DE102004017295A1 - Verbindungen, welche die Entfernung von Rezeptoren von Zelllmembranen bewirken oder verhindern, und Verfahren zu ihrem Nachweis - Google Patents

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Abstract

Es werden Verbindungen beschrieben, die die Entfernung von auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren induzieren oder verhindern, sowie Verfahren zum Auffinden derartiger Verbindungen, bei denen man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes Markermolekül auf die Zellmembran einwirken lässt, dann die zu testende Verbindung hinzugibt und nach einer ausreichenden Inkubationszeit prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet oder ob die Abspaltung des Rezeptors in Gegenwart einer hierfür an sich geeigneten Verbindung verhindert werden kann, wenn man eine hierfür geeignete weitere Substanz zusetzt.

Description

  • Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen und zelluläre Moleküle, die die Entfernung von auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren (Rezeptormoleküle) induzieren oder verhindern können, sowie Verfahren zum Nachweis von Verbindungen und zellulären Molekülen mit diesen Eigenschaften.
  • Es ist bekannt, dass viele physiologische und pathophysiologische Vorgänge in Makro- und Mikroorganismen durch Verbindungen ausgelöst werden, die mit den auf der Zellmembran vorhandenen Rezeptoren eine Bindung eingehen. Dadurch werden Reaktionen ausgelöst, die sich auf das Zellinnere auswirken. So wird zum Beispiel die Bindung eines Blutplättchens an Kollagen in der Blutgefäßwand durch Glykoproteine vermittelt, die sich auf der Blutplättchenoberfläche befinden. Nach erfolgter Bindung werden in dem Blutplättchen Folgereaktionen ausgelöst, die zu seiner Aktivierung führen (1, 2). Als Folge der Bindung verändert das Blutplättchen seine Form und setzt biologisch aktive Substanzen frei, die die Blutgerinnung an dieser Stelle einleiten. Der Vorgang der Blutplättchenaktivierung ist lebenswichtig, denn er verhindert, dass nach einer Verletzung von Blutgefäßen das Individuum verblutet. Andererseits kommt es bei chronisch entzündeten Blutgefäßen, insbesondere der Arterien, zu der sog. Arteriosklerose, bei der Kollagen freigesetzt werden kann und dann Blutplättchen in intakten Arterien aktiviert werden. Dadurch kann in den Blutgefäßen eine Thrombusbildung eintreten und die Arterie verschlossen werden, so dass die Organe, welche durch diese Arterien versorgt werden, durch den einsetzenden Sauerstoffmangel stark geschädigt werden können. Die häufigste Todesursache in den Industrieländern ist so auch tatsächlich auf den Verschluss von Arterien, zum Beispiel beim Herzinfarkt oder Schlaganfall, zurückzuführen.
  • In der jüngsten Zeit sind Rezeptoren zur Kollagenbindung und Plättchenaktivierung identifiziert worden. Insbesondere wird die Plättchenaktivierung durch Kollagen von dem Blutplättchenmolekül Glykoprotein VI (GPVI) vermittelt. Weiterhin hat sich im Mausmodell gezeigt, dass dieser Rezeptor durch Bindung des monoklonalen Antikörpers JAQ1 permanent von der Blättchenoberfläche entfernt werden kann (3, 4). Die Vorgänge, die nach der Antikörperbindung diese Rezeptorentfernung bewirken, sind nicht genau geklärt, jedoch wird dem genannten Antikörper, welcher die Rezeptorentfernung induziert, ein großes therapeutisches Potenzial zugetraut, vor allem da er auch an menschliches GPVI binden kann (4). Die Kollagenrezeptorenentfernung mittels dieses Antikörpers konnte bisher nur in lebenden Mäusen, aber noch nicht in vitro nachgewiesen werden und eine GPVI Rezeptor Entfernung von menschlichen Plättchen mittels JAQ1 konnte deshalb auch noch nicht gezeigt werden.
  • Da nicht nur solche Antikörper, sondern auch andere Substanzen mit der o. g. Eigenschaft ein großes therapeutisches Potenzial, z.B. für die Behandlung arteriosklerotischer Krankheitserscheinungen aufweisen könnten, ist es notwendig, derartige Antikörper oder andere Substanzen mit spezifischen Wirkungen auf die Rezeptorentfernung von den Zellmembran aufzufinden. Hierfür geeignete Screening-Verfahren stehen jedoch bisher nicht zur Verfügung.
  • Das Auffinden eines Moleküls mit Wirkungen auf die Rezeptoren einer Zellmembran ist bisher auch deshalb nicht gelungen, da die Messung der Rezeptorentfernung mit einem sehr hohen experimentellen und zeitlichen Aufwand verbunden ist. So muss die Testsubstanz im Falle des Kollagenrezeptors GPVI, beispielsweise ein Antikörper, bisher in die Maus injiziert, nach einiger Zeit die Blutplättchen entfernt und auf das Vorhandensein des GPVI Rezeptors getestet werden. Die Anzahl der zu testenden Moleküle ist deshalb bisher sehr gering gewesen und die Selektion solcher Moleküle im größeren Maßstab oder sogar im High Throughput System überhaupt nicht möglich gewesen. Der Nachweis der Entfernung von GPVI-Rezeptoren von menschlichen Blutplättchen ist, wie oben erwähnt, bisher überhaupt noch nicht gelungen, da es keine hierfür geeigneten in vitro Verfahren gibt.
    •
  • Es stellte sich deshalb die Aufgabe, Substanzen aufzufinden, welche die Entfernung von Rezeptoren von Zellmembranen induzieren oder verhindern können sowie Screening-Verfahren zu entwickeln, die zum Auffinden derartiger Substanzen geeignet sind.
  • Es wurde nun gefunden, dass eine Verbindung, die die Entfernung von auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren induzieren kann, aufgefunden wird, wenn man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes Markermolekül auf die Zellmembran einwirken lässt, dann die zu testende Verbindung hinzufügt und nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet. In der Regel wird hierbei ein Verfahren benutzt, bei dem das an die Rezeptoren bindende Markermolekül nicht gleichzeitig selbst die Entfernung des Rezeptors induziert, sondern als neutrales Agens durch seine Bindung den Rezeptor lediglich markiert, ohne dessen Eigenschaften in für die geschilderten Nachweise nachträglicherweise zu verändern.
  • Wenn in einem Unterfall ein Markermolekül eingesetzt wird, das zur Entfernung des dazu passenden Rezeptors führt, dann kann ein solchermaßen aktives Markermolekül zum Nachweis von Verbindungen, Substanzen und zellulären Molekülen für die Hemmung der Rezeptorentfernung eingesetzt werden.
  • Die zur Entfernung der Rezeptoren geeignete Verbindung kann eine körpereigene Verbindung, ein Enzym, ein Antikörper, ein anderes Protein oder Peptid, ein Polysaccharid, Lipid oder eine niedermolekulare Verbindung sein.
  • Der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor kann jeder beliebige Rezeptor, insbesondere aber ein Kollagenrezeptor sein. In diesem Fall ist das Markermolekül vorzugsweise ein Antikörper gegen den Kollagenrezeptor. Ein besonders bevorzugtes Markermolekül ist der markierte Antikörper JAQ1 der in EP 1228768A1 ausführlich beschrieben und auch hinterlegt ist. Der markierte Antikörper JAQ1 gehört zu denjenigen Antikörpern, die nach Bindung an den Kollagenrezeptor diesen auch abbauen. Der Antikörper JAQ1 kann jedoch nach proteolytischer Vorbehandlung (Entfernung des Fc-Anteils), in seinen Eigenschaften so verändert werden, dass er nur noch markiert und den Kollagenrezeptor nicht mehr abbaut. Der JAQ1 Antikörper liegt dann im F(ab')2-Format vor und kann für das im Beispiel 2 beschriebene Nachweisverfahren eingesetzt werden.
  • Grundsätzlich kann das neutrale Markermolekül aus den Gruppen der mit detektierbaren Substituenten versehenen niedermolekularen Substanzen, der Peptid- oder Proteinliganden oder insbesondere aus den noch Antigen-bindenden Teilen von monoklonalen Antikörpern ausgewählt sein. Es kann durch physikalische, chemische oder biochemische Verfahren nachgewiesen werden, weil es Fluoreszenz, Radioaktivität oder enzymatische Eigenschaften aufweist, die für Farbstoffreaktionen eingesetzt werden können. Wenn das Markermolekül mit einem auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptor reagiert, ist dieser und damit auch die Zelle spezifisch markiert und nachweisbar. Die nicht gebundenen Markermoleküle müssen durch Waschung der Zellen oder Membranen entfernt werden.
  • Die so markierten Membranen oder Zellen können dann mit Testsubstanzen in Kontakt gebracht und unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden. Anschließend kann durch die Bestimmung der noch gebundenen Markersubstanz auf den Membranen oder Zellen oder auch nach Abtrennung der Zellen oder Membranen von den Rückständen der Effekt auf die Entfernung des Rezeptors nachgewiesen werden. Enthalten die Membranen oder Zellen noch die Markermoleküle, hat keine Entfernung des Rezeptors stattgefunden. Ist jedoch das Markermolekül nicht mehr auf den Membranen nachweisbar, dann hat die Testsubstanz die Abtrennung des Rezeptors bewirkt.
  • Es ist auch möglich, die Rückstände nach Abtrennung der Membranen zu untersuchen: enthalten sie noch Markermoleküle, dann war die Testsubstanz bei der Entfernung der Rezeptoren wirksam. Enthalten die Rückstände jedoch keine Markermoleküle, dann hatte die Testsubstanz nicht die Entfernung der Rezeptoren bewirkt.
  • Im Fall eines aktiven Markermoleküls würden mutatis mutandis entsprechend Testsubstanzen identifiziert, die die Ablösung des Rezeptors verhindern.
  • Unter den für die Entfernung von Rezeptoren von einer Zellmembran geeigneten Verbindungen wurde die Entfernung von Kollagenrezeptoren von der Blutplättchenmembran ganz besonders sorgfältig untersucht.
  • Es ist jedoch auch möglich, Verbindungen aufzufinden, die die Entfernung der auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren verhindern. Das ist durch ein Verfahren möglich, bei dem man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes neutrales Markermolekül auf die Zellmembran einwirken lässt, dann eine zur Entfernung von Rezeptoren von einer Zellmembran an sich geeignete Verbindung auf die Zellmembran zusammen mit oder nach der zu testenden Verbindung einwirken lässt und nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet. In der Regel werden hierbei Markermoleküle eingesetzt, die die Entfernung des Rezeptors nicht schon von sich aus verhindern und wie diese oben als „neutral" bezeichnet sind.
  • Eine derartige Verbindung kann ein Enzym, ein Antikörper, ein anderes Protein oder Peptid, ein Polysaccharid, Lipid oder auch eine niedermolekulare Verbindung sein. Der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor kann beispielsweise ein Kol lagenrezeptor sein. In diesem Fall ist das Markermolekül vorzugsweise ein Antikörper gegen den Kollagenrezeptor.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Auffinden einer Verbindung, die die auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren entfernen kann, bei dem man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes neutrales Markermolekül auf die Zellmembran einwirken lässt, dann die zu testende Verbindung hinzufügt und nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet. Gegebenenfalls kann dann durch nochmaligen Zusatz des Markermoleküls geprüft werden, ob die Rezeptoren wirklich vollständig entfernt worden sind.
  • Bevorzugt ist ein derartiges Verfahren, bei dem ein Markermolekül eingesetzt wird, das die Entfernung der auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren selbst nicht induziert.
  • Vorzugsweise wird das Verfahren zur Entfernung des Kollagenrezeptors GPVI in Anwesenheit eines Antikörpers gegen diesen Kollagenrezeptor durchgeführt. Als Antikörper ist der markierte, monoklonale Antikörper JAQ1 im F(ab')2-Format besonders geeignet.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zum Auffinden einer Verbindung eingesetzt werden, die die Entfernung der auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren verhindern kann. Dabei lässt man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes neutrales Markermolekül auf die Zellmembran einwirken, gibt dann eine bekanntermaßen zur Entfernung von Rezeptoren von der Zellmembran an sich geeignete Verbindung zusammen mit oder nach einer geeigneten Zeitspanne zu der zu testenden Verbindung hinzu und prüft nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet. Vorzugsweise wird hierfür ein Markermolekül eingesetzt, das die Entfernung der auf der Zellmembran vorhandenen Rezeptoren nicht schon selbst verhindert.
  • Vorzugsweise wird dieses Verfahren zum Nachweis der verhinderten Entfernung der auf einer Zellmembran vorhandenen Kollagenrezeptoren insbesondere des Kollagenrezeptors GPVI in Anwesenheit eines Antikörper gegen diesen Kollagenrezeptor durchgeführt. Besonders bevorzugt ist der Einsatz des markierten monoklonalen Antikörpers JAQ1.
  • Der Nachweis für die Entfernung eines Rezeptors unter in vitro-Bedingungen, hier die des Kollagenrezeptors GPVI von Blutplättchen, ist in Beispiel 1 beschrieben worden. Ein Verfahren zum Auffinden solcher Verbindungen, die die Kollagenrezeptor-Entfernung von Blutplättchen induzieren, ist im Beispiel 2 beschrieben. Hier wurde der monoklonale Antikörper JAQ1 proteolytisch in sein F(ab')2-Fragment überführt und damit die Induktion der Rezeptorentfernung, nicht aber die Rezeptorbindung unterbunden. Dieses Fragment in Fluoreszenz-markierter Form eignet sich ideal für die Markierung des GPVI-Moleküls und für die anschließende Suche nach Rezeptor entfernenden Substanzen. Durch derartige Verfahren wird der zeitliche, finanzielle und experimentelle Aufwand zum Auffinden solcher Moleküle erheblich reduziert und Tierexperimente sind überhaupt nicht mehr erforderlich.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann besonders vorteilhaft mit gegen die Rezeptoren gerichteten Antikörpern durchgeführt werden, eignet sich aber auch für niedermolekulare Substanzen, welche die Entfernung oder Verhinderung von Rezeptoren von Membranen bewirken. Niedermolekulare Substanzen haben u. a. den Vorteil, dass sie in vereinfachten Darreichungsformen, zum Beispiel für die orale Applikation, hergestellt werden können. Damit wird auch die Therapieeinhaltung seitens der Patienten (compliance) sehr stark erhöht, die Eigenmedikation ermöglicht, der Preis für die Therapie erniedrigt und sogar eine Dauertherapie, zum Beispiel zur Prophylaxe gegenüber Wiederholungsfällen der Thrombose, organisatorisch und finanziell erschwinglich.
  • Die Entfernung der Kollagenrezeptoren von humanen Blutplättchen ist hier nur als ein Beispiel für die Anwendung des allgemein anwendbaren erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben worden. Das vorstehend genannte Verfahren der Markierung der Rezeptoren und des anschließenden Nachweises ihrer Entfernung von der Membran nach Inkubation mit der Testsubstanz kann deshalb auf alle Nachweisreaktionen angewendet werden, bei denen Rezeptoren von der Zellmembran entfernt werden sollen. Somit können Aktivatoren und Inhibitoren von Proteinrezeptor-, Lipidrezeptor- oder Kohlenhydratrezeptor-entfernenden Vorgängen aufgefunden werden. Diese Substanzen können dann zur Therapie der mit den Rezeptoren und mit den Molekülen, die deren Entfernung vermitteln, in Verbindung stehenden physiologischen Zuständen oder Krankheiten verwendet werden. Außerdem können durch das erfindungsgemäße Verfahren bisher unbekannte Moleküle, welche die Entfernung von Molekülen von Membranen bewirken, identifiziert und somit einer Manipulation, also entweder dem spezifischen Nachweis oder der Aktivitätsmodulation zum Zwecke einer therapeutischen Anwendung, zugänglich gemacht werden.
    •
  • Als Beispiel für die Durchführbarkeit eines solchen Verfahrens in vitro ist im folgenden der Nachweis der Entfernung des Kollagenrezeptors GPVI von der menschlichen Blutplättchenoberfläche durch den monoklonalen Antikörper JAQ1 beschrieben und durch die 1–3 verdeutlicht.
  • Dabei zeigen sie den Nachweis der Kollagenrezeptorentfernung GPVI von Blutplättchen in vitro. In diesem Ansatz ist das Markermolekül gleichzeitig das Molekül, das die Entfernung des Rezeptors bewirkt. Humane Blutplättchen (1×107) wurden mit Fluoreszenz-markiertem, monoklonalem Antikörper JAQ1 (2μg/ml) inkubiert und anschließend ihre Fluoreszenz im Zytofluorometer analysiert.
  • In 1 wurden die Blutplättchen 10 min mit dem Antikörper inkubiert.
  • In 2 wurden die Blutplättchen 60 min mit dem Antikörper inkubiert.
  • In 3 wurden die Blutplättchen zuerst 60 min mit dem Antikörper inkubiert, dann gewaschen und anschließend noch einmal 10 min mit dem Antikörper inkubiert.
  • Counts: Anzahl der im Zytofluorometer gemessenen Ereignisse (Blutplättchen); FL1 Height: Intensität der Fluoreszenz der gemessenen Blutplättchen.
  • Beispiel 1: Nachweis der Kollagenrezeptorentfernung von humanen Blutplättchen
  • Menschliche Blutplättchen werden isoliert und konzentriert nach Standardverfahren und viermal in Hepes-Tyrode Puffer gewaschen. Anschließend werden die Blutplättchen im Cell-Analyzer-System der Firma Schärfe gezählt und auf eine Zellkonzentration von 1 × 108/ml eingestellt und 100 μl in jedes Probenröhrchen pipettiert, nachdem die jeweilige Probe vorgelegt wurde. Mit dem monoklonalen Antikörper JAQ1 (Subtype) IgG2a, welcher mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszinisothiocyanat) markiert ist, einmal 10 Minuten (1) und einmal 60 Minuten (2) bei Raumtemperatur und einer Endkonzentration des Antikörpers (2 μg/ml in Zellkulturmedium DMEM und 10% fötalem Kälberserum, FKS) inkubiert. Danach wurden die Plättchen einmal gewaschen. In einem dritten Versuchsansatz (3) wurden die Plättchen 60 Minuten mit dem Antikörper inkubiert, anschließend gewaschen und noch einmal mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper in der gleichen Konzentration inkubiert. Auch in diesem Ansatz wurden die Plättchen abschließend gewaschen. Die Bindung des Antikörpers an die Plättchen in allen drei Ansätzen wurde anschließend in einem Zytofluorometer (FACSCalibur, Fa. BD in San Jose, Ca, Anregungswellenlänge 488 nm, emittierte Wellenlänge 535 nm +/– 15 nm) analysiert. In 1 ist eine Fluoreszenz-markierte Plättchenpopulation nach 10-minütiger Inkubation mit dem Antikörper durch die Erhebung (Peak) des Graphen bei einer Fluoreszenzintensität (FL1) von 102 zu erkennen, d.h. die Blutplättchen sind mit Fluoreszenz-markierten JAQ1 Antikörper, der an GPVI gebunden ist, beladen. Nach 60-minütiger Inkubation mit dem Antikörper (2) liegt der Peak der Fluoreszenzintensität bei nur noch 101, d.h., dass die Plättchen nun nicht mehr mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper beladen sind und das GPVI abgespalten ist. 3 zeigt, dass nach 60-minütigen Antikörperinkubation, anschließender Waschung und erneuter, 10-minütigen Inkubation immer noch keine Fluoreszenzmarkierten Plättchen zu erkennen sind, da die Erhebung des Graphen immer noch bei einer Intensität von 101 liegt. Das bedeutet, dass auf den Plättchen tatsächlich das Zielmolekül nicht mehr vorhanden ist, denn weder der Antikörper aus der 60-minütigen, noch der Antikörper aus der darauf folgenden 10-minütigen Inkubation konnte an den Plättchen binden. Daraus kann nun gefolgert werden, dass das GPVI, das nach 10-minütiger Antikörperbehandlung noch präsent war, im Laufe der 60-minütigen Inkubation von den Plättchen entfernt worden ist und dementsprechend auch der markierte, gebundene Antikörper mit entfernt wurde.
  • Beispiel 2: Nachweisverfahren für Substanzen die die Kollagenrezeptorenentfernung vermitteln
  • Humane Plättchen werden mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper (20 μg/ml in Zellkulturmedium DMEM und 10% fötalen Kälberserum, FKS) gegen den Kollagenrezeptor GPVI, welcher keine Abspaltung des Rezeptors induziert (JAQ1 im F(ab')2-Format), 10 Minuten inkubiert und mit der zu testenden Substanz 60 Minuten bei RT inkubiert. Optional kann nach der Antikörperbehandlung eine Waschung der Plättchen durchgeführt werden. Nach Abschluss der 60 minütigen Inkubation mit der Testsubstanz werden die Plättchen auf Fluoreszenz-Markierung getestet. Findet man keine Fluoreszenz-markierten Plättchen mehr, ist der Kollagenrezeptor abgespalten worden und die Substanz somit positiv getestet worden. Sind die Plättchen aber noch Fluoreszenz-markiert durch den Antikörper, dann hat die Testsubstanz nicht die Abspaltung des Rezeptors bewirkt.
  • Beispiel 3: Nachweisverfahren für Substanzen welche die Rezeptorentfernung hemmen
  • Humane Plättchen werden mit Fluoreszenz-markierten JAQ1 IgG (2 μg/ml in Zellkulturmedium DMEM und 10% fötalem Kälberserum, FKS) 60 Minuten bei RT inkubiert. Die zu testende Substanz wird entweder gleichzeitig mit dem Antikörper oder nach einer 10-minütigen Fluoreszenzantikörper-Inkubation und anschließender Waschung der Plättchen getrennt zu den JAQ1-gebundenen Plättchen gegeben und 60 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend werden die Plättchen gewaschen und auf Fluoreszenz analysiert. Tragen die humanen Plättchen immer noch den Fluoreszenz-markierten JAQ1, hat die Substanz die Entfernung des Kollagenrezeptors verhindert. Tragen die humanen Plättchen keinen Fluoreszenz-markierten Antikörper mehr, hat die Entfernung des Rezeptors stattgefunden und die Testsubstanz war nicht zur Hemmung der Entfernung geeignet.
  • Literaturverzeichnis:
    • 1. Gibbins JM, Okuma M, Farndale R, Barnes M, Watson SP. Glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptor gamma-chain. FEBS Lett. 1997 Aug 18; 413(2):255-9.
    • 2. Nieswandt B, Watson SP. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? Blood. 2003 July 15; 102(2):499-61.
    • 3. European Patent application: EP 1 228 768 A1 .
    • 4. Nieswandt B, Schulte V, Bergmeier W, Mokhtari-Nejad R, Rackebrandt K, Cazenave JP, Ohlmann P, Gachet C, Zimgibl H. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J Exp Med. 2001 Feb 19; 193(4):459-69.
    • 5. Schulte V, Rabie T, Prostredna M, Aktas B, Grunner S, Nieswandt B. Targeting of the collagen-binding site on glycoprotein VI is not essential for in vivo depletion of the receptor. Blood 2003 May 15; 101(10:3948-52.

Claims (12)

  1. Verbindung, die die Entfernung von auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren induzieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Verfahren aufgefunden wird, bei dem man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes neutrales Markermolekül auf die Zellmembran einwirken lässt, dann die zu testende Verbindung hinzufügt und nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet.
  2. Verbindung nach den Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine körpereigene Substanz, ein Enzym, ein Antikörper, ein anderes Protein oder Peptid, ein Polysaccharid, Lipid oder eine niedermolekulare Verbindung ist.
  3. Verbindung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor ein Kollagenrezeptor ist.
  4. Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor ein Kollagenrezeptor ist und das Markermolekül ein Antikörper gegen den Kollagenrezeptor ist.
  5. Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor ein Kollagenrezeptor und das Markermolekül das markierte Antikörperfragment JAQ1 F(ab)2 ist.
  6. Verbindung, die die Entfernung der auf einer Zellmembran vorhandenen Rezeptoren verhindern kann, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Verfahren aufgefunden wird, bei dem man zunächst ein an die Rezeptoren bindendes neutrales Markermolekül auf die Zellmembran einwirken lässt, dann eine zur Entfernung von Rezeptoren von der Zellmembran an sich geeignete Verbindung auf die Zellmembran zusammen mit oder nach der zu testenden Verbindung einwirken lässt und nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet oder die durch Anwendung eines Verfahrens nach Anspruch 10 aufgefunden wird.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Enzym, ein Antikörper, ein anderes Protein oder Peptid, Polysaccharid, Lipid oder eine niedermolekulare Substanz ist.
  8. Verbindung nach Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor ein Kollagenrezeptor ist.
  9. Verbindung nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der Zellmembran vorhandene Rezeptor ein Kollagenrezeptor ist und das Markermolekül ein Antikörper gegen den Kollagenrezeptor ist.
  10. Verfahren zum Auffinden einer Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein an die Rezeptoren bindendes Markermolekül das zur Entfernung der Rezeptoren führt, gleichzeitig mit oder nach Hinzufügen einer zu testenden Verbindung auf die Zellmembran einwirken lässt, und nach einer ausreichenden Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen prüft, ob das Markermolekül noch auf der Zellmembran haftet, sowie gegebenenfalls dann durch nochmaligen Zusatz des Markermoleküls prüft, ob die Rezeptoren vollständig entfernt worden sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man es zum Nachweis der Entfernung des Kollagenrezeptors GPVI in Anwesenheit eines Antikörpers gegen den Kollagenrezeptor GPVI durchführt.
  12. Verfahren nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass man es zum Nachweis der Entfernung des Kollagenrezeptors GPVI in Anwesenheit des markierten, monoklonalen Antikörpers JAQ1 durchführt.
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AU7097400A (en) * 1999-09-01 2001-03-26 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Platelet membrane glycoprotein vi (gpvi) dna and protein sequences, and uses thereof
EP1224942A1 (de) * 2001-01-23 2002-07-24 Bernhard Dr. Nieswandt Use of JAQ1 (monoclonal antibody anti GPVI) as a medicament for the protection against thrombotic diseases

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