CN108291917A - 检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法 - Google Patents

检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了以高灵敏度和特异性检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)和特异性结合裂解的HMWK的分离的抗体的免疫测定方法。

Description

检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119要求于2015年10月19日提交的美国临时申请第62/243,505号和于2016年5月12日提交的美国临时申请第62/335,311号的权益，其每一个的全部内容通过引用纳入本文。
背景技术
激肽原(kininogen)是激肽如缓激肽和胰激肽的前体。存在两种类型的人激肽原，即高分子量激肽原(HMWK)和低分子量激肽原(LMWK)，它们是剪接变体。HMWK主要作为凝血和炎症的辅因子，并且是用于血浆激肽释放酶(pKal)介导的缓激肽生成的优选底物。
血浆激肽释放酶(pKal)是循环中主要的缓激肽生成酶。pKal的激活通过与疾病病理学相关的接触系统发生，所述疾病病理学与遗传性血管性水肿(HAE)相关。pKal裂解HMWK(单链多肽)以产生缓激肽和裂解形式的HMWK，其含有通过二硫键保持在一起的两条多肽链。Cugno等，Blood(1997)89：3213-3218。
在遗传性血管性水肿(HAE)发作期间，裂解的HMWK增加至总激肽原的约47％(Cugno等，Blood(1997)89：3213-3218)，使其成为监测HAE发作的生物标志物。因此，开发敏感和可靠的测定法以检测生物样品中裂解的HMWK的水平是有意义的。
发明内容
本公开的一些方面提供一种用于以高灵敏度和特异性检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)的免疫测定方法。所述方法包括：(i)提供支持构件，在所述支持构件上附接特异性结合裂解的HMWK的第一试剂(例如，诸如559B-M004-B04的抗体)；(ii)使(i)的支持构件与疑似含有裂解的HMWK的生物样品接触；(iii)使(ii)中获得的支持构件与结合HMWK的第二试剂接触，其中所述第二试剂缀合至标记物；和(iv)直接或间接检测从结合至支持构件的第二试剂的标记物释放的信号，以确定生物样品中裂解的HMWK的水平。在一些情况下，步骤(ii)可在ZnCl2的存在下进行。
在一些实施方案中，在步骤(ii)之前，(i)的支持构件用封闭缓冲液培养。
在一些实施方案中，所述第二试剂是多克隆抗体、单克隆抗体或结合至HMWK的两种或更多种单克隆抗体的混合物。在所述混合物中的两种或更多种单克隆抗体可结合至HMWK中的不同表位。在一些实施方案中，所述标记物是信号释放剂。在一些实施方案中，所述标记物是受体-配体对的一个成员。在此情况下，所述免疫测定方法还可包括在步骤(iv)之前，使(iii)中的固定在支持构件上的第二试剂与受体-配体对的另一成员接触，其中所述另一成员缀合至信号释放剂。在一个实例中，所述受体-配体对是生物素和链霉亲和素。
本公开的另一个方面提供用于检测在样品中裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法，所述方法包括：(i)使疑似含有裂解的HMWK的样品与本文描述的任一种抗体(例如559B-M004-B04)接触；(ii)测量步骤(i)中形成的裂解的HMWK和抗体的复合物；和(iii)基于步骤(ii)的结果确定样品中裂解的HMWK的水平。在一些实施方案中，步骤(i)在ZnCl2的存在下进行。在一些实施方案中，步骤(i)使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)或免疫印迹测定法进行。
在本文中描述的任一种方法中，所述样品可以是从受试者(例如人受试者)获得的生物样品，例如血浆样品或血清样品。在一些实施方案中，所述方法还包括将样品收集到包含一种或多种蛋白酶抑制剂的真空血液收集管中。
本文中描述的任一种测定方法(例如免疫测定方法)可以是ELISA测定法、Western印迹测定法或侧向流测定法。
在一些实施方案中，所述生物样品从具有疾病的受试者(例如人患者)获得。所述测定方法还可包括基于裂解的HMWK的水平确定疾病是否由血浆激肽释放酶介导，样品中裂解的HMWK的水平与对照样品裂解的HMWK的水平的偏差表示疾病由血浆激肽释放酶介导。
本文中描述的任一种测定方法还可包括基于裂解的HMWK的水平鉴定具有由血浆激肽释放酶介导的疾病或紊乱的患者，或评价疾病或紊乱的治疗功效。在一些实施方案中，所述方法还可包括：如果所述受试者被鉴定为具有所述障碍，则向所述受试者施用有效量的用于治疗所述紊乱的治疗剂，例如血浆激肽释放酶(pKal)抑制剂、缓激肽2受体(B2R)抑制剂和/或C1酯酶抑制剂。在一些实施方案中，所述pKal抑制剂是抗pKal抗体。在一些实施方案中，所述治疗剂是兰达鲁单抗(lanadelumab)、艾卡拉肽(ecallantide)、艾替班特(icatibant)或人血浆衍生的C1酯酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述受试者是在接受对紊乱治疗的人患者，并且其中所述方法还包括基于步骤(iii)中确定的裂解的HMWK的水平评价所述治疗的功效，来自受试者的样品中裂解的HMWK的水平与对照样品的水平的偏差表示治疗功效。在一些实施方案中，所述方法还包括基于裂解的HMWK的水平确认受试者的合适的治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括基于裂解的HMWK的水平将所述受试者鉴定为用于治疗所述疾病的候选者。
在一些实施方案中，所述人患者具有疾病(例如HAE)的病史。在一些实施方案中，所述方法还包括基于裂解的HMWK的水平评价受试者疾病发作的风险，来自受试者的样品中裂解的HMWK的水平与对照样品的水平的偏差表示疾病发作的风险。在一些实施方案中，所述方法还包括如果所述受试者处于疾病发作的风险中，则向所述受试者施用治疗剂。
在另一方面，提供用于检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合裂解的HMWK的第一试剂(例如本文中描述的抗体)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括结合HMWK的第二试剂、支持构件、或第二试剂和支持构件两者，以及任选的用于检测裂解的HMWK的说明书。在一些实施例中，所述支持构件是96孔板。
在本公开的另一个方面，提供分离的抗体，其特异性结合裂解的高分子量激肽原(HMWK)。在一些实施方案中，所述抗体结合与559B-M004-B04相同的表位，或与559B-M004-B04竞争结合至裂解的HMWK。在一些实施方案中，所述抗体包括与559B-M004-B04相同的重链互补决定区和轻链互补决定区，例如与559B-M004-B04相同的重链可变区和轻链可变区。在一个实例中，所述抗体是559B-M004-B04。
本文描述的对于裂解的HMWK特异的任一种抗体可被用于检测样品中的裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法中。这种方法可以包括：(i)使疑似含有裂解的HMWK的样品与抗体接触；(ii)测量步骤(i)中形成的裂解的HMWK和抗体的复合物；和基于步骤(ii)的结果确定样品中裂解的HMWK的水平。在一些实施方案中，所述样品是生物样品，例如由人受试者获得的血清样品或血浆样品。可依赖由该方法获得的结果以确定从其获得样品的受试者发展由血浆激肽释放酶介导的紊乱，如HAE的风险。在一些实施方案中，步骤(i)可在ZnCl2的存在下进行。
本文中描述的任一个免疫测定方法可以是Western印迹形式或ELISA形式。
在又一个方面，提供结合完整的高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK两者的分离的抗体。
在一些实施方案中，结合完整的HMWK和裂解的HMWK两者的抗体不结合至低分子量激肽原(LMWK)。在一些实施方案中，所述抗体与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗体与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08竞争结合至完整的HMWK和/或裂解的HMWK。
在一些实施方案中，所述抗体包括与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08相同的重链CDR和轻链CDR。在一些实例中，所述抗体选自由以下构成的组：559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01和559B-M0004-E08。
在另一些实施方案中，结合完整的HMWK和裂解的HMWK两者的抗体还结合LMWK。在一些实施方案中，所述抗体与559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559B-M0064-H02或559B-M0065-B10结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗体与559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559-M0064-H02或559B-M0065-B10竞争结合至完整的HMWK、裂解的HMWK和/或LMWK。
在一些实施方案中，所述抗体包括与559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559B-M0064-H02或559B-M0065-B10相同的重链CDR和轻链CDR。在一些实例中，所述抗体选自由以下构成的组：559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559B-M0064-H02和559B-M0065-B10。
在下面的描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的细节。根据以下附图和几个实施方案的详细描述以及所附权利要求，本公开的其他特征或优点将显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本公开的某些方面，参考这些附图中的一个或多个结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开的某些方面。
图1是显示在指定的ELISA条件下将559B-M0004-B04结合至完整的HMWK(深灰色条)或裂解的HMWK(浅灰色条)的图。
图2呈现显示各种Fab克隆结合至完整的1-链(完整的)HMWK、2-链(裂解的)HMWK或LMWK的图。A：使用本文所述的噬菌体展示筛选方法鉴定的Fab克隆。完整的HWMK以深灰色条显示，裂解的HMWK以浅灰色条显示，并且LMWK以中灰色条显示。B：对于几个实例Fab克隆的结合。LWMK以深灰色条显示，完整的HMWK以浅灰色条显示，并且裂解的HWMK以中灰色条显示。
图3是显示559B-M0004-B04对完整的HMWK、裂解的HMWK或LMWK的特异性的图。将纯化的裂解的HMWK掺入SBT测定缓冲液(圆圈)或HMWK缺陷血浆(正方形)中。将纯化的完整的HMWK掺入SBT测定缓冲液(三角形)中。将纯化的LMWK掺入SBT测定缓冲液(菱形)中。y轴表示以吸光度单位计的ELISA信号，并且x轴呈现以μg/mL计的激肽原浓度。
图4是显示在血浆或测定缓冲液中2-链HMWK(裂解的HMWK)的检测图。将纯化的裂解的HMWK掺入SBT测定缓冲液(空心圆圈)，SBT测定缓冲液中并在10％血浆的存在下分析(正方形)，或掺入HMWK缺陷血浆中并在10％血浆的存在下分析(三角形)。还将纯化的裂解的HMWK掺入测定缓冲液中并在2.5％血浆的存在下分析(菱形)或掺入HMWK缺陷血浆中并在2.5％血浆的存在下分析(实心圆圈)。y轴表示以吸光度单位计的ELISA信号，并且x轴表示以μg/mL为单位的激肽原浓度。
图5是显示在接触系统激活之前和之后，所示人血浆样品中裂解的HMWK水平的图。A：用FXIIa或鞣花酸激活接触系统之前和之后。B：用FXIIa、pKal或鞣花酸激活接触系统之前和之后。
图6是显示在用鞣花酸激活接触系统之前和之后来自12名正常人供体的血浆样品中裂解的HMWK水平的图。
图7呈现显示用pKal抑制剂抑制后裂解的HMWK水平的图。A：在用鞣花酸激活接触系统之前用兰达鲁单抗/DX-2930或C1-INH进行抑制。B：在用10nM FXIIa激活接触系统之前用兰达鲁单抗/DX-2930抑制混合的柠檬酸钠血浆样品。
图8是显示在用FXIIa或鞣花酸激活接触系统后的指定时间点处裂解的HMWK产生的图。
图9是显示来自正常受试者和具有HAE的受试者的血浆样品中2-链HMWK的水平的图。
图10是显示由HMWK Western印迹分析法获得的结果的照片，其与由本文所述的2-链HMWK ELISA测定法获得的结果一致。用小鼠单克隆抗HMWK轻链抗体、然后用山羊抗小鼠检测抗体探测人柠檬酸化血浆样品(正常血浆、FXII缺陷血浆和前激肽释放酶缺陷血浆)。分析的血浆样品未经处理或用100nM pKal、10nM FXIIa或10％鞣花酸激活。
图11是显示在柠檬酸化或EDTA血浆样品中加入ZnCl2增加ELISA测定法中2-链HMWK的信号的图。x轴显示40倍稀释后测定孔中ZnCl2的浓度。
图12呈现使用本文所述的抗体的测定法的发现和开发的示意图。A：用于发现2-链HMWK结合抗体的噬菌体展示方法的示意图。B：示例性夹心ELISA测定法，其中将2-链HMWK特异性抗体/Fab(例如559B-M0004-B04)固定在96孔板中以捕获柠檬酸化血浆中的2-链HMWK，接着洗涤并用缀合至标记物的抗HMWK抗体(抗HMWK-HRP)检测。
图13是显示来自2-链HMWK夹心ELISA标准曲线的结果的图，其中柠檬酸化血浆样品掺入有2-链HMWK(10％最终稀释)。
图14显示通过噬菌体展示选择和筛选鉴定2-链HMWK特异性抗体。A：对于测试的每种抗体(Fab)，绘制y轴上的2-链HWMK结合测定的结果与LMWK结合测定的结果的比率相对于x轴上的2-链HMWK结合测定结果与1-链HMWK结合测定结果的比率。在添加生物素化的2-链HMWK、1-链HMWK或LMWK，然后链霉亲和素-HRP之前，将重组Fab片段被动固定到384孔板上。B：显示对于所示分离的Fab片段结合至1-链HMWK、2-链HMWK或LMWK。
图15是显示2-链HMWK和激肽原肽(HKH20和GCP28)竞争结合至559B-M0004-B04的图。
图16是显示用于检测人血浆样品中的2链HMWK的优化夹心ELISA的标准曲线的图。
图17呈现比较来自健康受试者和HAE患者的柠檬酸化血浆样品中2-链HMWK水平的Western印迹分析图。A：散点图，其比较HAE发作(“基础”)和HAE发作期间(“发作”)之间来自健康受试者(“HV”)和HAE患者的样品中的2-链HMWK百分比。B：ROC(接受者操作特征)分析，其比较对于HAE基础样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.977)。C：ROC分析，其比较对于HAE发作样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝1)。D：ROC分析，其比较对于HAE发作样品与HAE基础样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.625)。
图18呈现比较来自健康受试者和HAE患者的SCAT169血浆样品中2-链HMWK水平的Western印迹分析图。A：散点图，其比较HAE发作(“基础”)和HAE发作期间(“发作”)之间来自健康受试者(“HV”)和HAE患者的样品中的2-链HMWK百分比。B：ROC分析，其比较对于HAE基础样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.915)。C：ROC分析，其比较对于HAE发作样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.967)。D：ROC分析比较对于HAE发作样品与HAE基础样品的检测的敏感性和特异性(AUC＝0.597)。
图19呈现比较来自健康受试者和HAE患者的柠檬酸化血浆样品中2-链HMWK水平的ELISA分析图。A：散点图，其比较HAE发作(“基础”)和HAE发作期间(“发作”)之间来自健康受试者(“HV”)和HAE患者的样品中的2-链HMWK百分比。B：ROC分析，其比较对于HAE基础样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.795)。C：ROC分析，其比较对于HAE发作样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.866)。D：ROC分析比较对于HAE发作样品与HAE基础样品的检测的敏感性和特异性(AUC＝0.709)。
图20呈现比较来自健康受试者和HAE患者的SCAT169样品中的2-链HMWK水平的ELISA分析图。A：散点图，其比较HAE发作(“基础”)和HAE发作期间(“发作”)之间来自健康受试者(“HV”)和HAE患者的样品中的2-链HMWK百分比。B：ROC分析，其比较对于HAE基础样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.999)。C：ROC分析，其比较对于HAE发作样品与健康受试者样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝1)。D：ROC分析，其比较HAE发作样品与HAE基础样品的检测的灵敏度和特异性(AUC＝0.8176)。
具体实施方式
血浆激肽释放酶(PKal)是接触系统的丝氨酸蛋白酶组分，并且是循环中主要的缓激肽生成酶。在暴露于外来的或带负电荷的表面时通过因子XIIa(因子XII或FXII的活性形式)或者在内皮细胞表面上通过脯氨酰羧肽酶，接触系统被激活(Sainz IM等，ThrombHaemost98,77-83,2007)。血浆激肽释放酶的激活通过其因子XII的反馈激活而放大内在凝固，并且蛋白水解裂解激肽原前体、高分子量激肽原(HMWK)，释放促炎性九肽缓激肽和裂解的HMWK，其含有通过二硫键连接的两条多肽链(也称为2-链HMWK)。
作为循环中的主要激肽原酶，血浆激肽释放酶主要负责脉管系统中缓激肽的生成。C1抑制蛋白(C1-INH)的遗传缺陷导致遗传性血管性水肿(HAE)。具有HAE的患者遭受通常由未知触发物沉淀的疼痛性水肿的急性发作(Zuraw B.L.等，N Engl J Med 359，1027-1036，2008)。通过在动物模型中使用药理学试剂或基因研究，血浆激肽释放酶-激肽系统(血浆KKS)已经涉及各种疾病。
发现裂解的HME的水平在HAE发作以及其他pKal相关疾病中升高。因此，裂解的HMWK可以充当用于监测疾病发展和/或治疗功效的生物标志物。然而，本领域缺乏可以有效区分完整的HMWK与其裂解形式的合适的试剂和/或合适的测定方法。
本公开至少部分基于允许以高特异性和灵敏度检测裂解的HMWK的特定的免疫测定方法的开发。观察到与其中将抗原(在这种情况下，裂解的HMWK)固定在支持构件上的ELISA设置相比，其中将特异性结合裂解的HMWK的试剂固定在支持构件(例如多孔板)上的夹心ELISA出乎意料地提高了检测效率。此外，出乎意料地观察到，使用LowCross封闭缓冲液(含有酪蛋白)而不是含有牛血清蛋白(BSA)的封闭缓冲液，在初始筛选以发现对裂解的HMWK特异性的抗体期间提高了检测的特异性和灵敏度。此外，与384孔板相比，当使用96孔板时，检测特异性和灵敏度进一步提高。本公开还至少部分地基于分离特异性结合裂解的HMWK的抗体。
因此，本文提供了用于使用特异性结合裂解的HMWK(例如，分子量为46kDa的裂解的HMWK)的试剂(例如，抗体)检测疑似含有HMWK物种的生物样品中裂解的HMWK的存在或测量其水平的免疫测定方法。考虑到裂解的HMWK的水平与pKal相关或由pKal介导的紊乱(例如，HAE)之间的相关性，本文所述的免疫测定方法可以用于鉴定处于这种疾病风险中的患者、监测疾病进展和/或监测针对这种紊乱的治疗效果。
I.用于特异性检测裂解的HMWK的免疫测定方法
本公开的一个方面涉及用于以高灵敏度和特异性检测裂解的HMWK的免疫测定方法。该免疫测定方法可涉及夹心ELISA，其中特异性结合裂解的HMWK的试剂固定在可为96孔板的支持构件上。本文描述的免疫测定方法允许选择性检测生物样品(例如血清样品或血浆样品)中的裂解的HMWK，其可包含完整的HMWK和裂解的HMWK以及LMWK。
(i)高分子量激肽原
高分子量激肽原(HMWK)作为分子量约110kDa的单个多肽(1-链)多结构域(结构域1-6)蛋白质存在于血浆中，在本文中称为完整的HWMK。编码HMWK的人类基因是激肽原1(KNG1)。KNG1被转录和选择性剪接以形成编码HMWK或低分子量激肽原(LMWK)的mRNA。下面提供了HMWK的示例性蛋白质序列：
>gi|156231037|ref|NP_001095886.1|激肽原-1同种型1前体[智人(Homosapiens)]
MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQMKESYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:1)
例如，可以使用促凝剂或免疫学方法，如放射免疫测定方法(参见例如Kerbiriou-Nabias，D.M.，Br J Haematol，1984,56(2)：2734-86)测定完整的HMWK，在文中也称为“完整的激肽原”。人HMWK轻链的单克隆抗体是已知的。参见例如Reddigari,S.R.&Kaplan,A.P.，Blood，1999,74：695-702。也可以使用依赖于显色底物的HMWK测定法。参见例如Scott,C.F.等，Thromb Res,1987,48(6):685-700；Gallimore,M.J.等.Thromb Res,2004,114(2):91-96。
HMWK在结构域4内被pKal裂解以释放9个氨基酸的促炎性肽-缓激肽和HMWK的2-链形式，在此称为裂解的HMWK。HMWK的2个链是包含结构域1-3的重链，以及包含结构域5和6的轻链，其通过二硫键连接。在完整的HMWK的初始裂解后，重链和轻链分别具有约65kDa和56kDa的分子量。进一步的蛋白水解过程引起46kDa轻链的生成。
以下提供了裂解的激肽原的重链和轻链的示例性序列。
>裂解的激肽原-1重链
QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ ID NO:2)
>裂解的激肽原-1轻链
SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQMKESYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:3)
(ii)对裂解的HMWK特异性的抗体
本文所述的免疫测定方法可以使用可以特异性结合裂解的HMWK的任何试剂，例如识别在裂解的HMWK上的新表位的试剂，该新表位在完整的HMWK上不存在。在一些实施方案中，结合裂解的HMWK的试剂是抗体。
抗体(可互换地以复数形式使用)是通过至少一个抗原识别位点能够特异性结合至靶标(例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子，所述抗原识别位点位于免疫球蛋白分子的可变区。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整(即全长)的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定的类别。取决于其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别。存在五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
本文所述的任何抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同源抗体群体，“多克隆抗体”是指异源抗体群体。这两个术语不限制抗体的来源或其制造方式。
“特异性结合”裂解的HMWK或其表位的抗体是本领域公知的术语，并且确定此类特异性结合的方法在本领域中也是众所周知的。如果分子与特定的靶抗原(此处为裂解的HMWK)比其与替代靶标(例如，完整的HMWK和/或LMWK)更频繁、更快速地以更长持续时间和/或更高亲和力反应或缔合，则该分子被认为是表现出“特异性结合”。如果抗体比其结合至其他物质以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更长持续时间结合，则抗体“特异性结合”至靶抗原。例如，特异性(或优先)结合至裂解的HMWK或其中的表位的抗体是与结合至其他抗原(例如，完整的HMWK或LMWK)或相同抗原中的其他表位相比以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更长持续时间结合该靶抗原的抗体。通过阅读该定义也可以理解，例如，特异性结合至第一靶抗原的抗体可以特异性或优先结合至第二靶抗原或可以不特异性或优先结合至第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管它可以包括)独占结合。通常但不一定，提及结合意味着优先结合。
在一些实施方案中，文中描述的特异性结合裂解的HMWK(以及结合裂解的HMWK和完整的HMWK两者和任选的LMWK的其他抗体)的抗体对裂解的HMWK(或如本文所述的另一种靶抗原)具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的抗体可具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低的结合亲和力(KD)。增加的结合亲和力对应于降低的KD。相对于第二靶标，抗体结合至第一靶标的更高亲和力可以由相对于用于结合第二靶标的KA(或数值KD)，用于结合第一靶标的更高的KA(或更小的数值KD)来表示。在这种情况下，抗体相对于第二靶标(例如，第二构象形式的相同蛋白质或其模拟物；或第二蛋白质)具有对第一靶标(例如，第一构象形式的蛋白质或其模拟物)的特异性。结合亲和力的差异(例如，针对特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或105倍。例如，如本文所述的特异性结合裂解的HMWK的抗体的结合亲和力可以是该抗体对完整的HMWK和/或LMWK的结合亲和力的10倍、100倍、10,000倍或105倍。
结合亲和力可以通过多种方法测定，所述方法包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱学(例如使用荧光测定法)。评价结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，50mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可用于测量作为靶蛋白浓度的函数的已结合的结合蛋白(bound bindingprotein)的浓度。已结合的结合蛋白([已结合的])的浓度与游离靶蛋白([游离的])的浓度和靶标上结合蛋白的结合位点的浓度相关，通过以下等式表示，其中(N)是每个靶分子的结合位点的数目：
[已结合的]＝[N][游离的]/(Kd+[游离的])
然而，并非总是需要精确确定KA，因为有时足以获得与KA成比例的亲和力的定量测量(例如使用诸如ELISA或FACS分析的方法测定)并且因此可以用于比较，例如确定较高的亲和力(例如2倍高)是否获得亲和力的定性测量结果或者获得对亲和力的推断，例如通过功能测定(例如体外或体内测定)中的活性。
在一些实施方案中，特异性结合至裂解的HMWK的抗体(也称为抗裂解的HMWK抗体)结合至与559B-M004-B04相同的裂解的HMWK的表位。“表位”是指靶抗原上的被结合蛋白(例如抗体，如Fab或全长抗体)结合的位点。该位点可以完全由氨基酸组分组成，完全由蛋白质的氨基酸的化学修饰(例如糖基部分)组成，或由其组合组成。覆盖型表位包括至少一个公共的氨基酸残基、糖基、磷酸基、硫酸基或其他分子特征。在某些情况下，表位是线性的；在其他情况下，表位是构象的。
如果第一抗体结合至靶抗原上的与第二抗体结合的相同位点，或者结合至例如就氨基酸序列或其他分子特征(例如，糖基、磷酸基或硫酸基)方面与第二抗原结合的位点重叠的位点(例如50％、60％、70％、80％、90％或100％重叠)，则第一抗体与第二抗体一样“结合至相同的表位”。
在一些实施方案中，特异性结合至裂解的HMWK的抗体与559B-M004-B04竞争结合至HMWK。如果第一抗体与其表位的结合减少了结合至其表位的第二抗体的量(例如减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)，则第一抗体与第二抗体“竞争结合”。竞争可以是直接的(例如，第一抗体结合至与第二抗体所结合的表位相同或与其重叠的表位)，或间接的(例如，第一抗体与其表位的结合导致靶抗原的立体变化，其降低了第二抗体结合其表位的能力)。
在一些实施例中，特异性结合至裂解的HMWK的抗体包括VH链，所述VH链包括与559B-M004-B04的相应VH CDR至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3。可替选地或另外地，特异性结合至裂解的HMWK的抗体包括与559B-M004-B04的相应VL CDR至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方案中，特异性结合至裂解的HMWK的抗体具有与559B-M004-B04相同的重链互补决定区(CDR)和/或轻链互补决定区(CDR)。
本领域已知“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内氨基酸的非连续序列。通常，每个重链可变区中有三个(3)CDR，每个轻链可变区中有三个(3)CDR。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种容易地确定，所述方案包括由Kabat等，(1991),第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(Kabat"编号方案)；Al-Lazikani等,(1997)JMB273,927-948(Chothia"编号方案)；MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)(接触编号方案)；Lefranc M P等,Dev Comp Immunol,2003January；27(1):55-77(IMGT编号方案)；和Honegger A和Pluckthun A，J Mol Biol,2001Jun.8；309(3):657-70,(AHo编号方案)记载的方案。
给定CDR的边界可根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案则基于结构信息。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。因此，除非另外指明，否则给定抗体的术语“互补决定区”或“CDR”应理解为涵盖如上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。
如果通过相同的编号方案确定抗体具有与559B-M004-B04(以及本文公开的其它示例性抗体)相同的VH CDR和/或VL CDR，则认为这样的抗体具有与559B-M004-B04(或本文公开的其他示例性抗体)相同的CDR，并且该抗体在本公开的范围内。例如，如通过Chothia编号方案所确定的，这种抗体可具有与克隆559B-M004-B04相同的VH CDR和/或VL CDR。在另一个实例中，如通过Kabat编号方案所确定的，本公开范围内的抗裂解的HMWK抗体可具有与克隆559B-M004-B04相同的VH CDR和/或VL CDR。
可替选地或另外地，抗裂解HMWK抗体包括与559B-M004-B04的VH链至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VH链，和/或与559B-M004-B04的VL链至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VL链。在一些实施方案中，抗体是559B-M004-B04。
两个氨基酸序列的“百分比同一性(percent identity)”使用基于Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993改良的Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法确定。该算法被纳入至Altschul,等J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行，以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以使用如Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402，1997中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
下面显示了559B-M004-B04的重链可变区和轻链可变区的序列。重链的CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列以下划线和粗体显示(作为实例通过一个方案标识)。
>559B-R0048-A01(559B-M0004-B04)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
>559B-R0048-A01(559B-M0004-B04)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
在一些情况下，特异性结合裂解的HMWK的抗体可以包含在559B-M0004-B04的一个或多个重链CDR或一个或多个轻链CDR中的一个或多个(例如至多5个、至多3个或至多1个)保守突变，例如在残基不可能参与与裂解的HMWK相互作用的位置处。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变其中进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸取代。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，例如在汇编这些方法的文献中找到的，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等编，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，纽约，1989，或CurrentProtocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编,John Wiley&Sons,Inc.,纽约。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
可以通过本领域已知的任何方法制备能够结合至如本文所述的裂解的HMWK的抗体(以及能够结合至完整的HMWK和/或LMWK的抗体)。参见例如Harlow和Lane，(1988)Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约。
在一些实施方案中，可以通过常规杂交瘤技术制备对靶抗原特异的抗体(裂解的HMWK、完整的HMWK和/或LMWK)。任选地与载体蛋白(如KLH)偶联的全长靶抗原或其片段可用于免疫宿主动物以产生结合至该抗原的抗体。如本文进一步描述的，宿主动物的免疫途径和计划通常与已建立的和常规的用于抗体刺激和产生的技术一致。用于产生小鼠抗体、人源化抗体和人抗体的一般技术是本领域已知的并且在本文中描述的。预期可以操纵包括人的任何哺乳动物受试者或由其产生抗体的细胞作为产生哺乳动物(包括人类)杂交瘤细胞系的基础。典型地，向宿主动物腹膜内、肌肉内、口服、皮下、足底和/或皮内接种一定量的免疫原，包括本文所述的那些。
杂交瘤可以使用通常的体细胞杂交技术由淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备，所述体细胞杂交技术为Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的技术或如由Buck,D.W.,等，In Vitro,18:377-381(1982)所改良的技术。可用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute，Cell Distribution Center，San Diego，Calif.，USA的那些，可用于杂交。一般而言，该技术涉及使用融合剂(比如聚乙二醇)或通过本领域技术人员熟知的电学技术，使骨髓瘤细胞和淋巴细胞融合。融合之后，从融合培养基分离细胞并且使其在选择性生长培养基，诸如次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷(HAT)培养基上生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文所述的任何补充有血清或没有血清的培养基可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一可替选方案，EBV永生化B细胞可用于产生本文所述的抗PKal单克隆抗体。如果需要，则扩增和亚克隆杂交瘤，并且通过常规的免疫试验程序(例如，放射免疫测定方法、酶免疫测定方法或荧光免疫测定方法)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤包括产生能够干扰PKal活性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的所有衍生物、子代细胞。产生这样的抗体的杂交瘤可在体外或体内使用已知的程序生长。如果需要，单克隆抗体可通过常规的免疫球蛋白纯化程序(比如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱和超滤)从培养基或体液中分离。如果存在非期望的活性，可例如通过使制品在由附接至固相的免疫原制备的吸附剂上运行并且从免疫原洗脱期望的抗体或使期望的抗体从免疫原释放，而去除非期望的活性。使用双功能试剂或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)，用靶抗原或包含缀合至在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白质的靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物可产生大量的抗体(例如，单克隆抗体)，所述免疫原性的蛋白质是例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
如果需要，可对感兴趣的的抗体(单克隆或多克隆)(例如通过杂交瘤产生的)测序并且然后多核苷酸序列可克隆至载体，用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可保持在宿主细胞的载体中并且可然后扩增宿主细胞并且冷冻用于进一步使用。可替选地，多核苷酸序列可用于遗传操作以改善抗体的亲和力(亲和力成熟)，或其他特征。可期望遗传操作抗体序列，以获得对靶抗原更大的亲和力和/或特异性。对本领域技术人员显而易见的，可对抗体进行一个或多个多核苷酸改变并且仍维持其对靶抗原的结合特异性。
在其他实施方案中，可通过使用商业上可得的小鼠获得全人抗体，所述小鼠已经被工程化以表达特定的人免疫球蛋白蛋白质。设计为产生更期望的(例如，全人抗体)或更强健的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化的或人抗体。这样的技术的实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseRTM和来自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseRTM和TC MouseTM。另外可替选地，抗体可通过噬菌体展示或酵母技术重组制备。参见，例如美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150；以及Winter等(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。可替选地，噬菌体展示技术(McCafferty等(1990)Nature 348:552-553)可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系(gene repertoires)在体外产生人抗体和抗体片段。
可经常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生F(ab')2片段，和可通过还原F(ab')2片段的二硫键产生Fab片段。
可经重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备单链抗体。优选地，柔性接头并入在两个可变区之间。可替选地，可采用描述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)，以产生噬菌体或酵母scFv文库，并且可根据以下常规程序从该文库中鉴定对PKal特异的scFv克隆。阳性克隆可进行进一步筛选，以鉴定特异性结合靶抗原，例如裂解的HMWK的那些克隆。
在一些实施方案中，可以从抗体文库中分离对裂解的HMWK(或完整的HMWK或LMWK)特异性的抗体，所述抗体文库可以是合成文库或天然文库。天然抗体文库是指在常规规程之后从天然来源(例如，人供体)衍生的文库。合成抗体文库是指这样的文库：其成员按照预定的规则设计(例如，具有完整的无规化CDR区，如CDR；或半无规化CDR区，如重链、轻链或重链和轻链两者的CDR1或CDR2)。
在一些情况下，抗体文库是展示文库(例如，噬菌体展示文库或酵母展示文库)。展示文库是实体的集合；每个实体包括可获得的多肽组分和编码或鉴定该多肽组分的可回收组分。多肽组分是多样的，从而示出不同的氨基酸序列。多肽组分可以具有任何长度，例如从三个氨基酸到超过300个氨基酸。展示文库实体可以包括多于一种的多肽组分，例如sFab的两条多肽链。在一个示例性实施方式中，展示文库可用于鉴定结合至裂解的HMWK(以及本文描述的其他靶抗原)的蛋白质。在选择中，文库每个成员的多肽组分用裂解的HMWK(或其片段)探测，并且如果多肽组分结合至裂解的HMWK，则通常通过保留在载体上来鉴定展示文库成员。图12中提供了使用噬菌体展示抗体文库鉴定对裂解的HMWK特异的抗体的示例性说明。
保留的显示库成员从支持(support)中恢复并分析。分析可以包括在相似或不相似条件下的扩增和后续选择。例如，正选择和负选择可以交替进行。分析还可以包括确定多肽组分的氨基酸序列和纯化多肽组分以进行详细表征。
可使用本领域熟知的方法表征根据本领域已知的和本文所描述的方法获得的抗体。例如，一个方法是鉴定抗原所结合的表位，或“表位作图(epitope mapping)”。本领域存在许多已知的方法用于作图和表征蛋白质上表位的位置，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争试验、基因片段表达试验和基于合成肽的试验，如例如在Harlow和Lane的Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1999中第11章描述的。在另外的实例中，表位作图可用于确定抗体所结合的序列。表位可以是线性表位，即，包含在单个的氨基酸段中，或由氨基酸的三维相互作用形成的构型表位，其可能没必要包含在单个段(初级结构线性序列)中。可分离或合成(例如，重组)不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽并用于与抗体的结合试验。在另一实例中，可在系统筛选中，通过使用源自靶抗原序列的重叠肽和通过抗体测定结合，测定抗体所结合的表位。根据基因片段表达试验，使编码靶抗原的开放阅读框随机或通过特异性基因构建片段化，并且测定抗原的表达片段与待测试抗体的反应性。可例如通过PCR产生基因片段，并且然后在存在放射性氨基酸的情况下体外转录和翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。
也可通过使用展示在噬菌体颗粒表面上的无规肽序列的大文库(噬菌体文库)鉴定某些表位。可替选地，定义的重叠肽片段的文库可在简单的结合试验中测试用于测试抗体的结合。在另外的实例中，可进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变，以鉴定对于表位结合所需的、足够的和/或必须的残基。例如，可使用其中HMWK多肽的各种片段已经用来自密切关联、但是抗原性不同的蛋白质的序列替换(交换)的靶抗原的突变体进行结构域交换实验。通过评估抗体与突变体HMWK的结合，可评估特定的抗原片段对抗体结合的重要性。
可替选地，可使用结合至相同抗原的已知的其他抗体进行竞争试验，以测定抗体是否与其他抗体结合至相同表位。竞争试验是本领域技术人员熟知的。
任何抗裂解的HMWK抗体也在本公开的范围内。
(iii)免疫测定方法
本文提供了用于检测裂解的HMWK的免疫测定方法。如本文所用，术语“免疫测定方法”可以互换地称为基于免疫的测定法(immune-based assay)或基于免疫学的测定法(immuno-based assay)。通常，免疫测定方法使用结合至分子的试剂(例如抗体)检测样品中分子(例如HMWK)的存在和/或浓度(水平)。免疫测定方法的实例包括Western印迹、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、侧向流测定法、放射免疫测定方法、基于电化学发光的检测测定法、磁性免疫测定方法和相关技术。在一些实施方案中，免疫测定方法是ELISA测定法。在一些实施方案中，免疫测定方法是夹心ELISA测定法。在一些实施方案中，免疫测定方法是侧向流测定法。
ELISA在本领域是已知的(参见例如Crowther,John R(2009).“The ELISAGuidebook.”2nd ed.Humana Press和Lequin R(2005)."Enzyme immunoassay(EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)".Clin.Chem.51(12):2415–8)，并且本文描述了示例性ELISA。用于进行ELISA的试剂盒在本领域中也是已知的并且可商购(参见例如来自Life Technologies和BD Biosciences的ELISA试剂盒)。
为了进行本文所述的免疫测定方法，可以从受试者获得样品。如本文所用，“样品”是指包含来自受试者的组织(例如血液、血浆或蛋白质)的组合物。样品包括取自受试者的初始未处理样品以及随后处理的样品，例如部分纯化或保存的形式。示例性样品包括血液、血浆、眼泪或粘液。在一些实施方案中，样品是体液样品，例如血清或血浆样品。本文描述的通过免疫测定方法分析的样品可以是取自受试者的初始未处理样品或随后处理的样品，例如部分纯化或保存的形式。在一些实施方案中，可随时间或以特定时间间隔从受试者收集多个(例如至少2、3、4、5个或更多个)样品，例如以评估疾病或紊乱的进展或评价治疗的功效。多个样品可以在治疗之前和之后或在治疗过程中获得。
样品可以使用本领域已知的任何方法从受试者获得。在一些实施方案中，通过将样品(例如血液样品)收集到抽空的收集管(例如抽真空的采血管)中从受试者获得样品。在一些实施方案中，抽真空的收集管含有一种或多种蛋白酶抑制剂，例如以减少或防止样品收集期间接触系统的体外激活。这种蛋白酶抑制剂可以包含在液体制剂中。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。这种抽真空的收集管在本领域中是已知的。参见例如PCT申请号US2016/046681。任选地，真空采血管可以进一步包含一种或多种抗凝血剂。
通过本公开方法待治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”(这些术语可交换使用)可指人或非人动物。在一些实施方案中，受试者疑似具有由激肽释放酶介导的紊乱或处于由激肽释放酶介导的紊乱的风险中或患有由激肽释放酶介导的紊乱，例如由缓激肽介导的紊乱，例如遗传性血管性水肿(HAE)、非组胺-依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、败血症性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病变、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与心室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少、血栓栓塞病，和伴随不稳定的心绞痛的冠心病、水肿、眼病、痛风、肠疾病、口腔粘膜炎、神经病痛、炎性疼痛、椎管狭窄退行性脊柱病、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨性关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或瘤周脑水肿、脓毒症、急性脑中动脉(MCA)缺血性事件(中风)、再狭窄(例如，血管成形术之后)、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫疾病、炎性疾病、心血管疾病、神经疾病、与蛋白质错折叠相关的疾病、与血管生成相关的疾病、高血压肾病变和糖尿病性肾病变、变应性疾病和呼吸疾病(例如过敏症、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤)。
可替选地或另外地，需要本文所述分析的受试者可以是该疾病或紊乱的患者。这样的受试者可以目前处于疾病(例如，HAE)发作下，或者可以过去患有疾病(例如，目前处于疾病静息期间)。在一些实例中，受试者是可正在治疗疾病的人患者，例如涉及C1酯酶抑制剂(C1-INH)、血浆激肽释放酶抑制剂或缓激肽抑制剂的治疗。在其他情况下，这样的人患者可以没有这种治疗。
可以使用特异性结合裂解的HMWK的试剂对本文所述的样品进行分析以确定样品中裂解的HMWK的水平。在一些实施方案中，本文所述的免疫测定方法可以是夹心ELISA的形式，其中将特异性结合裂解的HMWK的第一试剂(例如，本文所述的抗体)固定在支持构件上。然后可以在允许形成裂解的HMWK/第一试剂(例如抗体)复合物的条件下，将支持构件与本文所述的样品培养一段合适的时间。然后可以使用结合HMWK的第二试剂来检测这种复合物。第二试剂可以缀合至标记物，其可以直接或间接释放信号。信号的强度表示样品中裂解的HMWK的水平。
本领域已知的任何支持构件都可以用于该方法中，包括但不限于膜、珠子、载片(slide)或多孔板。用于免疫测定方法的合适的支持构件的选择将取决于各种因素，例如样品数量和检测从缀合至第二试剂的标记物释放的信号的方法。
在一些实施方案中，支持构件是膜，例如硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或乙酸纤维素膜。在一些实例中，免疫测定方法可以是Western印迹测定形式或侧向流测定形式。
在一些实施方案中，支持构件是多孔板，例如ELISA板。在一些实施方案中，本文所述的免疫测定方法可以在高通量平台上进行。在一些实施方案中，多孔板，例如24孔、48孔、96孔、384孔或更多孔的板，可用于高通量免疫测定方法。可以在每个孔中平行进行单独的免疫测定方法。因此，通常希望使用平板阅读器来并行测量多个孔以增加测定通量。在一些实施方案中，能够并行成像多孔(例如4孔、16孔、24孔、48孔、96孔、384孔或更多孔)的平板阅读器可用于该平台。例如，可以使用市售的平板阅读器(例如，可从Perkin Elmer,Waltham,MA获得的平板::视觉系统)。该平板阅读器能够进行基于动力学的荧光分析。平板::视觉系统具有高收集效率的光学器件，并具有专门设计用于并行分析96个孔的光学器件。其他合适的并行的平板阅读器包括但不限于SAFIRE(Tecan,San Jose,CA)、(Molecular Devices,Union City,CA)、FDSS7000(Hamamatsu,Bridgewater,NJ)，以及CellLux(Perkin Elmer,Waltham,MA)。
如在实例1中所述，意外地发现多孔板的孔的表面积和/或体积可以影响免疫测定方法的结果。在一些实施方案中，所述免疫测定方法在96孔板、如96孔ELISA板中进行。
在其他实施方案中，本公开的高通量筛选免疫测定方法可以是自动的(例如，适应于机器人测定)。
在一些实施方案中，免疫测定方法可以在低通量平台上进行，包括单一免疫测定形式。例如，可以使用低通量平台来测量在生物样品(例如生物组织、组织提取物)中用于诊断方法、监测疾病和/或治疗进展和/或预测疾病或紊乱是否可受益于特定治疗的裂解的HMWK的存在和量。
可以使用本领域已知的任何方法，同样如本文所述，将特异性结合裂解的HMWK的试剂(例如本文所述的抗体)固定到支持构件上。在一些实施方案中，固定包括将试剂(例如抗体)结合到支持构件上。在其他实施方案中，固定包括将抗体吸附到支持构件。这种吸附方法可以例如通过将抗体在多孔板的孔中的缓冲液中培养来进行。在一些实施方案中，将例如抗体的试剂提供在涂覆缓冲液中并在多孔板的孔中培养。涂覆缓冲液对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以从商业来源制备或获得。涂覆缓冲液的非限制性实例包括50mM碳酸氢钠，pH 9.6；0.2M碳酸氢钠，pH 9.4；磷酸盐缓冲溶液(50mM磷酸盐，pH8.0，0.15M NaCl)；碳酸盐-碳酸氢盐溶液；和TBS(50mM TRIS，pH 8.0，0.15M NaCl)。
在一些实施方案中，第一试剂通过第一试剂和支持构件之间的疏水相互作用固定在支持构件上。在一些实施方案中，使用电泳转移将第一试剂固定在支持构件上。
无论是在固定之前还是固定之后，或者在固定之前和固定之后两者，可以将支持构件与封闭缓冲液一起培养。通常，封闭缓冲液用于封闭支持膜的任何暴露表面(例如，支持膜上未被第一试剂占据的位置)。使用封闭缓冲液可以减少检测到的基线信号(即“背景干扰”)和/或提高免疫测定方法的灵敏度和/或减少样品组分与支持膜的非特异性结合。如实施例1中所述，封闭缓冲液的选择影响免疫测定方法的结果。在一些实施方案中，封闭缓冲液含有血清白蛋白，例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在一些实施方案中，封闭缓冲液是BSA缓冲液(例如，PBS缓冲液中的2％BSA)。在一些实施方案中，封闭缓冲液不含血清白蛋白，例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在一些实施方案中，封闭缓冲液包含酪蛋白片段，以及任选的NaCl和吐温(Tween)，并且可以具有pH 7.0-7.4。在一些实施方案中，酪蛋白片段是高纯度酪蛋白片段。这种封闭缓冲液可以从商业来源(例如，来自CANDOR Bioscience的Blocking Solution LowCross)制备或获得。
其上附接有对裂解的HMWK特异的试剂的支持构件可以与本文所述的疑似含有裂解的HMWK的样品接触(培养)。一般来说，术语“接触”是指使支持构件暴露于生物样品或试剂合适的时间段，以足以在试剂、如抗体和样品中裂解的HMWK之间形成复合物，如果有的话。之后，样品可以从支持构件上移除，然后可以洗涤多次以除去任何未结合的裂解的HMWK。在一些实施方案中，所述接触通过毛细作用进行，其中生物样品或试剂在支持膜的表面上移动。
然后可以将支持构件与结合HMWK的第二试剂培养合适的时间段，以允许第二试剂结合附接至支持构件上的HMWK。
第二试剂可以是能够与HMWK结合的任何试剂，例如能够结合至HMWK的抗体(对裂解形式的HMWK具有特异性或可以与裂解的HMWK和完整的HMWK两者交叉反应)。在一些实施方案中，第二试剂包含一种或多种结合HWMK(裂解的和/或完整的)的抗体。在一些实施方案中，抗体是小鼠单克隆抗体或单克隆绵羊抗体。它与标记物缀合，该标记物是能够直接或间接释放信号的化合物(例如，通过与一种或多种另外的化合物相互作用)。
在一些实施方案中，标记物是信号释放剂，其是直接释放信号的试剂(例如染料或荧光团)或在与底物相互作用时释放信号的试剂(例如，诸如HRP或β-半乳糖苷酶，其可将无色底物转化为有色产物)。如本文所用，术语“荧光团”(也称为“荧光标记物”或“荧光染料”)是指以限定的激发波长吸收光能并以不同波长发射光能的部分。
在其他实施方案中，标记物可以是受体-配体对的成员。如本文所用，“配体-受体对”是指彼此具有特异性亲和力的一对分子(例如生物分子)，例如生物素-链霉亲和素。在这种情况下，携带第一试剂-裂解的HMWK-第二试剂的支持构件还可以与配体-受体对的另一个成员培养合适的时间段，使得受体-配体对的两个成员相互作用。如本文所述，受体-配体对的另一个成员与信号释放剂缀合。在一个实例中，第二试剂与生物素缀合并且使用HRP缀合的链霉亲和素来检测。
洗去任何未结合的缀合物后，可加入底物溶液以帮助检测。例如，在设置间隔之后，可以停止反应(例如通过加入1N NaOH)并且可以在分光光度计中测量形成的着色产物的浓度。颜色的强度与结合的抗原的浓度成比例。
接下来，可以通过常规方法来检测/测量如本文所述的从标记物释放的信号，所述常规方法取决于免疫测定方法的具体形式和其中使用的信号释放剂。如本文所用，术语“测量(measuring)”或“测量(measurement)”或可替选地“检测(detecting)”或“检测(detection)”意思是评估样品中物质的存在、缺少、数量或量(其可以是有效量)，包括推导这样的物质的定性或定量的浓度水平，或以其他方式评估受试者的值或分类。
测定法，例如Western印迹测定法可进一步涉及使用定量成像系统，例如可商购的LICOR成像技术(参见例如来自LI-COR Biosciences的CLx红外成像系统)。在一些实施方案中，使用电化学发光检测测定法或依赖于电化学发光和图案化阵列技术的组合的测定法(例如来自Meso Scale Discovery(MSD)的ECL或MULTI-ARRAY技术测定法)。
本文所述的任何免疫测定方法，例如免疫测定方法的一个或多个步骤，可以在合适的测定缓冲液中进行，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在一些实施方案中，测定缓冲液含有或已经补充有ZnCl2。在一些实施方案中，测定缓冲液含有至少约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM或更多的ZnCl2。在一些实施方案中，这样的含ZnCl2的测定缓冲液用于这样的步骤中：其中对裂解的HMWK特异的试剂(例如，对裂解的HMWK特异的抗体)结合裂解的HMWK。ZnCl2增强试剂(例如抗体)对裂解的HMWK的结合活性。
在一些实施方案中，测定缓冲液含有血清白蛋白，例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在一些实施方案中，测定缓冲液含有至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.12％、0.014％、0.16％、0.18％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％或更多的BSA。在一些实施方案中，测定缓冲液含有表面活性剂，例如吐温-20。在一些实施方案中，测定缓冲液含有0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％或更多的表面活性剂。在一个实例中，测定缓冲液含有在PBS中的0.1％BSA和0.05％吐温-20。
(iv)诊断和预后应用
考虑到裂解的HMWK的水平与这种疾病或紊乱之间的相关性(例如作为生物标志物)，本文所述的测定方法和试剂盒可用于评估与血浆激肽释放酶有关的疾病或紊乱，例如本文中描述的那些(例如HAE)。可替选地或另外地，本文所述的测定方法和试剂盒可被用于监测这种疾病的进展、评估疾病治疗的功效、鉴定适合于特定治疗的患者、和/或预测在受试者中的疾病状态(例如，发作与静息)。
在一些实施方案中，可依赖通过本文所述的免疫测定方法测定的裂解的HMWK的水平来评估自其获得生物样品的受试者(例如人患者)是否具有与血浆激肽释放酶相关的疾病或紊乱(例如HAE或自身免疫性疾病，例如RA、UC和克罗恩病)，或处于所述疾病或紊乱的风险中。裂解的激肽原的水平可然后与样品中完整的激肽原或激肽原的总量比较，以确定样品中裂解的激肽原的值(例如百分数)、完整的激肽原的值或二者。裂解的激肽原和/或完整的激肽原的值可与参考值比较，以确定受试者是否具有pKal介导的紊乱，例如HAE或自身免疫疾病，例如RA、UC和克罗恩病，或处于所述疾病的风险中。例如，如果裂解的激肽原的百分数为或高于参考数，则受试者可被鉴定为具有pKal介导的紊乱，例如HAE、RA、UC和克罗恩病，或处于所述疾病的风险中。可替选地，如果完整的激肽原的百分数为或小于参考数，则受试者可被鉴定为具有pKal介导的紊乱，例如HAE、RA、UC和克罗恩病，或处于所述疾病的风险中。
在一些实施方案中，本文所述方法的用于分析的样品来源于具有遗传性血管性水肿(HAE)或处于HAE的风险中的人受试者。HAE也称为“Quincke水肿”、C1酯酶抑制剂缺陷、C1抑制剂缺陷和遗传性血管神经性水肿(HANE)。HAE的特征在于严重肿胀的复发性发作(血管性水肿)，其可影响，例如四肢、面部、生殖器、胃肠道和气管。HAE的症状包括，例如臂、腿、嘴唇、眼睛、舌头和/或喉咙的肿胀；可涉及喉咙肿胀和突然嘶哑的气管阻塞；没有明显原因的腹部绞痛的重复发作；和/或肠道的肿胀，其可能是严重的并且可导致腹部绞痛、呕吐、脱水、腹泻、疼痛和/或休克。具有该HAE的个体的约三分之一在发作期间发展称为边缘性红斑的不发痒的皮疹。
气管的肿胀可能是威胁生命的并且造成一些患者的死亡。估计死亡率是15-33％。HAE每年导致约15,000-30,000次急诊室访问量。
创伤或应激(stress)，例如，牙科手术、疾病(例如，病毒性疾病，比如感冒和流感)、月经和外科手术可触发血管性水肿的发作。为了防止HAE的急性发作，患者可尝试避免先前造成发作的特定刺激。但是，在许多情况下，在没有已知触发的情况下出现发作。典型地，HAE症状第一次出现在童年并且在青春期加重。平均而言，未治疗的个体每1至2周发作，并且大部分发作持续约3至4天(ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema)。发作的频率和持续时间在患有遗传性血管性水肿的人中间、甚至在同一家族的人中间变化很大。
有三种类型的HAE，称为I、II和III型。据估计，50,000人中HAE影响1人，I型占约85％的病例，II型占约15％的病例，和III型非常罕见。III型是最近描述的形式并且最初认为仅仅出现在女人中，但是已经鉴定出了受影响的男性的家族。
HAE是以常染色体显性模式遗传，使得受影响的人可从一个受影响的亲代继承突变。也可出现基因的新突变，因此HAE也可出现在他们家族中没有该紊乱历史的人中。据估计，20-25％的病例来自新的自发突变。
SERPING1基因的突变造成I型和II型遗传性血管性水肿。SERPING1基因提供了制备对于控制炎症重要的C1抑制剂蛋白质的指导。C1抑制剂阻断促进炎症的某些蛋白质的活性。引起遗传性血管性水肿I型的突变导致了血液中C1抑制剂的水平下降。相反，引起II型的突变使得产生功能异常的C1抑制剂。在没有适当水平的功能性C1抑制剂的情况下，产生过量的缓激肽。通过增加经过血管壁进入身体组织的流体的渗漏，缓激肽促进炎症。流体在身体组织中的过多积聚引起患有I型和II型遗传性血管性水肿的个体中见到的肿胀的发作。
F12基因中的突变与一些III型遗传性血管性水肿病例相关。F12基因提供了制备凝固因子XII的指导。除了在血液凝结(凝聚)中起到关键作用外，因子XII也是重要的炎症的刺激剂并且参与缓激肽的产生。F12基因中的某些突变使得产生具有增加活性的因子XII。结果，产生更多的缓激肽并且血管壁变得更加渗漏，其引起肿胀的发作。III型遗传性血管性水肿的其他病例的原因仍是未知的。一个或多个仍未鉴定的基因的突变可造成这些病例中的紊乱。
HAE可与源自变态反应或其他医学病况的其他形式的血管性水肿类似地存在，但是明显不同的是病因和治疗。当HAE被误诊为变态反应时，其最通常用一般对HAE无效的抗组胺剂、类固醇类和/或肾上腺素治疗，但是肾上腺素可用于威胁生命的反应。误诊也已经导致患腹部肿胀的患者不必要的试探性外科手术，并且在一些HAE患者中腹部疼痛已经被错误地诊断为身心失调。
C1抑制剂疗法以及用于HAE的其他疗法描述在Kaplan,A.P.,J AllergyClinImmunol,2010,126(5):918-925中。
提供HAE发作的应急治疗，以尽可能快速地停止水肿的发展。静脉内施用的来自供体血液C1抑制剂浓缩物是一种应急治疗；但是，该治疗是在许多国家中不可用。在C1抑制剂浓缩物不可用的紧急情况下，新鲜冷冻的血浆(FFP)可用作替代物，因为其也包含C1抑制剂。
自从1979年起源自人血液的纯化的C1抑制剂已经在欧洲使用。数种C1抑制剂治疗现可在美国使用并且两种C1抑制剂产品现可在加拿大使用。巴氏消毒的Berinert P(CSLBehring)于2009年被F.D.A.批准用于急性发作。纳米过滤的于2008年被F.D.A.批准用于预防。Rhucin/Ruconest(Pharming)是处在开发阶段的重组C1抑制剂，其不具有由于人血液传播的病原体引起的传染病传染的风险。
急性HAE发作的治疗也可包括用于疼痛缓解的药物和/或IV流体。
其他治疗形式可刺激C1抑制剂的合成，或降低C1抑制剂消耗。雄激素药物，比如达那唑(danazol)，可通过刺激C1抑制剂的产生而降低发作的频率和严重程度。
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)可触发腹部发作。治疗幽门螺杆菌的抗生素将减少腹部发作。
更新的治疗攻击接触级联反应。艾卡拉肽抑制血浆激肽释放酶并且已经在美国被批准。艾替班特(Shire)抑制缓激肽B2受体，并且已经在欧洲和美国被批准。
HAE的诊断可依赖于，例如家族历史和/或血液测试。与I型、II型和III型HAE相关的实验室发现描述在于例如Kaplan,A.P.，J Allergy Clin Immunol,2010,126(5):918-925中。在I型HAE中，如C4的水平一样，C1抑制剂的水平下降，而C1q水平是正常的。在II型HAE中，C1抑制剂的水平是正常的或增加；但是，C1抑制剂功能异常。C4水平下降和C1q水平是正常的。在III型中，C1抑制剂、C4和C1q的水平都可以是正常的。本公开至少部分基于鉴定与健康个体相比在来自HAE患者的样品中具有不同水平的另外的蛋白质(表1)。测量2-HMWK的水平或存在可用于鉴定受试者是否患有疾病，例如HAE。在一些实施方案中，可以使用这些方法来确定患者是否已经具有HAE发作或正在具有HAE发作。
可例如使用问卷，例如，通常由患者、临床医生或家庭成员完成的问卷，评估HAE的症状。这样的问卷是本领域已知的并且包括，例如，视觉上模拟评分。参见，例如，McMillan,C.V.等Patient.2012；5(2):113-26。
在来自受试者的样品中检测的裂解的激肽原和/或完整的激肽原的值可与参考值比较，以确定受试者是否具有pKal介导的紊乱(例如HAE)，或处于所述疾病的风险中。可替选地或另外地，在来自受试者的样品中检测的裂解的激肽原和/或完整的激肽原的值可与参考值比较，以评估紊乱治疗的功效、紊乱的预后或严重性、和/或将受试者确定为治疗候选者。
参考值可以是裂解的激肽原百分比的对照水平。在一些实施方案中，对照水平是对照样品、例如从健康受试者或健康受试者群体获得的样品(例如血液或血浆样品)中裂解的激肽原的百分比，所述健康受试者优选地是与候选受试者相同的物种。如本文所使用的，健康受试者是在测量裂解和/或完整的激肽原水平时明显不含目标疾病(例如，PKal介导的紊乱，例如HAE或自身免疫性疾病，例如RA、US和克罗恩病)或没有疾病史的受试者。
对照水平也可以是预定的水平或阈值。这样预定的水平可表示没有目标疾病或没有目标疾病风险的受试者群体中裂解的激肽原的百分数。它也可表示具有目标疾病的受试者群体中裂解的激肽原的百分数。
预定的水平可为各种形式。例如，其可以是单个临界(cut-off)值，比如中值或平均值。在一些实施方案中，可基于比较组确定这样的预定水平，例如其中一个定义的组已知具有目标疾病和另一定义的组已知没有该目标疾病。可替选地，预定的水平可以是一个范围，例如表示在预定的百分数以内对照群体中裂解的激肽原的百分数的范围。
可通过常规技术确定如本文所描述的对照水平。在一些实施例中，可通过对如本文所述的对照样品进行常规方法(例如，为获得如本文所描述的测试样品中裂解的和/或完整的激肽原水平的相同测定法)获得对照水平。在其他实例中，裂解的和/或完整的激肽原的水平可获自对照群体的成员并且可通过例如计算程序分析结果，以获得表示对照群体中裂解的和/或完整的激肽原的水平的对照水平(预定的水平)。
通过比较获自候选受试者的样品中裂解的激肽原的百分数与如本文所描述的参考值，可确定候选受试者是否具有pKal介导的疾病(例如，HAE或自身免疫疾病，比如RA、UC和克罗恩病)或处于所述疾病的风险中。例如，如果候选受试者的样品中裂解的激肽原的百分数偏离参考值(例如，与参考值相比增加或与参考值相比降低)，那么候选受试者可能被鉴定为具有所述疾病或处于所述疾病的风险中。当参考值表示具有目标疾病的受试者群体中裂解的激肽原的百分数范围时，那么落在该范围内的候选者样品中裂解的激肽原的百分数指示该候选受试者具有目标疾病或处于目标疾病的风险中。在一些情况下，参考值可以表示背景水平，其指示不存在裂解的激肽原。裂解的激肽原的存在被认为是与这种背景参考值的偏差。如本文所用，与对照样品或参考值的“偏差”涵盖裂解的HMWK的水平以及样品中裂解的HMWK的存在或不存在。
如本文所使用，“升高水平或高于参考值的水平”意思是裂解的激肽原的水平/百分数高于参考值，例如对照样品中裂解的激肽原的水平/百分数的预定阈值。本文详细描述了对照水平。
裂解的激肽原升高的百分数包括，例如比参考值高1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更高的裂解的激肽原百分数。裂解的激肽原升高的百分数也包括将现象从零状态(例如，样品中没有或不可检测的结合至捕获剂的裂解的激肽原和/或完整的激肽原)增加至非零状态(例如，一些或可检测的裂解的激肽原和/或完整的激肽原)。
如本文所使用，“降低的百分数/水平，或低于参考值的百分数/水平”意思是裂解的百分数/水平小于参考值，例如对照样品中裂解的激肽原的预定阈值。本文详细描述了对照水平。
裂解的激肽原的降低的水平包括例如比参考值低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的裂解的激肽原。结合至捕获剂的裂解的激肽原降低的水平也包括将现象从非零状态(例如，样品中一些或可检测的裂解的激肽原)减少至零状态(例如，样品中没有或不可检测的裂解的激肽原)。
在一些实施方案中，候选受试者是具有pKal介导的紊乱，例如比如HAE或自身免疫疾病，如RA、UC和克罗恩病的症状的人患者。例如，受试者具有水肿、肿胀，其中所述肿胀完全或主要是外周的；荨麻疹；发红、疼痛和没有感染迹象的肿胀；非组胺介导的水肿，肿胀的复发性发作或其组合。在其他实施方案中，受试者在收集样品时没有pKal介导的紊乱的症状、没有pKal介导的紊乱症状的历史或没有pKal介导的紊乱、例如HAE的病史。在其他实施方案中，受试者抵抗抗组胺疗法、皮质类固醇疗法、或抗组胺疗法和皮质类固醇疗法二者。
在本文所述的方法中鉴定的受试者可进行适当的治疗。
考虑到裂解的HMWK的水平与这种疾病之间的相关性，本文所述的测定方法和试剂盒可用于评估与血浆激肽释放酶有关的疾病的治疗功效，所述疾病例如本文中描述的那些。例如，在治疗之前和之后或治疗过程期间，可从进行治疗的受试者收集多个生物样品(例如，血液或血浆样品)。可通过如本文所描述的任何测定方法测量裂解的和/或完整的激肽原的水平，并且因此可确定裂解的和/或完整的激肽原的值(例如，百分数)。如果在治疗之后或在治疗过程中(相比较早收集的样品，稍后收集的样品中的裂解的激肽原百分数)裂解的激肽原的百分数下降或在治疗之后或在治疗过程中完整的激肽原的百分数增加，则指示治疗是有效的。在一些实例中，治疗涉及治疗剂，例如激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH取代剂。治疗剂的实例包括但不限于兰达鲁单抗(DX-2930)、艾卡拉肽(DX88)、艾替班特和人血浆衍生的C1-INH。
如果受试者被鉴定为不响应治疗，则更高剂量和/或更高给药频率的治疗剂被施用至经鉴定的受试者。在一些实施方案中，在被鉴定为响应治疗或不需要进一步治疗的受试者中保持、降低或终止治疗剂的剂量或给药频率。可替选地，不同的治疗可被应用至被发现不响应第一治疗的受试者。
在其他实施方案中，也可依赖于裂解的激肽原，不论是单独的或是与完整的激肽原组合的值，以鉴定可通过pKal抑制剂治疗的紊乱。为了实施该方法，可通过适当的测定法，例如本文所述的那些比如Western印迹测定法或ELISA测定法，测量从具有目标疾病的受试者收集的样品(例如，血液样品或血浆样品)中裂解的激肽原的水平和/或完整的激肽原的水平。可如本文所描述测定裂解的和/或完整的激肽原的值，比如百分数。裂解的激肽原和/或完整的激肽原的值可与如本文所描述的参考值比较。如果裂解的激肽原/完整的激肽原的值偏离参考值(例如，升高或降低)，其指示pKal抑制剂可有效治疗疾病。例如，如果治疗之后或在治疗过程中裂解的激肽原的百分数下降，则治疗可被鉴定为有效的。可替选地，如果治疗之后或在治疗过程中完整的激肽原的百分数增加，则治疗被鉴定为有效的。
如果疾病被鉴定为对pKal抑制剂敏感(可用pKal抑制剂治疗)，则方法可进一步包括向具有疾病的受试者施用有效量的pKal抑制剂例如艾卡拉肽(DX-88)、EPIKAL-2或兰达鲁单抗(DX-2930)。
同样在本公开的范围内的是评估与血浆激肽释放酶或疾病状态相关的疾病或紊乱的严重程度的方法。例如，如本文所述，HAE可处于静息状态(基础状态)，在此期间受试者不会经历疾病症状。HAE发作通常是反复发作的事件，其中受试者可能会经历疼痛和肿胀，例如在手、脚、面部、胃肠道、生殖器和咽(喉)中可持续2-5天。在一些实施方案中，2-HMWK的水平指示受试者是否将经历、正在经历或将很快经历HAE发作。在一些实施方案中，所述方法包括将从具有HAE的受试者获得的样品中的2-HMWK的水平与来自相同受试者的样品(例如从处于基础状态的相同受试者获得的样品或在HAE发作期间从相同受试者获得的样品)中的2-HMWK的水平进行比较。
(v)非临床应用
此外，本文所述的用于检测裂解的2-HMWK水平的测定法可用于研究目的。尽管已经鉴定出许多与血浆激肽释放酶相关或由血浆激肽释放酶介导的疾病和紊乱，但其他疾病可能由类似机制介导或涉及类似组分。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定与血浆激肽释放酶相关联或由其介导、或与接触激活系统的组分相关联或由其介导的疾病。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于研究疾病机制(例如发现疾病发展中涉及的新的生物途径或过程)或疾病进展。
在一些实施方案中，在开发与接触激活系统相关的疾病的新治疗剂中可以依赖使用本文描述的测定法测量的裂解的2-HMWK的水平。例如，裂解的2-HMWK的水平可以在从已经施用新疗法(例如临床试验)的受试者获得的样品中测量。在一些实施方案中，裂解的2-HMWK的水平可以指示在新疗法之前、期间或之后在受试者中新治疗剂的功效或者疾病的进展。
II.与血浆激肽释放酶相关的疾病的治疗
如使用本文所述的方法和测定法鉴定的，处于与血浆激肽释放酶相关的疾病的风险中或患有所述疾病的受试者可用任何适当的治疗剂治疗。在一些实施方案中，所提供的方法包括基于所述方法的输出为受试者选择治疗，例如测量裂解的2-HMWK的水平。
在一些实施方案中，所述方法包括选择或施用治疗剂(例如激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体抑制剂和/或C1酯酶抑制剂)或者选择和施用所述治疗剂，以基于测定法(例如2-HMWK检测)的输出向受试者施用。
在一些实施方案中，将治疗剂一次或多次施用至受试者。在一些实施方案中，将血浆激肽释放酶抑制剂施用至受试者。在一些实施方案中，激肽释放酶抑制剂是肽、小分子抑制剂、激肽释放酶抗体或其片段。在一些实施方案中，将缓激肽B2受体的拮抗剂施用至受试者。在一些实施方案中，将C1-INH施用至受试者。
治疗剂，例如，激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体抑制剂和/或C1-INH，可与作为治疗涉及接触激活系统的疾病或病况的组合疗法的一部分的另一疗法一起施用。可以多种不同的方式提供组合疗法，例如以激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH替换试剂中的一种或多种，例如以激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH替换试剂中的一种或多种和另一疗法。第一试剂可在施用另一疗法之前或之后施用。在一些情况下，同时或时间上非常接近(例如，注射之间的短时间间隔，比如相同治疗周期之间)施用第一试剂和另一疗法(例如，治疗剂)。也可以以更大的时间间隔施用第一试剂和其他疗法。
血浆激肽释放酶结合试剂(例如结合蛋白，例如多肽，例如抑制多肽，例如抗体，例如抑制抗体，或其他结合试剂，例如小分子)是各种疾病和病况的有用治疗剂，例如，涉及血浆激肽释放酶活性的疾病和病况。例如，在一些实施方案中，涉及血浆激肽释放酶活性的疾病或病况是遗传性血管性水肿(HAE)。在一些实施方案中，将血浆激肽释放酶结合试剂，例如血浆激肽释放酶抑制剂施用至处于与接触激活系统相关的疾病的风险中或患有所述疾病的受试者。
许多有用的激肽释放酶(组织激肽释放酶和/或血浆激肽释放酶)的蛋白质抑制剂，包括Kunitz结构域。如本文所使用，“Kunitz结构域”是具有至少51个氨基酸和包含至少两个、优选地三个，二硫键的多肽结构域。折叠结构域使得第一和第六半胱氨酸，第二和第四半胱氨酸，以及第三和第五半胱氨酸形成二硫键(例如，在具有58个氨基酸的Kunitz结构域中，半胱氨酸可出现在对应于氨基酸5、14、30、38、51和55的位置(根据下面提供的BPTI同源序列的编号)处，并且二硫键可在位置5和55、14和38以及30和51的半胱氨酸之间形成)，或者，如果存在两个二硫键，则它们可在其相应半胱氨酸的亚组之间形成。根据下面提供的BPTI序列的编号，各个半胱氨酸之间的间隔可在下述对应于5至55、14至38和30至51位置之间的间隔的7、5、4、3、2、1或0个氨基酸内。BPTI序列可用作指示任何一般Kunitz结构域中特定位置的参考。感兴趣的Kunitz结构域与BPTI的比较可通过鉴定其中比对的半胱氨酸数目最大化的最佳拟合比对进行。
BPTI的Kunitz结构域的3D结构(以高分辨率)是已知的。一种X射线结构以“6PTI”保藏在布鲁克海文蛋白质数据库(Brookhaven Protein Data Bank)中。一些BPTI同系物的3D结构(Eigenbrot等,Protein Engineering(1990)3(7):591-598；Hynes等，Biochemistry(1990)29:10018-10022)是已知的。至少81个Kunitz结构域序列是已知的。已知的人同种组织(homologues)包括也称为组织因子通路抑制剂(TFPI)的LACI的三个Kunitz结构域(Wun等，J.Biol.Chem.(1988)263(13):6001-6004；Girard等，Nature(1989)338:518-20；Novotny等，J.Biol.Chem.(1989)264(31):18832-18837)、间-α-胰蛋白酶抑制剂APP-I的两个Kunitz结构域(Kido等J.Biol.Chem.(1988)263(34):18104-18107)、来自胶原蛋白的Kunitz结构域、TFPI-2的三个Kunitz结构域(Sprecher等，PNAS USA(1994)91:3353-3357)、1型肝细胞生长因子活性剂抑制剂的Kunitz结构域、2型肝细胞生长因子活性剂抑制剂的Kunitz结构域、美国专利公开号2004-0152633中描述的Kunitz结构域。LACI是人血清磷酸糖蛋白，分子量是39kDa(表1中的氨基酸序列)，包含三个Kunitz结构域。
表1：示例性天然Kunitz结构域
上述Kunitz结构域称为LACI-K1(残基50至107)、LACI-K2(残基121至178)和LACI-K3(213至270)。LACI的cDNA序列报道在Wun等(J.Biol.Chem.(1988)263(13):6001-6004)中。Girard等(Nature(1989)338:518-20)报道了突变研究，其中改变了三个Kunitz结构域中每一个的P1残基。当因子VIIa与组织因子复合并且LACI-K2抑制因子Xa，是LACI-K1抑制因子VIIa(F.VIIa)。
各种方法可用于从序列数据库中鉴定Kunitz结构域。例如，Kunitz结构域的已知的氨基酸序列、共有序列或基序(例如，ProSite基序)可从GenBank序列数据库((国立卫生研究院国家生物技术信息中心)(NationalCenter for Biotechnology Information)、国立卫生研究院(National Institutes of Health)、Bethesda MD)，例如使用BLAST搜索；从HMM的Pfam数据库(隐马尔可夫模型(Hidden Markov Models))(例如，使用Pfam搜索的默认参数)搜索；从SMART数据库搜索；或从ProDom数据库搜索。例如，Pfam版本9的Pfam登录号PF00014提供了许多Kunitz结构域和用于鉴定Kunitz结构域的HMM。关于Pfam数据库的描述可见于Sonhammer等Proteins(1997)28(3):405-420和关于HMM的详细描述可见于，例如Gribskov等Meth.Enzymol.(1990)183:146-159；Gribskov等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84:4355-4358；Krogh等J.Mol.Biol.(1994)235:1501-1531；和Stultz等ProteinSci.(1993)2:305-314中。HMM的SMART数据库(简单的模块构造研究工具(Simple ModularArchitecture Research Tool),EMBL,Heidelberg,DE)描述在Schultz等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:5857和Schultz等Nucl.Acids Res(2000)28:231中。SMART数据库包含通过用HMMer2搜索程序的隐马尔可夫模型分析(profiling)而鉴定的结构域(R.Durbin等(1998)Biological sequence analysis:probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press)。数据库也被注释和监测。ProDom蛋白质结构域数据库由同源结构域的自动编译构成(Corpet等Nucl.Acids Res.(1999)27:263-267)。当前版本的ProDom使用SWISS-PROT 38和TREMBL蛋白质数据库的递归PSI-BLAST搜索(Altschul等Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402；Gouzy等Computersand Chemistry(1999)23:333-340)构建。数据库自动产生每个结构域的共有序列。Prosite列举了作为基序的Kunitz结构域并且鉴定了包括Kunitz结构域的蛋白质。参见，例如Falquet等Nucleic Acids Res.(2002)30:235-238。
Kunitz结构域主要使用两个环区域(“结合环”)中的氨基酸与靶蛋白酶相互作用。第一环区域在大约对应于BPTI的氨基酸13-20的残基之间。第二环区域在大约对应于BPTI的氨基酸31-39的残基之间。Kunitz结构域的示例性文库在第一和/或第二环区域的一个或多个氨基酸位置不同。当筛选与激肽释放酶相互作用的Kunitz结构域或当选择改善的亲和力变体时，尤其有用的待改变的位置包括：相对于BPTI序列的位置13、15、16、17、18、19、31、32、34和39。预期这些位置中的至少一些紧密接触靶蛋白酶。改变其他位置也是有用的，所述位置例如在三维结构中邻近上述位置的位置。
Kunitz结构域的“框架区”定义为是Kunitz结构域的一部分，但是尤其排除第一和第二结合环区域中的残基的那些残基，即，大约对应于BPTI的氨基酸13-20和BPTI的氨基酸31-39的残基。相反地，不在结合环中的残基可耐受较宽范围的氨基酸取代(例如，保守和/或非保守取代)。
在一个实施方案中，这些Kunitz结构域是具有成环结构的变体形式，包括缔合人脂蛋白的凝聚抑制剂(LACI)蛋白的Kunitz结构域1。LACI包含内部的三个界定清楚的肽环结构，其是典型的Kunitz结构域(Girard,T.等,Nature(1989)338:518-520)。已经筛选、分离了本文所述的LACI的Kunitz结构域1的变体，其以增强的亲和力和特异性结合激肽释放酶(参见，例如，美国专利号5,795,865和6,057,287)。这些方法也可用于其他Kunitz结构域框架，以获得与激肽释放酶，例如血浆激肽释放酶相互作用的其他Kunitz结构域。激肽释放酶功能的有用调节剂通常结合和/或抑制激肽释放酶，如使用激肽释放酶结合和抑制试验测定的。
在一些方面中，血浆激肽释放酶抑制剂结合至活性形式的血浆激肽释放酶。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂结合并且抑制血浆激肽释放酶，例如人血浆激肽释放酶和/或鼠激肽释放酶。示例性多肽血浆激肽释放酶试剂公开在美国专利号5,795,865、美国专利号5,994,125、美国专利号6,057,287、美国专利号6,333,402、美国专利号7,628,983和美国专利号8,283,321、美国专利号7,064,107、美国专利号7,276,480、美国专利号7,851,442、美国专利号8,124,586、美国专利号7,811,991和美国公开号20110086801中，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂是抑制性多肽或抑制性肽。在一些实施方案中，抑制性肽是艾卡拉肽(也称为DX-88或SEQ ID NO:80)。在一些实施方案中，激肽释放酶抑制剂包括SEQ ID NO:80的氨基酸3-60的约58个氨基酸序列或具有SEQ ID NO:80的60个氨基酸序列的DX-88多肽，或由其组成。
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys ArgAla Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe IleTyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys LysMet Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO:80)。
血浆激肽释放酶抑制剂可以是全长抗体(例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1、IgA2)、IgD和IgE)或可仅仅包括抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2或scFv片段)。结合蛋白可包括两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白，或可以是单链抗体。血浆激肽释放酶抑制剂可以是重组蛋白质，比如人源化的、CDR移植的、嵌合的、去免疫化的或体外产生的抗体，并且可任选地包括源自人生殖细胞系免疫球蛋白序列的恒定区。在一个实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂是单克隆抗体。
示例性血浆激肽释放酶结合蛋白公开在美国公开号20120201756中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，激肽释放酶结合蛋白是具有选自下述抗体的轻链和/或重链的抗体(例如，人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X101-A01(也称为DX-2922)、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X115-B07、X115-D05、X115-E09、X115-H06、X115-A03、X115-D01、X115-F02、X124-G01(本文也称为DX-2930或兰达鲁单抗)、X115-G04、M29-D09、M145-D11、M06-D09和M35-G04。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白与下述相同的表位竞争或结合下述相同的表位：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X101-A01(本文也称为DX-2922)、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X115-B07、X115-D05、X115-E09、X115-H06、X115-A03、X115-D01、X115-F02、X124-G01、X115-G04、M29-D09、M145-D11、M06-D09和M35-G04。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白是兰达鲁单抗。参见US 20110200611和US20120201756，其通过引用并入本文。
血浆激肽释放酶抑制性抗体的实例是兰达鲁单抗。下文提供了兰达鲁单抗的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，其中以粗体和下划线标出CDR区。
兰达鲁单抗的重链可变区序列(SEQ ID NO:81)
兰达鲁单抗的轻链可变区序列(SEQ ID NO:82)
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂可具有与本文所述的血浆激肽释放酶抑制剂约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂可与本文所述的血浆激肽释放酶抑制剂在HC和/或LC框架区(例如，HC和/或LC FR 1、2、3和/或4)具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂可与本文所述的血浆激肽释放酶抑制剂在HC和/或LC CDR(例如，HC和/或LC CDR1、2、和/或3)具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶抑制剂可与本文所述的血浆激肽释放酶抑制剂在恒定区(例如，CH1、CH2、CH3和/或CL1)具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
在一些方面中，小分子结合和抑制活性形式的血浆激肽释放酶。
缓激肽B2受体抑制剂
在一些实施方案中，将缓激肽B2受体抑制剂(例如，拮抗剂)施用至受试者。示例性缓激肽B2受体拮抗剂包括艾替班特其是阻碍天然缓激肽与缓激肽B2受体结合、包含10个氨基酸的拟肽药物。
C1-INH替换试剂
在一些实施方案中，将C1酯酶抑制剂(C1-INH)，例如C1-INH替换试剂施用至受试者。示例性C1-INH替换试剂是公众可得的并且包括，例如人血浆衍生的C1-INH，例如和
III.用于检测裂解的HMWK的试剂盒
本公开还提供用于在疑似含有裂解的HMWK的样品中，例如来自人患者的生物样品中，评估裂解的HMWK的试剂盒。这种试剂盒可以包括，相较于完整的HMWK或LMWK，特异性结合至裂解的HMWK的第一试剂。在一些实施方案中，所述第一试剂是抗体，例如特异性结合裂解的HMWK的任何抗体(例如本文所述的559B-M004或其功能变体)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测第一试剂与裂解的HMWK的结合的第二试剂(例如，与HMWK结合的抗体)。所述第二试剂可缀合至标记物。在一些实施方案中，所述第二试剂是特异性结合裂解的HMWK的抗体。在其他实施方案中，第二试剂是与裂解的HMWK和完整的HMWK两者交叉反应的抗体。
该试剂盒可进一步包括用于实施免疫测定方法和固定第一试剂的支持构件。在一些实施方案中，支持构件是96孔板，例如96孔ELISA板。该试剂盒还可以包括一种或多种本文所述的缓冲液，但不限于包被缓冲液；测定缓冲液，如含有ZnCl2的测定缓冲液；封闭缓冲液；洗涤缓冲液；和/或终止缓冲液。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包括的说明书可以包括如何使用试剂盒中包含的组分来测量样品中裂解的和/或完整的HMWK的水平的描述，该样品可以是从人患者收集的生物样品。可替选地或另外地，所述试剂盒可以包括如何使用试剂盒中包含的组分来测量LMWK的水平的描述。
与使用试剂盒相关的说明书通常包括关于每种组分的量和用于实施本文所述的测定方法的合适条件的信息。试剂盒中的组分可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插入物(例如，试剂盒中包括的纸片)上的书写的说明书，但是机器可读的说明书(例如，在磁盘或光盘上携带的说明书)也是可接受的。
标签或包装插入物指示该试剂盒用于评估裂解的和/或完整的HMWK的水平。在一些实施方案中，所述试剂盒用于评估LWMK的水平。可提供用于实施本文所述任何方法的说明书。
本公开的试剂盒在适当的包装中。适当的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。也考虑结合专用设备使用的包装，比如吸入器、鼻的施用设备(例如，雾化器)或注入设备、比如微型泵。试剂盒可具有无菌入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针刺破的阻塞物的静脉溶液包或小瓶)。容器也可具有无菌入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针刺破的静脉内溶液包或小瓶)。
试剂盒可任选地提供另外的组分，例如解释信息，例如对照和/或标准或参考样品。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器结合的标签或包装插入物(一个或多个)。在一些实施方案中，本公开提供了包括上述试剂盒内容物的制造制品。
IV.结合至裂解的HMWK的其他抗体
本文还提供了结合裂解的HMWK和完整的HMWK两者的分离的抗体。在一些实施方案中，此类抗体不结合LMWK或以低亲和力结合至LMWK。在其他实施方案中，此类抗体也结合至LMWK。
在一些实施方案中，特异性结合本文所述的裂解的HMWK和完整的HMWK(或另外的LMWK)的抗体对一种或多种靶抗原具有合适的结合亲和力。本文所述的抗体可具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低的结合亲和力(KD)。
在以下实施例2中的表2中提供了上述抗体的实例及其结合特异性。以下提供了重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，其中以粗体和下划线标出了CDR区(通过一个方案作为实例确定)：
>559B-R0049-A01(559B-M0067-E02)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
>559B-R0049-A01(559B-M0067-E02)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
>559B-R0049-G05(559B-M0039-G07)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
>559B-R0049-G05(559B-M0039-G07)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
>559B-R0048-A09(559B-M0044-E09)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
>559B-R0048-A09(559B-M0044-E09)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
>559B-R0048-E01(559B-M0003-C08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:12)
>559B-R0048-E01(559B-M0003-C08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
>559B-R0049-G01(559B-M0039-H06)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:14)
>559B-R0049-G01(559B-M0039-H06)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
>559B-R0049-E05(559B-M0039-D08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:16)
>559B-R0049-E05(559B-M0039-D08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
>559B-R0048-A11(559B-M0068-C07)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
>559B-R0048-A11(559B-M0068-C07)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
>559B-R0048-A03(559B-M0021-G11)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
>559B-R0048-A03(559B-M0021-G11)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
>559B-R0048-C05(559B-M0061-G06)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
>559B-R0048-C05(559B-M0061-G06)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
>559B-R0049-A03(559B-M0036-G12)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
>559B-R0049-A03(559B-M0036-G12)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
>559B-R0048-C09(559B-M0042-E06)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
>559B-R0048-C09(559B-M0042-E06)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
>559B-R0048-E09(559B-M0070-H10)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
>559B-R0048-E09(559B-M0070-H10)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
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>559B-R0048-E05(559B-M0068-D01)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
>559B-R0048-C01(559B-M0004-E08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:32)
>559B-R0048-C01(559B-M0004-E08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:33)
>559B-R0049-C01(559B-M0069-C09)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:34)
>559B-R0049-C01(559B-M0069-C09)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
>559B-R0049-A05(559B-M0038-F04)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:36)
>559B-R0049-A05(559B-M0038-F04)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:37)
>559B-R0048-G05(559B-M0044-C05)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:38)
>559B-R0048-G05(559B-M0044-C05)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:39)
>559B-R0048-C11(559B-M0047-H01)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:40)
>559B-R0048-C11(559B-M0047-H01)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:41)
>559B-R0048-C03(559B-M0019-E12)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:42)
>559B-R0048-C03(559B-M0019-E12)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:43)
>559B-R0048-A05(559B-X0004-B05)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:44)
>559B-R0048-A05(559B-X0004-B05)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:45)
>559B-R0048-E11(559B-M0048-D12)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:46)
>559B-R0048-E11(559B-M0048-D12)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:47)
>559B-R0048-G11(559B-M0053-G01)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:48)
>559B-R0048-G11(559B-M0053-G01)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:49)
>559B-R0049-C05(559B-M0038-H03)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:50)
>559B-R0049-C05(559B-M0038-H03)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:51)
>559B-R0048-E03(559B-M0017-H08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:52)
>559B-R0048-E03(559B-M0017-H08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:53)
>559B-R0049-E03(559B-M0035-F05)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:54)
>559B-R0049-E03(559B-M0035-F05)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:55)
>559B-R0049-G03(559B-M0035-H09)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:56)
>559B-R0049-G03(559B-M0035-H09)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:57)
>559B-R0048-A07(559B-M0043-C06)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:58)
>559B-R0048-A07(559B-M0043-C06)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:59)
>559B-R0048-G01(559B-M0003-A08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:60)
>559B-R0048-G01(559B-M0003-A08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:61)
>559B-R0048-G09(559B-M0054-B11)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:62)
>559B-R0048-G09(559B-M0054-B11)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:63)
>559B-R0048-E07(559B-M0067-G11)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:64)
>559B-R0048-E07(559B-M0067-G11)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:65)
>559B-R0048-C07(559B-M0065-B10)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:66)
>559B-R0048-C07(559B-M0065-B10)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:67)
>559B-R0049-C03(559B-M0037-E08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:68)
>559B-R0049-C03(559B-M0037-E08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:69)
>559B-R0049-E01(559B-M0035-A01)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:70)
>559B-R0049-E01(559B-M0035-A01)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:71)
>559B-R0048-G03(559B-M0003-E08)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:72)
>559B-R0048-G03(559B-M0003-E08)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:73)
>559B-R0048-G07(559B-M0052-E02)重链氨基酸序列(SEQ ID NO:74)
>559B-R0048-G07(559B-M0052-E02)轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:75)
>559B-M0064-H02重链氨基酸序列(SEQ ID NO:76)
>559B-M0064-H02轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:77)
同样在本公开范围内的是以上列出的任何示例性抗体的功能等同物。这样的功能等同物可以结合至与上述列举的示例性抗体之一相同的裂解的HMWK和/或完整的HMWK的表位或LMWK的相同表位。在一些实施方案中，功能等同物与上述列举的示例性抗体之一竞争结合至靶抗原。
在一些实施方案中，功能等同物包括VH链，所述VH链包括与上述列举的示例性抗体之一的相应VH CDR至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VH CDR1，VH CDR2和/或VH CDR3。可替选地或另外地，功能等同物包括与上述列举的示例性抗体至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方案中，功能等同物具有与上述列举的示例性抗体之一相同的重链互补决定区和/或轻链互补决定区(CDR)。
可替选地或另外地，功能等同物包括与示例性抗体的VH链至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VH链和/或与示例性抗体的VL链至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的VL链。
在一些情况下，功能等同物可以在示例性抗体中的一个或多个重链CDR或一个或多个轻链CDR中包含一个或多个(例如，多达5个、多达3个或多达1个)保守性突变，例如在其中残基不可能参与与靶抗原相互作用的位置处。
不需进一步阐释，相信本领域技术人员可基于上述描述充分使用本公开。因此，下述具体实施方式仅仅解释为示意性的，并且不以任何方式限制本公开的其它部分。本文引用的所有公开出版物为了文中所提及的主题的目的通过引用并入本文。
实施例
实施例1：用于特异性检测裂解的HMWK的免疫测定法的开发
最初开发了基于ELISA的免疫测定筛选以鉴定结合至裂解的或完整的HMWK的噬菌体展示文库中的Fab片段。通常，测定条件依赖于固定在涂覆链霉亲和素的384孔测定板上的生物素化的完整或裂解的HMWK，使用牛血清白蛋白(BSA)封闭缓冲液封闭，并使固定的HMWK与来自大肠杆菌中的过夜培养物的噬菌体上显示的Fab接触(用抗M13-HRP抗体检测)。
如图12的图块A所示，通过首先对生物素化的1-链HMWK固定的链霉亲和素包被的磁珠(Dynabeads M280，Thermo Fisher)预先形成以大约1×1012噬菌体的文库的负选择来针对获得2-链HMWK特异性的抗体进行选择。然后将耗竭的文库与固定在链霉亲和素包被的磁珠上的生物素化的2链HMWK接触。珠子用PBS缓冲液充分洗涤并用于感染大肠杆菌用于噬菌体输出扩增以完成一轮选择。在通过ELISA使用固定在链霉亲和素涂覆的平板上的生物素化的1-链和2-链HMWK筛选单个噬菌体克隆之前进行三轮选择，随后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-M13抗体检测并进行由于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的底物水解引起的吸光度检测。重组Fab片段在大肠杆菌中表达，并通过蛋白质A琼脂糖层析纯化(Wassaf等Anal.Biochem.(2006)351:241-253)。通过涂覆384孔板并测量与生物素化的1-链HMWK、生物素化的2-链HMWK或生物素化的LMWK的结合、然后用缀合至HRP的链霉亲和素进行检测和TMB检测来确定每个纯化的Fab的特异性。这些测定条件导致对559B-M004-B04分离物的鉴定，其相对于完整的HMWK特异性结合裂解的HMWK(图1)。
固定的HMWK还与来自大肠杆菌中的过夜培养物的粗制(未纯化的)559B-M004-B04Fab制剂接触。使用抗人Fab-HRP抗体检测与HMWK结合的Fab，但未导致与裂解的HMWK特异性结合(图1)。
通过将559B-M004-B04的纯化的Fab片段惰性地固定在聚苯乙烯384孔测定板上，免疫测定方法的配置被反转。使Fab与生物素化的HMWK接触，并用链霉亲和素-HRP检测结合的HMWK。(图1)。
出乎意料地，当初始筛选分析期间BSA封闭缓冲液被商业上可获得的封闭缓冲液(来自Candor Biosciences的LowCross封闭溶液)替代时，559B-M004-B04 Fab对裂解的HMWK的特异性增强(图1)。此外，使用96孔测定板而不是384孔板进行免疫测定进一步增加了观察到的559B-M004-B04对裂解的HMWK的特异性(图1)。
使用559B-M004-B04分离物获得的结果导致用于检测样品中2-HMWK的免疫测定方法(ELISA)的开发(图12，图块B)。该测定方法也可用于进一步评估其他Fab片段和抗体的结合特征。简而言之，将Fab涂覆在多孔板上过夜。第二天洗涤平板，然后用BSA缓冲液封闭。洗涤后，将在LowCross缓冲液中稀释的样品、标准品和QC添加到平板，并且在随后的培养和然后洗涤后，通过添加HRP标记的羊抗HMWK多克隆检测抗体来检测任何结合的2链HMWK。在用检测抗体培养后，洗涤平板并将TMB底物加至平板。短暂培养后，反应用磷酸终止。然后在450nm-630nm下测量光密度。
实施例2：使用本文描述的免疫测定方法评估Fab克隆的结合特异性
使用实施例1中描述的免疫测定方法评估36个纯化的Fab克隆(参见下表2)与裂解的HWMK、完整的HMWK和LWMK的结合。具体地，将每个纯化的Fab克隆以PBS中总体积为100μL浓度为1μg/L固定在96孔测定板上，并在2-8℃培养过夜。使用LowCross封闭缓冲液封闭测定板。将生物素化的完整的HMWK、生物素化的裂解的HMWK或生物素化的LMWK(各1μg/L)加入到总体积为100μL的各孔中，并培养2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。以100ng/mL的浓度向每个孔中加入HRP标记的链霉亲和素，并使用Ultra TMB底物显影信号。使用将生物素化的蛋白加入至未涂覆的孔时观察到的信号计算信噪比。(图2，图块A和图块B)。根据ELISA结果，抗体可分为5类(表2)。
表2：Fab片段的结合特征
获得了与1-链HMWK、2-链HMWK两者和LMWK结合的几种抗体，例如559B-M0064-H02。这些抗体可能结合HMWK和LMWK之间共享的结构域1至4中的表位。M070-H10是被认为结合在1链和2链HMWK之间共享的表位但不在LMWK上的抗体的实例。LMWK是激肽原剪接变体，导致包括结构域1至4和结构域5的部分的截短蛋白(Colman等Blood(1997)90:3819-3843)。因此，诸如M070-H10的抗体可能结合结构域5或结构域6。
如图14的图块A所示，559B-M0004-B04显示出在1链HMWK和LMWK上对2-链的选择性，并被选择用于进一步的测定优化。开发夹心ELISA以检测人血浆样品中的裂解的HMWK，其中559B-M0004-B04(100μL，2μg/mL)惰性地固定在96孔板(Nunc Maxisorp板)上(图12，图块B)。第二天，洗涤平板，然后用2％BSA(不含蛋白酶/IgG)的PBS缓冲液封闭。洗涤后，样品在含有0.05％吐温-20的PBS中的0.1％BSA缓冲液(2链HMWK测定缓冲液)中含有裂解的HMWK。将纯化的蛋白质标准物(例如，2-链HMWK、完整的HMWK或LMWK)掺入HNKW HMWK缺陷血浆中并在2链HMWK测定缓冲液中稀释1:320。在用PBST洗涤平板后，在室温下加入在2链HMWK测定缓冲液中的1μg/mL的2个小鼠单克隆抗体(11H05和13B12)的混合物，保持1小时。洗涤未结合的检测抗体，加入与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠第二抗体的1:2000稀释液。含有第二抗体的试样在室温下培养1小时，通过用2-链HMWK测定缓冲液洗涤除去未结合的第二抗体。通过加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(一种HRP底物)检测信号。用磷酸终止反应。使用酶标仪在450nm-630nm下检测TMB底物的水解(图3)。另外，使用含有在2-链HMWK测定缓冲液或HMWK缺陷血浆中裂解的HMWK的样品并在2.5％或10％血浆存在下分析来进行ELISA测定法，导致相似的结合(图4)。使用这些免疫测定条件，检测到与裂解的HMWK特异性结合。当HMWK提供于2链HMWK测定缓冲液或HMWK缺陷血浆时，测定导致相当的性能(图3和图4)。此外，不存在559B-M0004-B04至LMWK的结合。
评估ELISA测定用于检测人血浆中接触激活后产生的裂解的HMWK(图5A和图5B)。在不存在或存在催化量的FXIIa、pKal或鞣花酸的情况下测量正常人血浆中裂解的HMWK的量，鞣花酸导致FXII自动激活成FXIIa并因此产生裂解的HMWK(图5，图块A和图块B)。与血浆激肽释放酶作为产生2链HMWK所需的主要血浆酶的作用一致，鞣花酸或FXIIa添加都不会导致前激肽释放酶缺陷血浆中裂解的HMWK的产生。FXI缺陷血浆中的接触系统使用FXIIa、pKal或鞣花酸同样被激活；该结果与FXIa由FXIIa产生并且不产生2-链HMWK的理解一致。
通过使用小鼠单克隆抗体11H05的Western印迹分析，通过检测在人血浆中接触激活后产生的裂解的HMWK来证实来自2链HMWK ELISA的结果(图10)。11H05抗体特异性结合HMWK的轻链并且阐明56kDa轻链和进一步蛋白水解的46kDa轻链两者，46kDa轻链随后在HMWK轻链的N-末端附近的位点处通过血浆激肽释放酶的蛋白水解活性产生(Colman等Blood(1997)90:3819-3843)。
还评估了ELISA测定法用于检测来自12个正常供体的血浆中产生的裂解的HMWK的能力(图6)。在接触激活系统的鞣花酸激活之后，在12个样品中的每一个中检测到裂解的HMWK。在接触激活系统使用各种浓度的兰达鲁单抗(DX-2930；血浆激肽释放酶的特异性抑制剂)或丝氨酸蛋白酶抑制剂C1-INH的抑制剂在正常的血浆中抑制然后用鞣花酸激活后(图7，图块A和图块B)，还测量裂解HMWK的量。兰达鲁单抗(DX-2930)是使用噬菌体发现的并且正在临床开发用于预防性治疗HAE-C1INH发作的有力的完全人抗体(Ki＝0.12nM)和血浆激肽释放酶的特异性抑制剂(Chyung等Ann.Allergy Asthma Immunol.(2014)113:460-466；Kenniston等J.Biol.Chem.(1994)289:23596-23608)。当兰达鲁单抗以不同的浓度掺入柠檬酸化血浆中时，如Western印迹和夹心ELISA所示，它有效地抑制由FXIIa诱导的2链HMWK的产生(图7B)。兰达鲁单抗抑制2-链HMWK产生的IC50为212±28nM，这与在纯血浆中激活所有前激肽释放酶的预期值(约500nM)一致。用接触系统激活剂处理的血浆中兰达鲁单抗对信号的完全抑制证实M004-B04对由血浆激肽释放酶产生的双链HMWK具有特异性。
在此初步测定中，使用M004-B04作为捕获抗体和HRP缀合的绵羊多克隆抗激肽原作为检测抗体，在激肽原缺陷血浆中接触系统的激活未引起ELISA信号的增加(数据未显示)。
从图10也可以看出，使用EDTA作为抗凝血剂从健康受试者收集的血浆与柠檬酸化血浆类似地被激活；支持了接触系统激活不需要金属离子的论述(Colman等Blood(1997)90:3819-3843)。然而，在EDTA血浆中通过ELISA未检测到2链HMWK(图5B)，表明M004-B04抗体与2-链HMWK的结合依赖于金属离子。先前鉴定了轻链结构域5(氨基酸479-498)中HMWK上的锌结合位点，并显示其介导与内皮细胞表面受体gC1qR、细胞角蛋白1和尿激酶纤溶酶原激活物受体的激肽原相互作用，从而增强接触系统激活(Kaplan等Adv.Immunol.(2014)121:41-89；Bjorkqvist等Biol.Chem.(2013)394:1195-1204)。在各种浓度下测试添加ZnCl2到测定缓冲液中并发现增强了抗体与裂解的HMWK的结合(图11)。研究了用鞣花酸激活的柠檬酸盐和EDTA血浆观察到的增加浓度的ZnCl2对ELISA信号的影响。EDTA血浆中的ELISA信号在ZnCl2浓度高于400μM(孔浓度)时增加至表观最大值。
先前使用电子显微镜显示1-链HMWK与锌的结合促进更紧凑和球形的四级结构(Herwald等Eur J.Biochem.(2001)268:396-404)。电子显微镜也显示，在含有EDTA的缓冲液中，2-链HMWK比1-链HMWK采用更长、更小球形的四级结构(Herwald等Eur J.Biochem.(2001)268:396-404)。尽管锌对2链HMWK结构的影响先前未有报道，但本文所述的M004-B04的明显的锌依赖性结合表明在锌存在下2-链HMWK以独特的构象存在。
在市售喷雾涂覆的K2EDTA试管中收集的血浆中的EDTA浓度为约4mM，其在1:20稀释后转化为约200μM的孔内浓度，并且与加入足够的ZnCl2后的锌依赖性结合的恢复一致以压倒EDTA的螯合能力。相反，使用鞣花酸激活的柠檬酸化血浆的ELISA信号在25μM或50μMZnCl2(孔浓度)存在下没有增加，但是当浓度高于100μM ZnCl2时增加，高于200μM ZnCl2时ELISA信号增加到最大值。(图11)来自健康志愿者的血浆中锌的正常浓度为10-17μM(Wessells等J.Nutr.(2014)144:1204-1210)。由于在激活的柠檬酸化血浆中观察到的ELISA信号仅在孔内ZnCl2浓度>50μM时增加，这相当于血浆内浓度>1mM，似乎ELISA对血浆中锌浓度的生理波动不敏感。因此，随后的实验没有将ZnCl2添加到测定缓冲液中。
如上所述，559B-M004-B04与2-链HMWK的结合被超生理浓度的ZnCl2增强，并且被高浓度的EDTA通过金属螯合抑制。已经描述了锌结合位点在2链HWMK的结构域中，并且包括该位点的合成肽(HKH20，HKHGHGHGKHKNKGKKNGKH(SEQ ID NO：83))显示出通过减弱细胞表面缔合来抑制接触系统激活(Nakazawa等Int.Immunopharmacol.(2002)2:1875-1885)。因此，通过ELISA测试了HKH20肽以及与结构域3中的序列相对应的GCP28肽抑制2-链HMWK与559B-M004-结合的能力。如图15所示，HKH20肽而非GCP28肽抑制2-链HMWK与M004-B04的结合，这表明M004-B04表位可以位于锌结合位点附近的结构域5内。为了进行该测定，将激肽原肽稀释至250μg/mL，并使其在测定板上预培养，然后将缺陷人血浆中纯化的2链HMWK稀释160，然后加入板中。
在用鞣花酸或FXIIa激活接触激活系统后，在不同的时间点评估在正常柠檬酸化的人血浆中裂解的HMWK产生的时间依赖性(图8)。最后，ELISA试验用于评估与来自正常患者(无HAE)的柠檬酸化血浆样品相比，来自患有遗传性血管性水肿(HAE)的患者的血浆样品中裂解的HMWK的存在和数量。发现来自HAE患者的样品相对于来自正常供体的样品(432.4±186ng/mL)含有升高水平的2-链HMWK(1423±603ng/mL)(图9)，通过单因素ANOVA分析其在统计学上具有差异(P＝0.017)。
已确定M004-B04特异性结合不存在于1-链HMWK或LMWK上的在2-链HMWK上的新表位并证明抗体结合依赖于血浆激肽释放酶活性，所述测定还使用一对用于检测的小鼠单克隆抗体(11H05和13B12)(图16)。抗体13B12似乎结合HMWK的重链，且11H05似乎结合HMWK的轻链，用于检测的两种抗体的组合导致信号增强，这可能是由于它们在抗原中的非重叠结合表位。
之前已经描述了血浆采集对接触系统评估的重要性(Suffritti等Clin.Exp.Allergy(2014)44:1503-1514)。众所周知，血浆与玻璃或其他极性表面的接触导致广泛的离体接触系统激活，这可能掩盖内源性接触系统激活的准确测定(Colman等，Blood(1997)90：3819-3843)。在不同的血浆类型中比较了优化的夹心ELISA检测2-链HMWK的能力，所述血浆类型包括在真空塑料血液收集管中的酸柠檬酸右旋糖中含有蛋白酶抑制剂的混合物的定制血浆，称为SCAT169(HTI，Essex VT)。如图6所示，在SCAT169血浆中制备的标准曲线比在柠檬酸化血浆中制备的曲线更不敏感，这可能是由于在收集的血浆中包含2mM EDTA。在该测定中使用的血浆稀释物(1:320)中，该浓度的EDTA(3.1μM)不明显干扰2-链HMWK，并且可以有助于稳定血浆免受由金属蛋白酶引起的蛋白水解降解。
通过Western印迹和夹心ELISA测定法将来自健康志愿者的柠檬酸化的血浆和SCAT169血浆与来自HAE患者的样品进行比较。在图17，图块A-C中，检测柠檬酸化的血浆中2-链HMWK(即裂解的激肽原)的Western印迹方法能够区分来自HAE患者的样品与健康志愿者(HV)的样品，如接受者操作者特征(ROC)分析所示，对于基础与HV的比较，曲线下面积(AUC)值为0.977，或对于发作与HV的比较，所述值为1.0。来自HAE患者静息期(基础)的柠檬酸化血浆样品与发作样品区分，其中AUC为0.625(图17，图块D)。
如图18显示，图块A-C所示，检测SCAT169血浆中2链HMWK的Western印迹法能够区分来自HAE患者的样品与来自健康志愿者(HV)的样品，如ROC分析所示，对于基础与HV的比较，AUC值为0.915，或对于发作与HV的比较，所述值为0.967。来自HAE患者静息期(基础)的SCAT169样品与发作样品区分，其中AUC0.597(图18，图块D)。
在图19，图块A-C中，检测柠檬酸化血浆中2链HMWK的2链ELISA方法能够区分来自HAE患者的样品与健康志愿者的样品，如ROC分析所示，对于基础与HV的比较，AUC值为0.915，或对于发作与HV的比较，所述值为0.866。来自HAE患者在静息期(基础)的柠檬酸化血浆样品与发作样品区分，其中AUC为0.709(图19，图块D)。
如图20，图块A-C所示，检测在SCAT169样品中2-链HMWK的2链ELISA方法能够区分来自HAE患者的样品与健康志愿者的样品，如通过ROC分析所示，对于基础与HV的比较，AUC值为0.999，或对于发作与HV的比较，所述值为1.0。来自HAE患者静息期(基础)的柠檬酸化血浆样品与发作样品区分，其中AUC为0.8176(图20，图块D)。
对于上述ROC分析，本文中证明的2-链HMWK Western印迹和2-链HMWK ELISA都可以基于血浆中裂解的激肽原的水平用于区分具有HAE或处于HAE风险的患者与健康志愿者。SCAT169血浆中蛋白酶抑制剂的存在减少了血液采集期间的离体血浆激活。
其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行结合。本说明书中公开的每个特征可被用于相同、等价或类似目的的可替选的特征替换。因此，除非另外明确指出，否则公开的每个特征仅仅是一般系列的等同或类似特征的例子。
从上面的描述，本领域技术人员可容易确定本公开的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本公开作出各种改变和修饰，以使其适应各种适用和条件。因此，其他实施方式也在本公开的权利要求范围内。
等同原则和范围
仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确认本文所述的公开的具体实施方式的许多等同方式。本公开的范围不旨在限于上面的描述，而是如所附的权利要求中阐释。
在权利要求中，冠词比如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”可意为是一个或多个，除非相反指出或从上下文其他方式是明显的。如果一个、大于一个或所有的组成员出现于、应用于或以其他方式与给定产品或方法相关，则认为权利要求或说明书满足在组的一个或多个成员之间包括“或”，除非有相反指出或从上下文另外显而易见。本公开包括了这样的实施方式：其中组中的恰好一个成员出现于、应用于或以其他方式与给定的产品或方法相关。本公开包括这样的实施方式：其中大于一个或所有的组成员出现于、应用于或以其他方式与给定的产品或方法相关。
此外，本公开涵盖所有这样的变型、组合和排列：其中来自一个或多个列举的权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语被引入另一权利要求中。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求可被修饰，以包括在从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中出现的一个或多个限制。在要素作为清单出现的情况下，例如，以马库什组形式，也公开了要素的各个子组，并且可从组中去除任何要素(一种或多种)。一般而言，应理解，在本公开或本公开的方面被指包括具体的要素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方式或本公开的方面由或基本上由这样的要素和/或特征组成。为了简化的目的，那些实施方式未在本文中明确阐释。也注意到，术语“包括”和“包含”旨在是开放式的，并且允许囊括其他要素或步骤。在给定范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指出或另外从上下文显而易见，本领域普通技术人员理解，表达为范围的值可认为为本公开的不同实施方式中该叙述范围内的任何具体的值或子范围，至该范围下限单位的十分之一，除非上下文明确相反指出。
本申请引用各种公布的专利、公开的专利申请、期刊文献和其他出版物，其所有均通过引用并入本文。如果在任何并入的参考文献和本说明之间存在冲突，以本说明书为准。另外，落入现有技术内的本公开任何具体的实施方式可明确从权利要求的任何一项或多项中排除。因为这样的实施方式视为是本领域普通技术人员已知的，它们可被排除，即使该排除未在本文中明确阐释。出于任何原因本公开任何具体的实施方式可从任何权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在相关。
仅仅使用常规实验，本领域技术人员认识到或能够确认本文所述的具体实施方式的许多等同方式。本文所述的实施方式的范围不旨在限于上面的描述，而是如在所附的权利要求中阐释。本领域技术人员认识到可对该描述做出各种改变和修饰，而不背离如下述权利要求中限定的本公开的精神或范围。
序列表
<110> 戴埃克斯有限公司
<120> 用于检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定法
<130> FPAP-1800263
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/335,311
<151> 2016-05-12
<150> US 62/243,505
<151> 2015-10-19
<160> 83
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr
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Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Ser Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
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<220>
<223> 合成多肽
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Glu
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<223> 合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
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<223> 合成多肽
<400> 27
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<223> 合成多肽
<400> 28
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
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<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
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Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Leu Ile Ala Ala Ala Gly Gly Phe Asp Pro Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成多肽
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ile
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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<220>
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
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35 40 45
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<223> 合成多肽
<400> 37
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<220>
<223> 合成多肽
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
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Met Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<223> 合成多肽
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<220>
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
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<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
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1 5 10 15
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Met Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Ile Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Trp Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Ser Gly Arg Gly Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gln Lys Ser Tyr
85 90 95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Phe Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ala Ile
20 25 30
Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Gly
20 25 30
Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Lys Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Ser Ser Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Phe Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Thr
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Leu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ile Pro Asn Trp Ile Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gly Val Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 74
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ala Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr His
85 90 95
Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Ile Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Val Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Gly Val Thr Val Leu His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 77
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Glu Gly Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ala Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Tyr Gly Gly His
85 90 95
Ser Arg Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro
115
<210> 78
<211> 304
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys
35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys
50 55 60
Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu
65 70 75 80
Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile
100 105 110
Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
130 135 140
Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly
145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu
165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn
180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu
195 200 205
Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly
210 215 220
Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly
225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn
245 250 255
Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile
260 265 270
Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys
275 280 285
Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met
290 295 300
<210> 79
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala
1 5 10 15
Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala
35 40 45
Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala
50 55
<210> 80
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys
1 5 10 15
Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys
20 25 30
Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu
35 40 45
Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp
50 55 60
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105
<210> 83
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys
1 5 10 15
Asn Gly Lys His
20

Claims (63)

1.一种用于检测裂解的高分子量激肽原HMWK的免疫测定方法，所述方法包括：
(i)提供支持构件，在所述支持构件上固定特异性结合裂解的HMWK的第一试剂；
(ii)使(i)的支持构件与疑似含有裂解的HMWK的生物样品接触；
(iii)使(ii)中获得的支持构件与结合HMWK的第二试剂接触，其中所述第二试剂缀合至标记物；和
(iv)直接或间接检测从结合至所述支持构件的第二试剂的标记物释放的信号，以确定所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平。
2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，其中所述第一试剂是特异性结合所述裂解的HMWK的抗体。
3.根据权利要求2所述的免疫测定方法，其中所述抗体是559B-M004-B04。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述支持构件是96孔板。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫测定方法，其中在步骤(ii)之前，将所述(i)的支持构件用封闭缓冲液培养。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第二试剂是多克隆抗体、单克隆抗体或结合至HMWK的两种或更多种单克隆抗体的混合物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫测定方法，其中所述标记物是信号释放剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述标记物是受体-配体对的一个成员，并且所述免疫测定方法还包括在步骤(iv)之前，使结合至所述支持构件的(iii)中的所述第二试剂与所述受体-配体对的另一成员接触，其中所述另一成员缀合至信号释放剂。
9.根据权利要求8所述的免疫测定方法，其中所述受体-配体对是生物素和链霉亲和素。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定方法是Western印迹测定法、ELISA测定法或侧向流测定法。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫测定方法，其中在ZnCl2的存在下进行步骤(ii)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫测定方法，其中所述生物样品从人受试者获得。
13.根据权利要求12所述的免疫测定方法，其中所述生物样品是血清样品或血浆样品，所述血清样品或血浆样品从在包含一种或多种蛋白酶抑制剂的真空血液收集管中收集的血液样品处理。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，其中人受试者具有疾病，并且其中所述免疫测定方法还包括基于步骤(iv)中确定的所述裂解的HMWK的水平确定所述疾病是否由pKal介导，所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示所述疾病由pKal介导。
15.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，还包括基于步骤(iv)中确定的所述裂解的HMWK的水平，确定所述人受试者是否具有由血浆激肽释放酶介导的疾病或处于血浆激肽释放酶介导的疾病的风险中，其中如果来自所述受试者的所述生物样品的所述裂解的HMWK的水平偏离对照样品的所述裂解的HMWK的水平，则所述受试者被鉴定为具有所述疾病或处于具有所述疾病的风险中。
16.根据权利要求15所述的免疫测定方法，还包括如果所述受试者被鉴定为具有所述疾病，则向所述受试者施用有效量的用于治疗所述疾病的治疗剂。
17.根据权利要求16所述的免疫测定方法，其中所述治疗剂为血浆激肽释放酶(pKal)抑制剂、缓激肽2受体(B2R)抑制剂和/或C1酯酶抑制剂。
18.根据权利要求17所述的免疫测定方法，其中所述pKal抑制剂是抗pKal抗体或抑制肽。
19.根据权利要求18所述的免疫测定方法，其中所述治疗剂是兰达鲁单抗、艾卡拉肽、艾替班特或人血浆衍生的C1-INH。
20.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，其中所述人受试者在接受所述疾病的治疗，并且其中所述免疫测定方法还包括基于步骤(iv)中确定的所述裂解的HMWK的水平评价所述治疗的功效，来自所述受试者的所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示治疗功效。
21.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，还包括基于所述裂解的HMWK的水平鉴定用于所述受试者的合适的治疗。
22.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，还包括基于所述裂解的HMWK的水平将所述受试者鉴定为用于治疗所述疾病的候选者。
23.根据权利要求12、13或15-22中任一项所述的免疫测定方法，其中所述人受试者具有所述疾病的病史。
24.根据权利要求23所述的免疫测定方法，其中所述疾病是HAE。
25.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，其中所述人受试者具有HAE的病史，并且其中所述免疫测定方法还包括基于所述裂解的HMWK的水平评价所述受试者疾病发作的风险来自所述受试者的所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示疾病发作的风险。
26.根据权利要求25所述的方法，还包括如果所述受试者处于疾病发作的风险中，则向所述受试者施用治疗剂。
27.一种分离的抗体，其特异性结合裂解的高分子量激肽原(HMWK)。
28.根据权利要求27所述的分离的抗体，其中所述抗体与559B-M004-B04结合相同的表位，或与559B-M004-B04竞争结合至所述裂解的HMWK。
29.根据权利要求28所述的分离的抗体，其中所述抗体包括与559B-M004-B04相同的重链互补决定区和轻链互补决定区。
30.根据权利要求29所述的分离的抗体，其中所述抗体是559B-M004-B04。
31.一种用于检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合裂解的HMWK的第一试剂；其中所述第一试剂是权利要求27-30中任一项所述的抗体。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括结合HMWK的第二试剂、支持构件、或结合HMWK的第二试剂和支持构件两者。
33.根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述支持构件是96孔板。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测所述裂解的HMWK的说明书。
35.一种分离的抗体，其结合完整的高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK。
36.根据权利要求35所述的分离的抗体，其中所述抗体不结合至低分子量激肽原(LMWK)。
37.根据权利要求36所述的分离的抗体，其中所述抗体与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08结合相同的表位；或与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08竞争结合至完整的HMWK和/或裂解的HMWK。
38.根据权利要求37所述的分离的抗体，其中所述抗体包括与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08相同的重链CDR和轻链CDR。
39.根据权利要求38所述的分离的抗体，其中所述抗体选自由以下构成的组：559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01和559B-M0004-E08。
40.根据权利要求35所述的分离的抗体，其中所述抗体还结合LMWK。
41.根据权利要求40所述的分离的抗体，其中所述抗体与559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559B-M0064-H02或559B-M0065-B10结合相同的表位；或与559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559-M0064-H02或559B-M0065-B10竞争结合至所述完整的HMWK、所述裂解的HMWK和/或所述LMWK。
42.根据权利要求41所述的分离的抗体，其中所述抗体包括与559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559B-M0064-H02或559B-M0065-B10相同的重链CDR和轻链CDR。
43.根据权利要求42所述的分离的抗体，其中所述抗体选自由以下构成的组：559B-M0069-C09、559B-M0038-F04、559B-M0044-C05、559B-M0047-H01、559B-M0019-E12、559B-X0004-B05、559B-M0048-D12、559B-M0053-G01、559B-M0038-H03、559B-M0017-H08、559B-M0035-F05、559B-M0035-H09、559B-M0043-C06、559B-M0003-A08、559B-M0054-B11、559B-M0067-G11、559B-M0064-H02和559B-M0065-B10。
44.一种检测样品中裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法，所述方法包括：
(i)使疑似含有裂解的HMWK的样品与权利要求27-30中任一项的抗体接触；
(ii)测量步骤(i)中形成的所述裂解的HMWK和所述抗体的复合物；和
(iii)基于步骤(ii)的结果确定样品中所述裂解的HMWK的水平。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述样品是从受试者获得的生物样品。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述生物样品是血清样品或血浆样品。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述受试者是人患者。
48.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，还包括将所述生物样品收集到包含一种或多种蛋白酶抑制剂的真空血液收集管中。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述方法使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹测定法或侧向流测定法进行。
50.根据权利要求45-49中所述的方法，其中所述受试者具有疾病，并且其中所述方法还包括基于步骤(iii)中确定的所述裂解的HMWK的水平确定所述疾病是否由pKal介导，所述样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示所述疾病由pKal介导。
51.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，还包括基于步骤(iii)中确定的所述裂解的HMWK的水平，确定所述受试者是否具有由血浆激肽释放酶介导的紊乱或处于血浆激肽释放酶介导的紊乱的风险中，其中如果来自所述受试者的样品的所述裂解的HMWK的水平偏离对照样品的所述裂解的HMWK的水平，则所述受试者被鉴定为具有所述紊乱或处于具有所述紊乱的风险中。
52.根据权利要求51所述的方法，还包括如果所述受试者被鉴定为具有所述紊乱，则向所述受试者施用有效量的用于治疗所述紊乱的治疗剂。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述治疗剂为血浆激肽释放酶(pKal)抑制剂、缓激肽2受体(B2R)抑制剂和/或C1酯酶抑制剂。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述pKal抑制剂是抗pKal抗体或抑制肽。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述治疗剂是兰达鲁单抗、艾卡拉肽、艾替班特或人血浆衍生的C1-INH。
56.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述受试者是在接受对所述紊乱治疗的人患者，并且其中所述方法还包括基于步骤(iii)中确定的所述裂解的HMWK的水平评价所述治疗的功效，来自所述受试者的所述样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示治疗功效。
57.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，还包括基于所述裂解的HMWK的水平确认用于所述受试者的合适的治疗。
58.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，还包括基于所述裂解的HMWK的水平将所述受试者鉴定为用于治疗所述疾病的候选者。
59.根据权利要求48-58中任一项所述的方法，其中所述人患者具有所述疾病的病史。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述疾病是HAE。
61.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，其中所述人患者具有HAE的病史，并且其中所述方法还包括基于所述裂解的HMWK的水平评价所述受试者疾病发作的风险，来自所述样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示疾病发作的风险。
62.根据权利要求61所述的方法，还包括如果所述受试者处于疾病发作的风险中，则向所述受试者施用治疗剂。
63.根据权利要求44-62中任一项所述的方法，其中在ZnCl2的存在下进行步骤(i)。
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