DE10195824T5

DE10195824T5 - Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der Reaktion der Lymphozyten im Blut auf spezifisches Antigen

Info

Publication number: DE10195824T5
Application number: DE10195824T
Authority: DE
Inventors: Jun Hu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2004-07-08
Also published as: WO2001065256A1; JP2003525452A; GB2375395A; CN1311437A; CN1140801C; US20030108968A1; AU2999801A; GB0220171D0

Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der Lymphozyten im Blut auf ein spezifisches Antigen, umfassend folgende Schritte:
das T-Lymphozyt im peripheren Blut des Empfängers ist mit einem flüssigen Kulturmedium zur Zellensuspensionsfüssigkeit präpariert;
eine Zellenprobierplatte mit dem das bekannte HLA-Antigen enthaltenden Standard-Zellenklon ist aufbereitet, und die Zellensuspensionsflüssigkeit ist nach dem Verhältnis von gezielten Zellen/Effektzellen von 1:0:5–10 in die einzelnen Kavitäten auf der Zellenprobierplatte zugefügt;
die Zellen sind für 2 bis 28 Stunden inkubiert;
zum Schluß ist der Unterschied zwischen der Reaktionsfähigkeit der Lymphozyten des Empfängers in den Kavitäten mit dem das Antigen des Spenders enthaltenden Zellenklon und der Reaktionsfähigkeit des Lymphozyten in den Vergleichskavitäten bestimmt, so daß festgestellt ist, ob das Lymphozyten des Empfängers sensibilisiert worden sind.

Description

Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der Lymphozyten im Blut auf spezifisches Antigen, den Grad der Ablehnungsreaktion des Empfängers auf das Organ des Spenders nach der Transplantation festzustellen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind mittels eines Standard-Zellenklons die Funktionalität der Störungs- und Vermehrungsreaktion der T-Lymphozyten im peripheren Blut des Empfängers in vitro ermittelt, um den Zustand der Ablehnungsreaktion des Empfängers auf das transplantierte Organ festzustellen, so daß entsprechende Referenzdaten für klinische Behandlung gewonnen sind.
Stand der Technik
Der Faktor, der zur Ablehnungsreaktion führt, liegt im Unterschied zwischen den Antigenen des Spenders und des Empfängers. Das Antigen, das bei der allogenischen Transplantation zur Ablehnungsreaktion führt, ist bestimmt und begrenzt. Der Hauptfaktor, der zur Ablehnungsreaktion führt, liegt im Unterschied des HLA-Antigens (das humane Lymphozyten-Antigen, nämlich Albumin-Antigen). Bis 1991 ist es festgestellt, daß die Gesamtzahl der humanen Serumantigene 161 beträgt, von denen die Zahl von I-Typs-Antigene 122 zählt und die Zahl von II-Typs-Antigene 39 zählt. Die II-Typs-Antigene führen im wesentlichen zur gemischten Lymphozytenreaktion, während die I-Typs-Antigene im wesentlichen zur Störungsaktivität führen (Transplantation Immunology, Seite 250, by Chen Shi, Hubei-Science and Technology Press, China, October, 1998). Diese HLA-Antigene können durch Screening aus der Menschheit oder durch Gentechnology gewonnen werden, um entsprechendes Standard-Zellenklon, nämlich Standard-Zellenklon mit bekanntem Genhintergrund und mit stabilem Darstellung eines oder einiger HLA-Antigen(e) zu entwickeln. Dadurch sind die Vorteile erreicht, daß die Zelle von jedem Standard-Zellenklon nur ein oder einige Antigene) von den HLA-Antigenen darstellt. Wie zum Beispiel stellt die Zellemembranoberfläche eines Standard-Zellenklons nur HLA-A23 dar, während das andere Standard-Zellenklon nur DR 9 darstellt (bei den B-Zellen der normalen Menschen können mehr als zehn Antigene dargestellt werden). Dadurch kann eine Anzahl der Standard-Zellenklonsysteme errichtet werden, die jeweils ein oder einige HLA-Antigene) darstellen. Jetzt haben zwei. amerikanische Gesellschaften, Lamda und Pel-freeze, schon entsprechende Standard-Zellenklonsysteme entwickelt, die einige bestimmte HLA-Antigene darstellen und auf den Markt gebracht. Solche Systeme sind als PRA-Probierplatte bezeichnet. Die PRA-Probierplatte findet als Träger der Antigene im wesentlichen bei der Bestimmung der Funktionalität und der Spezifität des Antikörpers von HLA-Antigen des Empfängers vor der Transplantation ihre Anwendung. Dadurch kann die Möglichkeit der superakute Ablehnungsreaktion im voraus bestimmt und entsprechende Referenzdaten für die Auswahl des geeigneten Spenders gewonnen werden. Aber bis jetzt ist es noch nicht erreicht, das Standard-Zellenklon zur Darstellung eines einzigen HLA-Antigens zu entwickeln.
Seit einigen zehn Jahren ist die gemischte Lymphozytenreaktion bekannt und im Bereich der Immunologie zur Bestimmung des Immunozustandes des Körpers gegenüber spezifischen Zellen von einem oder einigen Antigene) verwendet. In der früheren Phase war dieses Verfahren im Bereich der Transplantation oft bei der Bestimmung der Anpassung der HLA-Antigene des Empfängers und des Spenders vor der Transplantation angewandt, um die Überlebensfähigkeit des transplantierten Organs und die Möglichkeit der Ablehnungsreaktion im voraus zu ermitteln. Aber dieses Verfahren ist schwierig zu bedienen, seine Stabilität und Reproduzierbarkeit ist unbefriedigend, und es ist zeitaufwändig. (Es dauert normalerweise 5 bis 7 Tage, bis das Ergebnis gewonnen ist.). Daher ist es unmöglich, dieses Verfahren anzuwenden, wenn der Spender eine Leiche ist. Nachdem andere bessere HLA-Typing Techniken entwickelt worden sind, findet solches Verfahren nicht mehr Anwendung (Cellular & Molecular Immunology, ed. by Boquan Jin, Wold Books Publishing Co., August, 1995, Seite 230).
Um die Mängel der gemischten Lymphozytenreaktion bei der Typing-Bearbeitung aufzuheben, ist ein Verfahren für das vorbehandelte Lymphozyten-Typing-Test (Cellular & Molecular Immunology, Seite 230) vorgeschlagen. Dieses Verfahren umfaßt im wesentlichen folgende Schritte:
die, bekannten Zellen, die ein bestimmtes oder einige bestimmte HLA-Antigen(e) enthalten, sind als stimulierende Zellen ausgewählt;
die T-Lymphozyten, die kein genanntes Antigen enthalten, sind als Reaktionszellen extrahiert;
dann sind die stimulierenden Zellen mit den Reaktionszellen zur gemischten Lymphozytenreaktion gemischt;
die Zellen sind für 9 bis 14 Tage inkubiert;
die Vermehrung der Reaktionszellen ist nach und nach aufgehört;
zum Schluß sind diese Reaktionszellen zu den Memoriezellen verwandelt, die durch ein bestimmtes oder einige bestimmte HLA-Antigene) sensibilisiert sind und als vorbehandelte (vorsensibilisierte) Zellen bezeichnet sind;
die Zellen sind in flüssigem Nitrogen zur Verfügung aufbewahrt.
Bei Anpassung-Typing sind diese Zellen als Reaktionszellen aktiviert, während die Lymphozyten des Probandes als stimulierende Zellen verwendet sind. Wenn diese stimulierenden Zellen die gleichen HLA-Antigene wie bei den stimulierenden Zellen bei der Vorsensibilisierung, tritt eine rasche Memoriereaktion bei den vorbehandelten Reaktionszellen auf, innerhalb von 20 bis 30 Stunden wird eine rasche Vermehrungsreaktion durchgeführt. Dadurch kann festgestellt werden, ob die Lymphozyten des Probandes diese Antigene enthalten.
Seit einigen zehn Jahren ist das Zytostoxizität-T-Lymphozytenstörungstest (CTL) bekannt. Dieses Verfahren ist oft in Immunologie zur Bestimmung des Sensibilisierungszustandes des Körpers gegenüber einem oder einigen auf der Zellenoberfläche vorhandenen Antigen(en) verwendet (Immunology and Immunoassay, ed. by Yixun Tao, the People's Health Publishing House, China, Oct., 1989, Seite 250). In den letzten Jahren ist das Störungszellenaktivitätstest auch zur Kontrolle der Ablehnungsreaktion nach der Transplantation verwendet. Da der spezifische Unterschied vorliegt, ist dieses Test nur zur Bestimmung mit den Zellen des Spenders als gezielte Zellen in sogennater "eins zu eins" Weise beschränkt. Daher ist dieses Verfahren nur zur Bestimmung bei der Transplantation des Organs aus dem lebendigen Spenders anwendbar, da nur der lenbendige Spender in der Lage ist, die gezielten Zellen zur Bestimmung zu versorgen. Wenn es keine Versorgung der gezielten Zellen gibt, ist dieses Verfahren nicht anwendbar.
Zur Zeit ist die Zahl der Patienten in der Welt, die die Organtransplantationsoperation annehmen, jährlich um 40,000 zugenommen. Nach der Organtransplantation muß der Empfänger für lange Zeit das Immunounterdückungspräparat einnehmen. Die zu große Dosierung der Einnahme führt nicht nur zur erheblichen Kostenaufwand, sondern auch zur infektiven Erkrankung oder zum maligen Tumor, während die zu kleine Dosierung der Einnahme dazu führen wird, daß das transplantierte Organ abgelehnt ist und seine Funktion verliert. Seit langem ist es für die Kliniker sehr schwierig, für jeden spezifischen Patienten die geeignete Dosierung zu bestimmen. Normalerweise ist die Biopsie verwendet, um entsprechende Referenzdaten für die Dosierung als " goldenes Index" zu gewinnen. Da die Biopsie den Patienten hohe Kosten und Schmerzen mitbringt, ist sie bei den meisten Patienten nicht annehmbar. Zusätzlich ist die Biopsie selbst mit Risiko verbunden. Daher ist es unzulässig, oft solche Biopsie durchzuführen (Transplantation Immunology, Seite 200). Daher sterben die Patienten manchmal nach der Transplantation wegen der Ablehnungsreaktion und der Verlust der Funktionsfähigkeit des transplantierten Organs plötzlich ohne Wahrnehmung des Arztes.
Inhalt der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der T-Lymphozyten im Blut auf spezifisches Antigen nach der Transplantation des fremden Organs anzugeben, wobei man unter dem spezifischen Antigen das Antigen des Spenders, das zur Ablehnungsreaktion des Empfängers führt, und unter der Reaktionsfähigkeit den Zustand der Reaktion der Lymphozyten des Empfängers auf spezifisches Antigen versteht.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der T-Lymphozyten im Blut auf spezifisches Antigen nach der Transplantation des fremden Organs vorgeschlagen, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Lymphozyten im peripheren Blut des Empfängers mit flüssigem Kulturmedium zur Zellensuspensionsfüssigkeit präpariert ist; eine Zellenprobierplatte mit dem das bekannte HLA-Antigen enthaltenden Standard-Zellenklon aufbereitet ist, und die Zellensuspensionsflüssigkeit im Vehältnis von gezielten Zellen/Effektzellen von 1:0.5–10 in die einzelnen Kavitäten auf der Zellenprobierplatte zugefügt ist; die Zellen für 2 bis 28 Stunden inkubiert sind; zum Schluß die Differenz zwischen der Reaktionsfähigkeit des Lymphozyten des Empfängers in den Kavitäten mit dem das Antigen des Spenders enthaltenden Zellenklon und der Reaktionsfähigkeit des Lymphozyten in den Vergleichskavitäten bestimmt ist, so daß festgestellt ist, ob die Lymphozyten des Empfängers sensibilisiert sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die T-Lymphozyten in peripherem Blut des Empfängers bestimmt, so daß ein dynamisches Kontrollmittel zur Erfassung der Immunität des Empfängers gegenüber dem Organ des Spenders geschaffen ist, um entsprechende Referenzdaten für die Dosierung der Einnahme des Immunounterdrückungspräparates zu gewinnen, und es dadurch vorher erkennbar ist, daß das Symptom der Ablehnungsreaktion auftreten wird, Die Vorteile dieses Verfahrens liegen darin, eine schmerzenfreie, kurzzeitige, kostengünstige, höher spezifische und zuverlässige Bestimmung zu ermöglichen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung ist das Standard-Zellklon mit bekanntem HLA-Antigenen mit T-Lymphozyten des Empfängers in peripherem Blut in vitro gemischt und die Ablehnungsreaktion durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers auftreten wird. Bei dem Verfahren sind die T-Lymphozyten im peripheren Blut des Empfängers mit einem flüssigen Zellenkulturmedium zu einer Zellensuspensionsflüssigkeit präpariert. Anschließend ist die Zellenprobierplatten genommen, die mit dem das bekannte HLA- Antigen enthaltenden Standard-Zellenklon aufbereitet ist. Dann wird die Zellensuspensionsflüssikeit im Verhältnis von gezielten Zellen/Effektzellen 1:0.5–10 in jede Kavität auf der Zellenprobierplatte zugefügt, und die Zellenprobierplatte ist für 2 bis 28 Stunden inkubiert. Und zum Schluß wird die Reaktionsfähigkeit der Lymphozyten mit der Immunologiemeßverfahren bestimmt.
Bei der Bestimmung kann man mit Hilfe von einem Mikroskop beobachten, ob die Transformation der Lymphozyten in den einzelnen Kavitäten auftritt, und inzwischen wird die Transformationsrate durch Zählen ermittelt, um festzustellen, ob eine Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers auftritt. Das genannte flüssige Kulturmedium kann als das serumfreie flüssige Kulturmedium mit markiertem Thymin ausgebildet sein. Während der Zelleninkubierung, die 6 bis 28 Stunden dauert, beteiligt sich markiertes Thymin an die Synthese mit DNA in Zellen, so daß der Zellkern bei der Übewachung mittels Mikroskopes oder Fluoreszenz-Mikroskopes augenfällige Merkmale zeigt.
Wie oben beschrieben ist die Reaktionsfähigkeit der Lymphozyten bei der Überwachung der Konformation ermittelt, wobei bei der gemischten Lymphocytenreaktion das Standard-Zellklon mit Antigenen von verschiedenem Typ HLA-I und II als stimulierende Zelle und die Lymphozyten des Empfängers als zu sensibilisierende Zelle wirkt, und die Transformations- und Vermehrungsreaktion der Zelle beim nochmaligen Treffen mit Antigen des Spenders in vitro sofort auftritt, nämlich die Reaktionszelle zu Lymphoblast transformiert ist, sich die transformierte Zelle vergrößert, das Zellplasma zugenommen ist, Vakuole auftritt, Nukleolus augenfällig wird, und das Chromasom locker wird und dadurch ihre Konformation leicht erkennbar ist, nur wenn die Reaktionszelle im Körper des Empfängers wirklich sensibilisiert worden ist, Wenn das Thymine mit Label in das flüssige Kulturmedium zugefügt ist, so ist es noch leichter, den Zellkern in Konformation zu erkennen. Da die Kavitäten auf der Zellenprobierplatte ein bestimmtes oder einige bestimmte HLA-Antigene) enthalten, so kann das Typ von Antigen des Spenders, das die entsprechende Ablehnungsreaktion verursacht, nach der Position der Kavität, wo die Zelle transformiert (oder vermehrt) ist, erkannt werden. Nach dem Zählen der transformierten Zellen in einzelnen Kavitäten wird die entsprechende Transformationsrate ermittelt. Der Wert, der durch die Substraktion der mittleren Transformationsrate in den einelnen Kavitäten ohne Antigen des Spenders von der mittleren Transformationsrate der einzelnen Kavitäten mit Antigen des Spenders erhalten ist, stellt den Zustand der Ablehnungsreaktion im Körper dar. Obwohl dieses Verfahren der Überwachung der Konformation einfach und kostengünstig und das Bestimmunsergebnis in kurzer Zeit erhalten ist, ist es manchmal von den künstlichen Faktoren beeinflußt. Außerdem ist das Zählen der Zellen sehr arbeitsaufwändig. Um den künstlichen Einfluß zu vermeiden und den Arbeitsaufwand zu reduzieren, kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Geräten ausgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann auch in folgender Weise ausgeführt werden: Wie oben beschrieben, sind die Zellen für 2–6 Stunden inkubiert, dann ist eine gleiche Menge der superficiellen Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten extrahiert und jeweils in die entsprechenden Kulturkavitäten auf einer anderen leeren Probierplatte überführt, die enzymische Reaktion ist zur Bestimmung der Dehydrogenase durchgeführt, nachdem die Reaktion beendet worden ist, ist eine Wellenlänge, die in MTT-Lösung in maximaler Weise absorbierbar ist, im Bereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt, in separater Weide ist der Wert der Absorbtion des Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge in einzelnen Kavitäten erfaßt, nach diesen Absorptionswerten ist der Grad der Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers festgestellt werden. Die Dehydrogenase ist eines der in der Zelle enthaltenen Enzyme, und ist in normaler Weise nicht durch das Zellmembran durchführbar. Wenn die die Antigene des Spenders enthaltenden gezielten Zellen (Standard-Zellklon) durch die sensibilisierten Effektzellen (T-Lymphozyten) angegriffen und gestört sind, verändert sich die Durchdringbarkeit des Memobrans und wird die Dehydrohgenase befreit und tritt in das Medium ein. Durch die enzymatische Reaktion ist die Konformation der Dehydrogenase in den einzelnen Kavitäten ermittelt. Und nach dem Gehalt ist die Menge der gestörten Zellen ermittelt. Bei diesem Verfahren sollen zwei Vergleichsgruppen, eine für die natürliche Befreiung, und die andere für die maximale Befreiung, eingerichtet werden, wobei 4 bis 10 Kavitäten ohne Antigene des Spenders als Vergleichskavitäten ausgewählt werden können. Da der Empfänger vor und nach Transplantationsoperation mehrmalige Tests und Messung erlebt haben, kann im wesentlichen der Bereich von Typs der HLA-Antigene des Spenders, die die Ablehnungsreaktion induzieren, auf Grund der Daten der durchgeführten Messungen und Tests bestimmt werden. Dadurch wird festgestellt, welche Kavitäten die Antigene des Spenders enthalten, und welche Kavitäten die Antigene des Spenders nicht enthalten. Die Differenz zwischen dem Mittelwert der Absorption der Antigene des Spenders enthaltenden Kavitäten und dem Mittelwert der Absorption der Vergleichsgruppe für die natürliche Befreiung ist durch die Differenz zwischen dem Mittelwert der Absorption der Vergleichsgruppe für maximale Befreiung und dem Mittelwert für natürliche Befreiung dividiert, und der gewonnene Quotient widerspiegelt den Grad der Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers. Je größer der Quotient, desto mehr Zellen sind gestört, und desto stärker ist die Ablehnungsreaktion.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in folgender Weise ausgeführt werden. Wie oben beschrieben sind die oben genannten Zellen für 6 bis 16 Stunden inkubiert. Und in die einzelnen Kavitäten auf der Zellenprobierplatte ist jeweils eine gleiche Menge von Tetrazolliumsalz (MTT)-Lösung zugefügt und die Zellen sind weiter für 2 bis 6 Stunden inkubiert. Durch die Bestimmung der MTT-Restmenge in der superficiellen Flüssigkeit oder durch die Bestimmung der MTT-Transformationsrate ist der Zustand der Reaktionszellen festgestellt.

1) Eine gleiche Menge der superficiellen Flüssigkeit ist aus den einzelnen Kavitäten extrahiert, im Wellenlängenbereich von 480 nm bis 630 nm ist eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert für MTT-Lösung ausgewählt, mittels des Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge ist der Absorptionswert der Flüssigkeit jeweils in jeder Kavität abgelesen. Da dieses Verfahren zur Bestimmung der Restmenge von MTT im flüssigen Kulturmedium verwendet ist, tritt keine Vermehrungsreakfiion in den Kavitäten mit großem Absorptionswert auf und solche Kavitäten als Vergleichskavitäten angesehen werden. Und die Kavitäten mit kleinem Absorptionswert als die Kavitäten mit Antigenen des Spenders angesehen werden, die im Körper des Empfängers schon zur Ablehnungsreaktion geführt hat. Je größer die Differenz zwischen dem Mittelabsorptionswert der Vergleichskavitäten und dem Mittelabsorptionswert der Kavitäten mit Antigenen des Spenders ist, desto stärker die Vermehrung der Lymphozyten des Empfängers ist.
2) Die superficielle Flüssigkeit ist entfernt und eine gleiche Menge von Dimethylsulfoxyd (DMSO) ist jeweils in die einzelnen Kavitäten zugefügt, so daß das Formazan aus den Reaktionszellen kristallisiert ist, eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert ist in dem Wellenlängenbereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt, und der Lichtabsorptionswert der superficellen Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten ist mittels des Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen. Da dieses Verfahren zur Bestimmung der Menge des Formazans, das aus MTT in umgesetzten Zellen transformiert ist, tritt keine Vermehrungsreaktion in den Kavitäten mit niedrigem Absorptionswert auf und diese Kavitäten als native Vergleichskavitäten angesehen werden, während die Kavitäten mit hohem Absorptionswert Antigene als Antigene des Spenders enthalten und diese Antigene im Körper des Empfängers schon zur Ablehnungsreaktion geführt haben. Je größer die Differenz zwischen dem Mittelabsorptionswert in den Kavitäten mit Antigenen des Spenders und dem Mittelabsorptionswert der Vergleichskavitäten ist, desto stärker die Vermehrung der Lymphozyten des Empfängers ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in folgender Weise ausgeführt werden, daß das Standard-Zellenklon auf der Zellenprobierplatte bei der Aufbereitung mit MTT behandelt ist, so daß jede Zelle eine gleiche Menge von dem Formazankristall enthält, das durch Reduktion von MTT gebildet ist. Die Zellen auf der Zellenprobierplatte sind nach dem oben beschrieben Verfahren der gemischten Lymphozytenreaktion inkubiert sind, dieser Vorgang ist gleichzeitig auch der Vorgang des Störungstestes mit dem Standard-Zellenklon als gezielte Zelle. Daher kann erfindungsgemäß mit MTT-Verfahren die Verletzungszellenaktivität ermittelt, um festzustellen, ob eine Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers auftritt. Bei der Durchführung des Störungszellen-Testes sind die Kavitäten mit Antigenen des Spenders als Testreaktionskavitäten verwendet, während die Kavitäten ohne Antigene des Spenders als Vergleichskavitäten verwendet sind. Die Bestimmung der Störungszellenaktivität sind mit einer der folgenden drei Methoden durchgeführt:
1) die Zellen werden für 3 bis 8 Stunden inkubiert; dann wird jeweils eine gleiche Menge an einer Oxydantie in jede Kavitaetenät auf der Zellenprobierplatte zugefügt;
und die Zellen werden für 1 bis 4 Stunden weiter inkubiert;
die Oxydantie wird das in den verletzten gezielten Zellen enthaltende Formazankristall zur Bildung von MTT oxidiert;
die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavitaetenät wird nach dem Ende der Inkubierung mittels Saugens genommen;
eine Wellenlänge mit maximalem Absorptionswert wird im Bereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt;
mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge wird der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavitaetenät abgelesen.
Dieses Verfahren ist zur Bestimmung der Menge von Formazan in den verletzten Zellen verwendet. Je größer der Absorptionswert ist, desto mehr Menge an Formazan in der Kavität, desto mehr verletzte Zellen in der Kavität. Das heißt, daß die in dieser Kavität enthaltenen Antigene Antigene des Spenders sind, die schon im Körper des Empfängers zur Ablehnungsreaktion geführt haben. Je größer die Differenz zwischen dem Mittelabsorptionswert der Kavitäten mit Antigenen des Spenders und dem Mittelabsorptionswert der Kavitäten ohne Antigene des Spenders ist, desto stärker die Ablehnungsreaktion ist.
2) die Zellen sind für 4 bis 6 Stunden inkubiert;
die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität ist entfernt;
in jede Kavität ist jeweils eine gleiche Menge der DMSO-Lösung zugefügt, so daß das Formazan aus den ungestörten gezielten Zellen kristallisiert ist;
die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität ist extrahiert;
eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert ist im Bereich von 460 nm bis 630 nm ausgewählt;
der Absorptionswert ist mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen. Je mehr die gezielten Zellen überleben, desto weniger die gezielten Zellen gestört sind, da die vorsensibilisierten Lymphozyten des Empfängers während der Vermehrungsinkubierung einen Einfluß der Störung auf das die Antigene des Spenders enthaltende Standard-Zellenklon (gezielte Zellen) ausübt. Dieses Verfahren ist geeignet, zur Bestimmung der Zahl der überlebenden gezielten Zellen anzuwenden. Je niedriger der Absorptionswert ist, desto weniger gezielte Zellen in der Kavität überleben, desto mehr gezielte Zellen gestört sind. Das heißt auch, daß die in dieser Kavität enthaltenen Antigene Antigene des Spenders sind. Und diese Antigene haben im Körper des Empfängers schon zur Ablehnungsreaktion geführt. Je größer die Differenz zwischen dem Mittelabsorptionswert der Kavitäten ohne Antigene des Spenders und dem Mittelabsorptionswert der Kavitäten mit Antigenen des Spenders ist, desto stärker die Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers ist.
3) die Zellen sind für 4 bis 10 Stunden inkubiert;
in jede Kavität auf der Zellenprobierplatte ist jeweils eine gleiche Menge einer organischen Lösung zugefügt, so daß das Formazankristall in jeder gezielten Zelle gelöst ist;
die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität ist extrahiert;
eine Wellenlänge mit maximalem Absorptionswert ist im Bereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt;
der Absorptionswert in jeder Kavität ist mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen;
nach dem Absorptionswert in jeder Kavität kann festgestellt werden, ob eine Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers auftritt. Der Mechanismus dieses Verfahrens ist im wesentlich wie bei 1). Die genannte organische Lösung ist so ausgewählt ist, daß sie das Formazan und seinesgleichen lösen kann, aber nicht in die Zelleninnere eindringen kann, wie zum Beispiel Methanol, Ethanol, Benzylalkohol, Formaldehyd, Acetaldehyd, Glutaraldehyd oder Demethylbenzol.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit Hilfe der folgenden Zellenprobierplatte (Kulturplatte) ausführbar.
Die erfindungsgemäße Zellenprobierplatte besteht aus einem Basiskörper der Zellenprobierplatte und einer Decke, wobei eine Anzahl der Kuluturkavitäten und Markierung zur Positionierung der einzelnen Kavitäten in regelmäßiger Weise auf dem Basiskörper der Zellenprobierplatte angeordnet ist, die Dichtungen an der Decke entsprechend der Position der einzelnen Kavitäten angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Durchmesser der genannten Kulturkavität 3 bis 6 mm beträgt, ihre Tiefe eine Anzahl 5 bis 15 mm beträgt, ein vorspringender Rand am Außenumfang jeder Kavität angeordnet ist, der Boden der Kavität flach ausgebildet ist, der Boden mit der Umfangswandfläche über eine schräge Übergangsstrecke verbunden ist, und eine zweistufige Klemmeinrichtung an der innenseitigen Wand im unteren Teil der Decke und an den gegenseitigen Wänden des Zellenprobierplattenkörpers angeordnet ist, die Klemmeinrichtung als in Querrichtung erstreckende Vertiefungen und Vorsprünge ausgebildet sind, die beidseitigen Vorsprünge mit den ersten Vertiefungen formschlüssig verbunden sind und der Verschluß der Zellenprobierplatte durch die Dichtung der Decke noch nicht erreicht ist, wenn die Decke auf die Platte gesetzt und nach unten gedrückt ist, und die Vorsprünge mit den zweiten Vertiefungen formschlüssig verbunden sind und der Verschluß der Platte durch die Dichtung erreicht ist, wenn die Decke weiter nach unten gedrückt ist.
Aus der obenen Erläuterung ist erkannt, daß es nie da gewesen ist, daß die Bestimmung der Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers nach der Transplantation mit Hilfe der Standard-Zellenklon-Zellenprobierplatte und im Prinzip der Vorsensibilisierung durchgeführt ist, obwohl die meisten Bestimmungsmittel bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren die konventionellen Methoden sind. Im Gegensatz der konventionellen gemischten Lymphozytenreaktion sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die vorsensibilisierten Lymphozyten des Empfängers verwendet, so daß die Stimulatiosreaktion als Memoriereaktion gebildet ist und die Reaktionszeit dadurch erheblich verkürzt ist. Bei dem konventionellen vorsensibilisierten Lymphozyten-Typing-Test sind die in vitro präparierten vorsensibilisierten Lymphozyten verwendet, um festzustellen, ob die Zellen des Spenders oder des Empfängers bestimmte Antigene enthalten. Im Gegenteil dazu sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Lymphozyten des Empfängers als vorsensibilisierten Reaktionszellen und das Standard-Zellenklon als stimulierende Zellen zur Bestimmung des Immunozustandes des Empfängers verwendet. Dem Anschein nach sind die beiden Verfahren ähnlich, aber alle Mittels, Gegenstände und Ziele sind unterschiedlich. Im Gegensatz des konventionellen Lymphozytenstörungstestes ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Standard-Zellenklon als gezielte Zellen verwender. Es ist nicht erforderlich, die gezielten Zellen des Spenders zu versorgen. Dadurch ist die Aufbereitung erleichtert. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die konventionelle gemischte Lymphozytenreaktion und das vorsensibilisierte Zellen-Typin-Test kombiniert, wobei die Zeitdifferenz dazwischen zur Bestimmung ausgenutzt ist. Dadurch ist die Bestimmungsdauer von länger als 3 Tage beim konventionellen Verfahren auf weniger als 30 Stunden verkürzt. Unter einigen Umständen kann man sogar in 4 bis 5 Stunden das Bestimmungsergebnis gewinnen. Es ist nicht erforderlich, die gezielten Zellen des Spenders zu versorgen. Es ist auch nicht nötig zu überlegen, ob der Spender lebendig ist oder ob es Versorgung der gezielten Zellen gibt, und es wird keinen Einfluß auf die Bestimmung ausüben, ob es die Angabe über Typ der Antigene des Spenders vorher bekannt ist. Dadurch ist ein neues Anwendungsgebiet für die Standard-Zellenklon-Zellenprobierplatte entfaltet und ist ein dynamisches Mittel zur Beobachtung des Immunozustandes im Körper des Empfängers nach der Transplantation angeboten. Dadurch kann der Kliniker vor der Erscheinung des klinischen Symtoms erfahren, daß die Ablehnungsreaktion auftreten wird. Dadurch können auch entsprechende Referenzdaten für die Dosierung des Immunounterdrückungspräparates für die klinische Einnahme gewonnen werden. Die Erfolgsrate der Transplantation sind damit erheblich erhöht. Im Vergleich zu den bekannten Bestimmungsverfahren weist die vorliegende Erfindung folgende Vorteile auf: schmerzenfrei, kurzzeitig, kostengünstig, mehr zuverlässig und spezifisch.
Beschreibung der Zeichnungen
1 Konformationseigenschaft der Lymphozyten bei der Transformation schematisch dargestellt, wobei die Konformation der noch nicht transformierten Lymphozyten mit 1, die Konformation der Lymphozyten bei der Transformationsübergangsphase mit 2 und die Konformation des Lymphoblastes mit 3 bezeichnet sind;
2 Vorderansicht der Zellenprobierplatte (ohne Decke); und
3 Seitenansicht der erfindungsgemäßen Zellenprobierplatte (mit Decke), wobei der Basiskörper der Zellenprobierplatte mit 4, die Kulturkavität der Zellenprobierplatte mit 5, die Markierung zur Positionierung der Kulturkavität mit 6, die Decke der Zellenprobierplatte mit 7, der vorspringende Rand mit 8, die Dichtung mit 9 und die Vertiefung mit 10 bezeichnet sind.
Ausführungsform
Nachfolgend wird die technische Lösung und die technische Wirkung der Zellenprobierplatte in Verbindung mit Zeichnungen erläutert.
Wie in 3 dargestellt, ist die erfindungsgemäße Zellenprobierplatte (Kulturplatte) aus tansparentem Glas, Plexiglas oder Kunststoff einstückig ausgeformt, während die Decke aus Plexiglas oder Kunststoff hergestellt ist. Die Decke, die Dichtung und der vorspringende Rand (oder Vertiefung) können auch einstückig gebildet werden. Die Dichtung und der vorspringende Rand aus Gummi können auch an die Decke geklebt werden. Auf der Zellenprobierplatte sind die Kulturkavitäten in regelmäßiger Weise angeordnet. Das Volumen des Kulturkavität soll nach dem Bedarf der Bestimmung 0.05 bis 0.5 ml betragen. Die Zellenprobierplatte kann auch mit Kavitäten in einigen unterschiedlichen Volumina ausgebildet werden. Der Boden der Kavität ist flach ausgebildet und mit der Umfangswandfläche Ober eine schräge Übergangsstrecke verbunden, so daß die Ecke im unteren Teil vermieden ist und die Zellen in flacher Weise gelegt ist und die Säuberung erleichtert ist. Und ein vorspringender Rand (nicht dargestellt) ist am Außenumfang angeordnet, um die Einströmung der auf der Oberfläche der Zellenprobierplatte bleibenden Flüssigkeit zu vermeiden. Dadurch ist eine bessere Dichtung erreicht, wenn die Platte mit der Decke gedeckt ist. Der vorspringende Rand kann mit dem Basiskörper einstückig gebildet werden. Zwei Vertiefungen sind am Basiskörper im dem unteren Teil im der Decke gegenüberliegenden Bereich in Querrichtung angeordnet. Die Vertiefungen wirken mit einem im unteren Teil der Decke angeordneten Vorsprung zusammen. Wenn die Decke nach unten gedrückt ist, so werden die Vorsprünge an beiden Seiten der Decke mit der ersten Vertiefung am Basiskörper formschlüssig verbunden. In dieser Zeit gibt es zwischen der Dichtung und der Kulturkavität noch einen kleinen Abstand, so daß der Austausch der Luft bei der Inkubierung ermöglicht ist. Wenn die Decke weiter nach unten gedrückt ist, wird der Vorsprung in der zweiten Vertiefung geklemmt und die Kavität durch die Dichtung vollständig geschlossen. Es ist auch möglich sein, den Vorsprung am Basiskörper anzuordnen und die zweite Vertiefung im unteren Teil der Decke anzuordnen.
Bei der vorliegenden Erfindung sind verschiedene Bestimmungsmethoden zur Überwachung des Immunozustandes nach der Transplantantion vorgeschlagen, wobei unterschiedliche Bestimmungsmittels für verschiedene Gegenstände in verschiedenen Phasen im Prinzip des Immunologie verwendet sind. Konkret gesagt, sind das Standard-Zellenklon als gezielte Zellen (stimulierende Zellen) und die Lymphozyten des Empfängers als Effektzellen (Reaktionszellen) verwendet. Da das Standard-Zellenklon auf der Zellenprobierplatte fast alle HLA-Antigene enthält, die zur Ablehnungsreaktion führen werden, und die Lymphozyten zu den vorsensibilisierten Memoriezellen verwandelt sind, wenn eine Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers aufgetreten ist, wird eine rasche Memoriereaktion zur Erscheinung treten, wenn die Lymphozyten bei der Bestimmung in vitro mit dem die Antigene des Spenders enthaltenden Standard-Zellenklon treffen und wenn die Lymphozyten stimuliert sind. Einerseits sind Lymphozyten in großem Maße zu Lymphozytenblasten transformiert und sich vermehren, anderseits werden das Standard-Zellenklon als gezielte Zellen durch die Lymphozytenblasten gestört (dabei können unterschiedliche Methoden wie das Dehydrogenasebefreiungstest oder MTT-Bestimmung der vermehrten Zellen angewandt werden). Oben ist die grundlegende technische Lösung der vorliegenden Erfindung beschrieben. Nachfolgend werden die unterschiedlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung näher erläutert.
Um Material einzusparen, hat der Erfinder das bei einigen Beispielen der Ausführungsform weggeworfene Material bei anderen Beispielen benutzt. Diese Benutzung einschließlich der erforderlichen Behandlung für die Benutzung soll nicht als wesentlichen Schritt des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens angesehen werden, außer wenn diese Benutzung beim klinischen praktischen Test wirklich nötig ist.
Ausführungsbeispiel
Beispiel 1:
Präparierung der Standard-Zellenklon-Probierplatte:
Obwohl die von Lamda Co. produzierte Standard-Zellklon-Probierplatte verschiedene HLA-Antigene enthält, kann sie nicht unmittelbar zur erfindungsgemäßen Bestimmung verwendet werden, weil ihre Kulturkavität zu klein ist und nur wenige Zellen aufnehmen kann. Mit der erfindungsgemäßen Zellenprobierplatte (64 Kavitäten mit Durchmesser von 5 mm und Tiefe von 15 mm) wird in Verbindung mit von Lamda Co. produzierten 60 Standard-Zellenklons die Standard-Zellenklon-Probierplatte nach entsprechendem Aufbereitungsverfahren hergestellt. Jede Kavität kann 40,000 Zellen aufnehmen. (Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es zulässig, daß jede Kavität 20,000 bis 200,000 Zellen aufnimmt.). Dabei werden in die vier überschüssigen Kavitäten von den 64 Kavitäten nur Standardzellen zugefügt und als Vergleichsgruppe für die maximale Befreiung in Beispiel 4 verwendet.
Beispiel 2:
Die Bestimmung der Konformation der Reaktionszellen:
Nach der Transplantation wurden die T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut des Empfängers entfernt und dann mit RPMI 1640 Kulturmedium, das 20% menschliches AB Serum (oder DMEM Kulturmedium) zur Zellensuspensionsflüssigkeit mit 1 Million Zellen/ml aufbereitet. In jede Kavität auf der in Beispiel 1 aufbereiteten Zellenprobierplatte wurde 0.1 ml von der Zellensuspensionsflüssigkeit zugefügt (das Verhältnis von gezielte Zellen/Effektzellen ist 1:2.5.). Die Zellenprobierplatte wurde in den Inkubator mit der CO₂-Konzentration von 5% gelegt. Die Zellen wurden unter der Temperatur von 37°C für 10 bis 28 Stunden inkubiert. Dabei wurde es mit Hilfe von einem Mikroskop zu jeder Zeit beobachtet, ob die Transformation der Zellen auftritt. In Bezug auf die Konformation der Reaktionszellen mit Transformation oder ohne Transformation ist es auf 1 verwiesen. In Bezug auf Zählen der Zellen ist es auf "Experimental Technologies in Modem Immunology" ed. by Guanxin Shen etc., Hubei Science and Technology Press, China, October, 1998, verwiesen.
Beispiel 3:
Beobachtung der Konformation der markierten Zellen:
Nach der Transplantation wurden die T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut des Empfängers separiert und dann mit serumfreiem Kulturmedium, das 0.2 mmol von fluoreszenz-markiertem Thymin enthält, zur Zellensuspensionsflüssigkeit mit 400,000 Zellen/ml aufbereitet. In jede Kavität auf der in Beispiel 1 aufbereiteten Zellenprobierplatte wurde 0.1 ml von der Zellensuspensionsflüssigkeit zugefügt (das Verhältnis von gezielten Zellen/Effektzellen ist 1:1), Die Zellenprobierplatte wurde in den Inkubator mit der CO₂-Konzentration von 5% gelegt. Die Zellen wurden unter der Temperatur 37°C für 10 bis 28 Stunden inkubiert. Mit Hilfe von einem Fluoreszenzmikroskop wurde zu jeder Zeit beobachtet, ob der Zellenkern Fluoreszenz strahlt. Obwohl es nach Stand der Technik verschiedene Markierungsgegenstände und Markierungsmethoden gibt, ist es bei der vorliegenden Erfindung erforderlich, durch die unmittelbare Beobachtung der Konformation das Markierungssignal zu gewinnen. Wie zum Beispiel sind die Ferritin-Markierung, die kolloide goldene Markierung (macht den Kern dunkel), Fluoreszein-Markierung und die Lumineszenz-Markierung (macht den Kern luminös) solche Markierungen.
Beispiel 4:
Bestimmung der Befreiung der Dehydrogenase aus den gezielten Zellen:
Im Inkubator nach Beispiel 2 wurde die Zellenprobierplatte für 2 Stunden inkubiert. Nur in die vier Kavitäten als Standardzellenvergleichsgruppe wurde jeweils 0.1 ml von 1% NP (nichtionischem Detacheur) Lösung zugefügt. Die Zellenplatte wurde weiter für 2 Stunden inkubiert und herausgenommen. 0.1 ml der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität wurde extrahiert und in entsprechende Kavitäten auf einer anderen leeren Probierplatte (ohne Zellenklon) zugefügt. In jede Kavität wurde 0.1 ml der frisch aufbereiteten Substratlösung zugefügt. Bei der Raumtemperatur wurde die Reaktion unter dem Schutz vor Belichtung für 15 Minuten durchgeführt. Um die Reaktion zu beenden, wurde 30 μl der Citronensäure (1 mol/L). in jede Kavität zugefügt. Der Absorptionswert in jeder Kavität wurde mit Hilfe von einem ELISA-Lesegerät, hergestellt von Eastern China Electron Tube Factory bei der Wellenlänge von 570 nm abgelesen. Der Mittelabsorptionswert der Kavitäten ohne Antigene des Spenders wurde als Mittelabsorptionswert für natürliche Befreiung-Vergleichsgruppe genommen. Das vorliegende Verfahren kann sowohl zur Bestimmung der Befreiung einer einzigen Dehydrogenase (Lactikodehydrogenase, Malikodehydrogenase oder Glutamikodehydrogenase), als auch zur Bestimmung der Befreiung der verschiedenen Dehydrogenasen angewandt werden. Der Unterschied liegt nur dann, welches Reaktionssubstrat die Substratlösung enthält. Das Reaktionssubstrat kann eins von Natriumlaktat, Natriummalat und Natriumglutamat oder ihre Kombination sein. In dem vorliegenden Beispiel wurde LDH-Substratlösung (enthält Natriumlaktat). In Bezug auf die Aufbereitung der Substratlösung und die Bedienung der enzymatischen Reaktion ist es auf "Experimental Technologies in Modem Immunology", Seite 311 verwiesen.
Beispiel 5:
Die MTT-Bestimmung der Zellentransformation:
Die Zellenplatte, die in Beispiel 4 nach der Extraktion der superficellen Flüssigkeit und weggeworfen worden war, wurde genommen. In jede Kavität (mit Ausnehme der vier Kavitäten als Vergleichsgruppe für maximale Befreiung) wurde jeweils 0.1 ml des flüssigen Kulturmediums zugefügt und die Zellenplatte wurde in den Inkubator gelegt. In dem Inkubator wurde die Zellenplatte für 6 Stunden weiter inkubiert. Und dann wurde die Zellenplatte aus dem Inkubator herausgenommen und in jede Kavität wurde 10 μl der PBS-Lösung von MTT (Konzentration: 5 mg/ml) zugefügt. Und dann wurde die Zellenplatte wieder in den Inkubator gelegt und für 4 Stunden weiter inkubiert. Die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität wurde extrahiert. Mit Hilfe von ELISA-Lesegeät wurde der Absorptionswert in jeder Kavität bei der Wellenlänge von 480 nm abgelesen.
Beispiel 6:
Die MTT-Bestimmung der Zellentransformation:
Die Zellenplatte, die in Beispiel 5 nach der Extraktion der superficellen Flüssigkeit und weggeworfen worden war, wurde genommen. Nachdem der Rest der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität völlig entfernt worden war, wurde in jede Kavität jeweils 0.2 ml von DMSO zugefügt und die Zellenplatte wurde für 5 Minuten geschüttelt und dann wurde mit Hilfe von ELISA-Lesegerät der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität bei der Wellenlänge von 490 nm abgelesen. Da es bei diesem Verfahren bei der Wellenlänge von 630 nm auch einen maximalen Absorptionswert gibt, kann auch der Absorptionswert bei dieser Wellenlänge abgelesen werden. Bei beiden genannten Wellenlängen kann auch der Absorptionswert abgelesen werden, und dann wurde die Berechnung durchgeführt. In Bezug auf die Berechnung und Feststellung ist es auf "The Improvement of MTT Calorimetric Analysis and Preliminary Applications", Shanghai Journal of Immunology, No.5, 1996, verwiesen.
Beispiel 7:
Aufbereitung der Zellenprobierplatte mit den das aus MTT reduzierte Formazankristall enthaltenden Standardzellen:
Kurz vor der fertigen Inkubierung des Standard-Zellenklons wurde in jedes flüssige Zellenkulturmedium das MTT mit der Endkonzentration von 0.25 mg/ml zugefügt. Die Lösung wurde für 4 Stunden inkubiert. Dann wurde die Zellenprobierplatte nach dem oben beschriebenen Verfahren aufbereitet. Jede Zelle auf der Zellenprobierplatte enthält eine gleiche Menge von Formazankristall. Es ist auch möglich, die vorhandene Zellenprobierplatte mit MTT zu behandeln. In Bezug auf die Behandlung des Standard-Zellenklons mit MTT, und auf die MTT-Bestimmung in oben genannten Beispielen ist es auf "Experimental Technologies in Modern Immunology" verwiesen
Beispiel 8:
MTT-Bestimmung der gezielten Zellen:
Die in Beispiel 7 fertig aufbereitete Zellenplatte wurde genommen. In jede Kavität wurde jeweils 0.1 ml der in Beispiel 2 präparierten Suspensionsflüssigkeit der Lymphozyten des Empfängers (Verhältnis von gezielten Zellen/Effektzellen: 1:2.5) zugefügt. Die Zellenprobierplatte wurde in den Inkubator gelegt und für 4 Stunden inkubiert. Und dann wurde die Zellenprobierplatte aus dem Inkubator herausgenommen. Anschließend wurde in jede Kavität jeweils 20 μl von Hydrogenperoxyd (Konzentration: 1%) zugefügt. Die Zellenprobierplatte wurde wieder in den Inkubator gelegt und für 2 Stunden inkubiert. Dann wurde die Zellenprobierplatte aus dem Inkubator herausgenommen. Zum Schluß wurde der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität mit Hilfe von ELISA-Lesegerät bei der Wellenlänge von 480 nm abgelesen. In dem vorliegenden Beispiel wurde die Oxydantie so ausgewählt, daß das Formazankristall zu MTT oxydiert wurde und kein Einfluß auf die normalen Zellen ausgeübt wurde und diese Oxydantie keine Farbe aufweist. Es gibt keine ernste Forderung an die Zusatzmenge und die Konzentration. Aber die Zusatzmenge und die Konzentration müssen ausreichend sein und die Zusatzmenge in jeder Kavität muß gleich sein.
Beispiel 9:
MTT- Bestimmung der gezielten Zellen:
Die Zellenprobierplatte, die in Beispiel 8 nach der Extraktion der superficiellen Flüssigkeit weggeworfen worden war, wurde genommen. Nachdem der Rest der superficiellen Flüssigkeit endgültig entfernt worden war, wurde in jede Kavität jeweils 150 μl von DMSO zugefügt, Die Zellenprobierplatte wurde für 10 Minuten geschüttelt. Zum Schluß wurde mit Hilfe von ELISA-Lesegerät der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität bei der Wellenlänge von 630 nm abgelesen. In Bezug auf die Ablesung und Berechnung im vorliegenden Beispiel ist es auf Beispiel 6 verwiesen.
Beispiel 10:
MTT-Bestimmung der gezielten Zellen:
In jede Kavität auf der in Beispiel 7 fertig aufbereiteten Zellenprobierplatte wurde 0.1 ml (Verhältnis von gezielten Zellen/Effektzellen: 1:3) von der in Beispiel 2 präparierten Suspensionsflüssigkeit der Lymphozyten zugefügt. Die Zellenprobierplatte wurde in den Inkubator gelegt und für 8 Stunden inkubiert und dann aus dem Inkubator herausgenommen. In jede Kavität wurde 0.1 ml von Ethanol zugefügt und die Zellenprobierplatte wurde für 5 Minuten geschüttelt. Zum Schluß wurde mit Hilfe von dem ELISA-Lesegerät der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität bei der Wellenlänge von 570 nm abgelesen. In Bezug auf die Ablesung und Berechnung ist es auf Beispiel 6 verwiesen. Über Ersatzmittel für Ethanol ist oben schon erläutert, daher sind hierin nicht mehr entsprechende Beispiele genannt.
Beispiel 11:
Bestimmung der Toleranz
Nachdem das Reagenz auf der in Beispielen 2 bis 6 und 8 bis 10 weggeworfenen Zellenprobierplatte (die Zellen aufbehalten) entfernt worden war, wurde 0.2 ml des flüssigen Kulturmediums in jede Kavität zugefügt. Die Zellenprobierplatte wurde in den Inkubator gelegt und für 3 bis 5 Tage inkubiert und dann aus dem Inkubator herausgenommen. In jede Kavität wurde jeweils 20 μl von MTT (5 mg/ml) zugefügt und weiter für 2 bis 6 Stunden inkubiert. Nachdem die superficielle Flüssigkeit entfernt worden war, wurde in jede Kavität 0.2 ml von DMSO zugefügt. Zum Schluß wurde der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavität bei der Wellenlänge von 490 nm oder 630 nm abgelesen. Wenn der Absorptionswert von den die Antigene des Spenders enthaltenden Kavitäten erheblich kleiner als der Absorptionswert von den die Antigene des Spenders nicht enthaltenden Kavitäten ist; bedeutet es, daß der Empfänger entsprechende Toleranz gegenüber dem Organ des Spenders aufweist. So kann unter der regelmäßigen Überwachung die Dosierung der Einnahme des Immunounterdrückungspräparates reduziert oder die Einnahme aufgehört werden. Wenn der Absorptionswert von den die Antigene des Spenders enthaltenden Kavitäten erheblich höher als der Absorptionswert von den die Antigene des Spenders nicht enthaltenden Kavitäten ist, bedeutet es, daß eine akute Ablehnungsreaktion auftritt (wenn es einstimmig mit dem oben beschriebenen Bestimmungsergebnis innerhalb von 30 Stunden ist), oder eine chronische Ablehnungsreaktion auftritt (wenn es nicht einstimmig mit dem oben beschriebenen Bestimmungsergebnis innerhalb von 30 Stunden ist).
Durch eine große Anzahl der Experimenten hat es sich erwiesen, daß die Zeitdauer der Inkubierung bei den verschiedenen Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung von der Sensibilität der Lymphzyten des Empfängers abhängt. Wenn die Sensibilität höher (Eine akute Ablehnungsreaktion tritt auf) ist, tritt bei der kurzzeitigen Inkubierung die Reaktion auf. Aber wenn die Sensibilität niedriger (bei der Anfangsphase der Ablehnungsreaktion) ist, ist es erforderlich, eine längere Zeit für die Inkubierung in Anspruch zu nehmen. Die Zeitdauer der Inkubierung kann nach den klinischen Erfahrungen eingestellt werden. Obwohl es nach den durch das erfindungsgemäße Verfahren ermittelten Daten festgestellt werden kann, ob eine Ablehnungsreaktion im Körper des Empfängers auftritt und wie stark die Reaktion ist, ist es unmöglich, unmittelbar mit diesen Daten die Ablehnungsreaktion zu quantifizieren. Die Quantifizierung der Stärke der Ablehnungsreaktion muß durch Vergleich mit den vohergehenden Bestimmungsergebnissen und nach den langjährigen Bestimmungserfahrungen festgestellt werden. Bei der praktischen klinischen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahren sind bevorzugt zwei unterschiedliche Methoden zur Bestimmung parallel bei der ersten Durchführung der Bestimmung und unter der Voraussetzung ohne Erfahrungen angewandt, so daß die Bestimmungsergebnisse miteinander verglichen werden können. Eine davon bezieht sich auf die Bestimmung der Effektzellen, während sich die andere auf die Bestimmung der gezielten Zellen bezieht. Wenn der Kliniker über reiche Erfahrungen verfügt, so kann er mit einer einzigen Methode die Bestimmung durchführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist folgende spezifische Vorteile auf mit einer einzigen Standard-Zellenprobierplatte kann nicht nur die spezifische Störungssaktivität der CD* T-Lymphozyten und der NK-Zellen im Körper des Empfängers gegenüber den Zellen des Spenders, als auch die spezifische Transformations- und Vermehrungsfähigkeit der CD⁺ T-Lymphozyten des Empfängers unter der Stimulation der Antigene des Spenders bestimmt werden. Dieses Verfahren ist mehr spezifisch, sensitiv und zuvelässig bei der Beobachtung der Ablehnungsreaktion, da ein Vergleich zwischen den vielen die Antigene des Spenders enthaltenden Kavitäten bei der Bestimmung durchgeführt werden kann und auch mit der spezifischen Störungssaktivität der CD8⁺ Subgruppe und mit der spezifischen Vermehrungsfähigkeit der CD⁺Subgruppe ein Vergleich unter den Bestimmungsmethoden durchgeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann nicht nur zur Überwachung des Immunozustandes nach der allogenischen Transplantation angewandt werden, als auch zur Überwachung des Immunozustandes nach der heterogenischen Transplantation angewandt werden, nur wenn das Standard-Zellenklon, das verschiedene Antigene dieses Tieres enthält, vorhanden ist.
Es gibt sehr viele Verfahren zur Präparierung des erfindungsgemäßen Standard-Zellenklon. Mit der Gentechnologie ist das Verfahren durchgeführt, wobei ein menschliches B-Lymphozytenklon als Gegenstand der Modifikation ausgewählt ist. Mit Hilfe von der Gen-Bank wird die Nucleotid-Sequenz der menschlichen HLA-Gene ermittelt. Die Primer werden ausgestaltet, so daß zwei 2–4 kb DNA Fragmente an zwei Enden der HLA-Gene als homologener Rekombinationsteil respektiv verstärkt werden. Die gewonnenen Aufwärtsstrom- und Abwärststrom-Fragmenten der HLA-Gene werden zur Verfügung gereinigt (Cell, 1991, 66:1051–1066; Science, 1982, 256: 1392–1394). Ein DNA-Expressionsvektor der Eukaryozyten (als eukaryotischen Expressionvektor bezeichnet, wie zum Beispiel Living Color^TM Fluorescein Protein Reporting System, SV40 Vektor, und seinesgleichen) und ein Antibiotika-Screening-Markierung-Gen (wie zum Beispiel Neomycin-Resistance-Gen, Hygromycin-Resistance-Gen (HYP), Puromycin-Resistance-Gen, Zeoein usw) werden ausgewählt, um mit der konventionellen genetischen Technologie einen HLA-Gen-"Knockout"-Vektor zu errichten, wobei eine Tandemstruktur mit einem Markierungen zwischen Aufstrom- und Abstromfragmenten in den ausgewählten eukaryotischen Expressionsvektor gesteckt wird. Dann wird der errichtete Gen-Knockout-Vektor mit dem konventionellen molekularen biologischen Verfahren verbreitet.
Nach der Extraktion des Gen-Knockout-Vektors mit dem konventionellen Verfahren wird der gereinigte Gen-Knock-Vektor durch die Elektroporation oder andere molekulare biologische Methoden in die Zellen des ausgewählten B-Zellenklons zur Inkubierung überführt. Gleichzeitig wird das Antibiotikum entsprechend dem ausgewählten Resistance-Gen zugefügt, um das Zellenklon mit Resistanzgenen auszusieben ("mit Resistanzgenen" bedeutet, daß die gezielten Zellen in das Zellenklon überführt worden sind). Dann wird Genom-DNA aus dem ausgesiebten Zellenklon extrahiert und durch die Polymerkettereaktion (PCR) mit dem Primer, der spezifisch für HLA ist, identifiziert. Das Zellenklon, dessen HLA-Allel in den homologischen Chromosomen völlig ersetzt ist, wird als Zellenklon, das das humane HLA-Antigengengen nicht darstellt, zur Verfügung ausgewählt (Dieses Zellenklon enthält kein humanes HLA-Antigengen, das bedeutet, daß das normale humane HLA-Gen in "knockout" Weise schon aus dem Zellenklon entfernt ist.). Dann werden cDNA oder Genom-DNA von fast allen HLA-Antigenen durch reversible Transkription oder Screening aus dem humanen Genom-Bibliothek respektiv aufbereitet und in den oben genannten Expressvektor (ein Resistanzgen ausgewechselt) eingeführt. Dann werden die Expressvektoren als Träger für unterschiedliche HLA-Antigengene in die leeren Zellen respektiv eingeführt, deren Gene von HLA-Antigen in "knockout" Weise schon entfernt worden sind. Dadurch wird ein System des Standard-Zellenklon errichtet, das verschiedene HLA-Antigene respeltiv darstellt.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der Lymphozyten im Blut auf das spezifische Antigen, wobei das das bekannte HLA-Antigen enthaltende Standard-Zellenklon mit Lymphozyten des Enpfängers in vitro zur Vermehrung der Zellen für 2 bis 28 Stunden inkubiert wird, und dann die Raktionsfähigkeit der Lymphozyten mit dem Immunologiebestimmungverfahren bestimmt ist, um ein Mittel zur dynamischen Überwachung des Immunozustandes des Empfängers gegenüber dem Organ des Spenders nach der Transplantation des Organs und entsprechende Referenzdaten der Dosierung des Immunounterdrückungspräparates für die klinische Einnahme anzubieten, so daß die Erfolgsrate der Transplantation des Organs erhöht ist. Bei der vorliegenden Endung ist die schmerzenfreie, kurzzeitige, kostengünstige, mehr spezifische und zuverlässige Bestimmung erreicht.

Claims

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Reaktion der Lymphozyten im Blut auf ein spezifisches Antigen, umfassend folgende Schritte: das T-Lymphozyt im peripheren Blut des Empfängers ist mit einem flüssigen Kulturmedium zur Zellensuspensionsfüssigkeit präpariert; eine Zellenprobierplatte mit dem das bekannte HLA-Antigen enthaltenden Standard-Zellenklon ist aufbereitet, und die Zellensuspensionsflüssigkeit ist nach dem Verhältnis von gezielten Zellen/Effektzellen von 1:0:5–10 in die einzelnen Kavitäten auf der Zellenprobierplatte zugefügt; die Zellen sind für 2 bis 28 Stunden inkubiert; zum Schluß ist der Unterschied zwischen der Reaktionsfähigkeit der Lymphozyten des Empfängers in den Kavitäten mit dem das Antigen des Spenders enthaltenden Zellenklon und der Reaktionsfähigkeit des Lymphozyten in den Vergleichskavitäten bestimmt, so daß festgestellt ist, ob das Lymphozyten des Empfängers sensibilisiert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es bei der Bestimmung mittels eines Mikroskops beobachtet ist, ob eine Transformation der Lymphozyten in den einzelnen Kavitäten auftritt und die Transformationsrate durch das Zählen der Zellen ermittelt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Kulturmedium ein markiertes Thymin enthaltendes flüssiges Medium ist, sich das markierte Thymin bei der 6 bis 28-stündigen Inkubierung an die Synthese von DNA in der Zelle beteiligt, so daß die Merkmale des Zellenkerns bei der Beobachtung mittels eines Mokroskops oder eines Fluoreszenz-Mikroskops augenfällig sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils eine gleiche Menge von superficieller Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten extrahiert und in entsprechende Kulturkavitäten auf eiener anderen leeren Probierplatte überführt ist, um die enzymatische Reaktion zur Dehydrogenase-Bestimmung durchzuführen, eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert im Wellenlängenbereich von 480 nm bis 630 nm nach dem Ende der Reaktion ausgewählt ist, und der Absorptionswert der Lösung in den einzelnen Kavitäten mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils eine gleiche Menge von Tetrazolliumsalz (MTT)–Lösung in die einzelnen Kavitäten auf der Zellenprobierplatte zugefügt ist, nachdem die Wellen für 6 bis 16 Stunden inkubiert worden ist, eine weitere Inkubierung für 2 bis 6 Stunden durchgeführt ist, eine gleiche Menge der superficiellen Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten nach dem Ende der Inkubierung extrahiert ist und eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert für die Tetrazolliumsalz (MTT)-Lösung im Wellenlängenbereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt ist, und der Absorptionswert der Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten mittels des Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die superficielle Flüssigkeit nach dem Ende der Inkubierung entfernt ist und eine gleiche Menge von Dimethylsulfoxyd (DMSO) in die einzelnen Kavitäten zugefügt ist, so daß das Formazan aus der Lösung kristallisiert ist, eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert in dem Wellenlängenbereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt ist, und der Lichtabsorptionswert der superficellen Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten mittels des Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Standard-Zellenklon zur Aufbereitung der Zellenprobierplatte eine gleiche Menge von Formazankristall aufweist, das durch Reduktion von MTT erzeugt ist, die Kulturen in den einzelnen Kavitäten mittels MTT-Verfahrens detektiert ist, nachdem die genannten Zellen auf der Zellenprobierplatte inkubiert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das MTT-Verfahren folgende Schritte umfaßt: die Zellen sind für 3 bis 8 Stunden inkubiert; dann ist jeweils eine gleiche Menge einer Oxydantie in jede Kavität auf der Zellenprobierplatte zugefügt; und die Zellen sind für 1 bis 4 Stunden weiter inkubiert; durch die Oxydantie ist das in den gestörten gezielten Zellen enthaltende Formazan zur Erzeugung von MTT oxidiert; die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität ist nach dem Ende der Inkubierung extrahiert; eine Wellenlänge mit maximalem Absorptionswert ist für die MTT-Lösung im Bereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt; mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge ist der Absorptionswert der superficiellen Flüssigkeit in jeder Kavitätenät abgelesen.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das MTT-Verfahren folgende Schritte umfaßt: die Zellen sind für 4 bis 6 Stunden inkubiert; die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavitätenät wird entfernt; in jede Kavität ist jeweils eine gleiche Menge der DMSO-Lösung zugefügt, so daß das Formazan aus den gestörten gezielten Zellen kristallisiert ist; die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität ist extrahiert; eine Wellenlänge mit dem maximalen Absorptionswert ist im Bereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt; der Absorptionswert in jeder Kavität ist mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das MTT-Verfahren folgende Schritte umfaßt: die Zellen sind für 4 bis 10 Stunden inkubiert; in jede Kavität auf der Zellenprobierplatte ist jeweils eine gleiche Menge einer organischen Lösung zugefügt, so daß das Formazankristall in jeder gestörten gezielten Zelle gelöst ist; die superficielle Flüssigkeit in jeder Kavität ist extrahiert; eine Wellenlänge mit maximalem Absorptionswert ist im Bereich von 480 nm bis 630 nm ausgewählt; der Absorptionswert ist mittels Lichtstrahls mit dieser Wellenlänge abgelesen.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte organische Lösung Methanol, Ethanol, Benzylalkohol, Formaldehyd, Acetaldehyd, Glutaraldehyd oder Demethylbenzol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Zellenprobierplatte so ausgestaltet ist, daß die Kavität ein Durchmesser von 3 bis 6 mm und eine Tiefe von 5 bis 15 mm aufweist, ein vorspringender Rand am Außenumfanng jeder Kavität angeordnet ist, der Boden der Kavität flach ausgebildet ist, der Boden mit der Umfangswandfläche über eine schräge Übergangstrecke verbunden ist, und eine zweistufige Klemmeinrichtung an der innenseitigen Wand im unteren Teil der Decke und an den gegenseitigen Wänden des Zellenprobierplattenkörpers angeordnet ist, die Klemmeinrichtung als in Querrichtung erstreckende Kavität und Vorsprünge ausgebildet sind, die beideseitigen Vorsprünge mit der ersten Vertiefung formschlüssig verbunden sind und der Verschluß der Zellenprobierplatte durch die Dichtung der Decke noch nicht erreicht ist, wenn die Decke auf die Platte gesetzt und nach unten gedrückt ist, und der Vorsprung mit der zweiten Vertiefung formschlüssig verbunden sind und der feste Verschluß der Platte durch die Dichtung erreicht ist, wenn die Decke weiter nach unten gedrückt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard-Zellenklon durch folgende Verfahrensschritte präpariert ist: das B-Lyophozytenklon ist als Gegenstand der Modifikation ausgewählt, und das HLA-Genfragment in Chromosomen-DNA ist in "Gen-knockout" Weise entfernt; dann ist ein Genfragment der spezifischen NLA-Antigene in Chromosome-DNA gesteckt, so daß es zur Darstellung gebracht ist, so ist ein Standard-Zellenklon, das nur ein HLA-Antigen darstellt, entwickelt.