmenty koronárnej artérie kontrolných pacientov nejavili žiadne zhrubnutie intimy alebo zápal, ako je dokázané farbením hematoxylínom a eozínom (obrázky 4A-4B). Špecificky, makrofágy, bunky hladkého svalstva, penové bunky alebo lymfocyty neboli v intime prítomné a bunky neboli imunoreaktívne ani s jednou mAb anti-CD40L použitou v tejto štúdii. Imunoreaktivita CD40 bola prítomná a ohraničená na endotelové bunky lemujúce lúmen kontrolných artérií (obr. 4B). Bunky kontrolných ciev neexprimovali VCAM-1 alebo aktivovaný NF-κΒ a ojedinele vaskulárne endotelové bunky slabo exprimovali ICAM-1.
Histológia natívnej CA a TCAD
U 7 z 10 pacientov s CA boli v segmentoch koronárnej artérie nájdené vystupujúce fibroateromatózne pláty s excentrickým zúžením, bezbunkovým centrom bohatým na lipidy, štrbinami s cholesterolom a prekrývajúcim fibróznym krytom.
Bunkovosť lézií bola najväčšia v oblastiach ramienok, ktoré obsahovali makrofágy a lymfocyty (obr. 5A) . V intimálnych léziách boli tiež roztrúsené bunky hladkého svalstva, makrofágy, penové bunky a ložiská neovaskularizácie. Pláty z 3 pacientov s miernymi, skorými vaskulárnymi léziami, boli excentrické, malé, bohaté na makrofágy, penové bunky a lymfocyty.
Lézie koronárnych artérií u 9 pacientov mali obvodové zhrubnutie intimy s výrazným zúžením lumina (pozri tabulka 2).
Tabuľka 2
Semikvantitatívne vyhodnotenie (rozsah 0-4) bunkového zloženia intimálnej lézie u natívnej koronárnej aterosklerózy (CA) a ischemickej choroby srdca po transplantácii srdca (TCAD) a imunoreaktivity pre CD40, ICAM-1 a VCAM-1.' Hodnoty sú vyjadrené ako priemer + štandardná odchýlka.
1 Intimálny plát Kontrola (n=4) CA (n=10) TCAD (n=9)
Hrúbka 0,3 ± 0,5 2,1 ± 0,9* 3,1 ± 0,8*
CD4+ lymfocyty 0 1,3 ± 0.9* 3,2 ± 0,8*
CD8+ lymfocyty 0 0,3 ± 0,5 2,6 ± 1,1*
Makrofágy (CD68) 0,5 ±0,6 2,1 ± 0,8* 3,8 ± 0,4*
Penové bunky 0 1,2 ± 0,8* 2,4 ± 1,3*
Bunky hladkého svalstva 0,8 ± 1 1,7 ± 0,7 2,9 ± 0,8*
Neovaskularizácia 0 1,8 ± 0,7* 2,6 ± 0,9*
CD40 0,5 ± 0,6 2,2 ± 0,7* 3,3 ± 0,9*
1ICAM-1 0,5 ± 0,6 2,3 ± 1,7* 3,6 ± 0,7*
1VCAM-1 0,3 ± 0,5 1,7 ± 0,7* 2,9 ± 0,9*
* p 0,05 pre CA alebo TCAD oproti kontrolným Kruskal-Wallisovým testom
Lézie boli zložené z koncentrických vrstiev buniek hladkého svalstva a medzibunkovej hmoty a bola tu nadmerná infiltrácia makrofágov a lymfocytov spolu s oblasťami neovaskularizácie. V 4 koronárnych artériách boli vedia koncentrických vrstiev buniek hladkého svalstva rozpoznané ateromatózne lézie bohaté na lipidy a penové bunky (obr. 6A-C). Charakteristickými črtami pozorovanými u lézií TCAD bolo tiež subendotelové nahromadenie lymfocytov (endotelitída) a agregáty lymfocytov v adventícii.
Imunohistochemická analýza expresie u CA a TCAD
Značným rozdielom od normálnych koronárnych artérií, ktoré sú bez infiltrujúcich lymfocytov alebo buniek exprimujúcich CD40L je, že obidve lézie, CA a TCAD, obsahujú bunky CD40L+. U natívnej aterosklerózy bolo imunologické značenie .pozitívne na CD40L obmedzené na menšinu lymfocytov intimy. Značenie CD40L bolo zvyčajne slabé a pozorovalo sa buď v malých cytoplazmatických granulách alebo na povrchu buniek (obr. 7A-D). U natívnej CA väčšina intimálnych lymfocytov boli CD4+ T bunky, CD8+ T bunky boli prítomné iba ojedinele (obr. 7A-D). Analýza sériových rezov označených s mAb anti-CD4 alebo anti-CD8 dokazuje to, že CD40L+ lymfocyty boli primárne CD4+ T bunky. Endotelové bunky, bunky hladkého svalstva, makrofágy a penové bunky nereagovali so žiadnou mAb anti-CD40L použitou v tejto štúdii. U izotypových kontrolných mAb sa nepozorovalo žiadne značenie.
U lézií TCAD bolo pozitívne imunologické značenie na CD40L tiež spojené výhradne s lymfocytmi (obr. 8A-C). Na rozdiel od CA boli u lézií TCAD prítomné tak CD8+ ako aj CD4+ T bunky. Avšak CD8+ T bunky sa nachádzali prevažne v subendotelových oblastiach endotelitídy (obr. 8A-C), pokým CD4+ T bunky boli lokalizované v agregátoch hlbšie v intime priľahlej k vnútornej elastickej membráne (obr. 8A-C) a adventicii koronárnych artérií. Expresia CD40L korelovala priestorovo s CD4+ T bunkami v intime a adventicii koronárnych artérií u TCAD. Počet CD40L+ T buniek bol vyšší u TCAD lézií ako u natívnych CA lézií. Podobne ako u CA, endotelové bunky, bunky hladkého svalstva, makrofágy alebo penové bunky u lézií TCAD nereagovali so žiadnou mAb antiCD40L použitou v tejto štúdii (obr. 9A-B). Tieto údaje naznačujú, že CD40L exprimujú bunky, pravdepodobne CD4+ T bunky, sú prítomné v léziách natívnej CA a TCAD.
Imunohistochemická analýza expresie CD40 u CA a TCAD
Na rozdiel od slabej expresie CD40 obmedzenej na endotelové bunky lumina u normálnych koronárnych artérií (obr. 4A-B), CD40 imunoreaktivita bola aktivovaná a široko rozšírená v léziách natívnej CA (obr. 5A-B). Expresia CD40 bola zaznamenaná v endotelových bunkách, bunkách hladkého svalstva, makrofágoch a penových bunkách. V intimálnych léziách natívnej CA bol významne vyšší priemerný počet CD40 pozitívnych buniek ako v kontrolných artériách (2,2 + 0,7 oproti 0,5 + 0,6, tabulka 2). Dvojité imunologické značenie špecifickými markermi pre makrofágy alebo bunky hladkého svalstva potvrdilo, že tieto bunky a penové bunky obidvoch línií exprimujú CD40 (obr. 10AB) . Je zaujímavé, že CD40+ bunky hladkého svalstva boli prítomné v intime blízko zápalových infiltrátov, pokým bunky hladkého svalstva v médiu artérií nemali pozitívnu imunoreaktivitu pre CD40 (obr. 10A-B). Analýza sériových rezov označených CD40 alebo endotelovým markerom CD34 svedčia o tom, že endotelové bunky lemujúce novotvorené cievy intimy a vassa vasorum adventicie boli tiež silno CD40+ (obr. 11A-D).
V artériách pacientov s TACD bol model distribúcie expresie CD40 podobný ako u natívnej CA. Avšak priemerné hodnotenie CD40 imunoreaktivity bolo významne vyššie u TCAD ako u natívnej CA alebo kontrolných artérií (tabulka 2). Dvojité imunologické značenie ukázalo, že bunky hladké ho svalstva intimy a makrofágy exprimujú CD40 (obr. 10A-B). Okrem toho penové bunky (obr. 6AB) a endotelové bunky ohraničujúce vaskulárny lúmen, novotvorené cievy intimy a vaša vasorum adventicie boli výrazne CD40+. Tieto údaje spoločne dokazujú, že endotelové bunky, bunky hladkého svalstva a makrofágy exprimujú CD40 tak u natívnej CA ako aj u TCAD.
Vzťah expresie CD40 a intercelulárnym adhezívnym molekulám a aktivácii NF-κΒ u lézií CA a TCAD.
Makrofágy a endotelové bunky u CA a TCAD exprimujú intercelulárne adhezívne molekuly, ktoré regulujú docestovanie leukocytov do lézií. Pretože väzba CD40 vyvoláva aktiváciu intercelulárnych adhezívnych molekúl a aktiváciu NF-κΒ na bunkách in vitro, bola otázka, či expresia CD40 bola spojená so spoločnou expresiou intercelulárnych adhezívnych molekúl alebo NF-κΒ u lézií CA alebo TCAD. Najskôr sa dokázalo u natívnej CA, že endotelové bunky lumina prejavujú ložiskové pozitívne imunologické značenie na ICAM-1 s ojedinelými endotelovými bunkami exprimujúcimi VCAM-1. Na rozdiel od toho, endotelové bunky ohraničujú novotvorené cievy intimy a vaša vasorum adventicie boli ICAM-1 a VCAM-1 silno pozitívne (obr. 11A-D). Bunky hladkého svalstva intimy, makrofágy a penové bunky boli tiež mierne až silno pozitívne na ICAM-1 a VCAM-1 (obr. 12A-C). Medzi hodnotením CD40 a hodnotením ICAM-1 (r=0,85) a VCAM-1 (r=0,72) bola významná korelácia (p<0,05). Počet lymfocytov intimy významne koreloval s hodnotením pre CD40 a leukocytové adhezívne molekuly (pozri tabuľka 3) .
Tabuľka 3
Korelácia hodnotení (0-4) pre rôzne bunkové typy intimálnych lézií u CA (n=10) alebo TCAD (n=9) s hodnotením (04) pre expresiu CD40 a adhezívnych molekúl (ICAM-1, VCAM-1). Hodnoty sú vyjadrené ako Spearmanov korelačný koeficient (rozsah -1 až 1, pričom 0 je žiadna korelácia a -1 alebo 1 dokonalá korelácia).
Bunkový typ Skupina CD40 ICAM-1 VCAM-1
T lymfocyty (CD4+ CD8+) CA 0,78* 0,77* 0,83**
TCAD 0,79* 0,87* 0,77*
Makrofágy (CD68+) CA 0,93*** 0,84** 0,77*
TCAD 0,81** 0, 68* 0,55
Penové bunky CA 0,81** 0,68* 0,36
TCAD 0,44 0,33 0,26
Bunky hladkého svalstva (SMA+) CA 0,72* 0,81** 0,56
TCAD 0,12 0,38 0,02
Novotvorené cievy (CD34+) CA 0,69* 0,72* 0,53
TCAD 0,85** 0,87** 0,77* J
*ρ<0,05, ** ρ<0,01 a *** ρ<0,001 - hladina významnosti pre
Spearmanovu koreláciu
Zo všetkých uvedených bunkových typov iba hodnotenie intimálnych lymfocytov významne korelovalo s expresiou CD40 a rozsah ICAM-1 a VCAM-1 v intimálnych plátoch tak u CA ako aj u TCAD svedčil o tom, že lymfocyty sú zapojené v indukcii CD40 a adhezívnych molekúl u obidvoch chorôb. Makrofágy a neovaskularizácia tiež vykazovali významnú koreláciu s expresiou CD40 u CA a TCAD.
Dvojité imunologické značenie lézií CA s mAb anti-CD40 a anti-ICAM-1 alebo anti-VCAM-1 ukázalo, že CD40 boli lokalizované spoločne s týmito adhezívnymi molekulami na mnohých bunkách (obr. 12A-C). Okrem toho, v jadrách neointimálnych endotelových buniek, makrofágóch a bunkách hladkého svalstva sa pozoroval aktivovaný NF-κΒ (obr. 13) a dvojité imunologické značenie dokázalo, že mnoho CD40+ buniek tiež exprimovalo aktivovaný NFkB.
U TCAD bol prítomné silno pozitívne imunologické značenie na ICAM-1 a VCAM-1 v endotelových bunkách lumina, konkrétne v tých, ktoré boli blízko ložiskám endotelitídy. Endotelové bunky intimálnych novotvorených ciev vaša vasorum adventicie boli silno imunoreaktívne na ICAM-1 a VCAM-1. Hodnotenie imunologického značenia adhezívnych molekúl u TCAD bolo vyššie ako u CA alebo normálnych koronárnych artérii (tabuľka 2). Významná korelácia (p<0,05) bola medzi hodnotením CD40 a hodnotením ICAM-1 (r=0,82) a VCAM-1 (r=0,89). Počet intimálnych lymfocytov tiež koreloval významne s expresiou CD40, ICAM-1 VCAM-1 (tabuľka 3). Podobne ako u CA, dvojfarebné imunohistochemické štúdie dokázali, že mnoho CD40+ buniek u lézii TCAD exprimuje spoločne ICAM-1 alebo VCAM-1 (obr. 12A-C). Imunologické značenie na aktivovanú jadrovú formu NF-κΒ bolo širšie rozprestreté u TCAD ako u natívnej CA. NF-κΒ ‘ pozitívne makrofágy a bunky hladkého svalstva boli rovnako CD40+ (obr. 13) . Tieto štúdie spoločne dokazujú, že v léziách tak natívnej CA ako aj TCAD je CD40 spoločne exprimovaný na mnohých bunkách s intercelulárnymi adhezívnymi molekulami alebo NF-kB.
Diskusia
Natívna ateroskleróza (CA) a ateroskleróza po transplantácii (TCAD) sú zápalové choroby sprostredkované zložitými interakciami medzi aktivovanými T bunkami, endotelovými bunkami, makrofágmi a bunkami hladkého svalstva (2, 8, 12, 13, 17). Predpokladá sa, že T bunky hrajú úlohu v patogenéze CA a TCAD, ale mechanizmus, ktorým sa zapájajú do týchto procesov, nie je úplne známy (5, 9, 50) . Štúdie ukázali, že CD40L, povrchová molekula CD4+ T bunky indukovaná aktiváciou, prináša aktivačné signály závislé na kontakte k endotelovým bunkám a makrofágom exprimujúcim CD40, čoho následkom je tvorba prozápalových molekúl, ako sú intercelulárne adhezívne molekuly ICAM-1 a VCAM-1 (31, 32, 35-37) a aktiváciu transkripčného aktivačného faktora NF-κΒ (43-45, in vitro). Je zaujímavé, že
TCAD na myšacích modeloch je aspoň čiastočne závislá na interakciách CD40L-CD40 (51). V štúdii Larsona a kol. liečba s mAb anti-CD40L výrazne inhibovala rejekciu alogénneho heterotopického transplantátu a čiastočne blokovala pridruženú vaskulopatiu. Okrem toho, TCAD u tohto modelu bola takmer kompletne zabránená podávaním kombinácie mAb anti-CD40L a fúzneho proteínu CTLA4-Ig, molekuly, ktorá blokuje spoločne stimulujúce dráhy T bunky (51). Je možné, že interakcie CD40LCD40 sa môžu podieľať v patogenéze CA alebo TCAD u ludí.
Na ďalšie skúmanie tejto hypotézy boli na normálne a aterosklerotické koronárne artérie použité ďalšie imunohistochemické techniky, aby bolo možné študovať expresiu a bunkovú distribúciu CD40L a CD40. Normálne koronárne artérie neobsahujú bunky exprimujúce CD40L a CD40 imunoreaktivita bol u týchto ciev obmedzená na endotelové bunky lumina. Na rozdiel od toho, CD40L je exprimovaný na lymfocytoch v léziách tak natívnej CA ako aj TCAD. Zistilo sa, že lézie CA obsahovali málo CD8+ T buniek, pokým lézie TCAD obsahovali CD8+ T bunky v tesnej blízkosti endotelu lumina (endotelitis) a CD4+ T bunky hlbšie v intime a adventícii. Na základe lokalizácie a značenia sériových rezov mAb anti-CD4 alebo anti-CD8 sa usúdilo, že lymfocyty CD40L+ sú najpravdepodobnejšie CD4+ T bunky v léziách u obidvoch chorôb. S použitím dvoch odlišných mAb anti-CD40L sa zistilo, že CD40L imunoreaktivita bola slabá a nebola spojená ani s granulami či cytoplazmou alebo bunkovým povrchom. Podobný model CD40L imunoreaktivity sa pozoroval v štúdii expresie CD40L a CD40 u glomerulonefritídy (46). To, že je model značenia expresie CD40 v zápalových tkanivách slabý a často cytoplazmatický, sa môže vzťahovať na prechodnú povahu expresie CD40 na aktivovaných T bunkách (27-29) a fakt, že obsadenie CD40 na cieľových bunkách vyvoláva rýchle utlmenie CD40L endocytózou sprostredkovanou receptorom (52) a odpadávaním receptorov (53). Tieto regulačné mechanizmy pravdepodobne slúžia na zameranie signálov sprostredkovaných CD40L na príslušné rozpoznávané cielové bunky.
Zistilo sa, že expresia CD40 bola výrazne aktivovaná na mnohých bunkách v léziách u obidvoch chorôb. Makrofágy a penové bunky exprimujúce CD40 boli mimoriadne nápadné v zápalovom infiltráte ramienkových oblastí plátov bohatých na lipidy, o ktorých je známe, že obsahujú denzné zápalové infiltráty (54, 55). Expresia CD40 bola tiež aktivovaná na endotelových bunkách lumina u obidvoch chorôb, čo bol nápadné hlavne u TCAD. Endotelové bunky novotvorených ciev intimy a vaša vasorum adventicie boli u obidvoch chorôb silne CD40+. Bunky hladkého svalstva exprimujúce CD40 sa vyskytovali v intime obidvoch CA a TCAD, zvyčajne v tesnej blízkosti zápalových infiltrátov. Je zaujímavé, že bunky hladkého svalstva v médiu rovnakých ciev boli hodnotené ako CD40. IFN-γ vyvolával expresiu CD40 na mnohých bunkách in vitro (33, 35-37, 56) vrátane buniek hladkého svalstva a tento účinok je zosilnený cytokínmi, ako je IL-Ιβ a TNF-a (36). Preto výrazná aktivácie CD40 expresie na mnohých bunkových typoch u týchto lézií môže spôsobiť· uvolnenie cytokínov T bunkami, makrofágmi a ďalšími bunkami lézie. Dvojité imunologické značenie ukázalo, že mnoho CD40+ buniek tiež súčasne exprimuje intercelulárne adhezívne molekuly ICAM-1 a VCAM-1 a tiež aktivovanú formu NF-κΒ. Súčasná štúdia zároveň dokazuje prítomnosť CD40L+ T buniek a aktivovaných CD40+ cieľových buniek vo vaskulárnych léziách natívnej CA a TCAD.
Predchádzajúce štúdie ukázali že CD40 bol exprimovaný na niektorých nádoroch epitelových buniek a B bunkách (57, 58) .
Neskôr sa zaznamenalo, že CD40 je konštitutívne exprimovaný alebo indukovatelný na mnohých bunkových typoch in vitro (33-37, 56) . Ďalej je stále viac zrejmé, že interakcie CD40L-CD40 majú kľúčovú úlohu v zápalových reakciách sprostredkovaných bunkami in vivo (31, 32). Z tohto hľadiska súčasné publikácie demonštrujú in situ CD40L alebo CD40 expresiu u ľudských zápalových chorôb (35, 46, 59) . Napríklad expresia CD40 je aktivovaná na makrofágoch infiltrujúcich mozgy pacientov so sclerosis multiplex (59), na kožných endotelových bunkách a keratinocytoch u psoriázy (35), a na mnohých bunkách v obličkách pacientov so zápalovými glomerulonefritídami (46). Okrem toho zápalové infiltráty v mozgoch pacientov so sclerosis multiplex (59) a v obličkách pacientov so zápalovými glomerulonefritídami (46) obsahujú CD40L* T bunky. Je preto pravdepodobné, ž expresia CD40 je aktivovaná u mnohých zápalových chorôb a predstavuje molekulárny mechanizmus, ktorý umožňuje T bunkám prenášať prozápalové signály k celému radu cieľových buniek. Z tohto hľadiska tu prezentované nálezy znamenajú, že expresia CD40 je aktivovaná u CA a TCAD a že CD40L+ infiltrujúce T bunky sú nachádzané v léziách, slúžia ako dôkaz hypotézy, že imunitné sprostredkované zápalové reakcie hrajú úlohu v patogenéze týchto chorôb (5-7, 9, 18, 21, 23, 50).
Pozorovanie týkajúce sa CD40L sprostredkované aktivácie endotelových buniek a makrofágov in vitro a štúdie interakcií CD40L-CD40 v patogenéze TCAD na myšacích modeloch, svedčia o možnej patogénnej úlohe interakcií CD40L-CD40 u CA a TCAD. Napríklad CD40L sprostredkované signály aktivujú expresiu ICAM-1 a VCAM-1 na endotelových bunkách, in vitro (35-37). Tieto intercelulárne adhezívne molekuly, ktoré regulujú odchod a retenciu leukocytov na zápalových miestach, sú aktivované na endotelových bunkách novotvorených ciev intimy a vaša vasorum (49, 60) . Preto je zaujímavé, že v léziách CA a TCAD sa našlo mnoho CD40+ buniek a konkrétne endotelových buniek intimy a vaša vasorum, ktoré exprimujú súčasne ICAM-1 alebo VCAM-1. Je známe, že aktivácia ICAM-1 a VCAM-1 je závislá na aktivácii NF-kB (61). V predkladanej štúdii sa tiež dokázalo, že CD40+ intimálne makrofágy, bunky hladkého svalstva a endotelové bunky exprimujú aktivovanú formu NF-κΒ. Tieto štúdie svedčia o tom, že CD40L+ CD4+ T bunky môžu vyvolať aktiváciu intercelulárnych adhezívnych molekúl na CD40+ cieľových bunkách u CA a TCAD, čiastočne možná aktiváciou NF-kB.
Signály sprostredkované CD40L tiež vyvolávajú u endotelových buniek sekréciu IL-6 a IL-8 (62) a vyvolávajú prokoagulačný povrch aktiváciou tkanivového faktora a utlmením expresie trombodulínu. Vzhľadom na makrofágy, interakcie CD40LCD40 vyvolávajú u týchto buniek sekréciu prozápalových cytokínov (IL-la, IL-Ιβ, IL-6, TNF-a), chemokínov, metaloproteináz medzibunkovej hmoty a exprimujú tkanivový faktor in vitro (33, 34, 38, 41, 42) . Všetky tieto prozápalové molekuly majú pravdepodobne úlohu v patogenéze CA a TCAD (10, 17, 63-66).
Väzba CD40 na makrofágy tiež vyvoláva tvorbu NO (39, 40) . Je zaujímavé, že blokovanie interakcií CD40L-CD40 u myšacích modelov TCAD je spojené s utlmením expresie iNOS a redukciou TCAD lézií (51). Dokázalo sa, že iNOS je exprimovaný v léziách CA (67, 68), rejekciou srdcového aloštepu (69, 70) a TCAD (71,
72) . Signály sprostredkované CD40L môžu byť zapojené v podpore tvorby akejkoľvek z týchto molekúl u CA alebo TCAD. Interakcie CD40L-CD40 majú jasne prozápalové účinky u myšacích modelov TCAD (51) a tiež u artritídy indukovanej kolagénom (73), glomerulonefritídy podobnej lupoidnej glomerulonefritíde (74) a experimentálnej alergickej encefalomyelitídy (59) .
Skúmala sa tiež expresie CD40L a CD40 (62) u aterosklerózy karotíd u ľudí. Zistilo sa, že CD40 bol v léziách aktivovaný a mal rozsiahlu bunkovú distribúciu. Publikovalo sa, že CD40L je široko exprimovaný na bunkách hladkého svalstva, endotelových bunkách a makrofágoch u aterosklerotických lézií, pokým v predkladanej štúdii s použitím dvoch rôznych mAb anti-CD40L. bola expresia CD40L obmedzená na T bunky. U žiadnej choroby sa nepozorovala in situ expresia CD40L na makrofágoch, endotelových bunkách alebo bunkách hladkého svalstva. Podobne sa tiež zistilo, že CD40L imunoreaktivita je obmedzená na T bunky u iných zápalových chorôb, vrátane glomerulonefritídy (46), reumatoidnej artritídy a chronickej sínusitídy. Navyše Gerritse a kol. publikovali, že expresia CD40L bol obmedzená na CD4+ T bunky v ložiskách u sclerosis multiplex (59) . Nezrovnalosti medzi výsledkami tu uvedenými a výsledkami Macha a kol. sú v súčasnosti nejasné, ale môžu sa týkať jemných odchýlok v imunohistochemických technikách alebo v povahe lézií.
Zoznam citovanej literatúry
1. Nilsson, J. 1993. Transplant Proc. 25:2063-2064.
2. Munro, J., and R. Cotran. 1988. Lab. Invesc. 58:249-261.
3. Cramer, D., e: al. 1992. J. Keart Lung Transplant. 11:458-466.
4. Eillingham, M. 1992.
11:S38-S44.
5. Zhou, X., et al. 1996.
6. Wick, G., et al. 1995.
7. Stemme, S., et al.
Thrombc. 12:206-211.
J. Heart Lung Transplant.
Am. J. Páchol. 149:359-365. Immunol. Today. 16:27-33. 1992. Arteriosclerosis and
8. Ross, R. 1993. Náture. 362:801-809.
9. Lichtman, A., et al. 1996. Am. J. Pathol. 149:351-357.
10. Kishikawa, H., et al. 1993. Virchows Árch. 423 :433-442.
11. Krensky, A. 1994. Kidney Int. 45:5QS-56S.
12 . Salomon, R.. et al. 1991. Am. J. Pathol. 138:791 -798 .
13 . Shi, C., , et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci, USA.
:4051-4056.
14 . Jonasson, L., et al. 1985. J Clin Invest
76 : 125-131.
15 . Russell, P. S., et al. 1994. Am. J. Pathol
144 :260-274.
16 . Moyer, C., et al. 1992. J Pathol. 138:951-960.
17. Libby, P., and Z. Gallis . 1995. Ann NY Acad. Sci
748:158-168.
18. Stemme, S., et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 52:3893-3897.
19. . Witzxum. J., and D. Steinberg. 1991. J. Clin. Invest ,8S : 1785-1792.
20. de Loraeril, M.,
125 -.974-980.
et al.
1993. Am. Heart
Zl. Emescn, E., ec al. 1995. Am J Pachcl. 149:57=-585.
22. Russeii, P-, et al. 1994. Transplar.cacicn. 57:1357-1371.
23. Russell; M., ec al. 1996. J Clin Invesc. 97:833-838.
24. Hancock, W., ec al. 1996. Proc Nad Acad Sci. 93:13967-13972.
25. Graf, D., ec al. 1992. Eur J Immunol. 22:3191-3194.
26. Armicage, R. J., ec al. 1992. Nacure. 357 (€373) -.80-2.
27. Lane, P., ec al. 1992. Eur J Immunol. 22:2573-2578.
28. Lederman, S., (4):1091-101. ec al. 1992. J Exp Med. 175
29. Noelle, R. ec al. 1992 . Proc Nacl Acad Sci USA.
89:6550-6554.
30. Banchereau, J. . ec al. 1994 . Annu. Rev. Immunol.
12:881-922.
31. Noelle, R. 1995. Immunicy. 4:415-419.
32. Scouc, R., and J. Succles. 1996. Immunol Today.
17:487-492.
33. Alderson, M. R., ec al. 1993. J. Exp. Med. 178
12) :669-74 .
34. Caux, C., ec al. 1994. J. Exp. Med. 180:1263-1272. 3Ξ. Hcllenbaugh, D., ec al. 1995. J. Exp. Med. 182 -.33-40 .
35. Karmann, K., ec al. 199Ξ. Proc Nacl Acad Sci, USA. 92:4342-4346.
37. Yellin, M. J., ec al. 1995.’ J. Exp. Med.
182:1857-1864.
38. Kiener, ec al. 1995. J. Immunol. 155:4917-4925. 35. Scouc, R., ec al. 1996. J. Immunol. 156:5-11.
40. Tian, L., ec al. 1995. Eur J. Immunol. 25:306-305.
41 . Pradier, 0. , et al. 1996
Z · M · 3048-3054 .
42 . Malik, N. , et al. 1996. J Immu:
43 . t I., et al.
1 = 3 : 4357-4366.
44 . Hess, et al. 1555. J lacnun:
• 45 . Karmanr., X.. et al. 1555. č Ξχ·
45 . Yellin, M.. et al. 1557.
• 40 : 124-134.
47. Br and, K. . et al. 1996. J Clin
1994 xmmunoj.
Imrnunol.
-4555.
48. Kuamamoto, M., et al. 1995. Human Path. 26:450-456.
49. O'Brien, K., et al. 1996. Circulation. 93: 672-682.
50. Haraoka, S., et al. 1995. Virchows Árch. 426:307-315.
.
Larsen, C., et al. 1996. Náture. 381:434-438.
52. Yellin, M. J.. et al. 1994. J Imrnunol
(2) :598-608..
53 . Graf, D., et al. 1995. Eur J Imrnunol. 25:1745
54 . Bjoerkerud, s., and B. Bjoerkerud. 1996.
Pathol. 149:367-380.
55 . van der Wal, A., et al . 1994. Circulation. 89:
56 . Yellin, M. J., et al. 1995. J. Leuk.
58 : 209-216.
57. Pauli, S., et al. 1985. Cancer Imrnunol. Immunother. 20:23-28.
58. Clark, E. A., and J. A. Ledbetter. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:4494-4498.
59. Gerritse, K., et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93 -.2495-2504.
60. Davies, M., et al. 1993. J Pichol. 171:223-229.
Collins, T., et al. 1995. FASZB J. 9:899-909.
Mach. F., et al. 1997. Proc Natl Acad Sci, USA.
SI €Z
94:1921-1936.
63. Berliner, J., et al.
91:2488-2495.
64. Libbv, ?., et al. 1995. J Cardiovasc Pharx. 25 Suppl 2:S9-12.
1995 .
Circulaticn,
Li, Z., et al. 1996. Am J Park. 148:121-126.
Galis, Z., et al. 1994. J Clin Invest. 94:2493-2503. Buttery, L., et al. 1996. Lafc. Invest. 75:77-85. Aji, W., et al. 1997. Circulation. 95:430-427. Yang, X., et al. 1994. J Clir. Invest. 94:714-721. Wcrrali, N., et al. 1995. J Exp Med. 181:63-70. Russell, M., et al. 1995. Circulation. 92:457-464.
5 .
.
.
.
.
.
71.
72. Akyurek,
149:1891-1990.
.
.
et al
1996 .
Am
Pathol,
Durie, F. E., et al. 1993. Science. 261:1328-1330. Mohan, C., et al. 1995. J Immunol. 154:1470-1480.
Zoznam sekvencií (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 146 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (iii) hypotetická: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 1:
valy Asp Gin Asn Pro 5 Glr. Zle Ala Ala Kis 1C Val Zle Ser Glu Ala 15 Ser
Ser Lys Thr Thr 20 Ser Val Leu Glr. Tra 25* Ala Glu Lys Gly Tyr 3*0 Tyr Thr
Met Ser Asn 35 Asn Leu Val Thr Leu 40 Glu Asn Gly Lys Gin 45 Leu Thr Val
Lys Arg 50 Gin Gly Leu Tyr Tyr 55 íle Tyr Ala Gin Val 60 Thr Phe cys Ser
Asn 65 Arg Glu Ala Ser Ser 70 Glr. Ala Pro Phe íle 75 Ala Ser Leu cys Leu 80
Lys Ser Pro Gly Arg 85 Phe Glu Arg íle Leu 90 Leu Arg Ala Ala Asn 95 Thr
His Ser Ser Ala 100 Lys Pro Cys Gly Gin 105 Glr. Ser íle His Leu 110 Gly Gly
Val Pne Glu 115 Leu Gin Pro Gly Ala 120 Ser Val Phe Val Asn 125 Val Thr Asp
Pro Ser 130 Gin Val Ser His Gly 135 Thr Gly Phe Thr Ser 140 Phe Gly Leu Leu
Lvs Leu

Claims (21)

1. Použitie činidla, ktoré inhibuje interakciu medzi ligandom CD40 a CD40, na prípravu liečiva na inhibíciu aktivácie buniek nesúcich na bunkovom povrchu CD40, spôsobenú ligandom CD40, kde bunky nesúce CD40 sú bunky hladkého svalstva mechúra, bunky hladkého svalstva ciev, bunky hladkého svalstva aorty, bunky hladkého svalstva koronárnych artérií, bunky hladkého svalstva pľúcnych žíl alebo bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu.
2. Použitie podľa nároku 1, kde bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu sú bunky hladkého svalstva pažeráka, bunky hladkého svalstva žalúdka, bunky hladkého svalstva čriev alebo bunky hladkého svalstva tenkého čreva.
3. Použitie podlá nároku 1, kde činidlo špecificky inhibuje väzbu ligandu CD40 na CD40 buniek hladkého svalstva.
4. Použitie podľa nároku 1, kde činidlo špecificky viaže epitop, na ktorý sa špecificky viaže monoklonálna protilátka 5c8, produkovaná hybridómom ATCC č. HB 10916.
5. Použitie podľa nároku 1, kde sa činidlo špecificky viaže na CD40.
6. Použitie podlá nároku 1, kde činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej proteíny, látky iné ako proteíny a peptidomimetické zlúčeniny.
7. Použitie podlá nároku 6, kde proteín predstavuje protilátku alebo jej časť.
8. Použitie podlá nároku 7, kde protilátka je vybraná zo skupiny obsahujúcej monoklonálne protilátky, polyklonálne protilátky, chimérické protilátky, humanizované protilátky, primatizované protilátky a také protilátky, ktoré obsahujú oblasť CDR jedného človeka a kostru protilátky iného človeka.
9. Použitie podlá nároku 8, kde monoklonálna protilátka je protilátka 5c8 produkovaná hybridómom ATCC č. HB 10916.
10. Použitie podlá nároku 6, kde proteín obsahuje ‘rozpustný extracelulárny úsek ligandu CD40 alebo jeho varianty vrátane konzervatívnych substituentov alebo jeho časti, alebo obsahuje rozpustný extracelulárny úsek CD40 alebo jeho varianty vrátane konzervatívnych substituentov, alebo jeho časti.
11. Použitie podlá nároku 10, kde rozpustný extracelulárny úsek ligandu CD40 alebo CD40 je monomér alebo oligomér.
12. Použitie podlá nároku 10, kde rozpustný extracelulárny úsek CD40 alebo jeho časť ďalej obsahuje úsek Fc fúzovaný s extracelulárnym úsekom CD40 alebo jeho časťou alebo ligandom CD40 alebo jeho časťou.
13. Použitie podlá nároku 1, kde činidlo je vybrané alebo navrhnuté pomocou optimalizácie štruktúry základného inhibičného činidla na základe trojrozmernej štruktúry komplexu rozpustného extracelulárneho úseku CD40 alebo jeho časti so základným inhibičným činidlom.
14. Použitie podlá nároku 1, kde činidlo špecificky inhibuje bunkovú aktiváciu prostredníctvom ligandu CD40 buniek hladkého svalstva nesúcich CD40, ktoré sa podieľajú na chorobe závislej na bunkách hladkého svalstva.
15. Použitie podľa nároku 14, kde choroba závislá na bunkách hladkého svalstva patrí do skupiny obsahujúcej cievne choroby, choroby mechúra a choroby gastrointestinálneho traktu.
16. Použitie podlá nároku 15, kde choroba gastrointestinálneho traktu patrí do skupiny obsahujúcej poruchy motility pažeráka, zápalové črevné choroby a sklerodermiu.
17. Použitie podlá nároku 15, kde cievna choroba je ateroskleróza.
18. Použitie podlá nároku 1, kde činidlo je vybrané testovacou metódou, ktorá spočíva v uskutočnení nasledujúcich krokov:
a) izoluje sa vzorka buniek hladkého svalstva, pričom tieto bunky sú bunky hladkého svalstva mechúra, bunky hladkého svalstva ciev, bunky hladkého svalstva aorty, bunky hladkého svalstva koronárnych artérií, bunky hladkého svalstva pľúcnych žíl alebo bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu,
b) vzorka sa kultivuje v podmienkach, ktoré dovoľujú aktiváciu tých buniek hladkého svalstva vo vzorke, ktoré nesú CD40,
c) vzorka sa uvedie do kontaktu s bunkami exprimujúcimi proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB 10916, alebo sa vzorka uvedie do kontaktu s proteínom, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB
10916, pričom uvedené bunky alebo proteín účinne aktivujú bunky hladkého svalstva nesúce CD40,
d) vzorka sa uvedie do kontaktu s množstvom činidla, ktoré účinne inhibuje aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40, pokiaľ uvedené činidlo inhibuje na CD40-CD40L závislú aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40, a
e) určí sa, či bunky exprimujúce proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB 10916, alebo či proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC HB č. 10916, aktivujú v prítomnosti činidla bunky hladkého svalstva nesúce CD40.
19. Spôsob selekcie činidla, ktoré inhibuje interakciu ligandu CD40 buniek hladkého svalstva, pričom ide o bunky hladkého svalstva mechúra, bunky hladkého svalstva ciev, bunky hladkého svalstva aorty, bunky hladkého svalstva koronárnych artérií, bunky hladkého svalstva pľúcnych žíl alebo bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu, ktoré nesú na svojom bunkovom povrchu CD40 vyznačujúci sa tým, že sa skladá z krokov, keď sa
a) izoluje vzorka buniek hladkého svalstva, pričom tieto bunky sú bunky hladkého svalstva mechúra, bunky hladkého svalstva ciev, bunky hladkého svalstva aorty, bunky hladkého svalstva koronárnych artérií, bunky hladkého svalstva pľúcnych žíl alebo bunky hladkého svalstva gastrointestinálneho traktu,
b) vzorka sa kultivuje v podmienkach, ktoré umožňujú aktiváciu buniek hladkého svalstva vo vzorke, ktoré nesú CD40,
c) vzorka sa uvedie do kontaktu s bunkami exprimujúcimi proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB 10916, alebo sa vzorka skontaktuje s proteínom, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB
10916, pričom uvedené bunky alebo proteín účinne aktivujú bunky hladkého svalstva nesúce CD40,
d) vzorka sa uvedie do kontaktu s množstvom činidla, ktoré účinne inhibuje aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40, pokiaľ uvedené činidlo inhibuje sa CD40-CD40L závislú aktiváciu buniek hladkého svalstva nesúcich CD40, a
e) určí, či bunky exprimujúce proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB 10916, alebo či proteín, ktorý je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou 5c8 produkovanou hybridómom ATCC č. HB 10916, aktivujú v prítomnosti činidla bunky hladkého svalstva nesúce CD40.
20. Použite podľa nároku 18, keď vzorka buniek hladkého svalstva je vybraná zo skupiny obsahujúcej: bunkové línie v kultúre, bunky izolované zo zvieraťa, bunky izolované z pevného tkaniva, bunky získané z biopsie kostnej drene a bunky izolované z telových tekutín.
21. Spôsob podía nároku 19 vyznačujúci sa tým, že vzorka buniek hladkého svalstva sa vyberie zo skupiny obsahujúcej: bunkové línie v kultúre, bunky izolované zo zvieraťa, bunky izolované z pevného tkaniva, bunky získané z biopsie kostnej drene a bunky izolované z telových tekutín.
SK4-99A 1996-07-08 1997-07-03 Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells SK499A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67773096A 1996-07-08 1996-07-08
PCT/US1997/012925 WO1998001145A1 (en) 1996-07-08 1997-07-03 Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK499A3 true SK499A3 (en) 1999-08-06

Family

ID=24719894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK4-99A SK499A3 (en) 1996-07-08 1997-07-03 Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20030219437A1 (sk)
EP (1) EP0956030A4 (sk)
JP (1) JP2000515507A (sk)
CN (1) CN1242809C (sk)
AU (1) AU731299B2 (sk)
BG (1) BG63489B1 (sk)
BR (1) BR9710264A (sk)
CA (1) CA2259962C (sk)
CZ (1) CZ297300B6 (sk)
EA (1) EA004401B1 (sk)
EE (1) EE9900010A (sk)
HU (1) HUP9904669A3 (sk)
IL (1) IL127884A0 (sk)
IS (1) IS4935A (sk)
NO (1) NO990019L (sk)
NZ (1) NZ333602A (sk)
PL (1) PL188408B1 (sk)
SK (1) SK499A3 (sk)
TR (1) TR199900029T2 (sk)
WO (1) WO1998001145A1 (sk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6158501A (en) 2000-05-12 2001-11-26 Beth Israel Hospital Compositions and methods for achieving immune suppression
US20020173053A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-21 Bassam Damaj Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
UY32802A (es) * 2009-07-23 2011-01-31 Provimi Holding B V Composiciones para reducir la metanogénesis gastrointestinal en rumiantes
CA3022636A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Medimmune, Llc Cd40l-fc fusion polypeptides and methods of use thereof
CN110546164B (zh) * 2016-11-11 2023-10-20 锦湖Ht株式会社 特异性结合cd40的抗体及其用途
US11793854B2 (en) 2019-03-21 2023-10-24 Op-T Llc Methods for reducing symptoms of multiple sclerosis using a six-amino acid long peptide that inhibits CD40-CD150 interaction
US12048734B2 (en) 2020-04-17 2024-07-30 Op-T Llc Bioactive peptides and methods of use thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
CA2089229C (en) * 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6340459B1 (en) * 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US6822070B2 (en) * 1996-03-11 2004-11-23 David Baltimore Truncated CRAF1 inhibits CD40 signaling

Also Published As

Publication number Publication date
US20030219437A1 (en) 2003-11-27
BG103148A (en) 1999-10-29
EA004401B1 (ru) 2004-04-29
AU4229297A (en) 1998-02-02
JP2000515507A (ja) 2000-11-21
EP0956030A4 (en) 2001-11-28
AU731299B2 (en) 2001-03-29
CA2259962C (en) 2002-01-22
EE9900010A (et) 1999-06-15
IS4935A (is) 1998-12-23
NO990019L (no) 1999-03-08
US20080050369A1 (en) 2008-02-28
CZ297300B6 (cs) 2006-11-15
CN1242809C (zh) 2006-02-22
NZ333602A (en) 2000-06-23
BR9710264A (pt) 1999-08-10
HUP9904669A3 (en) 2001-06-28
CN1227494A (zh) 1999-09-01
WO1998001145A1 (en) 1998-01-15
CZ2699A3 (cs) 1999-05-12
IL127884A0 (en) 1999-10-28
HUP9904669A2 (hu) 2000-05-28
EP0956030A1 (en) 1999-11-17
TR199900029T2 (xx) 1999-04-21
NO990019D0 (no) 1999-01-04
EA199900091A1 (ru) 1999-08-26
PL331104A1 (en) 1999-06-21
BG63489B1 (bg) 2002-03-29
CA2259962A1 (en) 1998-01-15
PL188408B1 (pl) 2005-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU709550B2 (en) Thereapeutic applications for the anti-T-bam (CD40-L) monoclonal antibody 5c8
RU2192281C2 (ru) Способы и композиции для иммуномодуляции
EP2289534B1 (en) NKG2D antibodies for use in the treatment of rheumatoid arthritis or Crohn&#39;s disease
US20080050369A1 (en) Therapeutic applications of T-BAM (CD40L) technology to treat diseases involving smooth muscle cells
WO2007130642A2 (en) Modulation of nkg2d
KR100567998B1 (ko) 치료용 단백질 저해제 증후군에 대한 ｃｄ154 차단 요법
CA2585156A1 (en) Duffy antigen receptor for chemokines and use thereof
WO1997026000A1 (en) Therapeutic applications of t-bam (cd40-l) technology to treat inflammatory kidney diseases______________________________________
WO1997026000A9 (en) Therapeutic applications of t-bam (cd40-l) technology to treat inflammatory kidney diseases______________________________________
KR100478322B1 (ko) 평활근세포와관련된질병을치료하기위한t－bam(cd４０l)기법의치료적용도
WO2008014035A2 (en) Modulation of nkg2d and method for treating or preventing solid organ allograft rejection
US20050118166A1 (en) Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-1) monoclonal antibody 5C8
MXPA98004342A (en) Therapeutic applications for the monoclonal antibody 5c8 anti-t-bam (cd40