BRPI0010325B1 - dna recombinante isolado, composição farmacêutica e usos de gpvi recombinante isolada - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "glicoproteína vi de receptor de colágeno de plaqueta recombinante e a utilização farmacêutica da mesma". a invenção refere-se à glicoproteína vi (gpvi), seu isolamento, purificação e a processos para a produção recombinante. especialmente, a invenção refere-se ao uso de gpvi, preferencialmente de gpvi recombinante, no tratamento de distúrbios e de eventos patológicos correlacionados diretamente ou indiretamente a distúrbios de coagulação sangüínea tais como doenças trombóticas e cardiovasculares. a proteína recombinante extracelular pode ser ainda utilizada para estabelecer ensaios de seleção para encontrar inibidores potenciais da gpvi ligada à membrana a fim de inibir a ligação de trombócitos e plaquetas, respectivamente, ao colágeno. modificações na gpvi podem ser utilizadas para monitorar a idade da plaqueta e a exposição a doenças trombóticas e cardiovasculares.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DNA RE-COMBINANTE ISOLADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DE GPVI RECOMBINANTE ISOLADA". A presente invenção refere-se à Glicoprotreína VI (GPVI), ao seu isolamento, à sua purificação e a processos para a produção recombinante. Especialmente, a invenção refere-se ao uso de GPVI, preferencialmente de GPVI recombinante, no tratamento de distúrbios e de eventos patológicos correlacionados diretamente ou indiretamente a distúrbios de coagulação sanguínea tais como doenças trombóticas e cardiovasculares. A proteína recombinante extracelular pode ser ainda utilizada para estabelecer ensaios de seleção para encontrar inibidores potenciais de GPVI ligado à membrana a fim de inibir a interação de plaquetas e o colágeno. A GPVI na superfície das plaquetas é modificada durante o tempo de vida da plaqueta in vivo e pode portanto ser utilizada como um marcador do perfil de idade da plaqueta. A Glicoproteína VI é uma glicoproteína de membrana de plaqueta de 62/65 kDa (não-reduzida/reduzida respectivamente) que forma um complexo junto com a subunidade comum Fcy. A subunidade GPVI contém o sítio de ligação do colágeno e a subunidade Fcy é responsável pela sinalização. O complexo forma um dos receptores de colágeno principais na superfície da plaqueta, crítico para a ativação da plaqueta em resposta ao colágeno. A sequência de reconhecimento no colágeno consiste em sequências (GlyProHyp)n. São conhecidos pacientes no Japão que possuem uma deficiência genética de GPVI. Eles possuem problemas de sangramento suave e suas plaquetas respondem somente fracamente ao colágeno, presumivelmente através de outros receptores. Muito foi aprendido sobre as cascatas de sinalização que se originam em GPVI que se assemelham enormemente com aquelas dos receptores imunológicos incluindo os receptores de células T, de receptores de células B e de receptores de células assasi-nas naturais. Estas cascatas envolvem tirosina quinases da família src tais como Fyn e Lyn assim como p72SYK e muitas outras tirosina quinases e fos-fatases e proteínas adaptadoras tal como LAT. Um alvo principal destas cascatas é a ativação de fosfolipase Cy2 que quebra fosfolipídeos para for· necer os segundos diacilglicerol mensageiros e 1P3. Acredita-se que GPV esteja envolvido na ativação da integrina α2β1 de plaqueta que possui ume função principal na adesão da plaqueta na parede do vaso danificada. Ca· mundongos com a subunidade Fcy "nocauteada" possuem plaquetas que ainda exibem respostas ao colágeno implicando que o estado de repouso de α2β1 pode ser regulado pelo complexo GPVI/Fcy. O receptor GPVI de colágeno de plaqueta está intimamente relacionado com os receptores ativadores de assassinos naturais da família p58KAR assim como com FcaR. A adesão e a ativação de plaquetas circulantes em repouso nc local da danificação vascular é a primeira etapa em um processo que conduz à formação de um trombo que é convertido em um bloco hemostático. O colágeno é um dos componentes principais da parede do vaso responsáve pela ativação da plaqueta. Há muitos tipos de colágeno e sete destes sãc encontrados nas camadas subendoteliais. Foram identificados vários receptores diferentes para colágeno em plaquetas mas os principais são considerados agora como sendo integrina α2βι e GPVI não-integrina. Embora α2βι esteja bem caracterizada e ambas as subunidades tenham sido clonadas e seqüenciadas há vários anos, a estrutura de GPVI permaneceu indefinida embora várias características tenham sido identificadas. Foi determinado aproximadamente há vinte anos que GPVI seja uma glicoproteína de plaqueta importante com uma massa molecular na faixa de 60-65 kDa e um pl ácido. Sua função como um suposto receptor de colágeno foi estabelecida após a identificação de um paciente no Japão com um distúrbio de sangra-mento suave cujas plaquetas exibiam um defeito específico de resposta ac colágeno e não possuíam este receptor. Este paciente também desenvolveu auto-anticorpos para o receptor deficiente e estes foram utilizados para caracterizar a molécula adicionalmente. Mais recentemente foi estabelecido que GPVI está associado de forma não-covalente com a subunidade comum de Fcy que atua como a porção sinalizadora do complexo. Foi demonstrado ainda que a sequência de reconhecimento no colágeno para GPVI é um tri- pleto Gly-Pro-Hyp dentro da estrutura de hélice tripla e que peptídeos sintéti cos com base nesta estrutura poderíam ser utilizados como agonistas direto; específicos a GPVI. Foi mostrado que o complexo GPVI/Fcg sinaliza o inte rior da plaqueta através de um mecanismo similar a um receptor imunolpgi co, envolvendo a ativação de p72SYK e levando a uma cascata de intera ções quinase/fosfatase/proteína adaptadora para a ativação de PLCg2 e as sim para a liberação de grânulos e agregação de plaquetas. Uma etapa adi cional na caracterização desta molécula foi a demonstração de que a lectin; do tipo C de cobra, convulxina, da Cascavel Tropical, Crotalus duríssus tern ficus foi capaz de ativar plaquetas pelo agrupamento de GPVI através d( uma interação multimérica. Foi mostrado que a convulxina se liga especifi camente a GPVI fornecendo um processo para purificação deste recepto junto com abordagens estabelecidas.

Assim, é evidente partindo da técnica anterior que GPVI parece ser um composto muito interessante em muitos campos terapêuticos aciiru de tudo em relação às aplicações que estão relacionadas, diretamente oi indiretamente, com eventos de coagulação sangüínea que dependem dí interação colágeno - plaqueta. Era, portanto, objetivo da presente invençãc fornecer GPVI em uma forma recombinante e mostrar süa eficiência comc alvo terapêutico direto ou como ferramenta para a seleção de compostos curtos, especialmente compostos sintetizados quimicamente ou compostos que podiam ser sintetizados que possuíam a capacidade de inibir ou bloque ar a interação plaqueta - colágeno natural. A invenção refere-se também a porções ou fragmentos da prote ína GPVI que mantiveram a sua atividade biológica que é a ligação com c colágeno. A invenção teve sucesso na purificação de quantidades adequa das de GPVI para a caracterização preliminar e para o seqüenciamento dc peptídeo. As sequências foram utilizadas para projetar iniciadores para PCF para identificar uma seqüência positiva em uma biblioteca de DNA. Esta se· qüência de DNA foi então utilizada como uma sonda para isolar uma seqüência de cDNA quase completa partindo da biblioteca e a seqüência 5’ que faltava foi obtida utilizando um processo de RACE partindo de uma bi blioteca de cDNA de plaqueta. A invenção teve também sucesso em mostrar o uso de GPV recombinante como um composto que pode ser aplicado terapeuticamente que é capaz, quando administrado em um paciente com por exemplo vasoí sangüíneos danificados, de se ligar ao colágeno, prevenindo assim que pia quetas que carregam GPVI ligada à membrana se liguem ao dito colágeno O domínio extracelular solúvel recombinante de GPVI contém o sítio de liga ção de colágeno e pode prevenir a ativação das plaquetas pelo colágeno Poderiam ser portanto aplicáveis ao tratamento de doença condições envol· vendo ativação aumentada de plaquetas com colágeno, tal como ruptura ds placa aterosclerótica, em doenças tal como angina instável ou, durante tra· tamento cirúrgico tal como Angioplastia Coronária Transluminal Percutânee (PTCA), onde as artérias são reabertas pelo ato de inflar de um cateter err balão causando danos consideráveis à parede do vaso e muita ativação de plaquetas e resultando freqüentemente no refechamento do vaso mais tarde A vantagem dos fragmentos de GPVI recombinantes comparados aos processos do presente tratamento é de que estes atuam em um estágio anterioi prevenindo ou reduzindo ativação das plaquetas ao invés de suprimindo os eventos após a ativação das plaquetas, tal como a agregação pelos antagonistas GPIIb-llla. Assim, quantidades menores de teores de grânulos de plaquetas são liberados incluindo fatores de crescimento e quimiocinas que estão envolvidas não somente no reparo de feridas como no remodelamentc das paredes de vasos pela migração do músculo liso e na atração de células fagocíticas tais como monócitos conhecidos como sendo contribuidores para aterosclerose. O fragmento Fab de anticorpos monoclonais humanizados de camundongos contra GPVI poderia ser utilizado com efeito similar para bloquear GPVI na superfície da plaqueta com aplicações similares como acima. GPVI recombinante de acordo com esta invenção pode ser também utilizada em um ensaio de ligação ao colágeno para selecionar pequenas moléculas (em bibliotecas combinatórias por exemplo) capazes de inibir esta interação e que podem ser utilizadas para desenvolver compostos tera- pêuticos que são inibidores da interação colágeno - plaqueta, Estes com postos são produzidos de forma disponível oralmente por derivação adequa da. Novamente o objetivo principal é preparar compostos que reduzem aí interações GPVI - colágeno e assim a ativação em situações em que aí plaquetas entram em contato com o colágeno. A tecnologia de seleção comc tal utilizada nesta invenção está bem estabelecida na técnica anterior. Atra· vés de tais ensaios de seleção a invenção possibilita a descoberta e o des envolvimento de novos alvos que podem inibir GPVI ligada à membrana ne superfície das plaquetas como um antagonista do colágeno. Tais alvos que podem ser pequenas moléculas químicas podem então ser a base para ou tras invenções.

Uma outra aplicação principal de GPVI e de reagentes que reco nhecem domínios específicos de GPVI é como marcadores da idade e de funcionalidade da plaqueta. Acredita-se que as plaquetas jovens sejam geralmente mais ativas e funcionais que as velhas. As plaquetas jovens se li gam e são ativadas oela lectina do tipo C convulxina do veneno de cobra que é específica para GPVI e à medida em que envelhecem tanto a ligaçãc quanto o arau de ativação diminuem. Isto pode ser por causa de modificações proteolíticas ou conformacionais na GPVI ou por sua associação corr Fcy por causa da ativação da plaqueta ou dano na circulação. Isto pode sei um parâmetro útil para medir o perfil de idade e de função de plaquetas err pacientes assim como em pessoas normais durante controles médicos. C perfil de idade de plaqueta muda em muitas doenças que afetam a medule óssea ou o sistema imunológico e podería ser um critério diagnóstico importante se métodos melhores para sua determinação estivessem disponíveis Por exemplo, pacientes com doenças envolvendo reutilização aumentada de plaquetas exibirão mais plaquetas jovens enquanto que pacientes em tratamento de quimioterapia ou de radiação exibirão uma população em envelhecimento uniforme. Assim, tal perfil de idade pode ser utilizado para um monitoramento preciso do tratamento. Em uma população saudável se sabe muito pouco sobre a distribuição do perfil de idade e da sua função comc uma previsão de modificações na saúde. Não se sabe se as modificações ne GPVI são por causa do envolvimento parcial das plaquetas nos eventos he· mostáticos e se as modificações pode ser mais pronunciadas em pacientes com doença cardiovascular extensiva. Atualmente o laranja de tiazol é utilizado para detectar plaquetas reticuladas jovens contendo mRNA. Este mRNA decai rapidamente, restringindo o processo somente para as plaque tas mais iovens. Os reaaentes aue poderiam ser utilizados em tal ensaio in cluiriam proteínas do veneno de cobra específicas à GPVI tal como con-vulxina ou anticorpos monoclonais ou policlonais que reconhecem a região l\ terminal de GPVI ou anticorpos monoclonais que reconhecem novos sítios ou conformações expostas pela proteólise do domínio N terminal ou conformações específicas (presentes na molécula intacta e não na envelhecida ol vice-versa ou pequenas identidades químicas selecionadas que reconhecerr especificamente GPVI intacto ou a sua forma modificada. Estes reagentes seriam rotulados com um marcador fluorescente ou junto com um segunde anticorpo rotulado fluorescente ou reagente de afinidade e seriam utilizados em citometria de fluxo para medir o perfil de ligação de plaquetas. Em urr segundo estágio alternativo, poderiam ser adotadas técnicas de medidas intensivas menos trabalhosas baseadas em medidas de perfis de plaquetas Utilizando os processos de seleção de células com citometria de fluxo oi esferas magnéticas seria possível isolar plaquetas jovens e velhas pare examinar os fatores envolvidos na remoção das plaquetas velhas da circulação. Os reagentes que reconhecem formas específicas de GPVI seriam urra explicação para tais estudos.

Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer um DN/1 que codifica a Glicoproteína VI ou fragmentos biológicos ativos da mesma especialmente a sequência da Fig. 2, É um objetivo adicional desta invenção fornecer um DNA que codifica a Glicoproteína VI que compreende as seqüências de aminoá-cidos de Fig. 1a e 1b. É um outro objetivo desta invenção fornecer uma composiçãc farmacêutica que compreende GPVI recombinanté junto com um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável e a utilização da mesma para a fabricação de um medicamento no campo terapêutico de eventos trombolíticos e cardiovasculares e de distúrbios relacionados a interações plaqueta - colágeno.

Um outro objetivo da invenção é a utilização da GPVI recombi-nante em uma ferramenta de seleção para a detecção de inibidores específicos de interações plaqueta - colágeno.

Um outro objetivo da invenção é a utilização de GPVI como utr marcador para a idade e a exposição das plaquetas a doenças cardiovasculares.

As possíveis indicações e aplicações médicas, respectivamente são, por exemplo, angina pectoris instável, PTCA, a utilização de stents neste campo, operações nos vasos coronários, operações gerais em vasos sangüíneos, operações que podem danificar os vasos sangüíneos maiores tais como operações de juntas do quadril. Além disso, são incluídas todas as indicações que se referem aos eventos tromboembólicos causados por distúrbios da interação entre a parede do vaso e o sistema de coagulação corr um alto risco de formação de trombos e de bloqueio dos vasos.

Como indicado acima, a proteína GPVI e fragmentos da mesme de acordo com a presente invenção são adequados como compostos farma-ceuticamente eficientes nas composições e combinações farmacêuticas.

As formulações farmacêuticas de acordo com a invenção poderr compreender opcional mente ingredientes atbíos. como anticoagulantes tal como hirudina ou heparina ou agentes trombóticos tal como ativador de plasminogênio ou hementina ou antagonistas para outros receptores de plaquetas tal como antagonistas de GPIIb-llla como abciximab ou eptifibatide ou antagonistas de receptor de ADP tal como clopidogrel. A nova proteína e seus fragmentos biológicos ativos respectivamente, de acordo com a invenção podem formar sais farmaceuticamente aceitáveis com qualquer ácido orgânico ou inorgânico não-tóxico. Os ácidos inorgânicos são, por exemplo, ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico ou fosfó-rico e os sais metálicos tais como monohidrogeno ortofosfato de sódio e hi-drogenosulfato de potássio. Os exemplos para os ácidos orgânicos são os ácidos mono, di e tricarboxílicos tais como acético, glicólico, láctico, pirúvicc malônico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico maléico, hidroximaléico, benzóico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmico salicílico e ácidos sulfônicos tal como o ácido metano suifônico. Os sais d< porção do amínoácido carbóxi terminal incluem os sais do ácido carboxílic< não-tóxico formados com quaisquer bases inorgânicas ou orgânicas ade quadas. Estes sais incluem, por exemplo, metais alcalino-terroso tais comc sódio e potássio, metais alcalinos terrosos tais como cálcio e magnésio metais leves do Grupo IIIA incluindo alumínio e aminas orgânicas primárias secundárias e terciárias tal como trialquilaminas, incluindo trietilamina, pro caína, dibenzilamina, 1-etenamina, Ν,Ν’-dibenziletileno-diamina, dihidroabie tilamina e N-alquilpiperidina. " Como utilizado aqui, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" significa um enchimento sólido ou líquido, diluente ou matéria para encapsulamento não-tóxico inerte, que não reage adversamente com c composto ativo ou com o paciente. São bem conhecidos na técnica os veí culos adequados, preferencialmente líquidos, tais como (agua estéril, soluçãc salina, dextrose aquosa, soluções de açúcar, etanol, glicóis e óleos, incluin· do os de petróleo, animais, vegetais ou de origem sintética, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral.

As formulações de acordo com a invenção podem ser administradas como doses unitárias contendo veículos, diluentes, auxiliares e veículos farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos convencionais que são típicos para administração parenteral. O termo "parenteral" inclui aqui injeção subcutânea, intravenosa. intraarticular e intratraqueal e técnicas de infusão. São ainda adequadas outras administrações tal como a administração oral e a aplicação tópica. As composições e as combinações parenterais são mais preferencial mente administradas de forma intravenosa seja na forma de um bolo ou na forma de uma fusão constante de acordo com procedimentos conhecidos. Tabletes e cápsulas para administração oral contêm excipientes convencionais tais como agentes aglutinantes, recheios, diluentes, agentes formadores de ta- blete, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes umectantes. Os table tes podem ser revestidos de acordo com processos bem conhecidos na téc· nica.

Preparações líquidas podem estar na forma de suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires ou pode sei apresentadas na forma de um produto seco para reconstituição com água ol um outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas pode conter aditivos convencionais como agentes de suspensão, agentes emulsi-ficantes, veículos não-aquosos e preservantes.

As aplicações tópicas podem ser na forma de suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, geléias ou preferencialmente ungüen-tos em emulsão.

As doses unitárias de acordo com a invenção podem contei quantidades requeridas diariamente da proteína de acordo com a invençãc ou sub-múltiplos das mesmas para constituir a dose desejada. A dosagem ótima farmaceuticamente aceitável e a taxa de dose para um certo paciente (mamíferos, incluindo seres humanos) depende de uma variedade de fatores, tais como a atividade do material ativo específico empregado, a idade, c peso corporal, a saúde geral, o sexo, a dieta, o tempo e a rota de administração, a taxa de eliminação, o objetivo do tratamento, isto é, terapia ou pro-filaxia e a natureza da doença trombótica a ser tratada, a atividade antipla-queta ou anticoagulante.

Portanto, nas composições e combinações úteis como anticoa-gulantes em um paciente tratado (in vivo) uma dose farmacêutica eficaz diária dos peptídeos desta invenção está entre aproximadamente 0,01 e 100 mg/kg em peso corporal, preferencialmente, entre 0,1 e 10 mg/kg em peso corporal. De acordo com a forma de aplicação uma dose única pode conter entre 0,5 e 10 mg de inibidor de colágeno. Para alcançar um efeito anticoagulante no sangue extracorporal uma quantidade farmaceuticamente eficaz dos peptídeos da invenção está entre 0,2 e 150 mg/L preferencialmente entre 1 mg e 20 mg/L de sangue extracorporal.

Breve Descrição das Figuras: Fiq. 1: Seqüência de proteína de GPVI (código de uma letra) Ia: Seqüência líder IJb: Proteína madura Quadro de leitura aberto: 339 aminoácidos Asterisco: Sítio de glicosilação Sublinhado duplo: Domínio transmembrana Sublinhado: Peptídeos seqüenciados Fia. 2: Seqüência de nucleotídeos de GPVI que cobre o quadro de leitura aberto de 1017 bp mais as regiões 3’ e 5' total 1249 bp Descrição detalhada da invenção Duas seqüências de 7 aminoácidos exibindo a menor degenera-ção no código genético foram escolhidas para a síntese dos iniciadores de DNA a fim de amplificar ptécnica do cDNA da GPVI por PCR. Uma vez que a localização de ambos os peptídeos na proteína era totalmente desconhecida, foram preparados, para cada um deles, dois iniciadores deoenerados um sentido e um de anti-sentido . Estes iniciadores foram utilizados para amplificar uma biblioteca de medula óssea humana. A combinação do inicia-dor senso 5' TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3' que codifica a seqüência PAMKRSL com o anti-sentido 5' TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3' urr correspondendo a DQFALYK amplificou um fragmento de DNA de 221 bp, Em adição aos peptídeos selecionados, o DNA amplificado codificou c LysC/AspN peptídeo. DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS, que se liga claramente à seqüência do cDNA para GPVI. A seleção de 600.000 pfu de uma biblioteca de medula óssea com este fragmento de DNA de 221 bp produziu 4 pfu positivas. Três possuíam insertos de 1350 bp fossem estes cortados pelas enzimas de restrição Sall ou pela EcoRI e pertenciam à superfamília IgG. A quarta possuía um inserto de 4,6 kb pela digestão com Sall e forneceu dois fragmentos de 2300 bp e de 1300 bp respectivamente quando tratado com EcoRI. Seu DNA codificou a seqüência para os 10 peptídeos derivados do aminoácido do se-qüenciamento da GPVI mas parava logo próximo ao amino terminai. No pode ser observada metionina de partida ou sequência líder mas mais de 2000 bp do DNA do quadro sem leitura seqüencíado anteriormente termi· nando em uma sequência Alu estavam presentes. O experimento de RACE da extremidade 5’ foi completado em RNA com poli A de plaquetas com ini ciadores em uma porção da sequência GPVI que foi corroborada por aque Ias dos peptídeos. Um fragmento de 348 bp incluindo 278 bp da seqüêncis do quarto clone e 70 bp novos dos 1987 bp correspondentes aos 14 amino ácidos incluindo a primeira metionina foram encontrados antes de recorrer i seqüência de GPVI estabelecida. Assim, um cDNA contendo um total de 1249 bp, uma seqüência 5’ de 25 bp a montante do códon de partida, urr quadro de leitura aberto de 1017 bp que codifica um proteína, incluindo e seqüência líder, com 339 aminoácidos e uma região 3’ de 207 bp incluindo c códon de parada poderíam ser seqüenciados.

Um cDNA que codifica GPVI de plaquetas foi clonado e seqüen ciado partindo de uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana utilizando RACE com mRNA de plaquetas para fornecer a seqüência 5’que falta O quadro de leitura aberto de 1017 bp codifica 339 aminoácidos e uma região 3’ não-traduzida. A análise de hidrofobicidade da seqüência de aminoácidos revelou a presença de dois supostos domínios transmembrana, ume suposta seqüência sinal de 20 aminoácidos e um domínio de 19 aminoácidos entre os resíduos 247 e 265 da proteína madura. A seqüência e sua tradução em aminoácidos são mostradas na Fig. 2 e na Fig. 1. Uma comparação com a seqüência de aminoácidos das moléculas mais similares encontradas em uma busca no GenBank revela claramente que esta pertence è superfamília das imunoglobulinas e que o domínio extracelular contém duas alças de domínio C2 de Ig formadas por duas pontes dissulfeto. Esta é uma molécula de proteína que cruza a membrana de classe um com o N termina no exterior e atravessa a membrana uma vez. As moléculas mais proxima-mente relacionadas pertencem à classe de receptor de assassinos naturais que contém tanto os tipos inibitórios quanto os ativadores. GPVI pertence claramente à subclasse ativadora não somente através da sua função mas também pelo fato de que ao contrário da classe inibitória esta não contém sequências ITIM no seu domínio citoplasmático. Nem contém quaisquer resíduos de tirosina que podem estar envolvidos na fosforilação. Há alguns resíduos de treonina e de serina neste domínio mas estes não combinam quaisquer critérios para seqüências consenso para quinases. Como a classe ativadora de receptores de NK, GPVI contém um resíduo de arginina como o terceiro aminoácido do domínio que cruza a membrana que está envolvido no complexo de formação com a subunidade Fcy. O domínio citoplasmático contém 51 aminoácidos, exibindo somente uma pequena similaridade (na região logo abaixo da membrana) com os domínios citoplasmáticos dos outros membros desta família. Isto.sugere que este domínio em GPVI pode se associar com tipos diferentes de moléculas citoplasmáticas comparado aos outros membros da família. GPVI contém somente um único suposto sítio de N-alicosilacão na Asn69.O domínio loqo acima da membrana após as folhas beta dos domínios Ig terminarem, entretanto, é rico em resíduos de treonina e de serina que poderíam fornecer sítios de O-glicosilação tais como os que são encontrados em GPIba e GPV. A função principal desta O-glicosilação parece ser apresentar as estruturas de receptor bem extensas partindo da superfície da plaqueta para facilitar as interações com outros ligantes de volume. Uma vez que GPVI foi anteriormente estabelecida como uma sialogli-coproteína, a diferença na massa molecular entre a massa de aminoácidos teórica (37 kDa) e a massa determinada por eletroforese em gel (65 kDa reduzida) deve ser devida a esta alicosilação. A estrutura de receptores de assassinos naturais do tipo de dois domínios foi estabelecida por estudos cristalográficos por raio X e foi mostrado que os domínios de duas Ig formam um ângulo agudo com o sítio receptor para os antígenos HLA carregando peptídeo pendendo para fora do ângulo. Uma comparação direta da estrutura do sítio de ligação do peptídeo HLA com a do colágeno sugere imediatamente porque estes receptores possuem uma origem comum porque as várias estruturas em alfa hélice do sítio de ligação com HLA e o peptídeo que este contém se assemelha enormemente à estrutura em hélice tripla do colágeno. É postulado que os receptores de assassinos naturais funcionem através de um mecanismo de dimerização com dois receptores que reconhecem dois sítios separados de HLA na célula que a célula natural assassina está investigando. Possivelmente esta dimerização é ptécnica do mecanismo de ativação e de desativação dependendo da classe do receptor. No caso de GPVI pode havei também a possibilidade de que duas moléculas de GPVI associem-se com um Fcy, uma vez que cada monômero do dímero de Fcy possui uma se-qüência de reconhecimento. Entretanto, a estequiometria não é ainda conhecida e com base na estrutura dos colágenos, os peptídeos semelhantes ao colágeno que atuam através de GPVI e de convulxina, parece provável que a força do sinal esteja relacionada com o número de complexos de GPVI/Fcyque estão agrupados. Outros receptores de plaquetas que pertencem a esta família de Ig incluem ICAM-2 (CD102) e PECAM (CD31).

Todos os microorganismos, linhagens de células, sistemas de expressão, hospedeiros de expressão, plasmídeos, promotores, marcadores de resistência, origens de replicação, sítios de restrição ou outros fragmentos ou ptécnicas de vetores que são mencionados na descrição indiretamente em correlação com a invenção reivindicada estão geralmente disponíveis comercialmente ou de outra forma. Contanto que nenhuma outra indicação seja fornecida, são utilizados somente como exemplos e não são essenciais em relação à invenção e podem ser substituídos por outras ferramentas e materiais biológicos adequados, respectivamente.

As técnicas que são essenciais de acordo com a invenção são descritas em detalhes abaixo e acima. Outras técnicas que não estão descritas em detalhe correspondem a processos padrão que são bem conhecidos por um versado na técnica ou são descritas em maiores detalhes nas referências e pedidos de patentes citados e na literatura padrão (por exemplo Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor; Harlow, Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Materiais - Proteína A-Sepharose, anticorpos anticamundongo e anticoelho de cabra cojugados com peroxidase, albumina de soro bovino, veneno de Crotalus durissus terríficus, aglutinina de germe de trigo (WGA), agarose em esferas 4% reticulada ativada com cloroformiato de N-hidroxisuccinimidila e Triton X-114 eram da Sigma Chemical Co. {St. Louís, MO), Octanoil-N-metil-glucamida (ONMG) e nonanoil-N-metil-glucamida (NNMG) eram da Oxil Chemie (Bobingen, Alemanha).

Exemplo 2: isolamento de GPVI de plaquetas - As glicoproteínas de membrana foram isoladas de plaquetas como descrito anteriormente. Sucintamente, as plaquetas (de 40 coágulos em crosta) foram lavadas e Usadas em Triton X-114 2% na presença de inibidores de protease. O Triton X-114 e as fases aquosas foram separados e a fase de detergente foi carregada em uma coluna de aglutinina de germe de trigo acoplada comJSe-Pharose 4Βί As glicoproteínas de plaqueta foram eluídas com Tris HCI 10 mM, pH 7,4, NaCI 30 mM, octanoil-N-metilglucamida 0,2% (ONMG) e N-acetilglicosamina 2%. Após a diálise e a concentracao, a solução de glicoproteínas foi carregada em uma coluna de convulxina ligada a agarose em esferas a 4% reticulada ativada com cloroformiato de N-hidroxissuccinimidil-p-nitrofenila (1 mg/mL). A coluna foi lavada com 4 volumes de Tris HCI 10 mM, pH 7,4, NaCI 30 mM, nonanoil-N-metilglucamida 0,2% (NNMG) e então com 4 volumes de Tris HCI 10 mM, pH 7,4, NaCI 30 mM, NNMG. A GPVI foi eluída com SDS 0,08% em Tris/HCI 10 mM, pH 7,4. A solução foi concentrada e carregada em um gel preparatório de poliacrilamida a 8,5% utilizando o Model 491 Prep Cell (BioRad, CA). A eletroforese preparatória foi realizada sob condições não-redutoras seguindo as instruções do fabricante. A GPVI foi eluída como uma banda única a 65 kDa., As frações foram agrupadas, concentradas em Cen-tricon-30 (Amicon, Beverly, MA) e ressuspensas em Tris/HCI 10 mM, pH 7,4, ONMG 0,1%.

Exemplo 3: Análise de aminoácidos de GPVI - GPVI foi digerida com as en-doproteinases LysC e AspN (Boehringer Mannheim, Alemanha). Os 10 peptídeos gerados foram separados por HPLC de fase reversa e seqüencia-dos em um seqüenciador de proteína de fase líquida pulsada modelo 477A da Applied Biosystem com um analisador de aminoácidos de feniltiohidan-toína on-line modelo 120-A.

Exemplo 4: Amplificação de um fragmento de 221 bp que codifica ptécnica de GPVi de uma biblioteca de cDNA de Àgt11 - Uma amostra (1010 pfu) (unidades formadoras de placas) de uma biblioteca de medula óssea humana (Clonetech, Paio Alto, CA) foi amplificada utilizando 2 combinações de 4 iniciadores degenerados. As concentrações finais de iniciadores eram de 2 μΜ, a concentração de dNTP era de 200 μΜ e foram utilizadas 2U/100 μι de reação de AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Rotkreuz, Suíça). As condições de PCR eram 5 ciclos a 37°C seguidos por 30 ciclos a 44°C. O 19mer TYATHCCNGCNATGAARMG 3' de sentido 5'TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3' amplificaram um fragmento de 221 bp que foi subclonado em Bluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) e seqüenciado utilizando o kit T7 Sequenase (Amersham, Suíça).

Exemplo 5: Seleção da biblioteca de cDNA de Àgt11 com a sonda de GPVi de 221 bp~ O fragmento de 221 bp foi cortado do plasmídeo, limpo e rotulado com a32P-ATP (20MBq/50 pL, Hartmann Analytik, Braunschweig, Alemanha) utilizando o kit High Prime Labelling (Boehringer Mannheim, Suíça). A biblioteca de medula óssea humana foi selecionada seguindo as instruções do fabricante. Os fagos positivos foram crescidos, seus DNAs foram isolados e subclonados em BlueScript utilizando os sítios EcoRI ou Sall seqüencia-dos. O seqüenciamento foi realizado utilizando o sistema ABS do RACE - O RNA poli A de plaquetas foi preparado como descrito anteriormente (Power e outros, Cytokine 7, 479-482, 1995). A transcrição reversa (30 pL) foi realizada utiiizanndo 5 pg de RNA poli A com o iniciador 5TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC3' (20 μΜ), dNTP (1 mM), RNAsin (40 U), tampão AMV 1X e transcriptase reversa AMV 20 U durante 20 minutos a 45°C seguidos por 20 minutos a 52°C. A mistura de reação foi tratada com 2 pL de NaOH 6N a 65°C durante 30 minutos, neutralizada com 2 pL de ácido acético 6N e concentrada em um Centricon 30 (Amicon). Uma âncora foi ligada ao primeiro filamento de DNA seguindo o protocolo de Aptes e Siebert (BioTechniques 15: 890-893, 1993). Foi realizada uma aninhada PCR utilizando um iniciador complementar à âncora e o iniciador 5‘ TTGTACAGA-GCAAATTGGTC 3' (35 ciclos, 55°C) e seguido pelo iniciador 5' GACCA- GAGGCTTCCGTTCTG 3’ {30 ciclos, 53°C). A banda mais alta (350 bp) foi separada por eletroforese em agarose das mais baixas, subclonada em BlueScript e seqüenciada.

Exemplo 6: Preparação de Fab e F(ab’)2 anti-GPVI - Anti-soros policlonais contra GPVI humana foram gerados em coelhos. IgG de anti-soro anti-GPVI de coelho foi purificada como descrito. A diaestão de laG com Daoaína imobilizada (Pierce) para gerar fragmentos de Fab foi realizada de acordo com o protocolo padrão do fornecedor. Os fragmentos de Fab foram separados das IgG não-digeridas e dos fragmentos Fc utilizando uma coluna com Proteína A imobilizada (Sigma). O fluxo transversal foi transferido para um tubo de diálise, concentrado utilizando polietilenoglicol 20.000 sólido, submetido vigorosamente à diálise contra Hepes 20 mM, NaCI 140 mM, KCl 4 mM, pH 7,4 e armazenado a 4°C até o uso. Os fragmentos de F(ab’)2 foram preparados pela digestão com pepsina de IgG, na proporção enzima para substrato de 1:50 (p/p), em tampão acetato 0,5 M, pH 4,0, a 37°C durante 18 h. O pH foi corrigido para 7,4 com NaOH diluído e a amostra foi submetida à diálise contra fosfato 20 mM, pH 7,4. Os fragmentos de F(ab')2 foram separados de IgG não-digerida e de fragmentos de Fc utilizando cromatografia com Proteína A. O fluxo transversal foi transferido para o tubo de diálise, concentrado utilizando polietilenoglicol 20.000 sólido, submetido vigorosamente à diálise contra Hepes 20 mM, NaCI 140 mM, KCl 4 mM, pH 7,4 e armazenado em alíquotas a -20°C. As plaquetas lavadas foram lisadas em Triton X-114 e a fase de separação foi realizada no material solúvel antes de isolar as gli-coproteínas de membrana associadas com a fase de Triton X-114 por cromatografia de afinidade em Sepharose 4B - aglutinina de germe de trigo como descrito anteriormente. Como GPVI reoresenta uma fração muito oe-' quena do conjunto de glicooroteína de membrana de olaauetas. foi utilizada a especificidade da çonvulxina '$la lectina do tipo C de coora para o isolamento deste receptor. A cromatografia de afinidade na convulxina acoplada com a Sepharose 4B forneceu uma proteína de 65 kDa como o produto principal. Entretanto, o material não-caracterizado de Mr tanto maior quanto menor co-eluído com GPVI e não podia ser removido pela lavagem completa da coluna. A eletroforese preparatória em gel em poliacrilamida a 8,5% foi adicionada como uma etapa final da purificação. As frações contendo GPVI foram agrupadas e forneceram uma banda única na reanálise. Foi observado um efeito inibitório suave quando alíquotas de solução de GPVI foram adicionadas à suspensão de plaquetas. Entretanto, através da pré-incubação de GPVI com colágeno antes de adicionar a mistura à suspensão de plaquetas, a agregação podia ser inibida de uma forma dependente da dose. Estas pla-quetas ainda se agregavam quando colágeno fresco era adicionado. Sob condições não-redutoras, a proteína isolada possuía um Mr de 62 kDa com uma tendência em direção para um Mr levemente maior (65 kDa) sob condições redutoras. Como foi descoberto que o terminal amino da GPVI estava bloqueado, a proteína foi digerida com as enzimas LysC e LysC/AspN que produziram 4 e 6 peptídeos, respectivamente, dos quais a sequência foi obtida. Os peptídeos foram separados por HPLC de fase reversa em uma coluna C4 e seqüenciados utilizando o método de Edman. As sequências de aminoácidos destes peptídeos estão sublinhadas na seqüência de cDNA traduzida (Fig. 1).

Claims (4)

1. DNA recombinante isolado, caracterizado pelo fato de compreender a, ou consistir da, sequência de acordo com SEQ lO N0:1.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de comp,re- ender a Glicoproteína VI recombinante isolada (GPVI) compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ lO N0:3 e um carreador farmaceuticamente aceitável, com a condição de que o carreador seja diferente de água.

3. Uso de GPVI recombinante isolada compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N0:3, caracterizado pelo fato de ser em uma ferramenta de seleção para detecção de inibidores específicos de interações plaqueta-colágeno mediadas por GPVI.

4. Uso de GPVI recombinante isolada compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ lO N0:3, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento no campo terapêutico de eventos trombóti- cos e cardiovasculares e distúrbios relacionados com interações plaquetacolágeno mediadas por GPVI.