JP4701330B2 - 治療用化合物の同定 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、治療を必要とする部位を標的とし得る化合物の同定および治療上の使用に関する。

正常な哺乳動物組織において、細胞外ｐＨは、ｐＨ７．３５から７．４５の間に厳密に制御されている。ある組織、特に、胃の内腔（ｐＨ２から３の間）、およびいくつかの上皮表面（例えば、肺表面のｐＨは約６．８である（Jayaraman, S. et al. (2001) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, C1504-1511））はより低いｐＨ値となる。

病理組織、例えば、炎症、虚血、および他の種類の損傷中、ｐＨの低下が生じる。例えば、関節炎にかかった関節において、最大１単位のｐＨの低下が典型的に観察される（Andersson, S. E. et al. (1999) J. Rheumatol. 26、2018-2024）。最近になって、骨関節炎にかかった関節の軟骨は、５．０もの低いｐＨ値となることが示された（Konttinnen, Y. T. et al., (2002) Arth. Rheum. 46, 953-960）。過剰な神経活性も、細胞外ｐＨの低下を生じ得る。例えば、てんかん発射、および脊髄の過剰刺激は、細胞外ｐＨの変化と関連する（Chesler, M. Prog. Neurobiol. (1990) 34, 401-427）。同様に、細胞外ｐＨの低下は、固形腫瘍（５．５もの低いｐＨ値が観察される）において、おそらくは乏しい灌流および優位な解糖系の代謝の結果として観察される（Thistlethwaite, A. J. et al. Radiation Oncology Biol. Phys. (1985) 11, 1647-1652）。虚血において、血液供給の不足は、ｐＨの降下（Immke, D. C. & McCleskey, E. W. (2001) Nature Neurosci. 4, 869-870）、続いて炎症細胞の活性化を生じる。

これらの疾患および状態全てに共通する因子は、関与する組織のエネルギー需要が供給を上回ることである。このことは、乳酸およびピルビン酸産生を伴う嫌気性代謝を生じる。ｐＨ変化の別の関与因子は、分泌胞（例えば、神経終末または炎症細胞におけるもの）の細胞外空間への放出であり、これは、これらの空胞の内容物が低いｐＨで維持されているからである。ｐＨの低下は、組織の保護の手助けとなり得る。例えば、虚血性損傷に深く関与するＣＮＳのＮＭＤＡ受容体は、ｐＨ６．８で阻害される。

上記の疾患の別の共通因子は、アデノシンである。アデノシンは、４種の既知の受容体、アデノシンＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３受容体に作用する、偏在的局所性ホルモン／神経伝達物質である。アデノシンは、一般に、組織におけるエネルギーの供給と需要とのバランスをとる働きをする。例えば、心臓において、放出されたアデノシンは、心房および結節におけるＡ１受容体介在性作用により、心臓の動きを遅くさせ（Belardinelli, L & Isenberg, G Am. J. Physiol. 224, H734-H737）、一方同時に、エネルギー（すなわち、グルコース、脂質、および酸素）供給を増加させるために冠動脈を拡張させる（Knabb et al., Circ. Res. (1983) 53, 33-41）。同様に、炎症中、アデノシンは炎症活性を抑制するために働き、一方で、過剰な神経活性状態（例えば、てんかん）において、アデノシンは神経発射を抑制する（Klitgaard et al., Eur J. Pharmacol. (1993) 242、221-228）。この系、またはその変形系が全ての組織に存在する。従って、ｐＨが降下した状態下で、局所性アデノシンは、エネルギーの供給と需要とのバランスをとり、これにより正常組織機能およびｐＨを保持するために働く。

アデノシン自体は、上室性頻拍症を診断し、処置するために用いられ得る。アデノシンＡ１受容体アゴニストは、強力な鎮痛剤として作用することが知られている（Sawynok, Eur J Pharmacol. (1998) 347, 1-11）。アデノシンＡ２Ａ受容体アゴニストは、抗炎症剤として作用することが知られている（例えば、ＵＳ５，８７７，１８０、およびＷＯ９９／３４８０４）。実験動物において、Ａ２Ａ受容体アゴニストは、敗血症、関節炎、および腎臓動脈、冠動脈、または大脳動脈の閉塞から生じる虚血・再灌流損傷を含む広範な状態に対して有効であると示されてきた。これらの状態の共通因子は、炎症応答の低減であり、これは全てではないがほとんどの炎症細胞上の該受容体の阻害作用により引き起こされる。

しかしながら、アデノシン受容体の偏在的分布は、アデノシン受容体アゴニストの投与が有害な副作用を生じることを意味している。このことが、一般に、アデノシンベースの治療の開発を妨げてきた。選択的Ａ１受容体アゴニストは徐脈を生じる。第１の選択的Ａ２Ａ受容体アゴニスト（２−［４−（２−カルボキシエチル）フェニルエチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、またはＣＧＳ２１６８０）が、フェーズ２Ａ臨床治験において可能性のある抗高血圧剤として試験された。しかしながら、投与により、血圧の大降下および心拍出量の増加が引き起こされた。ＦＲ２１６２１２８は、アデノシン誘導体（少なくとも２個の炭素原子からなる低級アルキル基を含む２−アルコキシアデノシン誘導体を含む）が血圧降下活性および冠動脈拡張活性を有することを開示している。

Bartlett等（J. Med. Chem. 1981、24, 947-954）は、１−メチルイソグアノシン類似体の評価を開示している。これらの類似体は、２−メトキシアデノシン（スポンゴシン（spongosine）としても知られている）を含む。この化合物および他の化合物は、経口投与後のげっ歯類において、その骨格筋弛緩作用、体温低下作用、心血管作用、および抗炎症作用について試験された。２−メトキシアデノシンは、２０ｍｇ／ｋｇ経口投与したラットにおいて、カラギーナン（carageenan）誘発炎症を２５％抑制した。しかしながら、平均血圧の低下（４１％）および心拍数の低下（２５％）も、この用量で該化合物を投与した後に観察された。
それゆえ、投与され得るアデノシン受容体アゴニストに最小限の副作用をもたらす必要がある。

AskalanとRichardson（J. Neurochem. (1994) 63:1477-1484）は、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンド結合部位におけるヒスチジン残基の役割について記載している。具体的には、リガンド結合のｐＨ依存度が調べられた。あるリガンドについて親和性の２から４倍の増大が、周囲のｐＨを７．０から５．５に低下させると観察された。しかしながら、アデノシンＡ２Ａ受容体の作用は研究されていなかった。

Hiley等は、ラットの単離された灌流上腸間膜動脈床において、アデノシンに対する応答へのｐＨの作用を調べた。灌流液のｐＨを６．８に低下させると、アデノシンに対する拡張性応答が１０倍増強された。

この度、意外なことに、本出願人は、生理的範囲内にある比較的低いｐＨ値において、ある化合物が高いｐＨ値においてより実質的に高い（およそ１００倍高い）、アデノシン受容体に対する親和性および／または作用効力を有することを見出した。このことは、受容体がｐＨの変化に応答して、その構造を変化させるためであると思われる。

本出願人は、アデノシン受容体のｐＨ感受性を利用して、低いｐＨ条件下で高い受容体親和性および／または効力をただ有する他のアデノシン受容体リガンドが同定され得ることを理解している。次に、かかるアデノシン受容体リガンドの作用は、既知のアデノシン受容体リガンドの投与に関連する重篤な副作用を生じることなく、病理組織のような低いｐＨ領域を標的とし得る。

本発明により、可能性のある治療剤を同定する方法が提供され、該方法は、高い方のｐＨ（少なくともｐＨ７．２）、およびまた低い方のｐＨ（５．５から７．２）におけるアデノシン受容体に対する試験化合物の親和性および／または有効性を決定し、次に、低い方のｐＨにおける親和性および／または有効性が、高い方のｐＨにおけるものより高い場合、化合物を該剤として同定する、を含む。

低い方のｐＨにおける、可能性のある治療剤のアデノシン受容体に対する親和性および／またはアデノシン受容体でのその有効性と、高い方のｐＨにおけるそれらとの差が、できるだけ大きいことが好ましい。親和性および／または有効性に大きな差がある場合、剤は有益な治療効果を有する用量で投与されることができ、剤の高用量と関連する任意の副作用は回避されるか、あるいは最小限に抑えられると予測される。好ましくは、低い方のｐＨにおける親和性および／または有効性は、高い方のｐＨにおける親和性および／または有効性より１０倍、より好ましくは、１００倍、最も好ましくは、１０００倍を超えて高い。

低い方のｐＨにおいてより高い親和性および／または有効性を有するアゴニストは、治療、例えば、疼痛、特に、神経障害性疼痛または慢性炎症性疼痛、および関節炎の予防、処置、または改善において有用であり得る。これらのアゴニストの選択性は、それらが、病理組織、例えば、関節炎にかかった関節を標的とすることができ、これにより先行技術により示唆されるものより低い用量の有効投与を可能とし、副作用を最小限に抑えることを意味している。

受容体がｐＨ７で存在するものとは異なる構造形をとることが分かると、本発明の方法を用いて、低いｐＨにおいて高親和性でアデノシンＡ２Ａ受容体にのみ結合するリガンドが同定され得る。これらのリガンドは低いｐＨにおいてのみ有効なアゴニストであるので、それらは、ｐＨが抑えられている体内部位、最も著しくは、関節炎の関節包および同様の炎症性疼痛部位においてのみ作用し得る。

本発明の方法を用いて、低いｐＨにおいて高親和性でアデノシンＡ１受容体にのみ結合するリガンドが同定され得る。かかるリガンドは、過度の組織活性、例えば、神経活性を低下させる際に有用であり、かつ既知のアデノシンＡ１受容体アゴニストと比較して低減した副作用を有すると予測される。既知のアゴニストの副作用は、徐脈および動脈炎を含む。

本発明の方法を用いて、低いｐＨにおいて高親和性でアデノシンＡ３受容体にのみ結合するリガンドが同定され得る。かかるリガンドは、炎症疾患の処置において有用であると予測される。

本明細書において提供される情報に基づき、当業者は、特定の疾患状態の処置に適した活性剤を同定することができる。これらの剤は、病理組織において選択的に活性であり、従って、正常組織における受容体と関連する副作用の発生率および重篤度を低減させる。

単離された組織および細胞調製物において、ｐＨ感受性は正確に測定され得る。それゆえ、証拠が病理（例えば、炎症性疼痛）動物モデルで得られた後、適当な基準に見合った化合物が続く薬剤発見の「ヒット」となるであろう。

本発明の方法を用いて同定された化合物は、種々の状態の治療（予防を含む）において役立つと予測される。これらは、予防、処置、または改善がアデノシン受容体の活性化により介在される疾患または状態を含む。例としては、炎症、虚血・再灌流損傷、過剰神経活性（例えば、てんかん、または炎症性疼痛および神経障害性疼痛を含む慢性疼痛または痛覚過敏）、敗血症、敗血性ショック、神経変性（例えば、アルツハイマー病）、およびエネルギー需要が供給を上回っている他の状態、例えば、筋疲労または選手の痙攣のような局所組織のエネルギー需要が供給を上回るか、および／またはｐＨが降下している疾患または状態を含む。

本発明の方法を用いて同定された化合物は、疼痛、具体的には、以下の種類の疼痛：腸の疼痛、膵臓の疼痛、骨盤／会陰の疼痛、背中の疼痛、腰痛、胸痛、心臓痛、骨盤の疼痛／ＰＩＤ、関節痛（例えば、腱炎、滑液包炎、急性関節炎と関連するもの）、頚痛、産科系の疼痛（陣痛または帝王切開）、癌性疼痛、ＨＩＶ性疼痛、幻肢痛、術後疼痛、慢性神経障害性疼痛、腰椎手術の失敗による疼痛（failed back surgery pain）、身体外傷後疼痛（銃創、交通事故、または火傷により引き起こされる疼痛を含む）、瘢痕組織疼痛、急性帯状疱疹疼痛、急性膵炎突出痛（癌）、疱疹後神経痛、三叉神経痛の予防、処置、または改善において有効であり得る。

本発明の方法を用いて同定された化合物は、神経障害性疼痛、または糖尿病性神経障害、多発性神経障害、線維筋痛、筋膜痛症候群、骨関節炎、関節リウマチ、座骨神経痛または腰椎神経根障害、脊椎管狭窄症、顎関節症、腎疝痛、月経困難症（dysmenorrhoea）／子宮内膜症により引き起こされる、あるいは関連する他の疼痛の予防、処置、または改善において有効であり得る。

本発明の方法を用いて同定された化合物は、炎症性疼痛、または骨関節炎、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎のような関節炎状態、または喘息、慢性閉塞性肺疾患、線維症、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌ショック、毒素性ショック、出血性ショック、成人呼吸窮迫症候群、脳マラリア、臓器移植の拒絶反応、癌に続発する疼痛、ＨＩＶ、慢性肺炎症性疾患、珪肺症、肺肉腫（pulmonary sarcosis）、骨吸収疾患、再灌流損傷、移植片体宿主病、多発性硬化症、重症筋無力症、同種移植拒絶反応、感染に起因する発熱および筋肉痛、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、ケロイド形成、瘢痕組織形成、クローン病、潰瘍性大腸炎およびピレシス（pyresis）、過敏性腸症候群、骨粗鬆症、脳マラリア、細菌性髄膜炎、またはアムホテリシンＢ処置、インターロイキン−２処置、ＯＫＴ３処置、またはＧＭ−ＣＳＦ処置に由来する副作用により引き起こされる、あるいは関連する他の疼痛の予防、処置、または改善において有効であり得る。

本発明の方法により同定された化合物は、特に、関節炎（特に、関節炎の関節包におけるもの）、喘息、乾癬、および腸炎を含む、特有の種の炎症の予防、処置、または改善に有効であり得る。

本発明の方法により同定された化合物は、特に、関節リウマチ、過敏性腸症候群、または骨関節炎の予防、処置、または改善において有効であり得る。

化合物の有用性は、以下に記載の放射性リガンドアッセイにより決定されてもよい。親和性の増大は、高親和性結合部位（すなわち、アゴニスト活性部位）について測定され得る一方で、異なるｐＨ値におけるアゴニストの有効性が、低親和性状態と高親和性状態との差を評価することにより決定され得る。これは、ＧＴＰおよびそれらの安定な類似体（受容体の高親和性部状態を低親和性状態に変換し、これにより、アゴニストによる受容体の活性化を模倣する）を用いて行われ得る。有効でないリガンド（すなわち、アンタゴニスト）は、これらの異なる親和性状態間で差を生じない。あるいは、異なるｐＨ値において異なる親和性および／または有効性を有するアゴニストが、２次メッセンジャーの生成または除去（例えば、ｃＡＭＰ蓄積、イノシトールリン酸代謝回転、カルシウムシグナル伝達、キナーゼ活性化等の刺激または阻害）の測定のような機能的アッセイにおいて同定され得る。

アデノシン受容体に対する試験化合物の親和性は、以下の方法：
ｉ）複数の濃度の標識試験化合物（放射性標識試験化合物を含む）の、組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜に存在するアデノシン受容体との結合；
ｉｉ）かかる受容体を生じる組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜を用いた非標識試験化合物とのインキュベーションによる、結合した標識化合物のアデノシン受容体からの解離、
のいずれにより決定されてもよい。標識化合物は、試験化合物、または受容体の選択的リガンドのいずれであってもよい。

アゴニストの有効性は、その受容体を活性化するその能力に影響すると考えられるだろう。高い有効性を有するアゴニストは最大限の受容体応答を顕現させ、そして部分的アゴニストはよりわずかな応答を顕現させる。アデノシン受容体での試験化合物の作用の有効性は、以下の方法：
ｉ）組織、組織切片、完全な（intact）細胞、または部分的に破壊された細胞におけるｃＡＭＰ、ＩＰ３、および遊離カルシウムを含むシグナル伝達分子の蓄積または減少の測定による、アデノシン受容体作用の決定；
ｉｉ）Ｇタンパク質活性化の測定による（例えば、放射性標識グアニンヌクレオチドの使用による）、あるいは酵素活性（例えば、アデニルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、またはプロテインキナーゼ）の測定による、あるいはアデノシン受容体により活性化されたイオンチャンネル（例えば、カルシウムまたはカリウムチャンネル）を介したイオン流の測定による、試験化合物に応答したアデノシン受容体の活性化の評価するための生体膜の使用；
ｉｉｉ）組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜におけるプロテインキナーゼ活性の測定による、アデノシン受容体活性の決定；
ｉｖ）組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜におけるホスホリパーゼ活性（例えば、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ）の測定による、アデノシン受容体活性の決定；
ｖ）組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜におけるタンパク質リン酸化および脱リン酸化の測定による、アデノシン受容体活性の決定、
のいずれにより決定されてもよい。

化合物の活性レベル（すなわち、その固有の有効性）は、所望の効果に依存して変動可能である。例えば、低い有効性のアゴニストは、受容体脱感作の発生率を低減させる際、あるいは、すなわち、多くの受容体を保持するそれらの組織に対して余分な標的化の余地を与える際に有用であり得る。活性は、以下に報告される任意の活性剤に対するものと、好ましくは、少なくとも５０％高く、より好ましくは、少なくとも同等の高さである。差は、好ましくは、生理的ｐＨ（７．４）とｐＨ５．５または例えば、６．２（極度の虚血組織）、６．５、７．０（慢性炎症の範囲での典型）、または７．２より上の間でみられる。代わりに、低親和性の部分的アゴニストは、受容体と結合し、内在性伝達物質／ホルモン（例えば、アデノシン）の結合を防ぐ機能的アンタゴニストとして用いられ得る。

可能性のある治療剤が同定されると、次に該剤が、例えば、疼痛または炎症（特に、上述の任意の疾患または状態）に対する治療効果を有するか否かが決定されてもよい。好ましくは、非ヒト動物モデルを用いて、同定された剤が治療効果を有するか否かが決定される。任意の適当な動物モデルが用いられてもよい。例としては、コラーゲンＩＩの注射により誘発された関節炎、ストレプトゾトシン糖尿病により誘発された神経障害性疼痛を含む。

好ましくは、同定された剤の治療効果は、ｐＨ７．４におけるアデノシン受容体での該剤のＥＣ５０値より下の濃度で決定される。より好ましくは、治療効果は、ＥＣ５０値の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から１００分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１の濃度で決定される。

同定された剤が、最小限に抑えられた副作用で投与され得るかを確かめるために、同定された剤により引き起こされる副作用（例えば、静脈、血圧降下、または頻脈）が決定されてもよい。好ましくは、これらは、ｐＨ７．４におけるアデノシン受容体での剤のＥＣ５０値より小さい濃度で決定される。より好ましくは、副作用は、ＥＣ５０値の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１の濃度で決定される。

アデノシンＡ１またはＡ２受容体のアゴニストである、多数の化合物が同定された。これらの化合物は、低い方のｐＨにおいてアデノシンＡ１またはＡ２受容体に対して、より高い親和性を有する。受容体は、ｐＨの変化に応答して、その構造を変化させると考えられている。この変化が生じる正確な機序は分かっていないが、これらの受容体とのアゴニストの結合に関与し、かつ生理的範囲のｐＫ値を有するヒスチジン残基が関与すると考えられる。

図１は、親和性の増大が、リガンド結合実験におけるｐＨがｐＨ７．４からｐＨ５．５に低減されるに伴い、２−メトキシアデノシンを用いて観察されたことを示す。図２は、親和性の同様の増大はｐＨ７．０およびｐＨ６．８において観察されたが、原型Ａ２Ａ受容体アゴニストであるＣＧＳ２１６８０はこの作用を示さないことを示す。親和性変化の別の意外な結果は、アデノシンＡ２Ａ受容体における２−メトキシアデノシンの有効性が約１００倍増大されたことである（図３）。対照的に、３’−デオキシ−２−メトキシアデノシンは、ｐＨが７．４から６．２に下げられた場合に、Ａ１受容体において親和性の増大を示した。ヒトＡ１受容体からの［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸの置換における高親和性部位について決定されたＫｉ値は、ｐＨ７．４において１５８±８５ｎＭであり、ｐＨ６．２において４０５±１１４ｎＭであった。従って、アデノシン受容体アゴニストおよび部分的アゴニストは、組織ｐＨの局所変化によって大いに影響され得ること、そして意外なことに、これらのリガンドの有効性が増大されるか、あるいは低減され得ることが明らかとなる。有効性の低減を示す化合物は、低親和性部分的アゴニストとして作用するようである。

本出願人は、可能性のある治療剤がまた、試験化合物を、かなりのアデノシン受容体（すなわち、有益な治療効果を顕現させるのに十分なアデノシン受容体）を（ｐＨ７．４において）活性化すると予測されるものより低用量でインビボまたはインビトロにおいて投与し、次に、正常組織と比較して病理組織において受容体を活性化するのに必要な用量の差を評価することにより同定され得ることを意図している。

本発明のさらなる態様によると、可能性のある治療剤を同定する方法が提供され、該方法は、試験化合物をアデノシン受容体（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、またはＡ３アデノシン受容体）と、病理組織、細胞、または膜、および対応正常組織、細胞、または膜において、ｐＨ７．４におけるアデノシン受容体での試験化合物のＥＣ５０値より低い濃度で接触させ、次に、正常組織と病理組織間で、試験化合物との接触に応答したアデノシン受容体の作用に差があるか否かを決定する、を含む。

好ましくは、試験化合物は、ＥＣ５０値の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１の濃度でアデノシン受容体と接触される。

試験化合物がアデノシン受容体のアゴニストであり、試験化合物に応答したアデノシン受容体の作用が、正常組織においてより病理組織において大きい場合、試験化合物は可能性のある治療剤として同定される。病理組織が上皮組織を含む場合、上皮性疾患（例えば、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ）の処置のための可能性のある治療化合物が同定され得る。

異なるｐＨにおいて異なる受容体親和性および／または有効性を有するか、あるいは正常組織と比較して病理組織においてアデノシン受容体の異なる作用を引き起こす、アデノシン受容体アゴニストは、アデノシンの誘導体を含む。従って、本発明の方法は、スクリーニング方法として（特に、アデノシンの誘導体をスクリーニングするため）用いられ得ることが意図されるだろう。ｐＨ７．４において低い親和性（すなわち、アデノシン受容体に対するＫｄ＞０．５μＭ）、および／または有効性を有する誘導体が好ましい。異なるアデノシン受容体に対する誘導体の選択性は、低減したｐＨで変化し得るので、与えられた化合物の選択性は、正常ｐＨおよび低減したｐＨにおいて決定されるべきである。

本発明によると、以下の一般式：

（式中、ＲはＣ_１−４アルコキシであり、ＸはＯＨである）

（式中、ＲはＣ_１−４アルコキシであり、ＸはＨである）
の化合物が見出され、これらの多くが、低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有すると考えられる。

実施例１０において例示される化合物は、低い方のｐＨにおいてアデノシンＡ２Ａ受容体に対してより高い親和性を有することが見出されている。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）、あるいは実施例１０の化合物は、種々の疾患または状態の予防、処置、または改善において医薬として用いられ得る。これらは、予防、処置、または改善がアデノシン受容体の活性化により介在される、疾患または状態を含む。例としては、局所性組織エネルギー需要が供給を上回っているか、および／またはｐＨが降下している疾患または状態を含む。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）、あるいは実施例１０の化合物は、特に、癌、炎症、虚血・再灌流損傷、疼痛、過剰な神経活性（例えば、てんかん、または炎症性疼痛および神経障害性疼痛を含む慢性疼痛または疼痛過敏におけるもの）、敗血症、敗血性ショック、神経変性（アルツハイマー病を含む）、筋疲労または筋痙攣（特に、選手の痙攣）の予防、処置、または改善のための医薬の製造のために用いられ得る。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体における作用のより高い有効性を有する、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）、あるいは実施例１０の化合物は、以下の種類の疼痛：腸の疼痛、膵臓の疼痛、骨盤／会陰の疼痛、背中の疼痛、腰痛、胸痛、心臓痛、骨盤の疼痛／ＰＩＤ、関節痛（例えば、腱炎、滑液包炎、急性関節炎と関連するもの）、頚痛、産科系の疼痛（陣痛または帝王切開）、癌性疼痛、ＨＩＶ性疼痛、幻肢痛、術後疼痛、慢性神経障害性疼痛、腰椎手術の失敗による疼痛、身体外傷後疼痛（銃創、交通事故、または火傷により引き起こされる疼痛を含む）、瘢痕組織疼痛、急性帯状疱疹疼痛、急性膵炎突出痛（癌）、疱疹後神経痛、三叉神経痛；神経障害性疼痛、または糖尿病性神経障害、多発性神経障害、線維筋痛、筋膜痛症候群、骨関節炎、関節リウマチ、座骨神経痛または腰椎神経根障害、脊椎管狭窄症、顎関節症、腎疝痛、月経困難症/子宮内膜症により引き起こされるか、あるいは関連する他の疼痛；または炎症性疼痛、または骨関節炎、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎の様な関節炎状態、または喘息、慢性閉塞性肺疾患、線維症、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌ショック、毒素性ショック、出血性ショック、成人呼吸窮迫症候群、脳マラリア、臓器移植の拒絶反応、癌に続発する疼痛、ＨＩＶ、慢性肺炎症性疾患、珪肺症、肺肉腫、骨吸収疾患、再灌流損傷、移植片体宿主病、多発性硬化症、重症筋無力症、同種移植拒絶反応、感染に起因する発熱および筋肉痛、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、ケロイド形成、瘢痕組織形成、クローン病、潰瘍性大腸炎およびピレシス、過敏性腸症候群、骨粗鬆症、脳マラリア、細菌性髄膜炎、またはアムホテリシンＢ処置、インターロイキン−２処置、ＯＫＴ３処置、またはＧＭ−ＣＳＦ処置に由来する副作用により引き起こされるか、あるいは関連する他の疼痛の予防、処置、または改善において有効であり得る。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、および実施例１０の化合物は、特に、関節炎（特に、関節炎の関節包におけるもの）、喘息、乾癬、および腸炎を含む特定の種類の炎症の予防、処置、または改善に有効であり得る。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、および実施例１０の化合物は、特に、関節リウマチ、過敏性腸症候群、または骨関節炎の予防、処置、または改善に有効であり得る。

本発明により、癌、炎症、虚血・再灌流損傷、疼痛、過剰な神経活性（例えば、てんかん、または炎症性疼痛および神経障害性疼痛を含む慢性疼痛または痛覚過敏におけるもの）、敗血症、敗血性ショック、神経変性（アルツハイマー病を含む）、筋疲労または筋痙攣（特に、選手の痙攣）の予防、処置、または改善方法がさらに提供され、これは、低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対するより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）、または実施例１０の化合物を、かかる予防、処置、または改善の必要な対象に投与することを含む。

式（Ｉ）の化合物は、２−メトキシアデノシン、２−エトキシアデノシン、２−プロポキシアデノシン、２−イソプロポキシアデノシン、および２−ブトキシアデノシンを含む。式（Ｉ）の好ましい化合物は、２−メトキシアデノシン、２−エトキシアデノシン、および２−ブチルオキシアデノシンである。

式（ＩＩ）の化合物は、３’−デオキシ−２−メトキシアデノシン、３’−デオキシ−２−エトキシアデノシン、３’−デオキシ−２−プロポキシアデノシン、３’−デオキシ−２−イソプロポキシアデノシン、および３’−デオキシ−２−ブトキシアデノシンを含む。式（ＩＩ）の好ましい化合物は、３’−デオキシ−２−プロポキシアデノシン、３’−デオキシ−２−イソプロポキシアデノシン、および３’−デオキシ−２−ブトキシアデノシンである。

２−メトキシアデノシンは、アデノシンＡ２Ａ受容体でのＥＣ５０値が３μＭであると報告されている（Daly, J.W. et al. (1993) Pharmacol. 46, 91-100）。しかしながら、この化合物は、意外なことに、血漿濃度０．２μＭまたはそれ未満で抗痛覚過敏活性および抗炎症活性がすでに見出されていた。この低用量において、２−メトキシアデノシンは、副作用の発生率および重篤度を低減した。鎮痛剤としての２−メトキシアデノシンの活性は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０３／０５３７９（本願出願日において未公開）の主題である。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、式（Ｉ）の他の化合物、および式（ＩＩ）の他の化合物（および実施例１０の化合物）（および、本発明の方法を用いて同定された化合物）も、他のアデノシン受容体アゴニストより低用量でずっと有効であると考えられる。したがって、かかる化合物は、副作用の低減した発生率および重篤度を有する用量で有効に投与され得る。これらの化合物は、代わりにあるいはさらに、他のアデノシン受容体アゴニストと比較して副作用の低減した発生率および重篤度を有し得る。

疼痛は２つの要素を有し、それぞれが、感覚神経の活性化に関与する。第１の要素は、感覚神経が、例えば、皮膚の加温または加圧の結果として刺激される際の早期フェーズまたは即時フェーズである。第２の要素は、以前に損傷された組織を刺激する知覚機序の感受性の増大の結果である。この第２の要素は、痛覚過敏と呼ばれ、組織損傷から生じる慢性疼痛の全ての型に関与するが、疼痛知覚の早期フェーズまたは即時フェーズには関与しない。

従って、痛覚過敏は、組織損傷により引き起こされる、疼痛認知の増大した状態である。この状態は、損傷した個体による損傷組織の保護を促進し、組織修復が生じる時間を与えるために恐らく設計された、神経系の本来の応答である。２つの既知の、この状態の背後にある原因が存在し、それは、感覚神経活性の増大、および脊髄で生じる侵害受容情報の神経処理の変化である。痛覚過敏は、慢性炎症（例えば、関節リウマチ）状態において、および感覚神経損傷が生じた場合（すなわち、神経障害性疼痛）、弱められ得る。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、本発明の方法により同定される化合物、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、および実施例１０の化合物は、アデノシン受容体を活性化すると分かっているものより十分に低い濃度を与えることが予測される用量で投与される場合でさえ、神経障害性疼痛および炎症性疼痛に罹患している哺乳動物において、疼痛認知を阻害するのに有効であると考えられる。これらの用量において、これらの化合物は、他のアデノシン受容体アゴニストの投与と関連する有意な副作用を生じることなく、そしてまた正常な感覚認知を低減させることなく、神経障害性疼痛および炎症性疼痛を処置できる。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、本発明の方法により同定された化合物、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、実施例１０の化合物は、腸の疼痛、背中の疼痛、癌性疼痛、ＨＩＶ性疼痛、幻肢痛、術後疼痛、糖尿病性神経障害、多発性神経障害、疱疹後神経痛、および三叉神経痛を含む神経障害の結果として引き起こされる疼痛（特に、痛覚過敏）の予防、処置、または改善のための抗痛覚過敏剤として用いられ得る。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、本発明の方法により同定された化合物、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物は、腸の疼痛、背中の疼痛、癌性疼痛、線維筋痛、術後疼痛、骨関節炎、および関節リウマチを含む炎症性疾患の結果として引き起こされる疼痛（特に、痛覚過敏）の予防、処置、または改善のための抗痛覚過敏剤として用いられ得る。

低い方のｐＨにおいてアデノシン受容体に対してより高い親和性、および／またはアデノシン受容体での作用のより高い有効性を有する、本発明の方法により同定された化合物、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、および実施例１０の化合物は、主要な２種類の既知鎮痛剤である化合物と比較して、疼痛（特に、痛覚過敏）を処置するために用いられるときの利点（例えば、増大した有効性および／または低減した副作用）を有すると予測される。（ｉ）非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、および関連ＣＯＸ−２阻害剤；および（ｉｉ）モルヒネベースのアヘン剤がある。これら両方の種類の鎮痛剤は、一般的な侵害受容性疼痛を制御するのに有効である。しかしながら、それらは、神経障害性疼痛のようなある種の痛覚過敏性疼痛に対してはあまり有効でない。多くの医療従事者は、これらの化合物の投与により引き起こされる副作用、および患者がそれらの中毒となり得る可能性のせいで、神経障害性疼痛に作用するのに必要な高用量でアヘン剤を処方するのを嫌がる。ＮＳＡＩＤは、アヘン剤より随分効果が小さいので、より高用量のこれらの化合物が必要とされる。しかしながら、このことは、これらの化合物が胃腸管の炎症を引き起こすため、望ましくない。

対象に投与される、本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）、あるいは実施例１０の化合物の量は、ｐＨ７．４におけるアデノシン受容体での該化合物のＥＣ５０値より低い最高血漿濃度を与える量でなければならない。

化合物のＥＣ５０値は、異なるアデノシン受容体（すなわち、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３アデノシン受容体）に対して異なるようであると考えられるだろう。投与されるべき化合物の量は、異なる受容体での化合物の最も低いＥＣ５０値と比べて、計算されるべきである。

最高血漿濃度は、ＥＣ５０値の千分の１から５分の１、または５０分の１から３分の１（より好ましくは、千分の１から２０分の１、百分の１または５０分の１から５分の１、５０分の１から１０分の１、または１０分の１から５分の１）であり得る。好ましくは、最高血漿濃度は、ＥＣ５０値の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１である。

好ましくは、投与量は、ｐＨ７．４におけるアデノシン受容体での化合物のＥＣ５０値の千分の１と５分の１の間、より好ましくは、千分の１と２０分の１、または百分の１と５分の１、または５０分の１と５分の１の間で１時間より長く維持される血漿濃度を生じる。より好ましくは、投与量は、１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１で１時間より長く維持される血漿濃度を生じる。

誤解を避けるために、化合物のＥＣ５０値は、本明細書において、受容体応答のベースラインと受容体応答の最大値との中間の受容体応答（例えば、用量応答曲線を用いて決定される）を誘発する化合物の濃度として定義される。

ＥＣ５０値は、標準条件（ｐＨ７．４に緩衝化した平衡塩類溶液）下で決定されるべきである。単離された膜、細胞、および組織を用いてのＥＣ５０の決定のため、これは、ｐＨ７．４の緩衝塩類溶液（例えば、細胞培地）中であろう（例えば、Daly et al. (Pharmacol. (1993) 46, 91-100)、または好ましくは、Tilburg et al (J. Med. Chem. (2002) 45, 91-100)に記載）。ＥＣ５０はまた、正常健常動物において、あるいは正常健常動物において正常条件（すなわち、酸素化血液、またはｐＨ７．４に緩衝化された酸素化等張培地）下でかん流された組織において、アデノシン受容体介在性応答を測定することによりインビボで決定され得る。

あるいは、投与される、本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物の量は、アデノシン受容体におけるＫｄ値の千分の１から２０分の１、千分の１から３分の１、より好ましくは、百分の１から５分の１、または５０分の１から１０分の１の最高血漿濃度を生じる量であってもよい。より好ましくは、アデノシン受容体でのＫｄ値の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１の最高血漿濃度を生じる量である。

化合物のＫｄ値は、異なるアデノシン受容体（すなわち、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３アデノシン受容体）に対して異なるだろうと考えられるであろう。投与されるべき化合物の量は、異なる受容体に対する化合物の最低Ｋｄまたは最高Ｋｄと比較して計算されてもよい。

好ましくは、投与される化合物の量は、アデノシン受容体での化合物のＫｄ値の千分の１と５分の１の間、より好ましくは、千分の１と２０分の１、または百分の１と５分の１、または５０分の１と５分の１の間で少なくとも１時間維持される血漿濃度を生じる量である。より好ましくは、量は、アデノシン受容体での化合物のＫｄ値の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１で少なくとも１時間維持される血漿濃度を生じる量である。

それぞれの受容体での化合物のＫｄ値は、標準条件下で、アデノシン受容体の供給源として、これらの受容体を内在的に発現している組織または細胞のいずれか由来、あるいはアデノシン受容体遺伝子をコードするＤＮＡベクターでトランスフェクションされた細胞由来の細胞膜を用いて、決定されるべきである。あるいは、アデノシン受容体を発現している細胞を用いた全細胞調製物が用いられてもよい。異なる受容体選択性に標識（例えば、放射性標識）されたリガンドを緩衝（ｐＨ７．４）塩溶液（例えば、Tilburg et al, J. Med. Chem. (2002) 45, 420-429参照）において用い、結合親和性を決定し、これによりそれぞれの受容体での化合物のＫｄが決定されるべきである。

あるいは、投与される、本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物の量は、化合物が投与されるべき対象と同種の動物において徐脈、血圧降下、または頻脈の副作用を生じる化合物の最小用量の千分の１から５分の１、または５０分の１から３分の１（好ましくは、千分の１から２０分の１、または百分の１または５０分の１から５分の１）の量であってもよい。好ましい量は、副作用を生じる最小用量の１０分の１から５分の１である。より好ましい量は、副作用を生じる最小用量の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１である。

好ましくは、投与される量は、副作用を生じる最小血漿濃度の千分の１と２０分の１、または百分の１または５０分の１と５分の１との間で、１時間より長く維持される血漿濃度を生じる。より好ましくは、投与される量は、副作用を生じる最小血漿濃度の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１で１時間より長く維持される血漿濃度を生じる。

あるいは、投与される、本発明の方法により同定された化合物、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物の量は、化合物が投与されるべき対象と同種の動物において徐脈、血圧降下、または頻脈の副作用を生じる化合物の最小血漿濃度の千分の１から５分の１、または５０分の１から３分の１（好ましくは、千分の１から２０分の１、または百分の１または５０分の１から５分の１）の血漿濃度を生じる量であってもよい。好ましくは、量は、副作用を生じる最小血漿濃度の１０分の１から５分の１の血漿濃度を生じる。より好ましくは、副作用を生じる最小血漿濃度の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１の血漿濃度を生じる。

好ましくは、投与される量は、副作用を生じる最小血漿濃度の千分の１と２０分の１、または百分の１または５０分の１と５分の１の間で１時間より長く維持される血漿濃度を生じる。より好ましい量は、副作用を生じる最小血漿濃度の１万分の１から５分の１、または１万分の１から２０分の１、または１万分の１から百分の１、最も好ましくは、１万分の１から千分の１で、１時間より長く維持される血漿濃度を生じる。

本発明の方法を用いて同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物の適当な投薬量は、患者の年齢、性別、体重、および状態、化合物の有効性、および投与経路などで変動するであろう。適当な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。

投与される、本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物の量は、０．００１から１５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１から１５ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．０１から５または１０ｍｇ／ｋｇ、または０．００１から０．０１ｍｇ／ｋｇでなければならないと予測される。量は、６ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、少なくとも０．００１、または０．０１、または０．０５ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．０１から２ｍｇ／ｋｇ未満であってもよい。量は、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１から１または２ｍｇ／ｋｇ、または０．２から１ｍｇ／ｋｇであってもよい。典型的な量は、０．２または０．６から１．２ｍｇ／ｋｇである。

本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物の単位投薬量は、典型的には、活性剤最大５００ｍｇ（例えば、１から５００ｍｇ、好ましくは、５から５００ｍｇ）を含む。好ましくは、活性剤は、活性剤、および生理的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物の形態である。好ましい投薬量は、（ヒト）対象１ｋｇ当たり、活性剤０．１から２、例えば、０．５から１、典型的には、約０．６ｍｇである。これらの濃度において、効果的な処置は、血圧降下を付随させずに（例えば、わずか１０％）、実質的に達成され得る。

７０ｋｇヒト対象に好ましい用量は、４２０ｍｇ、好ましくは、少なくとも０．７ｍｇ、より好ましくは、少なくとも３．５ｍｇ、最も好ましくは、少なくとも７ｍｇ未満である。より好ましくは、７から７０ｍｇ、または１４から７０ｍｇである。

上で特定された投薬量は、化合物が任意の有益な治療効果を有するのに必要であると予測されるもの（アデノシンＡ２Ａ受容体でのスポンゴシンのＥＣ５０値に基づく）より、有意に少ない（最大約１０００倍少ない）。

本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物は、他の治療剤、例えば、抗炎症剤（ステロイド、ＮＳＡＩＤ、メトトレキサート）、鎮痛剤（例えば、アヘン剤、ＮＳＡＩＤ、カンナビノイド、タキキニン調節剤、またはブラジキニン調節剤）、抗痛覚過敏剤（例えば、ガバペンチン、プレガバリン、カンナビノイド、ナトリウムまたはカルシウムチャネル調節剤、抗てんかん剤、または抗抑制剤）と共に、あるいはなしで、投与されてもよい。

一般に、本発明の方法により同定された化合物、または式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、あるいは実施例１０の化合物は、既知の手段により、任意の適した剤形で、任意の適した経路により、投与され得る。本発明の化合物は、好ましくは、経口、非経腸、舌下、経皮、髄腔内、または経粘膜投与される。他の適した経路は、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、および局所を含む。投与される薬剤の量は、典型的には、例えば、静脈内投与される場合より、経口投与される場合の方が多いであろう。

例えば、経口投与に適した組成物は、固形単位用量剤形、および錠剤、カプセル剤、バイアル、およびアンプル剤のような、例えば、注入用に液剤を含有しているものを含み、ここで、活性剤は、既知の手段により、生理的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と共に製剤されている。適当な希釈剤および担体は既知であり、例えば、適当な結合剤などと一体となったラクトース、およびタルクを含む。

本発明の化合物の好ましい投与頻度は、１日当たり２回または３回であると予測される。

本発明の化合物はまた、より有効な薬剤、またはさらに低減した副作用を有する薬剤を同定するためのベースとなり得る。

式（Ｉ）の化合物の（特に、炎症、または痛覚過敏の様な疼痛の予防、処置、または改善のための）使用に関する本発明の実施態様は、２−メトキシアデノシンを除いてもよい。

式（Ｉ）の化合物に関する本発明の実施態様は、２−プロポキシアデノシン、および／または２−イソプロポキシアデノシンを除いてもよい。

式（ＩＩ）の化合物に関する本発明の実施態様は、３’−デオキシ−２−メトキシアデノシン、および／または３’−デオキシ−２−エトキシアデノシンを除いてもよい。

本発明の実施態様は、本明細書において、添付の図面
［図面中：
図１は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ５．５におけるアデノシン受容体Ａ２Ａに対する２−メトキシアデノシンの親和性の増大を示す；
図２は、ラットのアデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシン（しかし、ＣＧＳ２１６８０ではない）の親和性が、ｐＨが低下（７．４から７．０、そして６．８）するにつれて増大することを示す；
図３は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ７．０におけるアデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシン（しかし、ＣＧＳ２１６８０ではない）の有効性の増大を示す；
図４は、２−メトキシアデノシンが、カラギーナン誘発炎症の痛覚過敏作用を阻害することを示す；
図５は、２−メトキシアデノシン（０．６２４ｍｇ／ｋｇ、経口）が、血圧または心拍数に対して有意な作用を有さないことを示す；
図６は、神経障害性疼痛の慢性狭窄損傷モデルにおける２−メトキシアデノシンの抗痛覚過敏作用を示す；
図７は、２−メトキシアデノシン（６２．４および６２４μｇ／ｋｇ、腹腔）が、血圧に影響しない濃度で、インドメタシン（３ｍｇ／ｋｇ、経口）と同等の効果でカラギーナン（ＣＧＮ）誘発炎症を抑制することを示す；および
図８は、２−メトキシアデノシン（０．６ｍｇ／ｋｇ）をラットに投与した後の経時血漿濃度変化を示す］
と関連し、例示のみの目的で記載される。

実施例１
アデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシンの親和性は、ｐＨが低減されるにつれて増大する
ラットの線条体膜を、２ｎＭ ［３Ｈ］−ＣＧＳ２１６８０、１単位／ｍｌ アデノシンデアミナーゼ、および増加数濃度の２−メトキシアデノシン（事前に濾過し、液体シンチレーションカウントした）の存在下、２２℃にて９０分間インキュベーションした。データを、１部位結合曲線、および２部位結合曲線に当てはめた（図１参照）：
ａ）特異的結合の総量をパーセンテージとして表し；
ｂ）高親和性状態における部位の割合を表し；
ｃ）高親和性状態のＫｉを表し（ｐＨ７．４においてＮ．Ｂ． 曲線の傾斜（ｎＨ）は、ほぼ一致し、２部位の当てはめのための曲線の当てはめアルゴリズム（the curve fitting algorithm for a two site fit）は、高親和性状態に対する実際の特性を定義できなかった）；および
ｄ）低親和性状態のＫｉを表す。

実施例２
異なるｐＨにおけるアデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシンとＣＧＳ２１６８０の親和性の比較
［３Ｈ］−ＣＧＳ２１６８０結合の置換を、実施例１に記載のように行った。結果（図２に示す）は、ラットアデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシン（しかし、ＣＧＳ２１６８０ではない）の親和性が、ｐＨが低減（７．４から７．０、そして６．８）するのに伴い、増大することを示している。

実施例３
アデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシン（しかし、ＣＧＳ２１６８０ではない）の有効性は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ７．０において増大する
ヒトＡ２Ａ受容体をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、ｃＡＭＰ蓄積を刺激するアゴニストの能力を、ホスホジエステラーゼ酵素を阻害するためにロリプラムの存在下で評価した。結果を図３に示す。

実施例４
２−メトキシアデノシンはカラギーナン誘発炎症の痛覚過敏作用を阻害する
図４は、２−メトキシアデノシンが、カラギーナン誘発炎症の痛覚過敏作用を阻害することを示す：Ａ．２−メトキシアデノシン（０．６ｍｇ／ｋｇ）は、カラギーナン（ＣＧＮ）誘発温熱性痛覚過敏（ＣＩＴＨ）を、インドメタシン（３ｍｇ／ｋｇ 経口）に匹敵する効果で阻害する。Ｂ．投与後３時間における２−メトキシアデノシンの濃度・応答関係。

カラギーナン（２％、１０μｌ）を右の後足に投与した。熱源を、処置した後足と無処置の後足の近くに置いた。後足を引っ込めるまでの時間（paw withdrawal latencies）の差を示す。２−メトキシアデノシンをカラギーナンと同時に投与した。２−メトキシアデノシンは、インドメタシン（Indo，３ｍｇ／ｋｇ 経口）と同様に有効であった。

実施例５
２−メトキシアデノシン（０．６２４ｍｇ／ｋｇ 経口における）は、血圧または心拍数に対して有意な作用を示さない
移植可能な放射線遠隔測定装置を、１グループ当たり６匹のラットの腹腔にセットした。装置の圧カテーテルを腹大動脈に、そして２本の電極を、リードＩＩポジション（腹腔／右肩の左側部）の皮膚下に通した。個々のラットを、データ取得のための放射線受容器（ＤＳＩ）上の各ケージに入れた。次に、血圧に対する０．６ｍｇ／ｋｇ ２−メトキシアデノシン、またはビークルの作用を評価した。結果を図５（Ａ：血圧；Ｂ：心拍数）に示す。

実施例６
神経障害性疼痛の慢性狭窄損傷モデルにおける２−メトキシアデノシンの抗痛覚過敏作用
２−メトキシアデノシン（０．６２４ｍｇ／ｋｇ 経口）は、ラット座骨神経の慢性狭窄損傷により引き起こされる温熱性痛覚過敏を阻害する。麻酔下で、右足の座骨神経を露出させ、４本の緩い結紮糸を神経束の周りに結んだ。およそ２週間後、ラットは、手術した足に温熱性痛覚過敏を発症し、これは右足と左足の足を引っ込めるまでの時間の差により判断した。２−メトキシアデノシンの投与は痛覚過敏を低減し、これは、引っ込めるまでの時間の差の低減により示された。２−メトキシアデノシンは、カルバマゼピン（ＣＢＺ，１００ｍｇ／ｋｇ 皮下注射）と同等、あるいはそれより有効であった。結果を図６に示す。

実施例７
２−メトキシアデノシン（６２．４および６２４μｇ／ｋｇ 腹腔）は、血圧に影響しない濃度にて、カラギーナン（ＣＧＮ）誘発炎症を、インドメタシン（３ｍｇ／ｋｇ，経口）に匹敵する効果で阻害する
カラギーナン（２％，１０マイクロタイター）を、右の後足に投与し、足の体積を体積変動測定法により評価した。２−メトキシアデノシンをカラギーナンと同時に投与した。結果を図７に示す。２−メトキシアデノシンは、インドメタシン（Indo，３ｍｇ／ｋｇ 経口）と同等に有効であった。

実施例８
２−メトキシアデノシン（０．６ｍｇ／ｋｇ）のラットへの投与後の経時的血漿濃度変化
アデノシン受容体での２−メトキシアデノシンのＥＣ５０値（ｐＨ７．４において測定
）は、９００ｎｇ／ｍｌ（３μＭ）であった。図８より、血漿濃度は、３時間より長い間ＥＣ５０値の２％より上を保つとみることができる。抗炎症作用および抗痛覚過敏作用を、最高血漿濃度が、インビトロで決定したＥＣ５０値の１％と３０％の間にあるときに観察した（血圧変化はない）。最高血漿濃度がＥＣ５０値に達すると、血圧の著しい低下が何時間も続く。

実施例９
低い方のｐＨにおけるアデノシン受容体アゴニストの増大した親和性は、対応するＧＴＰシフトの増大と関連しており、これは、これらのアゴニストが、低い方のｐＨにおいてより効き目があることを示唆している。これらの結果を以下に概略する。

表１．ラット線条体Ａ２Ａ受容体からの３Ｈ−ＣＧＳ２１６８０の置換（値はＫｉ（ｎＭ）である）

ＮＥＣＡ：５’Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン；ＣＶ１８０８：２−フェニルアミノ−アデノシン；ＰＩＡ：フェニルイソプロピルアデノシン

上記の全てが、アゴニストに対してただ１つの親和性状態を現し、これは、高親和性状態と低親和性状態が、親和性において類似していることを示唆している。しかしながら、２−メトキシアデノシンおよび２−エトキシアデノシンは、低い方のｐＨにおいて２種類の明らかな親和性状態を現す（表２）。高親和性状態は、結合部位総数の約２５％に対応し、ＧＴＰの存在により破壊された。このことは、それらが高親和性アゴニスト結合状態に対応することを示唆している。

表２．ラット線条体Ａ２Ａ受容体からの３Ｈ−ＣＧＳ２１６８０の置換（値はＫｉ（ｎＭ）である）

さらに、化合物は、低い方のｐＨにおいてラットＡ１受容体に対して高親和性を示すことを発見した（表３）。

表３．ラット皮質Ａ１受容体からの３Ｈ−ＤＰＣＰＸの置換（Ｋｉ（ｎＭ））

両方のｐＨ値において、ＧＴＰの安定な類似体（ＧｐｐＮＨｐ）は、３’−デオキシ−２−クロロアデノシンにより認識される高親和性状態を破壊した。

実施例１０
化合物は、低い方のｐＨにおいてアデノシンＡ２Ａ受容体に対してより高い親和性を有することが見出された
以下に挙げる化合物は、ｐＨ７．２よりｐＨ５．５においてアデノシンＡ２Ａ受容体に対してより高い親和性を有することが見出された。Ａ２Ａ受容体結合アッセイを、［３Ｈ］−ＣＧＳ２１６８０を用いて行い、実施例１に記載のように分析した。ｐＨ５．５にて検出した高親和性結合部位および低親和性結合部位のＫｉ値、およびｐＨ７．４にて検出した該部位のＫｉを示す。

Ｘ＝ＯＨのとき

Ｘ＝Ｈのとき

図１は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ５．５におけるアデノシン受容体Ａ２Ａに対する２−メトキシアデノシンの親和性の増大を示す。 図２は、ラットのアデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシン（しかし、ＣＧＳ２１６８０ではない）の親和性が、ｐＨが低下（７．４から７．０、そして６．８）するにつれて増大することを示す。 図３は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ７．０におけるアデノシンＡ２Ａ受容体に対する２−メトキシアデノシン（しかし、ＣＧＳ２１６８０ではない）の有効性の増大を示す。 図４は、２−メトキシアデノシンが、カラギーナン誘発炎症の痛覚過敏作用を阻害することを示す。 図５は、２−メトキシアデノシン（０．６２４ｍｇ／ｋｇ、経口）が、血圧または心拍数に対して有意な作用を有さないことを示す。 図６は、神経障害性疼痛の慢性狭窄損傷モデルにおける２−メトキシアデノシンの抗痛覚過敏作用を示す。 図７は、２−メトキシアデノシン（６２．４および６２４μｇ／ｋｇ、腹腔）が、血圧に影響しない濃度で、インドメタシン（３ｍｇ／ｋｇ、経口）と同等の効果でカラギーナン（ＣＧＮ）誘発炎症を抑制することを示す。 図８は、２−メトキシアデノシン（０．６ｍｇ／ｋｇ）をラットに投与した後の経時血漿濃度変化を示す。

Claims (29)

1. アデノシンＡ２Ａ受容体の活性化により介在される疾患または状態の予防、処置、または改善のための可能性のある治療剤を同定する方法であって、少なくとも７．４の高い方のｐＨ、およびまたｐＨ５．５から７．２、または５．０から７．０の低い方のｐＨにおけるアデノシンＡ２Ａ受容体に対する試験化合物の親和性を決定し、次に、低い方のｐＨにおける親和性が高い方のｐＨにおける親和性よりも１０倍を超えて高い場合、化合物を該剤として同定する、を含む方法。
2. 試験化合物の親和性の決定が、異なる濃度の標識化合物の受容体との結合を測定することを含む、請求項１記載の方法。
3. 試験化合物の親和性の決定が、結合した標識化合物のアデノシンＡ２Ａ受容体からの非標識試験化合物による置換を測定することを含む、請求項１記載の方法。
4. アデノシンＡ２Ａ受容体が、組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜にある、請求項１から３のいずれか記載の方法。
5. アデノシンＡ２Ａ受容体の活性化により介在される疾患または状態の予防、処置、または改善のための可能性のある治療剤を同定する方法であって、少なくとも７．４の高い方のｐＨ、およびまた５．５から７．２、または５．０から７．０の低い方のｐＨにおけるアデノシンＡ２Ａ受容体での試験化合物の作用の有効性を決定し、次に、低い方のｐＨにおける有効性が高い方のｐＨにおける有効性よりも１０倍を超えて高い場合、化合物を該剤として同定する、を含む方法。
6. 試験化合物の作用の有効性の決定が、試験化合物を、アデノシンＡ２Ａ受容体を含む組織、組織切片、完全な細胞、または部分的に破壊された細胞と接触させ、次に、組織、組織切片、完全な細胞、または部分的に破壊された細胞におけるシグナル伝達分子の蓄積または減少を測定することによりアデノシンＡ２Ａ受容体の作用を決定する、を含む請求項５記載の方法。
7. シグナル伝達分子がｃＡＭＰ、ＩＰ３、または遊離カルシウムである、請求項６記載の方法。
8. 試験化合物の作用の有効性の決定が、試験化合物を、アデノシンＡ２Ａ受容体を含む生体膜と接触させ、次に、アデノシンＡ２Ａ受容体作用を、Ｇタンパク質の活性化；酵素活性；または生体膜と関連するイオンチャンネルを介したイオン流を測定することにより決定する、を含む請求項５記載の方法。
9. Ｇタンパク質の活性化が、放射性標識グアニンヌクレオチドを用いて測定されるか、あるいは測定される酵素活性が、アデニルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、またはプロテインキナーゼ活性であるか、あるいはイオン流が測定されるイオンチャンネルがカルシウムまたはカリウムチャンネルである、請求項８記載の方法。
10. 試験化合物の作用の有効性の決定が、試験化合物を、アデノシンＡ２Ａ受容体を含む組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜と接触させ、次に、アデノシンＡ２Ａ受容体作用を、組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜におけるプロテインキナーゼ活性を測定することにより決定する、を含む請求項５記載の方法。
11. 試験化合物の作用の有効性の決定が、試験化合物を、アデノシンＡ２Ａ受容体を含む組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜と接触させ、次に、アデノシンＡ２Ａ受容体作用を、組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜におけるホスホリパーゼ活性を測定することにより決定する、を含む請求項５記載の方法。
12. ホスホリパーゼ活性が、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＤの活性である、請求項１１記載の方法。
13. 試験化合物の作用の有効性の決定が、試験化合物を、アデノシンＡ２Ａ受容体を含む組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜と接触させ、次に、アデノシンＡ２Ａ受容体作用を、組織、組織切片、完全な細胞、破壊された細胞、または細胞に由来する膜におけるタンパク質リン酸化および／または脱リン酸化を測定することにより決定する、を含む請求項５記載の方法。
14. 低い方のｐＨが５．５から６．５である、請求項１から１３のいずれか記載の方法。
15. 低い方のｐＨが５．５から６．２である、請求項１から１３のいずれか記載の方法。
16. 同定された剤が治療効果を有するか否かを決定することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか記載の方法。
17. 非ヒト動物モデルを用いて、同定された剤が治療効果を有するか否かが決定される、請求項１６記載の方法。
18. 同定された剤が疼痛または炎症に対する治療効果を有するか否かが決定される、請求項１６または１７記載の方法。
19. 同定された剤が、癌、虚血・再灌流損傷、過剰神経活性、敗血症、敗血性ショック、神経変性（アルツハイマー病を含む）、筋疲労、または筋痙攣に対する治療効果を有するか否かが決定される、請求項１６から１８のいずれか記載の方法。
20. 過剰神経活性が、てんかん、または炎症性疼痛および神経障害性疼痛を含む慢性疼痛または痛覚過敏におけるものである、請求項１９記載の方法。
21. 同定された剤が、関節炎、喘息、乾癬、腸炎、関節リウマチ、過敏性腸症候群、または骨関節炎に対する治療効果を有するか否かが決定される、請求項１６から２０のいずれか記載の方法。
22. 同定された剤が、腸の疼痛、背中の疼痛、癌性疼痛、ＨＩＶ性疼痛、幻肢痛、術後疼痛、糖尿病性神経障害、多発性神経障害、疱疹後神経痛、または三叉神経痛を含む、神経障害の結果として引き起こされる痛覚過敏に対する治療効果を有するか否かが決定される、請求項１６から２０のいずれか記載の方法。
23. 同定された剤が、腸の疼痛、背中の疼痛、癌性疼痛、線維筋痛、術後疼痛、骨関節炎、または関節リウマチを含む、炎症性疾患の結果として引き起こされる痛覚過敏に対する治療効果を有するか否かが決定される、請求項１６から２０のいずれか記載の方法。
24. 同定された剤の治療効果が、ｐＨ７．４におけるアデノシンＡ２Ａ受容体での剤のＥＣ５０値より低い濃度で決定される、請求項１６から２３のいずれか記載の方法。
25. 同定された剤の治療効果が、ｐＨ７．４におけるアデノシンＡ２Ａ受容体での剤のＥＣ５０値の１万分の１から５分の１の濃度で決定される、請求項１６から２４のいずれか記載の方法。
26. アデノシンＡ２Ａ受容体の活性化により介在される疾患または状態の予防、処置、または改善のための可能性のある治療剤を同定する方法であって、試験化合物を、単離された病理組織、細胞、または膜、および対応する単離された正常組織、細胞、または膜のアデノシンＡ２Ａ受容体と、ｐＨ７．４におけるアデノシンＡ２Ａ受容体での試験化合物のＥＣ５０値より低い濃度で接触させ、次に、正常組織と病理組織との間で、試験化合物との接触に応答したアデノシンＡ２Ａ受容体の作用に差があるか否かを決定する、を含む方法。
27. 試験化合物が、アデノシンＡ２Ａ受容体のアゴニストであり、かつ試験化合物に応答したアデノシンＡ２Ａ受容体の作用が、正常組織より病理組織において高い場合、試験化合物が可能性のある治療剤として同定される、請求項２６記載の方法。
28. 病理組織が上皮組織を含む、請求項２６または２７記載の方法。
29. 乾癬、喘息、またはＣＯＰＤを処置するための可能性のある治療剤を同定するための、請求項２８記載の方法。

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