WO2001065251A2 - Verwendung eines elektrodenarrays - Google Patents

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WO2001065251A2
WO2001065251A2 PCT/EP2001/002332 EP0102332W WO0165251A2 WO 2001065251 A2 WO2001065251 A2 WO 2001065251A2 EP 0102332 W EP0102332 W EP 0102332W WO 0165251 A2 WO0165251 A2 WO 0165251A2
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electrode array
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Cornelia Leibrock
Thomas Müller
Hansjürgen VOLKMER
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NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention is concerned with systems for studying regeneration, synaptogenesis and synaptic stability in biological material, such as cells.
  • the invention is also related to injuries to the central nervous system (CNS) of adult mammals caused, for example, by trauma, ischemia or neurodegenerative diseases. These injuries result in serious and permanent functional deficits that require curative treatment. It is already known that, in contrast to the developing CNS or peripheral nerves, CNS axons lose their ability to regenerate after axotomy at a certain point in development. This loss is believed to result from the non-permessive environment of the CNS and from factors intrinsic to the adult CNS neurons.
  • Treatments that can lead to neural regeneration include the administration of active substances, such as pharmaceuticals, or the use of physical methods, such as electrostimulation.
  • Li et al-, Enthorinal Axons Project to Dentate Gyrus in Organotypic Slice Co-culture, NEUROSCIENCE 1993, Volume 52, pages 799-813 describe an organotypic coculture of the entorhinal cortex and postnatal hippocampus, which prepares itself from its own entorhinal entrance has been.
  • the authors show the formation of entorhinal projections in the cocultivated hippocampus in an immunohistochemical manner, for which the sections were stained and evaluated under a microscope.
  • the authors also show a few electrophysiological data that were obtained with an excitation electrode made of tungsten and a measuring electrode made of glass.
  • the measurement method described here is not suitable as a model system for long-term recordings.
  • WO 00/79273 A2 which was only published after the priority date of the present application, describes a method in which hippocampus tissue is arranged on a microelectrode array, via which the nerve tissue is stimulated and the different response to different psychotropic drugs is measured.
  • the present invention has for its object to provide a way to evaluate treatments that can lead to neural regeneration in a model system that corrects long-term records of physiological activity with morphological changes.
  • This object is achieved according to the invention by using an electrode array in order to investigate a regeneration promoted by active substances or physical processes in biological material, a microelectrode arrangement being preferably used as the electrode arrangement.
  • organotypic cultures and cocultures of tissue of the central nervous system can be used, in particular, for the formation and regeneration of connections to measure functionally between cells and to investigate the effect of pharmaceuticals or physical processes for activating cell functions.
  • promoting regeneration is understood to mean both the effect and the support of regeneration.
  • Electrode arrays especially microelectrode arrays, e.g. Egert et al., A Novel Organotypic Long-term Culture of the Rat Hippocampus on Substrate Integrated Multielectrode Arrays, BRAIN RESEARCH PROTOCOLS, 1998, Volume 2, pages 229-242, are particularly well suited for long-term measurement in such systems ,
  • organotypic cocultures By combining organotypic cocultures with extracellular microelectrode recording technology, the development of new connections and their regenerative ability can be repeatedly monitored on a functional level in the same culture for days to weeks.
  • organotypic cultures represent a good alternative to animal experiments for dealing with questions in the field of regeneration.
  • the coculture model of the dentate gyrus and entorhinal cortex offers a favorable starting point. It can be seen from the literature described in the introduction that this coculture model is well morphologically characterized in the literature, and the analogy to the in vivo situation has also been demonstrated. However, electrophysiological data from the literature are hardly available. bar, these data can now be provided by using the microelectrode array (hereinafter: MEA). It is also advantageous that there is a simple, monosynaptic connection with a clearly defined starting and ending point between the two tissues.
  • MEA microelectrode array
  • the inventors of the present application have now recognized for the first time that the use of microelectrode arrays makes it possible to generate a previously experimentally interrupted perforant pathway both during the juvenile phase, where regeneration is still relatively easy in the central nervous system, and in the differentiated state to investigate.
  • the use of MEA technology in connection with the organotypical culture mentioned as an example offers the possibility of electrophysiologically determining the activity over the entire area of a preparation repeatedly over a period of days and weeks. Electrostimulation at reproducibly always the same places with simultaneous derivation in the entire remaining coculture is also possible in order to prove a connection between the two explants.
  • the explants grow together for the first time in the juvenile phase. If a lesion is then placed through the newly formed connection after the coculture has reached a differentiated state, the regeneration can also be examined in an adult-like state.
  • Such long-term monitoring of 17 derived cocultures on an MEA with electrodes spaced 200 ⁇ m apart and 30 ⁇ m in diameter showed that twelve of these cocultures had grown together again. Seven of these co-cultures that had grown together were lesioned, four of which were still vital after the lesion.
  • the pharmaceuticals or active substances are selected from the group: organic or chemical compounds and biologically active substances, such as peptides, proteins, nucleic acids, where the biological material can include both juvenile cells and cells in an adult-like state.
  • the regeneration of cultures and cocultures can also be observed repeatedly over a longer period of time, preferably more than one week. It is also possible to investigate the reactions of receptor systems to the administration of active substances.
  • the application also relates to a method for investigating the effects of pharmaceuticals on the regeneration potential of functional interconnections in cultures, in which an electrode array is preferably used as described above.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the in vivo situation between the entorhinal cortex (ec) and the dentate gyrus (dg);
  • Figure 3 shows electrical stimulation on cocultures as in Figure 2;
  • Figure 4 shows the restoration of functional compounds in a coculture as in Figure 2.
  • FIG 5 shows the electrical stimulation of electrogenic cells in the cell cluster on an MEA.
  • Example 1 Measurements on a coculture
  • Figure 1 is a schematic drawing of the in vivo situation between the entorhinal cortex (ec) and the dentate gyrus (dg). Part of the perforant pathway is shown with pp, which is cut during the preparation on the dashed line.
  • CA1 and CA3 denote fields of the hippocampus.
  • Sections of the entorhinal cortex and dentate gyrus which were taken from 6 to 7-day-old Wistar rats or BalbC mice, were cultured on a microelectrode array of 60 substrate-integrated electrodes.
  • the electrodes had a stood of 200 ⁇ m and a diameter of 30 ⁇ m.
  • the stimulation of the sections and the recording of the electrophysiological activity was achieved by using an MCS amplifier and a data acquisition system (Multi Channel Systems, Germany), which allows the use of each contact as a stimulation or recording electrode without manipulation of the section allows.
  • the data was recorded online from all 60 channels at a sampling frequency of 25 kHz / channel.
  • FIG. 2 shows such a preparation of the cocultures, for which horizontal brain sections (425 ⁇ m) were used.
  • the entorhinal cortex and the corresponding dentate gyrus were separated from the brain sections, which represent the origin and target tissue of part of the preferant pathway.
  • the cuts that were made during the preparation are shown in dashed lines in FIG. 2a.
  • the two explants were then positioned similar to the in vivo situation on a microelectrode array with an 8x8 field of extracellular electrodes.
  • 2b shows a coculture immediately after preparation.
  • DIV7 Starting from the seventh day in vitro (DIV7), every three days both the total spontaneous activity of the cocultures and the response to extracellular electrical stimulation of layer II of the entorhinal cortex and the stratum granulums of the dentate gyrus were monitored. Additionally marked Dil staining (1, l-dioctadecyl-3, 3, 3, 3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; Honey and Hume, Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Original to be Studied in Long-term Cultures, J CELL. BIOL. 1986, volume 103, pages 171-187) of the dg retrograd the cells in layer II of the ec.
  • FIG. 3 shows the extracellular stimulation of a coculture of ec and dg
  • FIG. 3a indicating the morphology of the coculture after 7 days in vitro (DIV7)
  • 3b shows the reaction on all MEA electrodes after electrical stimulation in layer II-III of the ec (80 ⁇ A, 150 ⁇ s).
  • FIG. 4 The functional restoration of compounds in cocultivated explants from dg and ec juvenile rats or mice is shown in FIG. 4. After 7 days in vitro, it is possible to elicit activity in the dg via electrical stimulation in the ec (FIG. 4a), but not vice versa (FIG. 4b). This corresponds to the in vivo situation in the ec layer II cells in the dg project.
  • the linked co-culture thus established is now developing in vitro to an adult-like stage, whereupon the newly produced compounds are then damaged.
  • the regenerative potential of the differentiated neurons and the promotion, i.e. effecting or supporting regeneration, of pharmaceuticals or physical processes can then be tested at these lesions.
  • Neuroproductive or regenerative substances that act directly on the output cells in layer II of the ec can enable the pathway that has already been established in vitro to be regenerated, which is normally not possible in the differentiated state.
  • Organotypic cortical cocultures (350-425 ⁇ m thick, from the Neocortex) were prepared from three to seven day old Wistar rats of each sex and maintained in vitro using the roller tube technique; see Gähwiler, Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue, J. NEURO-SCIENCE METHODS, 1981, Volume 4, pages 329-342.
  • the cocultures were grown for up to 35 days either on glass coverslips or on microelectrode arrays in medium containing 50% basic Eagle medium, 25% Hanks buffered saline, 25% horse serum, 33 mM D-glucose and 1 mM L-glutamine , The medium was changed twice a week, and the coculture explants were placed with different orientations and distances (0 to 500 ⁇ m) to one another.
  • the explants cultured on glass coverslips were fixed in buffered 4% paraformaldehyde for two hours, washed, treated in buffered 0.1% Triton X-100, washed again and in 1% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% Goat serum pre-incubated to prevent non-specific binding.
  • BSA bovine serum albumin
  • the cultures were incubated for 3 to 9 days with primary antibody in 1% buffered BSA solution. After washing for four to five days in buffer, the cultures were incubated with a secondary antibody (goat anti-mouse IgG, CY3) for three to five days and then washed for four to five days. The explants were placed on slides, viewed for fluorescence and photographed. The controls passed Explants that were only incubated with the secondary antibody.
  • Primary antisera (Boehringer, Mannheim) were monoclonal antibodies, which were diluted into working solutions of 0.5 ⁇ g / m and 1 ⁇ g / ml for anti-GAP-43 and synaptophysin.
  • Nissl stains were used to assess the morphology of the explants. The cocultures were fixed, dehydrated, stained in toluidine blue, placed on slides and photographed.
  • the explants cultured on microelectrode arrays were recorded at various times with regard to spontaneous electrical activity, at the earliest after 4 DIV (days in vitro) to at the latest 35 DIV in normal culture medium at a temperature of 35 ° C.
  • the 60 microelectrodes could be recorded simultaneously, which made it possible to test correlated activity in the cocultures.
  • the restoration of functional links between the explants was shown.
  • the electrodes had impedances of 100 to 300 k ⁇ (at 1 kHz), a distance of 500 ⁇ m and a diameter of 10 ⁇ m.
  • the activity was recorded at 10 to 25 kHz per channel, stored and analyzed offline for latency.
  • 5b shows a long-term stimulation over more than one hour, in which uniform responses were obtained on the different electrodes.
  • Each column shows the amplitude of the stimulus response to stimuli that was applied every 60 seconds to the electrode shown with a star.
  • FK506 - an immunosuppressor - that has been shown to have neuroprotective and neuroregenerative effects in the central and peripheral nervous system (Brecht and Herdegen, 1999, The New 'Twist': Inhibition of FKBP Rotamases as a Neuroregenerative and Neuroprotective Principle, Neuro Forum 5: 36-43), was added to the culture medium at 0 DIV in a concentration of 50 nM and administered again with each exchange of the culture medium to 14 DIV. The cocultures were tested for correlated activity and the percentage of explants that showed correlation across an entire group of treated explants was compared to controversies where no explant was treated with the drug.
  • correlated activity is understood to mean the regeneration of functional connections between the sections.

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Abstract

Es wird die Verwendung eines Elektrodenarrays vorgeschlagen, um in biologischem Material eine durch Wirksubstanzen oder physikalische Verfahren geförderte Regeneration zu untersuchen.

Description

Verwendung eines Elektrodenarrays
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Systemen zur Untersuchung von Regeneration, Synaptogenese und synaptischer Stabilität in biologischem Material, wie beispielsweise Zellen.
Die Erfindung steht ferner im Zusammenhang mit Verletzungen des Zentralen Nervensystems (ZNS) erwachsener Säugetiere, die beispielsweise durch Trauma, Ischämie oder neurodegenerative Krankheiten verursacht werden. Diese Verletzungen resultieren in schwerwiegenden und dauerhaften funktionalen Defiziten, die einer kurativen Behandlung bedürfen. Es ist bereits bekannt, daß im Gegensatz zu dem sich entwik- kelnden ZNS oder zu peripheren Nerven ZNS-Axone zu einem be- stiiriirvten Punkt in der Entwicklung ihre Fähigkeit verlieren, nach Axotomie zu regenerieren. Es wird vermutet, daß sich dieser Verlust durch die nicht-permessive Umgebung des ZNS und durch für die adulten ZNS-Neuronen intrinsische Faktoren ergibt.
Behandlungen, die zur neuralen Regeneration führen können, umfassen die Gabe von Wirksubstanzen, wie beispielsweise Pharma- ka, oder die Anwendung von physikalischen Verfahren, wie beispielsweise eine Elektrostimulation.
Bisher ist kein zuverlässiges Verfahren bekannt, mit dem die Bewertung von derartigen Behandlungen, die zu neuronaler Regeneration führen können, im Rahmen eines Modellsystemes ermöglicht wird, das Langzeitaufzeichnungen der physiologischen Aktivität mit morphologischen Veränderungen korreliert.
Li et al-, Enthorinal Axons Project to Dentate Gyrus in Organo- typic Slice Co-culture, NEUROSCIENCE 1993, Band 52, Seiten 799- 813 beschreiben eine organotypische Kokultur von entorhinalem Cortex und postnatalem Hippocampus, der von seinem eigenen en- torhinalen Eingang freipräpariert worden ist. Die Autoren zeigen in diesem in vitro-System auf immunhistochemische Weise die Bildung von entorhinalen Projektionen in den kokultivierten Hippocampus, wozu die Schnitte angefärbt und unter einem Mikroskop ausgewertet wurden. Die Autoren zeigen auch einige wenige elektrophysiologische Daten, die mit einer Anregungselektrode aus Wolfram und einer Meßelektrode aus Glas gewonnen wurden. Als Modellsystem für Langzeitaufzeichnungen ist das hier beschriebene Meßverfahren nicht geeignet.
Die Exklusivität der Verbindungen zwischen entorhinalem Cortex und Gyrus dentatus zeigen Li et al., Connectional Specification of Regenerating Entorhinal Projection Neuron Classes Cannot Be Overriden by Altered Target Availability in Postnatal Organotypic Slice Co-culture, EXPERIMENTAL NEUROLOGY, 1996, Band 142, Seiten 151-160, auf der anatomischen Ebene.
Baker et al., Chronic Blockade of Glutamate-mediated Bio- electric Activity in Long-term Organotypic Neocortical Explantε Differentially Effects Pyramidal/Non-pyramidal Dendritic Mor- phology, DEVELOPMENTAL BRAIN RESEARCH, 1997, Band 104, Seiten 31-39 zeigen Regeneration in einem anderen organotypischen Präparat, nämlich in Cortex-Cortex-Kokulturen. Auch hier wurden elektrophysiologische Daten unter Verwendung von Glas-Mikro- elektroden aufgenommen.
Nessler und Mass, Direct-current Electrical Stimulation of Ten- don Healing in vitro, CLINICAL ORTHOPAEDICS, 1987, Band 217, Seiten 303-312 berichten über die Möglichkeit, die Regeneration von Sehnen in vitro durch Gleichstrom zu stimulieren.
Darüber hinaus konnte Borgens, Electrically Mediated Regeneration and Guidance of Adult Mammalian Spinal Axons into Poly- meric Channels, NEUROSCIENCE, 1999, Band 91, Seiten 251-264 zeigen, daß ein extrazelluläres elektrisches Feld die Regeneration von Nervenfasern im adulten Säuger-Rückenmark fördert. Der insoweit beschriebene Stand der Technik zeigt also prinzipielle Modellsysteme, die für die Untersuchung der Regeneration in biologischem Material geeignet sind; zuverlässige Langzeitmessungen der physiologischen Aktivität und deren Korrelation mit morphologischen Veränderungen lassen sich mit dem im Stand der Technik beschriebenen Meßverfahren jedoch nicht durchführen.
Die erst nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlichte WO 00/79273 A2 beschreibt ein Verfahren, bei dem Hippocampus-Gewebe auf einem Mikroelektrodenarray angeordnet wird, über das das Nervengewebe stimuliert und die unterschiedliche Reaktion auf verschiedene Psychopharmaka gemessen wird.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zu schaffen, um Behandlungen, die zu neuraler Regeneration führen können, in einem Modellsystem zu bewerten, das Langzeitaufzeichnungen der physiologischen Aktivität mit morphologischen Veränderungen korre- liert .
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Elektrodenarrayε, um in biologischem Material eine durch Wirksubstanzen oder physikalische Verfahren geförderte Regeneration zu untersuchen, wobei als Elektrodenanordnung vorzugsweise eine Mikroelektrodenanordnung eingesetzt wird.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erkannt, daß sich in diesem Zusammenhang insbesondere organotypische Kulturen und Kokulturen von Gewebe des Zentralen Nervensystems dazu einsetzen lassen, die Entstehung und Regeneration von Verknüpfungen zwischen Zellen funktionell zu messen und die Wirkung von Phar- makagaben oder physikalischen Verfahren zur Aktivierung von Zellfunktionen zu untersuchen.
Unter Förderung der Regeneration wird im Rahmen dieser Anmeldung sowohl die Bewirkung als auch die Unterstützung der Regeneration verstanden.
Die Erfinder haben ferner erkannt und nachgewiesen, daß sich allgemein Elektrodenarrays, insbesondere Mikroelektrodenarrays, die z.B. beschrieben sind in Egert et al., A Novel Organotypic Long-term Culture of the Rat Hippocampus on Substrate Integra- ted Multielectrode Arrays, BRAIN RESEARCH PROTOCOLS, 1998, Band 2, Seiten 229-242, besonders gut für eine Langzeitmessung in derartigen Systemen eignen.
Durch Kombination organotypischer Kokulturen mit extrazellulärer Mikroelektrodenaufnahmetechnologie kann nämlich die Entwicklung neuer Verknüpfungen und ihre regenerative Fähigkeit auf einer funktioneilen Ebene in derselben Kultur für Tage bis Wochen wiederholend überwacht werden.
Organotypische Kulturen stellen in diesem Zusammenhang eine gute Alternative zu Tierversuchen für die Bearbeitung von Fragestellungen im Bereich der Regeneration dar. Das Kokulturmodell von Gyrus dentatus und entorhinalem Cortex bietet dabei eine günstige Ausgangsbasis. Aus der einleitend beschriebenen Literatur ist zu entnehmen, daß dieses Kokulturmodell in der Literatur gut morphologisch charakterisiert ist, wobei ferner die Analogie zur in vivo Situation nachgewiesen wurde. Elektrophysiologische Daten aus der Literatur sind jedoch kaum verfüg- bar, diese Daten können jetzt durch die erfindungsgemäße Verwendung des Mikroelektrodenarrays (im folgenden: MEA) bereitgestellt werden. Dabei ist weiter von Vorteil, daß zwischen den beiden Geweben eine einfache, monosynaptische Verschaltung mit klar definiertem Ausgangs- und Endpunkt besteht.
Zwischen dem Gyrus dentatus und dem entorhinalen Cortex existiert ein in der Literatur gut beschriebener perforant path- way, der durch diese monosynaptische Verschaltung teilweise dargestellt wird.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nun erstmals erkannt, daß es unter Einsatz von Mikroelektrodenarrays möglich ist, die Generation eines zuvor experimentell unterbrochenen perforant pathways sowohl während der juvenilen Phase, wo Regeneration auch im Zentralen Nervensystem noch relativ leicht möglich ist, als auch im ausdifferenzierten Zustand zu untersuchen. Die Verwendung der MEA-Technologie in Verbindung mit der beispielhaft erwähnten organotypischen Kultur bietet dabei die Möglichkeit, elektrophysiologisch die Aktivität über die gesamte Fläche eines Präparates über einen Zeitraum von Tagen und Wochen wiederholt zu bestimmen. Ebenso ist eine Elektrostimula- tion an reproduzierbar immer gleichen Stellen bei gleichzeitiger Ableitung in der gesamten restlichen Kokultur möglich, um eine Verbindung zwischen beiden Explantaten nachzuweisen.
Das erste Zusammenwachsen der Explantate geschieht dabei in der juvenilen Phase. Setzt man dann eine Läsion durch die neu entstandene Verbindung, nachdem die Kokultur einen ausdifferenzierten Zustand erreicht hat, so kann die Regeneration auch im adultähnlichen Zustand untersucht werden. Bei einer derartigen Langzeitüberwachung von 17 abgeleiteten Kokulturen auf einem MEA mit Elektroden, die einen Abstand von 200 μm und einen Durchmesser von 30 μm hatten, konnte gezeigt werden, daß zwölf dieser Kokulturen wieder zusammengewachsen waren. Sieben dieser zusammengewachsenen Kokulturen wurden lä- sioniert, wovon vier nach der Läsion noch vital waren.
Es konnte in einem Versuch gezeigt werden, daß bei Einsatz von FK506, einem Immunosuppressor, eine Kokultur den perforant pa- thway regenerierte.
Dies stellt nicht nur einen Test für das regenerative Potential der differenzierten Neuronen dar, vielmehr kann auch das regenerative Potential von Pharmaka und von physikalischen Verfahren zur Aktivierung von Zellfunktionen, z.B. durch funktioneile elektrische Stimulation, getestet werden. Dies kann beispielsweise durch direkte elektrische Stimulation oder das Anlegen eines elektrischen oder elektromagnetischen Feldes erfolgen, was ebenfalls mit Hilfe eines MEA durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß werden die Pharmaka oder Wirksubstanzen dabei ausgewählt aus der Gruppe: organische oder chemische Verbindungen sowie biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Pep- tide, Proteine, Nukleinsäuren, wobei das biologische Material sowohl juvenile Zellen als auch Zellen im adultähnlichen Zustand umfassen kann.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung kann jetzt die Regeneration von interzellulären Verknüpfungen, die funktioneile Verschaltung oder Wiederverschaltung zwischen Neuronen, ein zeitlicher Verlauf von entstehenden Verknüpfungen oder Wiederver- Schaltungen sowie die Regeneration von bezüglich ihrer interzellulären Verknüpfungen geschädigten Zellen untersucht werden.
Erfindungsgemäß kann ferner an Kulturen und Kokulturen die Regeneration wiederholt über einen längeren Zeitraum von vorzugsweise mehr als einer Woche beobachtet werden. Ferner ist es möglich, die Reaktionen von Rezeptorsystemen auf die Gabe von Wirkstoffen zu untersuchen.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Anmeldung auch ein Verfahren zur Untersuchung von Pharmakawirkung auf das Regenerationspotential von funktioneilen Verschaltungen in Kulturen, bei dem ein Elektrodenarray vorzugsweise wie oben beschrieben verwendet wird.
Dabei ist es zunächst notwendig, pharmakologisch zu überprüfen, welche Rezeptorsysteme in der Kokultur bspw. für die Verknüpfung vom entorhinalen Cortex in den Gyrus dentatus wichtig sind. Dazu muß die Wirkung von Antagonisten der verschiedenen potentiell relevanten Rezeptoren auf die Aktivität in zusammengewachsenen Kokulturen getestet werden.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den folgenden Ausführungs- beispielen und im Zusammenhang mit der Zeichnung, in der: Fig. 1 eine schematische Darstellung der in vivo Situation zwischen entorhinalem Cortex (ec) und Gyrus dentatus (dg) zeigt;
Fig. 2 die Präparation von Kokulturen auf einem Mikro- elektrodenarray zeigt;
Fig. 3 die elektrische Stimulation an Kokulturen wie in Fig. 2 zeigt;
Fig. 4 die Wiederherstellung von funktionalen Verbindungen in einer Kokultur wie in Fig. 2 zeigt; und
Fig. 5 die elektrische Stimulation elektrogener Zellen im Zellverband auf einem MEA zeigt.
Beispiel 1 : Messungen an einer Kokultur
Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung der in vivo-Situation zwischen entorhinalem Cortex (ec) und Gyrus dentatus (dg). Mit pp ist ein Teil des perforant pathways gezeigt, der während der Präparation an der gestrichelt dargestellten Linie geschnitten wird. CA1 und CA3 bezeichnen Felder des Hippocampus.
Schnitte von entorhinalem Cortex und Gyrus dentatus, die 6 bis 7 Tage alten Wistar-Ratten oder BalbC-Mäusen entnommen wurden, wurden auf einem Mikroelektrodenarray von 60 substrat-inte- grierten Elektroden kultiviert. Die Elektroden hatten einen Ab- stand von 200 μm und einen Durchmesser von 30 μm. Die Stimulation der Schnitte und die Aufzeichnung der elektrophysiologi- schen Aktivität wurde durch die Verwendung eines MCS-Verstär- kers und eines Daten-Akquisitionssystems (Multi Channel Systems, Deutschland) erzielt, das die Verwendung jeden Kontakts als Stimulations- oder AufZeichnungselektrode ohne Manipulation des Schnittes ermöglicht. Die Daten wurden online von allen 60 Kanälen bei einer Abtastfrequenz von 25 kHz/Kanal aufgezeichnet .
Fig. 2 zeigt eine derartige Präparation der Kokulturen, für die horizontale Gehirnschnitte (425 μm) verwendet wurden. Von den Gehirnschnitten wurden der entorhinale Cortex-Teil und der korrespondierende Gyrus dentatus abgetrennt, die den Ursprung und das Zielgewebe eines Teils des preferant pathways repräsentieren. Die Schnitte, die während der Präparation gemacht wurden, sind in Fig. 2a gestrichelt dargestellt.
Die beiden Explantate wurden dann ähnlich der in vivo-Situation auf einem Mikroelektrodenarray mit einem 8x8-Feld von extrazellulären Elektroden positioniert. Fig. 2b zeigt eine Kokultur unmittelbar nach Präparation.
Beginnend vom siebten Tag in vitro (DIV7), wurden alle drei Tage sowohl die gesamte spontane Aktivität der Kokulturen als auch die Reaktion auf extrazelluläre elektrische Stimulation der Schicht II des entorhinalen Cortex und des Stratum granulo- sum des Gyrus dentatus überwacht. Zusätzlich markierte Dil-Färbung ( 1 , l-Dioctadecyl-3 , 3 , 3 , 3- Tetramethylindocarbocyanin perchlorat; Honig and Hume, Fluores- cent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Ori- gine to be Studied in Long-term Cultures, J. CELL. BIOL. 1986, Band 103, Seiten 171-187) des dg retrograd die Zellen in Schicht II des ec .
Fig. 3 zeigt die extrazelluläre Stimulation einer Kokultur von ec und dg, wobei Fig. 3a die Morphologie der Kokultur nach 7 Tagen in vitro (DIV7) angibt. Fig. 3b zeigt die Reaktion an allen MEA-Elektroden nach elektrischer Stimulation in Schicht II- III des ec (80 μA, 150 μs).
Die funktioneile Wiederherstellung von Verbindungen in kokultivierten Explantaten von dg und ec juveniler Ratten oder Mäuse ist in Fig. 4 gezeigt. Nach 7 Tagen in vitro ist es möglich, Aktivität in dem dg über elektrische Stimulation in dem ec hervorzurufen (Fig. 4a), nicht aber umgekehrt (Fig. 4b). Dies korrespondiert mit der in vivo-Situation in der ec-Schicht II- Zellen in den dg projizieren.
Von 112 untersuchten Kulturen zeigten 85 diese einseitig gerichtete Verbindung, 20 eine beidseitige Verbindung und 7 gar keine Verbindung.
Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, daß unabhängig vom Verlust des intermediären subikularen Gewebes die Axone des entorhinalen Cortex korrekte und funktioneile Verknüpfungen mit dem Gyrus dentatus ausbilden, die dem in vivo bekannten perforant pathway ähnlich sind. Es ist unwahrscheinlich, daß die beobachteten Verknüpfungen aus unspezifischem axonalem Sprießen entstammen, denn die dg-Axone zeigen ebenfalls extensiven Auswuchs aus dem Explantat, stellen aber keine funktionellen Verknüpfungen mit dem Cortex her.
Die so etablierte, verknüpfte Kokultur entwickelt sich jetzt in vitro zu einem adultähnlichen Stadium, woraufhin die neu hergestellten Verbindungen dann lädiert werden.
An diesen Läsionen kann dann das regenerative Potential der differenzierten Neuronen sowie die Förderung, also Bewirkung oder Unterstützung der Regeneration durch Pharmaka oder physikalische Verfahren, getestet werden.
Beispiel 2 : Untersuchungen bei verschiedenen Stufen der Regeneration
Neuritenwachstum:
Neuroproduktive oder regenerationsfordernde Stoffe, die direkt auf die Ausgangszellen in Schicht II des ec wirken, können eine Regeneration des bereits einmal in vitro etablierten pathways ermöglichen, die im ausdifferenzierten Zustand normalerweise nicht möglich ist.
Hier besteht die experimentelle Möglichkeit, nach Läsion beispielsweise FK506 ins Kulturmedium zu applizieren. Dabei ist wichtig, daß die Kultur ein ausreichendes Alter erreicht hat, um entwicklungsbedingtes Wachsen der Neuriten auszuschließen. Dies ist nach DIV7 oder älter der Fall. Zielfindung
Die durch den Neuropilin I-Rezeptor vermittelte repulsive Wirkung von Semaphorin III trägt mit hoher Wahrscheinlichkeit zur korrekten, zielgerichteten Verschaltung von dg und ec bei.
Experimentell besteht die Möglichkeit, mit me brangängigen Pep- tiden die fragliche Signalkaskade zu hemmen und die Semaphorin III-Wirkung zu unterbinden. Die Peptide werden direkt nach Präparation ins Kulturmedium gegeben, so daß eine Läsion nicht erforderlich ist.
Svnaptoqenese
Es hat sich ergeben, daß für die korrekte Anordnung der Rezeptoren und anderen Membranproteine in der Synapse die Interaktion mit intrazellulären Proteinen essentiell ist. Viele dieser intrazellulären Proteine teilen ein gemeinsames Motiv, die sogenannte PDZ-Bindungsstelle, mit der sie an die Membranproteine binden. Die funktionelle Relevanz dieser Interaktionen ist noch weitgehend unbekannt, sie läßt sich jedoch mit dem hier beschriebenen Meßverfahren untersuchen.
Auch hier läßt sich die Interaktion der Rezeptoren mit den PDZ- Proteinen durch membrangängige PDZ-Antagonisten hemmen, was während des Zusammenwachsens oder danach erfolgen kann. Dies bietet die Möglichkeit, an einem Schnitt die Situation vorher/ nachher zu vergleichen (interne Kontrolle). Beispiel 3: Immunhistochemische und elektrophysiologische Untersuchung
Organotypische kortikale Kokulturen (350-425 μm dick, vom Neo- cortex) wurden von drei bis sieben Tage alten Wistar-Ratten jeden Geschlechts präpariert und in vitro unter Verwendung der Roller-Tube-Technik aufrechterhalten; siehe hierzu Gähwiler, Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue, J. NEURO- SCIENCE METHODS, 1981, Band 4, Seiten 329-342. Die Kokulturen wurden für bis zu 35 Tage entweder auf Glasdeckgläschen oder auf Mikroelektrodenarrays in Medium wachsen gelassen, das 50 % basisches Eagle-Medium, 25 % Hanks-gepufferte Salzlösung, 25 % Pferdeserum, 33 mM D-Glukose und 1 mM L-Glutamin enthielt. Das Medium wurde zweimal die Woche ausgetauscht, die Kokultur- Explantate mit variierten Orientierungen und variierten Abständen (0 bis 500 μm) zueinander plaziert.
Die auf Glasdeckgläschen kultivierten Explantate wurden in gepuffertem 4%igem Paraformaldehyd für zwei Stunden fixiert, gewaschen, in gepuffertem 0,l%igem Triton X-100 behandelt, wieder gewaschen und in l%igem bovinem Serumalbumin (BSA) und 0,l%igem Ziegenserum präinkubiert , um nicht-spezifische Bindung zu verhindern.
Die Kulturen wurden für 3 bis 9 Tage mit primärem Antikörper in l%iger gepufferter BSA-Lösung inkubiert. Nach vier- bis fünftägigem Waschen in Puffer wurden die Kulturen mit einem sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Maus IgG, CY3 ) für drei bis fünf Tage inkubiert und hinterher für vier bis fünf Tage gewaschen. Die Explantate wurden auf Objektträger gebracht, auf Fluoreszenz betrachtet und fotografiert. Die Kontrollen bestanden aus Explantaten, die nur mit dem sekundären Antikörper inkubiert wurden. Primäre Antiseren (Boehringer, Mannheim) waren monoklo- nale Antikörper, die zu Arbeitslösungen von 0,5 μg/m und 1 μg/ml für Anti-GAP-43 bzw. Synaptophysin verdünnt wurden.
Nissl-Färbungen wurden verwendet, um die Morphologie der Explantate zu beurteilen. Die Kokulturen wurden fixiert, dehydriert, in Toluidin-Blau gefärbt, auf Objektträger gebracht und fotografiert.
Die auf Mikroelektroden-Arrays kultivierten Explantate wurden zu verschiedenen Zeitpunkten bezüglich spontaner elektrischer Aktivität aufgezeichnet, frühestens nach 4 DIV (Tage in vitro ) bis spätestens 35 DIV in normalem Kulturmedium bei einer Temperatur von 35 °C. Unter Verwendung eines Multikanal-Aufzeich- nungssystemes konnten die 60 Mikroelektroden simultan aufgezeichnet werden, wodurch es möglich wurde, in den Kokulturen korrelierte Aktivität zu testen. Dabei zeigte sich die Wiederherstellung funktioneller Verknüpfungen zwischen den Explantaten. Die Elektroden hatten Impedanzen von 100 bis 300 kΩ (bei 1 kHz), einen Abstand von 500 μm und einen Durchmesser von 10 μm. Die Aktivität wurde bei 10 bis 25 kHz pro Kanal aufgezeichnet, gespeichert und offline bezüglich Latenz analysiert.
Während die Explantate mit Karbogen-äquilibriertem ACF, bestehend aus (jeweils in ml/1) 125 NaCl, 3,5 KC1, 1,3 MgS04, 1,2 KH2P04 , 2,4 CaCl2, 26 NaHC03, 10 Glukose (pH 7,4), bei einer Durchflußrate von ungefähr 0,5 ml/min perfundiert wurden, wurde die Neuronensensitivität auf verschiedene Kanalblocker und Re- zeptor-Agonisten und -Antagonisten getestet. Die Explantate wurden nach den pharmakologischen Experimenten verworfen. Fig. 5 zeigt eine elektrische Stimulation elektrogener Zellen im Zellverband auf einem Mikroelektrodenarray, wie es bei den hier beschriebenen Versuchen eingesetzt wurde. Fig. 5a zeigt einfache Antworten in einer organotypischen Hippocampuskultur nach 17 Tagen in vitro bei monopolarer elektrischer Stimulation über die mit einem Stern gekennzeichnete MEA-Elektrode . Stimulationsartefakte sind nicht gezeigt.
Fig. 5b zeigt eine Langzeitstimulation über mehr als eine Stunde, bei der auf den verschiedenen Elektroden gleichmäßige Antworten erhalten wurden. Jede Säule zeigt die Amplitude der Reizantwort auf Stimuli, die alle 60 Sekunden bei der mit Stern gezeigten Elektrode appliziert wurde.
Beispiel 4 : Testen von FK506
FK506 - ein Immunosuppressor -, für den gezeigt wurde, daß er neuroprotektive und neuroregenerative Effekte im zentralen und peripheren Nervensystem hat (Brecht und Herdegen, 1999, Der neue 'Dreh': Hemmung von FKBP-Rotamasen als neuroregeneratives und neuroprotektives Prinzip, Neuroforum 5:36-43), wurde zum Kulturmedium bei 0 DIV in einer Konzentration von 50 nM zugegeben und mit jedem Austausch des Kulturmediums bis 14 DIV wieder verabreicht. Die Kokulturen wurden auf korrelierte Aktivität getestet, und der prozentuale Anteil der Explantate, der innerhalb einer gesamten Gruppe der behandelten Explantate Korrelation zeigte, wurde mit Kontroiläufen verglichen, bei denen kein Explantat mit dem Wirkstoff behandelt wurde.
In der unbehandelten Kontrolle (n = 28) zeigten sich nach 14 Tagen in vitro bei ca. 60 % eine korrelierte Aktivität, während sich bei den mit FK506 behandelten Explantaten (n = 18) eine korrelierte Aktivität von nahezu 90 % nachweisen ließ. Unter "korrelierter Aktivität" wird in diesem Zusammenhang die Regeneration von funktioneilen Verbindungen zwischen den Schnitten verstanden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Elektrodenarrays, um in biologischem Material eine durch Wirksubstanzen oder physikalische Verfahren geförderte Regeneration zu untersuchen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der als Elektrodenanordnung ein Mikroelektrodenarray eingesetzt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , bei der die Wirksubstanzen ausgewählt sind aus der Gruppe: organische oder chemische Verbindungen sowie biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Peptide, Proteine, Nukleinsäuren.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , bei der Regeneration von interzellulären Verknüpfungen untersucht wird.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , bei der die funktioneilen Verschaltungen oder Wiederverschaltungen zwischen Neutronen untersucht werden.
6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, bei der ein zeitlicher Verlauf von entstehenden Verknüpfungen oder Wiederverschaltungen untersucht wird.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei der die Regeneration von bezüglich ihrer interzellulären Verknüpfung geschädigten Zellen untersucht wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der an Kulturen und Kokulturen die Regeneration wiederholt über einen längeren Zeitraum von vorzugsweise mehr als einer Woche beobachtet wird.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das biologische Material juvenile Zellen umfaßt.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das biologische Material Zellen im adultähnlichen Zustand umfaßt.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der Reaktionen von Rezeptorsystemen auf Gabe der Wirkstoffe untersucht werden.
12. Verfahren zur Untersuchung von Pharmakawirkungen auf das Regenerationspotential von funktionellen Verschaltungen in Kulturen, bei dem ein Elektrodenarray eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem eine Verwendung eines Elektrodenarrays wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 erfolgt.
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