DE602004013431T2

DE602004013431T2 - Identifikation von therapeutische verbindungen.

Info

Publication number: DE602004013431T2
Application number: DE602004013431T
Authority: DE
Inventors: Peter Hadstock RICHARDSON
Original assignee: Cambridge Biotechnology Ltd
Current assignee: CBT Development Ltd
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2024-03-06
Also published as: DE602004013431D1; WO2004079329A3; JP2006519602A; ATE393917T1; ES2305741T3; GB0305153D0; PT1604211E; PL1604211T3; SI1604211T1; JP4701330B2; AU2004217731B2; EP1604211A2; EP1604211B1; CA2514338A1; AU2004217731A1; US20070059773A1; DK1604211T3; CY1108540T1; WO2004079329A2

Description

Diese Erfindung betrifft die Identifizierung von potenziellen Therapeutika.
In normalen Säugergeweben wird der extrazelluläre pH-Wert zwischen einem pH-Wert von 7,35 und 7,45 fest eingestellt. Einige Gewebe zeigen niedrigere pH-Werte, insbesondere das Lumen des Magens (pH-Wert zwischen 2 und 3) und die Oberflächen einiger Epithelia (zum Beispiel ist der pH-Wert der Lungenoberfläche ungefähr 6,8, Jayaraman, S. et al. (2001) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, C1504–1511).
In pathologischen Geweben kommt es zum Beispiel während einer Entzündung, Ischämie und anderen Schädigungsarten zu einer Absenkung des pH-Wertes. Beispielsweise sind im arthritischen Gelenk Absenkungen des pH-Wertes von bis zu 1 Einheit typischerweise feststellbar (Andersson, S. E. et al. (1999) J. Rheumatol. 26, 2018–2024). Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass Knorpel bzw. Knorpelgewebe in osteoarthritischen Gelenken pH-Werte von nur 5,0 (Konttinnen, Y. T. et al., (2002) Arth. Rheum. 46, 953–960) zeigt. Eine übermäßige neuronale Aktivität kann auch zu einer Verringerung des extrazellulären pH-Wertes führen. Zum Beispiel waren epileptische Entladungen und eine Überstimulierung des Rückenmarks mit Veränderungen des extrazellulären pH-Wertes verbunden (Cheslar, M. Prog. Neurobiol. (1990) 34, 401–427). Ebenso sind Absenkungen im extrazellulären pH-Wert in soliden Tumoren festgestellt worden, wo pH-Werte von nur 5,5 festgestellt wurden, vermutlich als eine Folge einer schlechten Durchblutung und des Vorherrschens eines glykolytischen Metabolismus (Thistlewthaite, A. J. et al. Radiation Oncology Biol. Phys. (1985) 11, 1647–1652). Bei Ischämie führt der Mangel an Blutzufuhr zu einem Absinken des pH-Werts (Immke, D. C. & McCleskey, E. W. (2001) Nature Neurosci. 4, 869–870) und einer nachfolgenden entzündlichen Zellaktivierung.
Ein gemeinsamer Faktor bei all diesen Erkrankungen und Zuständen ist der, dass der Energiebedarf der betroffenen Gewebe die Versorgung übersteigt. Dies führt zu einem anaeroben Metabolismus mit der Produktion von Milch- und Pyruvinsäure. Ein weiterer zu den pH-Veränderungen beitragender Faktor ist das Entleeren von sekrotorischen Vakuolen (zum Beispiel in Nervenenden oder entzündlichen Zellen) in den extrazellulären Raum, da die Inhalte dieser Vakuolen auf einem niedrigen pH-Wert gehalten werden. Die Verringerung des pH-Werts kann zum Schutz des Gewebes beitragen. Zum Beispiel wird der NMDA-Rezeptor im ZNS (zentralen Nervensystem), der bei einer ischämischen Schädigung stark beteiligt war, bei einem pH-Wert von 6,8 inhibiert.
Ein weiterer gemeinsamer Faktor bei den oben genannten Erkrankungen ist Adenosin. Adenosin ist ein überall vorkommendes lokales Hormon/Neurotransmitter, das/der auf vier bekannte Rezeptoren, nämlich die Adenosion A1-, A2A-, A2B- und A3 Rezeptoren, einwirkt. Adenosin dient allgemein dazu, die Versorgung und den Bedarf an Energie in Geweben ins Gleichgewicht zu bringen. Zum Beispiel verlangsamt im Herzen freigesetztes Adenosin das Herz durch eine A1-Rezeptor-vermittelte Aktion in den Knoten und Vorhöfen (Belardinelli, L & Isenberg, G. Am. J. Physiol. 224, H734–H737), unter gleichzeitiger Erweiterung der Koronararterie zur Erhöhung der Energie-(d. h. Glukose-, Fett- und Sauerstoff-)Versorgung (Knabb et al., Circ. Res. (1983) 53, 33–41). Desgleichen dient während der Entzündung Adenosin dazu, die entzündliche Aktivität zu inhibieren, während bei Zuständen einer übermäßigen Nervenaktivität (z. B. Epilepsie) Adenosin das Nervenfeuern hemmt (Klitgaard et al., Eur. J. Pharmacol. (1993) 242, 221–228). Dieses System oder eine Variante davon ist in allen Geweben vorhanden. Somit dient unter Bedingungen, unter denen der pH-Wert abfällt, lokales Adenosin dazu, den Energievorrat und -bedarf ins Gleichgewicht zu bringen, wodurch die normale Gewebefunktion und der pH-Wert wiederhergestellt werden.
Adenosin selbst kann zur Diagnose und Behandlung supraventrikulärer Tachykardie verwendet werden. Adenosin-A1-Rezeptoragonisten sind dafür bekannt, dass sie als starke Analgetika fungieren (Sawynok, Eur. J. Pharmacol. (1998) 347, 1–11). Adenosin-A2A-Rezeptoragonisten fungieren bekanntermaßen als entzündungshemmende Mittel (zum Beispiel von der US 5 877 180 und der WO 99/34804 ). Bei Versuchstieren wurde nachgewiesen, dass A2A-Rezeptoragonisten gegen eine große Vielzahl von Zuständen, einschließlich Sepsis, Arthritis und Ischämie/Reperfusionsschädigung, die von einem renalen, koronaren oder zerebralen Arterienverschluss herrühren, wirksam sind. Der gemeinsame Faktor bei diesen Zuständen ist eine Verringerung der entzündlichen Anwortreaktion, die durch die inhibitorische Wirkung dieses Rezeptors auf die meisten, wenn nicht alle, entzündlichen Zellen verursacht wird.
Jedoch bedeutet die überall vorkommende Verteilung von Adenosinrezeptoren, dass die Verabreichung von Adenosinrezeptoragonisten schädliche Nebenwirkungen verursacht. Dies schloss allgemein die Entwicklung von Therapien auf Adenosin-Basis aus. Selektive A1-Rezeptoragonisten verursachen Bradykardie. Der erste selektive A2A-Rezeptoragonist gegen (2-[4-(2-Carboxyethyl)phenylethylamino]-5'-N-ethylcarboxamidoadenosin oder CGS21680) wurde in einem klinischen Phase-2A-Versuch als potenzielles blutdrucksenkendes Mittel getestet. Allerdings verursachte die Verabreichung einen starken Abfall des Blutdrucks und eine Zunahme der Herzleistung.
Die FR2162128 offenbart, dass Adenosinderivate (einschließlich 2-Alkoxyadenosinderivate, welche eine Niederalkylgruppe von nicht weniger als zwei Kohlenstoffatomen umfassen) eine hyptotensive und koronare Gefäße erweiternde Aktivität besitzen.
Bartlett et al. (J. Med. Chem. 1981, 24, 947–954) offenbart die Evaluierung von Analoga von 1-Methylisoguanosin. Diese Analoga schließen 2-Methoxyadenosin (auch als Spongosin bekannt) ein. Diese und andere Verbindungen wurden auf ihre skeletalen, muskelentspannenden, hypothermalen, kardiovaskulären und entzündungshemmenden Wirkungen bei Nagern im Anschluss an die orale Verabreichung getestet. 2-Methoxyadenosin verursachte eine 25%ige Inhibierung einer Karragheen-induzierten Entzündung bei Ratten bei 20 mg/kg po. Jedoch waren Verringerungen im mittleren Blutdruck (41%) und bei der Herzrate (25%) ebenfalls nach der Verabreichung dieser Verbindung bei dieser Dosis feststellbar.
Kirk und Richardson (British Journal of Pharmacology (1995) 114, 537–543) beschreiben die Charakterisierung von [3H]-CGS 21680-Bindungsstellen im Striatum und Kortex der Ratte.
Die WO 96/38728 offenbart ein Verfahren zum Messen der A2a-Rezeptorbindungsaktivität von Verbindungen von pharmakologischem Interesse durch die Verwendung des tritiummarkierten Liganden (³H)-SCH58261.
Jiang et al. (J. Med. Chem. 1997, 40, 2588–2595) beschreiben die Verwendung von sequenzgerichteter Mutagenese in den transmembranen spiralförmigen Domänen des humanen A2_A-Adenosinrezeptors zur Untersuchung der Struktur-Aktivität-Beziehungen für die Ligandenbindung.
Ribeiro et al. (Progress in Neurobiology 68 (2003) 377–392) ist eine Übersicht der Adenosinrezeptoren im Nervensystem, und Kommentare, dass periphere Nebenwirkungen, die mit Adenosinrezeptoragonisten vergesellschaftet sind, schränken deren Nützlichkeit in Therapeutika ein.
Es besteht daher ein Bedarf für die Bereitstellung von Adenosinrezeptoragonisten, die mit minimalen Nebenwirkungen verabreicht werden können.
Askalan und Richardson (J. Neurochem. (1994) 63: 1477–1484) beschreiben die Rolle von Histidinresten an der Adenosin-A2A-Rezeptorligand-Bindungsstelle. Insbesondere wurde die pH-Abhängigkeit der Bindung von Liganden untersucht. Eine zwei- bis vierfache Zunahme der Affinität wurde für einige Liganden bei der Absenkung des umgebenden pH-Wertes von 7,0 auf 5,5 festgestellt. Allerdings wurde die Wirkungsweise von Adenosin-A2A-Rezeptoren nicht untersucht.
Hiley et al. (British Journal of Pharmacology (1995) 116, 2641–2646) untersuchten die Wirkungen des pH-Wertes auf Antwortreaktionen auf Adenosin in dem isolierten perfusionierten, oberen mesenterialen artieriellen Bett der Ratte. Eine Reduzierung des pH-Wertes des Perfusats auf 6,8 erhöhte die Dilator-Antwortreaktionen auf Adenosin um das 10-fache.
Der Anmelder fand nun überraschend heraus, dass bei relativ niedrigen pH-Werten innerhalb des physiologischen Bereichs einige Verbindungen eine wesentlich höhere (ungefähr 100-fach höhere) Affinität für und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren besitzen als bei höheren pH-Werten. Es wird angenommen, dass dies daran liegt, weil die Rezeptoren ihre Konformation als Reaktion auf Veränderungen des pH-Wertes verändern.
Der Anmelder ist zu dem Schluss gelangt, dass die pH-Empfindlichkeit von Adenosinrezeptoren zur Identifizierung anderer Adenosinrezeptorliganden genutzt werden kann, die nur eine hohe Rezeptoraffinität und/oder Wirksamkeit unter den Bedingungen eines niedrigen pH-Werts besitzen. Die Wirkungen solcher Adenosinrezeptorliganden können dann auf Regionen mit niedrigem pH-Wert als Ziel gerichtet werden, wie pathologische Gewebe, ohne die ernsten Nebenwirkungen, die mit der Verabreichung bekannter Adenosinrezeptorliganden vergesellschaftet sind, zu verursachen.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren eines potenziellen Therapeutikums bereitgestellt, welches das Bestimmen der Affinität und/oder Wirksamkeit einer Testverbindung für einen Adenosinrezeptor bei einem höheren pH-Wert von mindestens pH 7,4 und auch bei einem niedrigeren pH-Wert von 5,5 bis 7,2, oder von 5,0 bis 7,0 und das Identifizieren der Verbindung als das genannte Mittel umfasst, wenn die Affinität und/oder Wirksamkeit bei dem niedrigeren pH-Wert höher als diejenige bei dem höheren pH-Wert ist.
Es ist bevorzugt, dass der Unterschied zwischen der Affinität des potenziellen Therapeutikums für und/oder dessen Wirkung bei dem Adenosinrezeptor bei dem niedrigeren oder höheren pH-Wert so hoch wie möglich ist. Wo es einen großen Unterschied in der Affinität und/oder Wirksamkeit gibt, wird erwartet, dass das Agens in einer Dosierung verabreicht werden kann, bei welcher es nützliche therapeutische Wirkungen besitzt und jegliche mit höheren Dosen des Agens zusammenhängenden Nebenwirkungen vermieden oder minimiert werden. Vorzugsweise ist die Affinität und/oder Wirksamkeit bei dem niedrigeren pH-Wert um über das 10-Fache, stärker bevorzugt über das 100-Fache, am meisten bevorzugt über das 1000-Fache höher als die Affinität und/oder Wirksamkeit bei dem höheren pH-Wert.
Agonisten, die eine höhere Affinität und/oder Wirksamkeit bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können in der Therapie nützlich sein, zum Beispiel bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von Schmerz, insbesondere von neuropathischem oder chronischem entzündlichen Schmerz und Arthritis. Die Selektivität dieser Agonisten bedeutet, dass sie auf pathologische Gewebe, zum Beispiel auf artbritische Gelenke als Ziel gerichtet werden können, wodurch die wirksame Verabreichung niedrigerer Dosen als durch den Stand der Technik vorgeschlagen ermöglicht wird und Nebenwirkungen minimiert werden.
Verfahren der Erfindung können zur Identifizierung von Liganden angewandt werden, die nur an den Adenosin-A2A-Rezeptor mit hoher Affinität bei einem niedrigen pH-Wert binden, wenn der Rezeptor eine andere Konformation als die bei einem pH-Wert von 7,4 existierende annehmen soll. Da diese Liganden nur wirksame Agonisten bei einem niedrigen pH-Wert sind, können sie nur an Stellen innerhalb des Körpers fungieren, wo der pH-Wert abgesenkt ist, ganz besonders in der Gelenkkapsel von Arthritis und an ähnlichen entzündlichen Schmerzstellen.
Verfahren der Erfindung können zur Identifizierung von Liganden angewandt werden, die nur an den Adenosin-A1-Rezeptor mit hoher Affinität bei einem niedrigen pH-Wert binden. Solche Liganden sollen bei der Herabsetzung einer übermäßigen Gewebeaktivität, zum Beispiel Nervenaktivität, nützlich sein und verminderte Nebenwirkungen im Vergleich mit bekannten Adenosin-A1-Rezeptoragonisten haben. Nebenwirkungen der bekannten Agonisten schließen Bradykardie und Arteritis ein.
Verfahren der Erfindung können zur Identifizierung von Liganden angewandt werden, die nur an den Adenosin-A3-Rezeptor mit hoher Affinität bei einem niedrigen pH-Wert binden. Solche Liganden sollen bei der Behandlung von entzündlichen Leiden nützlich sein.
Auf Basis der hierin gegebenen Informationen kann ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet geeignete Wirkstoffe für die Behandlung spezifischer Erkrankungszustände identifizieren. Diese Agenzien wären in dem pathologischen Gewebe selektiv aktiv, wodurch die Wahrscheinlichkeit und Schwere von Nebenwirkungen, die mit Rezeptoren in normalem Gewebe vergesellschaftet sind, verringert wird.
Bei isoliertem Gewebe und Zellpräparaten kann die pH-Empfindlichkeit genau gemessen werden. Aus diesem Grund dienen, nachdem in Tiermodellen der Pathologie Nachweise erhalten wurden (zum Beispiel entzündlicher Schmerz) Verbindungen, die das entsprechende Kriterium erfüllen, als "Treffer" für die nachfolgende Arzneistofffindung.
Verbindungen, die mit Hilfe von Verfahren der Erfindung identifiziert werden, sollen bei der Therapie, einschließlich der Prophylaxe, von verschiedenen Zuständen von Nutzen sein. Diese schließen Erkrankungen oder Zustände ein, bei welchen die Prävention, Behandlung oder Linderung der Erkrankung oder des Zustands durch Aktivierung von Adenosinrezeptoren vermittelt wird. Beispiele schließen Erkrankungen oder Zustände ein, bei welchen der lokale Energiebedarf von Gewebe die Versorgung übersteigt und/oder der pH-Wert sinkt, wie Entzündung, Ischämie-Reperfusionsschädigung, übermäßige neuronale Aktivität (zum Beispiel bei Epilepsie oder chronischem Schmerz oder Hyperalgesie, einschließlich entzündlicher und neuropathischer Schmerz), Sepsis, septischen Schock, Neurodegeneration (einschließlich Alzheimer-Krankheit), und andere Zustände, bei denen der Energiebedarf die Versorgung übersteigt, zum Beispiel Muskelermüdung oder Muskelkrampf bei Sportlern.
Verbindungen, die mit Hilfe von Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von Schmerz, insbesondere der folgenden Schmerztypen wirksam sein: Darmschmerz, Pankreasschmerz, Becken-/perinealer Schmerz, Rückenschmerz, Schmerzen im unteren Rücken, Brustschmerz, Herzschmerz, Beckenschmerz/PID, Gelenkschmerz (zum Beispiel vergesellschaftet mit Tendonitis, Bursitis, akuter Arthritis), Hals- bzw. Nackenschmerz, obstetrischer Schmerz (Wehen oder Kaiserschnitt), Krebsschmerz, HIV-Schmerz, Phantom-Gliederschmerz, postoperativer Schmerz, chronischer neuropathischer Schmerz, Schmerzen durch eine misslungene Rückenoperation, postphysischer Traumaschmerz (einschließlich Schmerz, der durch eine Schusswunde, einen Verkehrsunfall oder eine Verbrennung verursacht wird), Narbengewebeschmerz, akuter Herpes-Zoster-Schmerz, akuter Pankreatitis-Durchbruchschmerz (Krebs), Post-Herpes-Neuralgie, trigeminale Neuralgie.
Verbindungen, die mit Hilfe von Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von neuropathischen oder anderen Schmerzen, die durch diabetische Neuropathie, Polyneuropathie, Fibromyalgie, Costen-Schmerzsyndrom, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Hexenschuss oder lumbale Radikulopathie, spinale Stenose, temporomandibulares Gelenkleiden, Nierenkolik, Dysmenorrhoe/Endometriose verursacht werden oder damit vergesellschaftet sind, wirksam sein.
Verbindungen, die mit Hilfe von Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von entzündlichem oder anderem Schmerz wirksam sein, der durch arthritische Zustände, wie Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, rheumatoide Spondylitis, gichtartige Arthritis oder Asthma, chronische obstruktive pulmonare Erkrankung, Fibrose, Multiple Sklerose, Sepsis, septischen Schock, endotoxischen Schock, Gram-negativen Schock, toxischen Schock, hämorraghischen Schock, ARDS-Schocklunge, zerebrale Malaria, Organtransplantatabstoßung, Krebssekundärschmerz, HIV, chronische pulmonare entzündliche Erkrankung, Silikose, pulmonare Sarkose, Knochenresorptionserkrankungen, Reperfusionsschädigung, Transplantat-versus-Wirt-Abstoßung, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Allotransplantat-Abstoßungen, Fieber und Myalgie infolge von Infektion, AIDS-verwandten Komplex (ARC), Keloid-Bildung, Narbengewebebildung, Crohn-Krankheit, ulzerative Kolitis und Pyresis, Reizdarmsyndrom, Osteoporose, zerebrale Malaria, bakterielle Meningitis oder schädliche Wirkungen durch Amphotericim-B-Behandlung, Interleukin-2-Behandlung, OKT3-Behandlung oder GM-CSF-Behandlung verursacht wird oder damit vergesellschaftet ist.
Verbindungen, die durch ein Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von speziellen Entzündungsarten, einschließlich Arthritis (besonders an der Gelenkkapsel von Arthritis), Asthma, Psoriasis und Darmentzündung, besonders wirksam sein.
Verbindungen, die mit Hilfe von Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können für die Prävention, Behandlung oder Linderung von rheumatoider Arthritis, Reizdarmsyndrom oder Osteoarthritis besonders wirksam sein.
Der Nutzen einer Verbindung kann durch ein weiter unten beschriebenes Radioligand-Assay bestimmt werden. Die Zunahme der Affinität kann für die Bindungsstelle von hoher Affinität (d. h. die aktive Agonistenstelle) gemessen werden, während die Wirksamkeit des Agonisten bei unterschiedlichen pH-Werten durch Bewertung des Unterschieds in der Affinität der Zustände von niedriger und hoher Affinität bestimmt werden kann. Dies kann mit Hilfe von GTP und stabiler Analoga davon erfolgen, welche den Zustand einer hohen Affinität des Rezeptors zu dem Zustand geringer Affinität umwandeln, wodurch die Aktivierung des Rezeptors durch Agonisten nachgestellt wird. Liganden ohne Wirksamkeit (d. h. Antagonisten) unterscheiden nicht zwischen diesen verschiedenen Affinitätszuständen. Alternativ können Agonisten, die unterschiedliche Affinitäten und/oder Wirksamkeiten bei unterschiedlichen pH-Werten besitzen, in funktionellen Assays, wie der Messung der Produktion nachrangiger Botenstoffe oder Entfernung (z. B. Stimulierung oder Inhibierung von cAMP-Akkumulation, des Inositolphosphat-Umsatzes, der Calcium-Signalisierung, Kinaseaktivierung etc.) identifiziert werden.
Die Affinität einer Testverbindung für einen Adenosinrezeptor kann durch eines der folgenden Verfahren bestimmt werden:

i) Binden mehrerer Konzentrationen einer markierten Testverbindung (einschließlich radiomarkierter Testverbindung) an Adenosinrezeptoren, die in Geweben, Gewebeschnitten, intakten Zellen, aufgebrochenen Zellen oder von Zellen herrührenden Membranen vorhanden sind;
ii) Verdrängung einer gebundenen markierten Verbindung von Adenosinrezeptoren durch Inkubation mit unmarkierter Testverbindung unter Verwendung von Geweben, Gewebeschnitten, intakten Zellen, aufgebrochenen Zellen oder von Zellen herrührenden Membranen, welche solche Rezeptoren tragen. Die markierte Verbindung kann entweder die Testverbindung oder ein selektiver Ligand für den Rezeptor sein.

Man gelangt zu dem Schluss, dass die Wirksamkeit eines Agonisten dessen Fähigkeit zur Aktivierung von dessen Rezeptor wiederspiegelt. Agonisten mit einer hohen Wirksamkeit rufen eine maximale Rezeptor-Antwortreaktion hervor, und partielle Agonisten rufen eine geringere Antwortreaktion hervor. Die Wirkung einer Testverbindung bei einem Adenosinrezeptor kann durch eines der folgenden Verfahren bestimmt werden:

i) Bestimmen der Adenosinrezeptor-Wirkung durch die Messung der Akkumulation oder Verarmung von signalgebenden Molekülen, einschließlich cAMP, IP3 und freies Calcium in Geweben, Gewebeschnitten, intakten Zellen oder teilweise aufgebrochene Zellen;
ii) Verwendung von biologischen Membranen zur Bewertung der Adenosinrezeptor-Aktivierung als Reaktion auf eine Testverbindung durch die Messung der G-Protein-Aktivierung (zum Beispiel durch die Verwendung radiomarkierter Guaninnukleotide) oder durch die Messung der Enzymaktivität (zum Beispiel Adenylylcyclase, Phosphodiesterase, Phospholipase oder Proteinkinase) oder durch die Messung des Ionenstroms durch Ionenkanäle, die durch den Adenosinrezeptor aktiviert werden (zum Beispiel Calcium- oder Kaliumkanäle);
iii) Bestimmen der Adenosinrezeptorwirkung durch die Messung der Proteinkinaseaktivität in Geweben, Gewebeschnitten, intakten Zellen, aufgebrochenen Zellen oder von Membranen herrührenden Zellen;
iv) Bestimmen der Adenosinrezeptorwirkung durch die Messung der Phospholipase-Aktivität (z. B. Phospholipase C, Phospholipase A2, Phospholipase D) in Geweben, Gewebeschnitten, intakten Zellen, aufgebrochenen Zellen oder von Zellen herrührenden Membranen;
v) Bestimmen der Adenosinrezeptorwirkung durch die Messung der Protein-Phosphorylierung und Dephosphorylierung in Geweben, Gewebeschnitten, intakten Zellen, aufgebrochenen Zellen oder von Zellen herrührenden Membranen.

Der Aktivitätsspiegel einer Verbindung (d. h. dessen intrinsische Wirksamkeit) kann in Abhängigkeit von dem gewünschten Effekt variieren. Zum Beispiel können Agonisten mit geringer Wirksamkeit bei der Herabsetzung der Wahrscheinlichkeit einer Rezeptor-Desensibilisierung oder bei der Vermittlung einer extra Targetierungsdimension, d. h. auf jene Gewebe mit einer großen Rezeptorreserve nützlich sein. Die Aktivität beträgt vorzugsweise mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens soviel wie für einen der weiter unten angeführten Wirkstoffe. Der Unterschied wird vorzugsweise zwischen dem physiologischen pH-Wert (7,4) und pH-Wert von 5,5 oder darüber, z. B. 6,2 (Extremfall für ischämisches Gewebe), 6,5, 7,0 (typisch in Bereichen mit chronischer Entzündung) oder 7,2 gesehen. Alternativ können die partiellen Agonisten mit geringer Wirksamkeit als funktionelle Antagonisten verwendet werden, wobei sie an den Rezeptor binden und das Binden des endogenen Transmitters/Hormons (zum Beispiel Adenosin) verhindern.
Wenn ein potenzielles Therapeutikum identifiziert wird, kann bestimmt werden, ob das Agens eine therapeutische Wirkung hat, zum Beispiel gegen Schmerz oder Entzündung (insbesondere jede/jeden der weiter oben aufgelisteten Erkrankungen und Zustände). Vorzugsweise kommt ein Nicht-Humanes-Tiermodell zur Anwendung, um zu bestimmen, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung hat. Es kann jedes geeignete Tiermodell zur Anwendung kommen. Beispiele schließen durch Injektion von Kollagen II induzierte Arthritis oder neuropathischen Schmerz, welcher durch Streptozotokin-induzierten Diabetes induziert wird, ein.
Vorzugsweise wird die therapeutische Wirkung des identifizierten Agens bei einer Konzentration unterhalb des EC50-Werts des Agens bei dem Adenosinrezeptor bei einem pH-Wert von 7,4 bestimmt. Stärker bevorzugt wird die therapeutische Wirkung bei einer Konzentration bestimmt, die ein Zehntausendstel bis ein Fünftel oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hunderstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel des EC50-Wertes beträgt.
Um zu bestätigen, dass das identifizierte Agens bei minimierten Nebenwirkungen verabreicht werden kann, können die Nebenwirkungen (wie Bradykardie, niedriger Blutdruck oder Tachykardie), die durch das identifizierte Agens verursacht werden, bestimmt werden. Vorzugsweise werden diese bei einer Konzentration unterhalb des EC50-Wertes des Agens bei dem Adenosinrezeptor bei einem pH-Wert von 7,4 bestimmt. Stärker bevorzugt werden die Nebenwirkungen bei einer Konzentration bestimmt, die ein Zehntausendstel bis ein Fünftel, oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hundertstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel des EC50-Werts beträgt.
Eine Reihe von Verbindungen, die Agonisten des Adenosin-A1- oder -A2-Rezeptors sind, sind identifiziert worden. Diese Verbindungen besitzen eine höhere Affinität für den Adenosin-A1- oder -A2-Rezeptor bei einem niedrigeren pH-Wert. Man nimmt an, dass die Rezeptoren ihre Konformation in Reaktion auf die Veränderungen des pH-Werts verändern. Der genaue Mechanismus, durch welchen diese Veränderung erfolgt, ist unbekannt, doch wird angenommen, dass dieser Histidinreste beinhaltet, welche bei der Agonist-Bindung an diese Rezeptoren beteiligt waren und pK-Werte im physiologischen Bereich besitzen.
Die 1 veranschaulicht die Zunahme in der Affinität, die mit 2-Methoxyadenosin festgestellt wird, als der pH-Wert in einem Ligand-Bindungsexperiment von einem pH-Wert von 7,4 auf pH 5,5 verringert wurde. Die 2 zeigt, dass die gleiche Zunahme in der Affinität bei einem pH-Wert von 7,0 und pH von 6,8 festgestellt wurde, dass aber der archetypische A2A-Rezeptoragonist CGS21680 nicht diese Wirkung zeigt. Eine weitere überraschende Folge der Affinitätsveränderungen war, dass die Wirksamkeit von 2-Methoxyadenosin bei dem Adenosin-A2A-Rezeptor ungefähr um das 100-Fache erhöht wurde (3). Demgegenüber zeigte 3'-Desoxy-2-methoxyadenosin eine Abnahme der Affinität bei dem A1-Rezeptor, wenn der pH-Wert von 7,4 auf 6,2 abgesenkt wurde. Die Ki-Werte, die für die Stellen mit hoher Affinität bei der Verdrängung von [3H]-DPCPX von dem humanen A1-Rezeptor bestimmt wurden, waren 158 ± 85 nM bei einem pH-Wert von 7,4 und 405 ± 114 nM bei einem pH-Wert von 6,2. Somit scheint es, dass Adenosinrezeptoragonisten und partielle Agonisten durch lokale Veränderungen im Gewebe-pH stark beeinflusst werden können und überraschenderweise, dass die Wirksamkeit dieser Liganden entweder erhöht oder verringert werden kann. Verbindungen, die eine Abnahme der Wirksamkeit zeigen, fungieren vermutlich als partielle Agonisten mit geringer Wirksamkeit.
Der Anmelder ist zu dem Schluss gelangt, dass potenzielle Therapeutika ebenfalls durch Verabreichen einer Testverbindung in vivo oder in vitro in einer Dosis, die niedriger ist als die erwartete, um (bei einem pH-Wert von 7,4) einen signifikanten Anteil von Adenosinrezeptoren (d. h. ausreichend Adenosinrezeptoren zur Hervorrufung einer günstigen therapeutischen Wirkung) zu aktivieren, und anschließende Bewertung des Unterschieds in der Dosis, die zur Aktivierung der Rezeptoren in dem pathologischen Gewebe erforderlich ist, im Vergleich mit normalem Gewebe identifiziert werden können.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung eines potenziellen Therapeutikums bereitgestellt, welches das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem Adenosinrezeptor (einem A1-, A2A-, A2B- oder A3-Adenosinrezeptor) in einem pathologischen Gewebe, Zelle oder einer Membran und einem/einer entsprechenden normalen Gewebe, Zelle oder Membrane bei einer Konzentration unter dem EC50-Wert der Testverbindung bei dem Adenosinrezeptor bei einem pH-Wert von 7,4, und das Bestimmen, ob es einen Unterschied in der Wirkung des Adenosionrezeptors als Reaktion auf einen Kontakt mit der Testverbindung zwischen dem normalen Gewebe und dem pathologischen Gewebe gibt, umfasst.
Vorzugsweise wird die Testverbindung mit dem Adenosinrezeptor in einer Konzentration kontaktiert, die ein Zehntausendstel bis ein Fünftel, oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hundertstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel des EC50-Wertes beträgt.
Die Testverbindung wird als ein potenzielles Therapeutikum identifiziert, wenn die Testverbindung ein Agonist des Adenosinrezeptors ist, und die Wirkung des Adenosinrezeptors in Reaktion auf die Testverbindung ist größer in dem pathologischen Gewebe als in dem normalen Gewebe. Wenn das pathologische Gewebe Epithelgewebe umfasst, können potenzielle therapeutische Verbindungen für die Behandlung einer epithelialen Erkrankung (zum Beispiel Psoriasis, Asthma, COPD) identifiziert werden.
Adenosinrezeptoragonisten, die eine unterschiedliche Rezeptor-Affinität und/oder Wirksamkeit bei unterschiedlichem pH-Wert haben oder die eine unterschiedliche Wirkung von Adenosinrezeptoren in pathologischem Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe verursachen, schließen Derivate von Adenosin ein. Damit wird anerkannt, dass Verfahren der Erfindung als Screening-Verfahren angewandt werden können, insbesondere zum Screenen von Derivaten von Adenosin. Derivate, die eine geringe Affinität (d. h. einen Kd für einen Adenosinrezeptor > 0,5 μM) und/oder Wirksamkeit bei einem pH-Wert von 7,4 haben, sind bevorzugt. Die Selektivität der Derivate für unterschiedliche Adenosinrezeptoren kann sich bei einem verringerten pH-Wert verändern, dementsprechend sollte die Selektivität einer bestimmten Verbindung sowohl bei einem normalen als auch einem verringerten pH-Wert bestimmt werden.
Verbindungen der folgenden allgemeinen Formeln, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung sind, wurden gefunden, von denen viele eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirksamkeit bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert aufweisen sollen:
worin R C_1-4-Alkoxy ist und X OH ist;
worin R C_1-4-Alkoxy ist und X H ist.
Bei Verbindungen, die in Beispiel 10 beispielhaft angegeben sind, zeigte sich, dass sie eine höhere Affinität für Adenosin-A2A-Rezeptoren bei niedrigerem pH-Wert aufweisen.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können als Medikamente bei der Prävention, Behandlung oder Linderung verschiedener Erkrankungen oder Zustände verwendet werden. Diese schließen Erkrankungen und Zustände ein, bei welchen die Prävention, Behandlung oder Linderung durch Aktivierung von Adenosinrezeptoren vermittelt wird. Beispiele schließen Erkrankungen oder Zustände ein, bei welchen der lokale Energiebedarf von Gewebe die Versorgung übersteigt und/oder der pH-Wert fällt.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkungseffizienz bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können insbesondere für die Herstellung eines Medikaments für die Prävention, Behandlung oder Linderung von Krebs, Entzündung, Ischämie-Reperfusionsschädigung, Schmerz, übermäßiger neuronaler Aktivität (zum Beispiel bei Epilepsie oder chronischem Schmerz oder Hyperalgesie, einschließlich entzündlichem und neuropathischem Schmerz), Sepsis, septischem Schock, Neurodegeneration (einschließlich Alzheimer-Krankheit), Muskelermüdung oder Muskelkrampf (besonders Krampf bei Athleten) verwendet werden.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können bei der Prävention, Behandlung oder Linderung der folgenden Schmerzarten wirksam sein: Darmschmerz, Pankreasschmerz, Becken-/perinealer Schmerz, Rückenschmerz, Schmerzen im unteren Rücken, Brustschmerz, Herzschmerz, Beckenschmerz/PID, Gelenkschmerz (zum Beispiel vergesellschaftet mit Tendonitis, Bursitis, akuter Arthritis), Nackenschmerz, obstetrischer Schmerz (Wehen oder Kaiserschnitt), Krebsschmerz, HIV-Schmerz, Phantom-Gliederschmerz, postoperativer Schmerz, chronischer neuropathischer Schmerz, Schmerzen durch eine misslungene Rückenoperation, postphysischer Traumaschmerz (einschließlich Schmerz, der durch eine Schusswunde, einen Verkehrsunfall oder eine Verbrennung verursacht wird), Narbengewebeschmerz, akuter Herpes-zoster-Schmerz, akuter Pankreatitis-Durchbruchschmerz (Krebs), Post-Herpes-Neuralgie, trigeminale Neuralgie; neuropathische oder andere Schmerzen, die durch diabetische Neuropathie, Polyneuropathie, Fibromyalgie, Costen-Schmerzsyndrom, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Hexenschuss oder lumbale Radikulopathie, spinale Stenose, temporomandibulares Gelenkleiden, Nierenkolik, Dysmenorrhoe/Endometriose; oder entzündliche oder andere Schmerzen, die durch arthritische Zustände verursacht werden oder damit vergesellschaftet sind, wie Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, rheumatoide Spondylitis, gichtartige Arthritis oder Asthma, chronische obstruktive pulmonare Erkrankung, Fibrose, Multiple Sklerose, Sepsis, septischer Schock, endotoxischer Schock, Gram-negativer Schock, toxischer Schock, hämorraghischer Schock, ARDS-Schocklunge, zerebrale Malaria, Organtransplantatabstoßung, Krebssekundärschmerz, HIV, chronische pulmonare entzündliche Erkrankung, Silicosis, pulmonare Sarkose, Knochenresorptionserkrankungen, Re perfusionsschädigung, Transplantat-versus-Wirt-Abstoßung, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Allotransplantat-Abstoßungen, Fieber und Myalgie infolge von Infektion, AIDS-verwandter Komplex (ARC), Keloid-Bildung, Narbengewebebildung, Krohn-Krankheit, ulzerative Kolitis und Pyresis, Reizdarmsyndrom, Osteoporose, zerebrale Malaria, bakterielle Meningitis oder schädliche Wirkungen durch Amphotericin-B-Behandlung, Interleukin-2-Behandlung, OKT3-Behandlung oder GM-CSF-Behandlung.
Verbindungen der Formel (I), Verbindungen der Formel (II) und Verbindungen von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkungseffizienz bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können besonders wirksam sein für die Prävention, Behandlung oder Linderung von speziellen Entzündungsarten, einschließlich Arthritis (besonders an der Gelenkkapsel von Arthritis), Asthma, Psoriasis und Darmentzündung.
Verbindungen der Formel (I), Verbindungen der Formel (II) und Verbindungen von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkungseffizienz bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können besonders wirksam sein bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von rheumatoider Arthritis, Reizdarmsyndrom oder Osteoarthritis.
Verbindungen der Formel (I) schließen ein: 2-Methoxyadenosin, 2-Ethoxyadenosin, 2-Propoxyadenosin, 2-Isopropoxyadenosin und 2-Butoxyadenosin. Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind 2-Methoxyadenosin, 2-Ethoxyadenosin und 2-Butyloxyadenosin.
Verbindungen der Formel (II) schließen ein: 3'-Desoxy-2-methoxyadenosin, 3'-Desoxy-2-ethoxyadenosin, 3'-Desoxy-2-propoxyadenosin, 3'-Desoxy-2-isopropoxyadenosin und 3'-Desoxy-2-butoxyadenosin. Bevorzugte Verbindungen der Formel (II) sind 3'-Desoxy-2-propoxyadenosin, 3'-Desoxy-2-isopropoxyadenosin und 3'-Desoxy-2-butoxyadenosin.
2-Methoxyadenosin besitzt laut Berichten einen EC50-Wert bei dem Adenosin-A2A-Rezeptor von 3 μM (Daly, J. W. et al. (1993) Pharmacol. 46, 91–100). Allerdings weist die Verbindung überraschend eine tiefgreifende Anti-Hyperalgesie- und entzündungshemmende Aktivität bei Plasmakonzentrationen von 0,2 μM oder weniger auf. Bei diesen niedrigen Dosen besitzt 2-Methoxyadenosin eine verringerte Wahrscheinlichkeit und Schwere von Nebenwirkungen. Die Aktivität von 2-Methoxyadenosin als ein Analgetikum ist der Gegenstand der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB03/05379 (unveröffentlicht am Einreichungsdatum der vorliegenden Anmeldung).
Andere Verbindungen der Formel (I) und Verbindungen der Formel (II) (und Verbindungen von Beispiel 10), welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen (und Verbindungen, die mit Hilfe von Verfahren der Erfindung identifiziert werden) sollen ebenfalls bei niedrigen Dosen viel wirksamer sein als andere Adenosinrezeptoragonisten. Somit wird erwartet, dass solche Verbindungen wirksam in Dosen verabreicht werden können, bei welchen sie eine verringerte Wahrscheinlichkeit und Schwere von Nebenwirkungen aufweisen. Diese Verbindungen können alternativ oder zusätzlich eine verringerte Wahrscheinlichkeit und Schwere von Nebenwirkungen im Vergleich mit anderen Adenosinrezeptoragonisten aufweisen.
Schmerz hat zwei Komponenten, wobei jede davon mit der Aktivierung sensorischer Neuronen verbunden ist. Die erste Komponente ist die frühe oder unmittelbare Phase, wenn ein sensorisches Neuron stimuliert wird, zum Beispiel als eine Folge von Wärme oder Druck auf der Haut. Die zweite Komponente ist die Folge einer erhöhten Empfindlichkeit des sensorischen Mechanismen innervierenden Gewebes, das zuvor beschädigt wurde. Diese zweite Komponente wird als Hpyerlagesie bezeichnet und ist bei allen Formen des chronischen Schmerzes, der aus einer Gewebeschädigung herrührt, beteiligt, dagegen nicht an der frühen oder unmittelbaren Phase der Schmerzwahrnehmung.
Somit ist Hyperalgesie ein Zustand einer erhöhten Schmerzwahrnehmung, der durch eine Gewebeschädigung verursacht wird. Dieser Zustand ist eine natürliche Antwortreaktion des Nervensystems, die anscheinend dazu bestimmt ist, den Schutz des geschädigten Gewebes durch eine verletzte Person zu unterstützen, um Zeit für eine Gewebereparatur zu geben. Es gibt zwei bekannte zugrunde liegende Ursachen dieses Zustands, eine Erhöhung der sensorischen Neuronenaktivität und eine Veränderung der neuronalen Prozessierung von nozizeptiven Informationen, die im Rückenmark erfolgt. Hyperalgesie kann bei Zuständen einer chronischen Entzündung (z. B. rheumatoider Arthritis), und wenn es zu einer sensorischen Nervenschädigung gekommen ist (d. h. neuropathischer Schmerz), schwächen.
Verbindungen, die durch Verfahren der Erfindung identifiziert werden, Verbindungen der Formel (I) oder (II) und Verbindungen von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, sollen bei der Hemmung der Schmerzwahrnehmung bei Säugern, die an neuropathischem und entzündlichem Schmerz leiden, selbst wenn sie in Dosen verabreicht werden, die Konzentrationen deutlich unter den für die Aktivierung von Adenosinrezeptoren bekannten liegen, wirksam sein. Bei diesen Dosen nimmt man an, dass diese Verbindungen neuropathischen und entzündlichen Schmerz behandeln können, ohne signifikante Nebenwirkungen, die mit der Verabreichung anderer Adenosinrezeptoragonisten vergesellschaftet sind, zu verursachen, und auch ohne die Herabsetzung der normalen sensorischen Wahrnehmung.
Verbindungen, die durch Verfahren der Erfindung identifiziert werden, Verbindungen der Formel (I) oder (II) oder Verbindungen von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können als Anti-Hyperalgetika für die Prävention, Behandlung oder Linderung von Schmerzen (besonders Hyperalgesie), die als eine Folge von Neuropathie, einschließlich Darmschmerz, Rückenschmerz, Krebsschmerz, HIV-Schmerz, Phantom-Gliederschmerz, postoperativer Schmerz, diabetische Neuropathie, Polyneuropathie, Post-Herpes-Neuralgie und trigeminale Neuralgie, verursacht wird.
Verbindungen, die durch Verfahren der Erfindung identifiziert werden, Verbindungen der Formel (I) oder (II) oder Verbindungen von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, können als Anti-Hyperalgetika für die Prävention, Behandlung oder Linderung von Schmerz (besonders Hyperalgesie), der als eine Folge einer entzündlichen Erkrankung, einschließlich Darmschmerz, Rückenschmerz, Krebsschmerz, Fibromyalgie, postoperativer Schmerz, Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis, verursacht wird, verwendet werden.
Verbindungen, die durch Verfahren der Erfindung identifiziert werden, Verbindungen der Formel (I) oder (II) und Verbindungen von Beispiel 10, welche eine höhere Affinität für Adenosinrezeptoren und/oder Wirkung bei Adenosinrezeptoren bei einem niedrigeren pH-Wert besitzen, sollen Vorteile haben (wie eine erhöhte Wirksamkeit und/oder verminderte Nebenwirkungen), wenn sie zur Schmerzbehandlung (insbesondere Hyperalgesie) eingesetzt werden, verglichen mit Verbindungen der zwei Hauptklassen bekannter Analgetika. Diese sind: (i) nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs) und die verwandten COX-2-Inhibitoren; und (ii) Opiate auf Basis von Morphin. Analgetika beider dieser Klassen sind bei der Bekämpfung von normalem nozizeptivem Schmerz wirksam. Allerdings sind sie weniger wirksam gegen einige Arten von Hyperalgesie-Schmerz, wie neuropathischen Schmerz. Viele praktische Ärzte verschreiben nur ungern Opiate in den hohen Dosierungen, die zur Beeinflussung von neuropathischem Schmerz erforderlich sind, aufgrund der Nebenwirkungen, die durch die Verabreichung dieser Verbindungen verursacht werden, und der Möglichkeit, dass Patienten von diesen abhängig werden können. NSAIDs sind weniger wirksam als Opiate, sodass noch höhere Dosen dieser Verbindungen erforderlich sind. Jedoch ist dies unerwünscht, weil diese Verbindungen eine Reizung des gastrointestinalen Trakts verursachen.
Die Menge von einer durch das Verfahren der Erfindung identifizierten Verbindung oder von einer Verbindung der Formel I oder (II) oder von Beispiel 10, welche an einen Patienten verabreicht wird, sollte eine Menge sein, die zu einer Peakplasmakonzentration führt, die weniger als der EC50-Wert der Verbindung bei den Adenosinrezeptoren bei einem pH-Wert von 7,4 ist.
Man gelangt zu dem Schluss, dass der EC50-Wert der Verbindung vermutlich für verschiedene Adenosinrezeptoren (nämlich die A1-, A2A-, A2B-, A3-Adenosinrezeptoren) unterschiedlich ist. Die Menge der Verbindung, die verabreicht werden soll, sollte im Verhältnis zu dem niedrigsten EC50-Wert der Verbindung bei den verschiedenen Rezeptoren berechnet werden.
Die Peakplasmakonzentration kann ein Tausendstel bis ein Fünftel, oder ein Fünfzigstel bis ein Drittel (stärker bevorzugt ein Tausendstel bis ein Zwanzigstel, ein Hundertstel oder ein Fünfzigstel bis ein Fünftel, ein Fünfzigstel bis ein Zehntel, oder ein Zehntel bis ein Fünftel) des EC50-Wertes betragen. Vorzugsweise ist die Peakplasmakonzentration ein Zehntausendstel bis ein Fünftel, oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hunderstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel des EC50-Wertes.
Vorzugsweise führt die verabreichte Menge zu einer Plasmakonzentration, die für mehr als eine Stunde zwischen einem Tausendstel und einem Fünftel, stärker bevorzugt zwischen einem Tausendstel und einem Zwanzigstel, oder einem Hundertstel und einem Fünftel, oder einem Fünfzigstel und einem Fünftel des EC50-Wertes der Verbindung bei Adenosinrezeptoren bei einem pH-Wert von 7,4 gehalten wird. Stärker bevorzugt führt die verabreichte Menge zu einer Plasmakonzentration, die für mehr als eine Stunde bei einem Zehntausendstel bis einem Fünftel, oder einem Zehntausendstel bis einem Zwanzigstel, oder einem Zehntausendstel bis einem Hundertstel, am meisten bevorzugt einem Zehntausendstel bis einem Tausendstel gehalten wird.
Zur Vermeidung von Zweifeln wird der EC50-Wert einer Verbindung hierin als die Konzentration der Verbindung definiert, die eine Rezeptorantwortreaktion in der Mitte zwischen der Basislinien-Rezeptorantwortreaktion und der maximalen Rezeptorantwortreaktion hervorruft (wie zum Beispiel mit Hilfe einer Dosis-Antwortreaktions-Kurve bestimmt).
Der EC50-Wert sollte unter Standardbedingungen definiert werden (ausbalancierte Salzlösungen, die auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert sind). Für EC50-Bestimmungen unter Verwendung von isolierten Membranen, Zellen und Geweben wäre dies in gepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 (z. B. Zellkulturmedium), zum Beispiel wie bei Daly et al. (Pharmacol. (1993) 46, 91–100), oder vorzugsweise Tilburg et al. (J. Med. Chem. (2002) 45, 91–100). Der EC50 könnte auch in vivo durch Messen der Adenosinrezeptor-vermittelten Antwortreaktionen in einem normalen gesunden Tier, oder sogar in einem unter normalen Bedingungen perfundierten Gewebe (d. h. oxygeniertes Blut oder oxygenierte isotonische Medien, ebenfalls gepuffert bei einem pH-Wert von 7,4) in einem normalen gesunden Tier bestimmt werden.
Alternativ kann die Menge einer Verbindung, die durch ein Verfahren der Erfindung identifiziert wird, oder der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10, die verabreicht wird, eine Menge sein, die zu einer Peakplasmakonzentration führt, die ein Tausendstel bis ein Zwanzigstel, ein Tausendstel bis ein Drittel, stärker bevorzugt ein Hunderstel bis ein Fünftel, oder ein Fünfzigstel bis ein Zehntel des Kd-Werts bei Adenosinrezeptoren beträgt. Stärker bevorzugt ist die Menge eine Menge, die zu einer Peakplasmakonzentration führt, die ein Zehntausendstel bis ein Fünftel, oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hunderstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel des Kd-Werts bei Adenosinrezeptoren beträgt.
Es wird geschätzt, dass der Kd-Wert der Verbindung vermutlich für verschiedene Adenosinrezeptoren (nämlich die A1-, A2A-, A2B-, A3-Adenosinrezeptoren) unterschiedlich ist. Die Menge der Verbindung, die verabreicht werden soll, kann im Verhältnis zu dem niedrigsten oder höchsten Kd-Wert der Verbindung für die verschiedenen Rezeptoren berechnet werden.
Vorzugsweise ist die Menge der Verbindung, die verabreicht wird, eine Menge, die zu einer Plasmakonzentration führt, die mindestens eine Stunde zwischen einem Tausendstel und einem Fünftel, stärker bevorzugt zwischen einem Tausendstel und einem Zwanzigstel oder einem Hunderstel und einem Fünftel, oder einem Fünfzigstel und einem Fünftel des Kd-Werts der Verbindung bei Adenosinrezeptoren gehalten wird. Stärker bevorzugt führt die Menge zu einer Plasmakonzentration, die mindestens eine Stunde auf einem Zehntausendstel bis einem Fünftel, oder einem Zehntausendstel bis einem Zwanzigstel, oder einem Zehntausendstel bis einem Hunderstel, am meisten bevorzugt einem Zehntausendstel bis einem Tausendstel des Kd-Werts der Verbindung bei Adenosinrezeptoren gehalten wird.
Der Kd-Wert der Verbindung bei jedem Rezeptor sollte unter Standardbedingungen bestimmt werden unter Verwendung von Plasmamembranen als einer Quelle der Adenosinrezeptoren, die entweder von Geweben oder Zellen stammen, die endogen diese Rezeptoren exprimieren, oder von Zellen, die mit DNA-Vektoren, welche die Adenosinrezeptorgene codieren, transfiziert sind. Alternativ können Ganzzellenpräparate unter Verwendung von Zellen, welche Adenosinrezeptoren exprimieren, eingesetzt werden. Markierte Liganden (z. B. radiomarkierte), die für die verschiedenen Rezeptoren selektiv sind, sollten in gepufferten (pH-Wert von 7,4) Salzlösungen verwendet werden (siehe z. B. Tilburg et al., J. Med. Chem. (2002), 45, 420–429), um die Bindungsaffinität und damit den Kd der Verbindung bei jedem Rezeptor zu bestimmen.
Alternativ kann die Menge einer Verbindung, die durch ein Verfahren der Erfindung identifiziert wird, oder der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10, die verabreicht wird, eine Menge sein, die ein Tausendstel bis ein Fünftel, oder ein Fünfzigstel bis ein Drittel (vorzugsweise ein Tausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Hundertstel oder ein Fünfzigstel bis ein Fünftel) der Mindestdosis der Verbindung ist, die zu Bradykardie-, Hypotonie- oder Tachykardie-Nebenwirkungen bei Tieren der gleichen Spezies wie dem Subjekt, welchem die Verbindung verabreicht werden soll, führt. Vorzugsweise ist die Menge ein Zehntel bis ein Fünftel der Mindestdosis, die zu den Nebenwirkungen führt. Stärker bevorzugt ist die Menge ein Zehntausendstel bis ein Fünftel, oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hundertstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel der Mindestdosis, die zu den Nebenwirkungen führt.
Vorzugsweise führt die verabreichte Menge zu einer Plasmakonzentration, die mehr als 1 Stunde lang zwischen einem Tausendstel und einem Zwanzigstel, oder einem Hundertstel oder einem Fünftel und einem Zwanzigstel, oder einem Hunderstel oder einem Fünfzigstel und einem Fünf tel der Mindestplasmakonzentration, die zu den Nebenwirkungen fährt, gehalten. Stärker bevorzugt führt die verabreichte Menge zu einer Plasmakonzentration, die mehr als 1 Stunde lang auf einem Zehntausendstel bis einem Fünftel, oder einem Zehntausendstel bis einem Zwanzigstel, oder einem Zehntausendstel bis einem Hundertstel, am meisten bevorzugt einem Zehntausendstel bis einem Zehntausendstel bis einem Tausendstel der Mindestplasmakonzentration, die zu den Nebenwirkungen führt, gehalten wird.
Alternativ kann die Menge einer Verbindung, die durch ein Verfahren der Erfindung identifiziert wird, oder der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10, die verabreicht wird, eine Menge sein, die zu Plasmakonzentrationen führt, die ein Tausendstel bis ein Fünftel, oder ein Fünfzigstel bis ein Drittel (vorzugsweise ein Tausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Hundertstel oder ein Fünfzigstel bis ein Fünftel) der Mindestplasmakonzentration der Verbindung, die Bradykardie-, Hypotonie- oder Tachykardie-Nebenwirkungen bei Tieren der gleichen Spezies wie dem Subjekt verursachen, welchem die Verbindung verabreicht werden soll, betragen. Vorzugsweise führt die Menge zu Plasmakonzentrationen, die ein Zehntel bis ein Fünftel der Mindestplasmakonzentration, welche die Nebenwirkungen verursacht, betragen. Stärker bevorzugt führt die Menge zu Plasmakonzentrationen, die ein Zehntausendstel bis ein Fünftel, oder ein Zehntausendstel bis ein Zwanzigstel, oder ein Zehntausendstel bis ein Hundertstel, am meisten bevorzugt ein Zehntausendstel bis ein Tausendstel der Mindestplasmakonzentration, welche diese Nebenwirkungen verursacht, betragen.
Vorzugsweise führt die verabreichte Menge zu einer Plasmakonzentration, die mehr als 1 Stunde lang zwischen einem Tausendstel bis einem Zwanzigstel, oder einem Hundertstel oder einem Fünfzigstel und einem Fünftel der Mindestplasmakonzentration, welche die Nebenwirkungen verursacht, gehalten wird. Stärker bevorzugt rührt die Menge zu einer Plasmakonzentration, die mehr als eine Stunde lang auf einem Zehntausendstel bis einem Fünftel, oder einem Zehntausendstel bis einem Zwanzigstel, oder einem Zehntausendstel bis einem Hunderstel, am meisten bevorzugt einem Zehntausendstel bis einem Tausendstel der Mindestplasmakonzentration, welche die Nebenwirkungen verursacht, gehalten wird.
Die geeignete Dosierung einer Verbindung, die mit Hilfe eines Verfahren der Erfindung oder der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10 identifiziert wird, variiert mit dem Alter, Geschlecht, Gewicht und dem Zustand des Patienten, der Wirksamkeit der Verbindung und dem Verabreichungsweg etc. Die geeignete Dosierung lässt sich ohne Weiteres durch einem Fachmann auf dem Gebiet bestimmen.
Es wird erwartet, dass die Menge einer Verbindung, die durch ein Verfahren der Erfindung oder der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10 identifiziert wird, die verabreicht wird, 0,001 bis 15 mg/kg, oder 0,01 bis 15 mg/kg, zum Beispiel 0,01 bis 5 oder 10 mg/kg, oder 0,001 bis 0,01 mg/kg betragen sollte. Die Menge kann weniger als 6 mg/kg, vorzugsweise mindestens 0,001, oder 0,01 oder 0,05 mg/kg, zum Beispiel 0,01 bis 2 mg/kg betragen. Die Menge kann mindestens 0,1 mg/kg, zum Beispiel 0,1 bis 1 oder 2 mg/kg, oder 0,2 bis 1 mg/kg betragen. Eine typische Menge ist 0,2 oder 0,6 bis 1,2 mg/kg.
Eine Dosierungseinheit einer durch ein Verfahren der Erfindung identifizierten Verbindung oder der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10 umfasst typischerweise bis zu 500 mg (zum Beispiel 1 bis 500 mg, vorzugsweise 5 bis 500 mg) des Wirkstoffs. Vorzugsweise liegt der Wirkstoff in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor, welche den Wirkstoff und einen physiologisch akzeptablen Träger, Exzipiens oder Verdünnungsmittel umfasst. Die bevorzugte Dosis ist 0,1 bis 2, z. B. 0,5 bis 1, typischerweise etwa 0,6 mg des Wirkstoffs pro kg des (menschlichen) Subjekts. Bei diesen Anteilen kann eine wirksame Behandlung im Wesentlichen ohne einen damit einhergehenden Abfall (zum Beispiel um nicht mehr als 10%) des Blutdrucks erreicht werden.
Bevorzugte Dosen für einen 70-kg-Menschen sind weniger als 420 mg, vorzugsweise mindestens 0,7 mg, stärker bevorzugt mindestens 3,5 mg, am meisten bevorzugt mindestens 7 mg. Starker bevorzugt 7 bis 70 mg, oder 14 bis 70 mg.
Die oben spezifizierten Dosierungsmengen sind deutlich niedriger (bis zu etwa das 1000-Fache niedriger) als zu erwarten wäre (auf Basis des EC50-Wertes von Spongosin bei dem Adenosin-A2A-Rezeptor), die erforderlich sind, damit die Verbindungen einen positiven therapeutischen Effekt haben.
Verbindungen, die durch Verfahren der Erfindung identifiziert werden, oder Verbindungen der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10 können mit oder ohne Therapeutika verabreicht werden, zum Beispiel entzündungshemmende Mittel (Steroide, NSAIDs, Methotrexat), Analgetika (wie Opiate, NSAIDs, Kannabinoide, Tachykinin-Modulatoren oder Bradykinin-Modulatoren) oder Anti-Hyperalgetika (wie Gabapentin, Pregabalin, Kannabinoide, Natrium- oder Calciumkanal-Modulatoren, Antiepileptika oder Antidepressiva).
Im Allgemeinen kann eine Verbindung, die durch ein Verfahren der Erfindung oder eine Verbindung der Formel (I) oder (II) oder von Beispiel 10 identifiziert wird, durch bekannte Methoden in jeder brauchbaren Formulierung über jede geeignete Route verabreicht werden. Eine Verbindung wird vorzugsweise oral, parenteral, sublingual, transdermal, intrathekal oder transmukosal verabreicht. Andere geeignete Routen schließen die intravenöse, intramuskuläre, subkutane, Inhalierungs- und topische Route ein. Die Menge des verabreichten Arzneistoffs ist typischerweise höher, wenn dieser oral verabreicht wird, als wenn der beispielsweise intravenös verabreicht wird.
Geeignete Zusammensetzungen, zum Beispiel für die orale Verabreichung, schließen feste Dosierungseinheitenformen und solche ein, die Flüssigkeit enthalten, z. B. für die Injektion, wie Tabletten, Kapseln, Vials und Ampullen, bei welchen der Wirkstoff durch bekannte Methoden mit einem physiologisch akzeptablen Exzipiens, Verdünnungsmittel oder Träger formuliert ist. Geeignete Verdünnungsmittel und Träger sind bekannt und schließen zum Beispiel Lactose und Talk, zusammen mit geeigneten Bindemitteln etc. ein.
Eine bevorzugte Verabreichungshäufigkeit der Verbindungen soll zwei- oder dreimal pro Tag sein.
Verbindungen können auch als Basis für die Identifizierung von noch wirksameren Arzneistoffen dienen, oder von Arzneistoffen, die weiter verringerte Nebenwirkungen haben.
Ausführungsformen der Erfindung werden nun lediglich in Beispielform unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in welchen:
die 1 die Zunahme der Affinität von 2-Methoxyadenosin für den Adenosin-A2A-Rezeptor bei einem pH-Wert von 5,5 im Vergleich mit einem pH-Wert von 7,4 zeigt;
die 2 zeigt, dass die Affinität von 2-Methoxyadenosin (aber nicht CGS21680) für den Ratten-Adenosin-A2A-Rezeptor in dem Maße zunimmt, wie der pH-Wert verringert wird (von 7,4 auf 7,0 bis 6,8);
die 3 die Zunahme der Wirksamkeit von 2-Methoxyadenosin, aber nicht von CGS21680, für den Adenosin-A2A-Rezeptor bei einem pH-Wert von 7,0 im Vergleich mit einem pH-Wert von 7,4 zeigt;
die 4 zeigt, dass 2-Methoxyadenosin die hyperalgetische Wirkung von Carrageenan-induzierter Entzündung hemmt;
die 5 zeigt, dass 2-Methoxyadenosin (0,624 mg/kg p. o.) keine signifikante Wirkung auf den Blutdruck oder die Herzrate hat;
die 6 die Anti-Hyperalgesie-Wirkung von 2-Methoxyadenosin in dem Modell einer chronischen Konstriktionsschädigung von neuropathischem Schmerz zeigt;
die 7 zeigt, dass 2-Methoxyadenosin (62,4 und 624 μg/kg i. p.) Carrageenan-(CGN-)induzierte Entzündung mit einer vergleichbaren Wirksamkeit wie Indomethacin (3 mg/kg, p. o.) bei Konzentrationen, die nicht den Blutdruck beeinflussen, inhibiert; und
die 8 die Veränderung der Plasmakonzentration über einen bestimmten Zeitraum nach der Verabreichung von 2-Methoxyadenosin (0,6 mg/kg) an eine Ratte zeigt.
Beispiel 1
Die Affinität von 2-Methoxyadenosin für den Adenosin-A2A-Rezeptor nimmt in dem Maße zu, wie der pH-Wert verringert wird.
Striatummembranen der Ratte wurden 90 Minuten lang bei 22°C in Gegenwart von 2 nM [3H]-CGS21680, 1 Einheit/ml Adenosindeaminase und unter Erhöhung der Konzentrationen von 2-Methoxyadenosin vor der Filtration und der Flüssigkeits-Szintillationszählung inkubiert. Die Daten wurden in Ein- und Zwei-Stellen-Bindungskurven eingefügt (siehe 1):

a) repräsentiert die Gesamtmenge einer spezifischen Bindung als Prozentsatz;
b) repräsentiert den Anteil der Stellen im Zustand hoher Affinität;
c) repräsentiert den Ki des Zustands einer hohen Affinität (N. B. bei einem pH-Wert von 7,4, die Hillsche Steigung (nH) lag dicht an der Einheit und der Kurvenanpassungs-Algorithmus für eine Zwei-Stellen-Anpassung war nicht in der Lage, realistische Eigenschaften für einen Zustand hoher Affinität zu definieren); und
d) repräsentiert den Ki des Zustand geringer Affinität.

Beispiel 2
Vergleich der Affinität von 2-Methoxyadenosin und CGS21680 für den Adenosin-A2A-Rezeptor bei unterschiedlichem pH-Wert
Die Verdrängung der [3H]-CGS21680-Bindung erfolgte wie für Beispiel 1 beschrieben. Die in 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Affinität von 2-Methoxyadenosin (jedoch nicht CGS21680) für den Ratten-Adenosin-A2A-Rezeptor in dem Maße zunimmt, wie der pH-Wert verringert wird (von 7,4 auf 7,0 bis 6,8).
Beispiel 3
Die Wirksamkeit von 2-Methoxyadenosin, aber nicht von CGS21680, für den Adenosin-A2A-Rezeptor wird bei einem pH-Wert von 7,0 im Vergleich zu einem pH 7,4 erhöht
Der humane A2A-Rezeptor wurde in HEK293-Zellen exprimiert, und die Fähigkeit von Agonisten zur Stimulierung der cAMP-Akkumulation wurde in Gegenwart von Rolipram zur Hemmung der Phosphodiesteraseenzyme bewertet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Beispiel 4
2-Methoxyadenosin hemmt die Hyperalgesie-Wirkung von Karragheen-induzierter Entzündung
Die 4 zeigt, dass 2-Methoxyadenosin die Hyperalgesie-Wirkung von Karragheen-induzierter Entzündung inhibiert: A. 2-Methoxyadenosin (0,6 mg/kg) inhibiert die Karragheen-(CGN-)induzierte thermale Hyperalgesie (CITH) mit einer vergleichbaren Wirksamkeit zu Indomethacin (3 mg/kg, p. o.). B. Konzentration-Antwortreaktion-Beziehung für 2-Methoxyadenosin bei einer 3-Stunden-Nachdosierung.
Carrageenan (2%, 10 Mikroliter) wurde in die rechte Hinterpfote verabreicht. Eine Wärmequelle wurde in der Nähe der behandelten und unbehandelten Hinterpfoten platziert, und es wird der Unterschied in den Pfotenrückzieh-Latenzzeiten gezeigt. 2-Methoxyadenosin wurde zum gleichen Zeitpunkt wie Karragheen verabreicht. 2-Methoxyadenosin war als Indomethacin wirksam (Indo, 3 mg/kg p. o.).
Beispiel 5
2-Methoxyadenosin (bei 0,624 mg/kg p. o.) hat eine signifikante Auswirkung auf den Blutdruck oder die Herzrate
Eine implantierbare Radiotelemtrievorrichtung wurde in der Bauchhöhle von 6 Ratten pro Gruppe platziert. Der Druckkatheter der Vorrichtung wurde in der Bauchschlagader eingeführt, und es wurden zwei Elektroden unter der Haut in einer Lead- bzw. Zuführ-II-Position (linke Seite der Bauchhöhle/rechten Schulter) getunnelt. Einzelne Ratten wurden in ihren eigenen Käfig auf einem Radiorezeptor (DSI) zur Datenerhebung gegeben. Die Wirkung von 0,6 mg/kg 2-Methoxyadenosin oder Vehikel (p. o.) auf den Blutdruck wurde danach bewertet. Die Ergebnisse sind in 5 aufgeführt: A: Blutdruck; B: Herzrate.
Beispiel 6
Die Anti-Hyperalgesie-Wirkung von 2-Methoxyadenosin in dem Modell einer chronischen Konstriktionsschädigung von neuropathischem Schmerz
2-Methoxyadenosin (0,624 mg/kg p. o.) inhibiert die thermale Hyperalgesie, die durch eine chronische Konstriktionsschädigung des Ischiasnervs der Ratte verursacht wird. Unter Anästhesie wurde der Ischiasnerv im rechten Bein freigelegt, und es wurden vier lose Ligaturen um das Nervenbündel gebunden. Nach ungefähr zwei Wochen entwickelten die Ratten thermale Hyperalgesie im operierten Bein, wie durch den Unterschied bei den Pfotenrückzieh-Latenzen der rechten und linken Pfoten beurteilt. Die Verabreichung von 2-Methoxyadenosin verringerte die Hyperalgesie, wie durch die Verringerung des Unterschieds zwischen den Rückzieh-Latenzen gezeigt. 2-Methoxyadenosin war so wirksam wie, oder wirksamer als Carbamazepin (CBZ, 100 mg/kg s. c.). Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
Beispiel 7
2-Methoxyadenosin (62,4 und 624 μg/kg i. p.) inhibiert Karragheen-(CGN-)induzierte Entzündung mit vergleichbarer Wirksamkeit wie Indomethacin (3 mg/kg, p. o.) in Konzentrationen, die nicht den Blutdruck beeinflussen
Karragheen (2%, 10 Mikroliter) wurde in die rechte Hinterpfote verabreicht, und das Pfotenvolumen wurde durch Plethysomometrie bewertet. 2-Methoxyadenosin wurde zum gleichen Zeitpunkt wie Karragheen verabreicht. Die Ergebnisse sind in 7 aufgeführt. 2-Methoxyadenosin war so wirksam wie Indomethacin (Indo, 3 mg/kg p. o.).
Beispiel 8
Die Veränderung der Plasmakonzentration mit der Zeit nach der Verabreichung von 2-Methoxyadenosin (0,6 mg/kg) an eine Ratte
Der EC50-Wert von 2-Methoxyadenosin bei Adenosinrezeptoren (gemessen bei einem pH-Wert von 7,4) beträgt 900 ng/ml (3 μM). Es lässt sich anhand von 8 erkennen, dass die Plasmakonzentration über 2% des EC50-Werts für mehr als 3 Stunden bleibt. Entzündungshemmende und Anti-Hyperalgesie-Wirkungen sind beobachtet worden (ohne Veränderungen des Blutdrucks), wenn die Peakplasmakonzentration zwischen 1% und 30% des in vitro festgestellten EC50-Werts beträgt. Wenn die Peakplasmakonzentration den EC50-Wert erreicht, kommt es zu tiefgreifenden Absenkungen des Blutdrucks, die über Stunden anhalten.
Beispiel 9
Die erhöhte Affinität von Adenosinrezeptoragonisten bei niedrigerem pH-Wert war mit einer entsprechenden Zunahme der GTP-Verschiebung verbunden, was nahelegt, dass diese Agonisten ebenfalls bei dem niedrigeren pH-Wert wirksamer waren. Diese Ergebnisse sind weiter unten zusammengefasst. Tabelle 1. Verdrängung von 3H-CGS21680 von dem Striatum-A2A-Rezeptor bei Ratten (die Werte sind Ki in nM)

pH-Wert von 7,4 pH-Wert von 5,5

CGS21680 10,5 ± 2,1 2,8 ± 1,0

NECA 3,5 ± 0,9 1,1 ± 0,2

CV1808 170 ± 20 35 ± 9

R-PIA 172 ± 21 21 ± 1,4

S-PIA 1712 ± 423 271 ± 4,9

NECA: 5'-N-Ethylcarboxamidoadenosin; CV1808: 2-Phenylamino-adenosin; PIA: Phenylisopropyladenosin.

Alle der oben Genannten offenbarten nur einen Affinitätszustand für Agonisten, was darauf schließen lässt, dass die Zustände einer hohen und geringen Affinität von ähnlicher Affinität sind. Jedoch zeigten 2-Methoxyadenosin und 2-Ethoxyadenosin zwei scheinbare Affinitätszustände bei dem niedrigeren pH-Wert (Tabelle 2). Die Zustände einer hohen Affinität entsprachen ungefähr 25% der Gesamtzahl an Bindungsstellen und wurden durch das Vorhandensein von GTP beseitigt, was darauf schließen lässt, dass sie der Agonistenbindungsstelle von hoher Affinität entsprechen. Tabelle 2. Verdrängung von 3H-CGS21680 von dem striären A2A-Rezeptor der Ratte (die Werte sind Ki in nM)

2-Methoxyadenosin

pH-Wert von 7,4: Hohe Affinität nicht nachweisbar Geringe Affinität 2500 ± 200

pH-Wert von 5,5: Hohe Affinität 12,1 ± 2,7 Geringe Affinität 1200 ± 100

2-Ethoxyadenosin

pH-Wert von 7,4: Hohe Affinität 245 ± 76 Geringe Affinität 6600 ± 2200

pH-Wert von 5,5: Hohe Affinität 2,8 ± 1,2 Geringe Affinität 1200 ± 120
Weiterhin wurden Verbindungen gefunden, die eine höhere Affinität für den Ratten-A1-Rezeptor bei niedrigerem pH-Wert zeigten (Tabelle 3). Tabelle 3. Verdrängung von 3H-DPCPX von dem Ratten-Kortex-A1-Rezeptor (Ki nM)

2-Chloradenosin

pH-Wert von 7,4: Hohe Affinität 4,4 ± 1,8 Geringe Affinität 1670 ± 346

pH-Wert von 6,2: Hohe Affinität 3,7 ± 0,5 Geringe Affinität 1660 ± 40

3'-Desoxy-2-chloradenosin

pH-Wert von 7,4: Hohe Affinität 227 ± 74 Geringe Affinität 11500 ± 850

pH-Wert von 6,2: Hohe Affinität 17 ± 46 Geringe Affinität 13400 ± 2400
Bei beiden pH-Werten beseitigte das stabile Analogon von GTP (GppNHp) den durch 3'-Desoxy-2-chloradenosin erkannten Zustand einer hohen Affinität.
BEISPIEL 10
Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie eine höhere Affinität für Adenosin-A2A-Rezeptoren bei niedrigerem pH-Wert aufweisen
Man fand, dass die unten aufgelisteten Verbindungen eine höhere Affinität für Adenosin-A2A-Rezeptoren bei einem pH-Wert von 5,5 als bei einem pH-Wert von 7,4 aufweisen. Das A2A-Rezeptor-Bindungsassay wurde unter Verwendung von [3H]-CGS21680 durchgeführt und so analysiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ki-Werte der Bindungsstellen mit hoher und niedriger Affinität, welche bei einem pH-Wert von 5,5 nachgewiesen wurden, sind angegeben, und der Ki-Wert der Stelle, die bei einem pH-Wert von 7,4 nachgewiesen wurde.

Wenn X = OH ist

Struktur R₁	pH 5,5 (Ki 1) nM	pH 5,5 (Ki 2) nM	pH 7,4 (Ki 2) nM
OCH3	1,5	380	1300
OCH₂CH₂CH₂CH₃	11	560	280
OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃	3	170	1500
OPh	71	1200	2500
O-(4-cyano)Ph	4	380	1300
O-(3-Ph)Ph	0,7	135	620
5-indanyloxy	12	175	760
O-(3-CH(CH₃)₂)Ph	16	240	560
NH(CH₃)	24	2240	1356
NHCH₂CH₃	130	3500	1200
N(CH₃)₂	24	21440	13350
NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃	0,7	20	290
NHPh	5	2028	160
NH-(4-MeO)Ph	3	180	55
NH-(4-F)Ph	10	150	200
NH-cyclopentyl	2	60	420
NH-cyclohexyl	0,4	100	1000
N-CH₃, N-CH₂CH₂CH(CH₃)₂	26	2600	4000
OCH₂cyclopentyl	0,2	54	200
SO₂CH₂CH₃	100	5250	39000
OCH₂CH₂OH	4	164	203
CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃	15	630	800

X = H

Struktur R₁	PH 5,5 (Ki 1) nM	pH 5,5 (Ki 2) nM	pH 7,4 (Ki 2) nM
OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃	13	440	2990

Struktur R₂	pH 5,5 (Ki 1) nM	pH 5,5 (Ki 2) nM	pH 7,4 (Ki 2) nM
N(CH₃)₂	42	9400	450000
NHCH₂CHC(CH₃)₂	1,5	380	8600
N-CH₃, N-CH₂Ph	7	2100	8500
Piperazinyl	38	7000	5000
N-Me, N-(CH₂CH₂OCH₃)	13	6470	13000

R₁	R₂	R₃	pH 5,5 (Ki 1) nM	pH 5,5 (Ki 2) nM	pH 7,4 (Ki 2) nM
H	NH₂	CH(CH₃)₂	5	190	1930
H	NH₂	H	9	180	270
H	NHCH₃	CH(CH₃)₂	188	3420	2440
OCH₃	NH₂	Ph	230	53400	26100

Struktur R₄	pH 5,5 (Ki 1) nM	pH 5,5 (Ki 2) nM	pH 7,4 (Ki 2) nM
CH₂CH₂CH₃	145	53550	16900
NHCH₂CH₃	40	5900	6570

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines potenziellen Therapeutikums, umfassend das Bestimmen der Affinität einer Testverbindung für einen Adenosinrezeptor bei einem höheren pH-Wert von mindestens 7,4 und auch bei einem niedrigeren pH-Wert von 5,6 bis 7,2 oder von 5,0 bis 7,0 und Identifizieren der Verbindung als ein oben genanntes Mittel, wenn die Affinität bei dem niedrigeren pH-Wert mehr als das 10-Fache beträgt als die Affinität bei dem höheren pH-Wert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Bestimmen der Affinität der Testverbindung das Messen des Bindens von verschiedenen Konzentrationen einer markierten Testverbindung an den Rezeptor umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Bestimmen der Affinität der Testverbindung das Messen der Verdrängung einer gebundenen markierten Verbindung von dem Adenosinrezeptor mit unmarkierter Testverbindung umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Adenosinrezeptor sich in einem Gewebe, einem Gewebeschnitt, einer intakten Zelle, einer aufgebrochenen Zelle oder einer von einer Zelle herrührenden Membran befindet.
Verfahren zum Identifizieren eines potenziellen Therapeutikums, umfassend das Bestimmen der Effizienz der Wirkung einer Testverbindung bei einem Adenosinrezeptor bei einem höheren pH-Wert von mindestens 7,4 und auch bei einem niedrigeren pH-Wert von 5,5 bis 7,2 oder von 5,0 bis 7,0, und Identifizieren der Verbindung als ein oben genanntes Mittel, wenn die Wirksamkeit bei dem niedrigeren pH-Wert mehr als das 10-Fache beträgt als die Wirksamkeit bei dem höheren pH-Wert.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Bestimmen der Wirksamkeit der Testverbindung das Kontaktieren der Testverbindung mit einem Gewebe, einem Gewebeschnitt, einer intakten Zelle oder einer den Adenosinrezeptor umfassenden teilweise aufgebrochenen Zelle umfasst, und Bestimmen der Adenosinrezeptor-Wirkung durch Messen der Akkumulation oder Verarmung eines signalgebenden Moleküls in dem Gewebe, dem Gewebeschnitt, der intakten Zelle oder der teilweise aufgebrochenen Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das signalgebende Molekül cAMP, IP3 oder freies Calcium ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Bestimmen der Wirksamkeit der Testverbindung das Kontaktieren der Testverbindung mit einer den Adenosinrezeptor umfassenden biologischen Membran und das Bestimmen der Adenosinrezeptor-Wirkung durch Messen: der Aktivierung eines G-Proteins; der Aktivität eines Enzyms; oder des Ionenflusses durch einen mit der biologischen Membran assoziierten Ionenkanal umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Aktivierung des G-Proteins durch die Verwendung eines radiomarkierten Guaninnukleotids gemessen wird, oder wobei die gemessene Enzymaktivität Adenylylcyclase-, Phosphodiesterase-, Phospholipase- oder Proteinkinaseaktivität ist, oder wobei der Ionenkanal, durch welchen der Ionenstrom gemessen wird, ein Calcium- oder Kaliumkanal ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Bestimmen der Wirksamkeit der Testverbindung das Kontaktieren der Testverbindung mit einem Gewebe, einem Gewebeschnitt, einer intakten Zelle, einer aufgebrochenen Zelle oder einer den Adenosinrezeptor umfassenden, von Zellen abgeleiteten Membran und das Bestimmen der Adenosinrezeptor-Wirkung durch Messen der Proteinkinaseaktivität in dem Gewebe, dem Gewebeschnitt, der intakten Zelle, der aufgebrochenen Zelle oder der von Zellen abgeleiteten Membran umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Bestimmen der Wirksamkeit der Testverbindung das Kontaktieren der Testverbindung mit einem Gewebe, einem Gewebeschnitt, einer intakten Zelle, einer aufgebrochenen Zelle oder einer den Adenosinrezeptor umfassenden, von Zellen abgeleiteten Membran und das Bestimmen der Adenosinrezeptor-Wirkung durch Messen der Phospholipaseaktivität (z. B. Phospholipase C, Phospholipase A2, Phospholipase D) in dem Gewebe, dem Gewebeschnitt, der intakten Zelle, der aufgebrochenen Zelle oder der von Zellen abgeleiteten Membran umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Bestimmen der Wirksamkeit der Testverbindung das Kontaktieren der Testverbindung mit einem Gewebe, einem Gewebeschnitt, einer intakten Zelle, einer aufgebrochenen Zelle oder einer den Adenosinrezeptor umfassenden, von Zellen abgeleiteten Membran und das Bestimmen der Adenosinrezeptor-Wirkung durch Messen der Proteinphosphorylierung und/oder Dephosphorylierung in dem Gewebe, dem Gewebeschnitt, der intakten Zelle, der aufgebrochenen Zelle oder der von Zellen abgeleiteten Membran umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der niedrigere pH-Wert 5,5 bis 6,5 beträgt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der niedrigere pH-Wert 5,5 bis 6,2 beträgt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Adenosinrezeptor ein Adenosin-A2A-Rezeptor, ein Adenosin-A1-Rezeptor oder ein Adenosin-A3-Rezeptor ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend die Bestimmung, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, in welchem ein Nicht-Humanes-Tiermodell für die Bestimmung verwendet wird, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei bestimmt wird, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung gegen Schmerz oder Entzündung besitzt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 18, wobei bestimmt wird, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung gegen Krebs, Ischämie-Reperfusionsschädigung, übermäßige neuronale Aktivität (zum Beispiel bei Epilepsie oder chronischem Schmerz oder Hyperalgesie, einschließlich entzündlichem und neuropathischem Schmerz), Sepsis, septischen Schock, Neurodegeneration (einschließlich Alzheimer-Krankheit), Muskelermüdung oder Muskelkrampf besitzt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 19, wobei bestimmt wird, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung gegen Arthritis, Asthma, Psoriasis, Darmentzündung, rheumatoide Arthritis, Reizdarmsyndrom oder Osteoarthritis besitzt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 19, wobei bestimmt wird, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung gegen Hyperalgesie besitzt, die als eine Folge von Neuropathie, einschließlich Darmschmerz, Rückenschmerz, Krebsschmerz, HIV-Schmerz, Phantom-Gliederschmerz, postoperativen Schmerz, diabetische Neuropathie, Polyneuropathie, Post-Herpes-Neuralgie oder trigeminale Neuralgie, verursacht wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 19, wobei bestimmt wird, ob das identifizierte Agens eine therapeutische Wirkung gegen Hyperalgesie besitzt, die als eine Folge einer entzündlichen Erkrankung, einschließlich Darmschmerz, Rückenschmerz, Krebsschmerz, Fibromyalgie, postoperativer Schmerz, Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, verursacht wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis 22, in welchem die therapeutische Wirkung des identifizierten Agens bei einer Konzentration unter dem EC50-Wert, vorzugsweise ein Zehntausendstel bis ein Fünftel des EC50-Werts des Agens bei dem Adenosinrezeptor bei einem pH-Wert 7,4 bestimmt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis 23, in welchem die durch das identifizierte Agens verursachten Nebenwirkungen bestimmt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 24, in welchem die Nebenwirkungen bei einer Konzentration unter dem EC50-Wert, vorzugsweise ein Tausendstel bis ein Fünftel des EC50-Werts, des Agens bei dem Adenosinrezeptor bei einem pH-Wert von 7,4 bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, in welchem die Nebenwirkungen Bradykardie-, Hypotonie- oder Tachykardie-Nebenwirkungen sind.
Verfahren zum Identifizieren eines potenziellen Therapeutikums, umfassend das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem Adenosinrezeptor in einem pathologischen Gewebe, einer Zelle oder einer Membran und einem/einer entsprechenden normalen Gewebe, Zelle oder Membran bei einer Konzentration unter dem EC50-Wert der Testverbindung bei dem Adenosinrezeptor bei einem pH-Wert von 7,4, und Bestimmen, ob es einen Unterschied in der Wirkung des Adenosionrezeptors als Reaktion auf einen Kontakt mit der Testverbindung zwischen dem normalen Gewebe und dem pathologischen Gewebe gibt.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Testverbindung als ein potenzielles Therapeutikum identifiziert wird, wenn die Testverbindung ein Agonist des Adenosinrezeptors ist und die Wirkung des Adenosinrezeptors in Reaktion auf die Testverbindung bei dem pathologischen Gewebe größer als bei dem normalen Gewebe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei das pathologische Gewebe Epithelgewebe umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 29 zum Identifizieren eines potenziellen Therapeutikums für die Behandlung von Psoriasis, Asthma oder COPD.