DE60303315T2

DE60303315T2 - Screening-verfahren und daraus erhaltene antitumormittel

Info

Publication number: DE60303315T2
Application number: DE60303315T
Authority: DE
Inventors: Russell Stuart MAUDSLEY; Peter Robert MILLAR
Original assignee: Ardana Bioscience Ltd
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2002-07-22
Filing date: 2003-07-22
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2023-07-23
Also published as: DE60303315D1; GB2397649B; EP1512016B1; US7361633B2; ES2259418T3; PT1512016E; JP4162682B2; ATE316246T1; GB2397649A; US20060057649A1; DK1512016T3; JP2005531331A; AU2003260700A1; WO2004010146A1; GB0410051D0; EP1512016A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Screening-Verfahren zum Auswählen einer aktiven Verbindung, die zur Behandlung von Krebs oder von Hyperplasie des reproduktiven Gewebes nützlich ist.
GnRH (Gonadotropin-Releasing-Hormon) ist ein Dekapeptid, welches eine tragende Rolle bei der Steuerung der Reproduktionsachse der meisten bekannten Arten spielt. Es wird stoßweise vom Hypothalamus freigesetzt und wirkt auf spezifische Rezeptoren im Hypophysenvorderlappen und steuert die Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) und des Follikel stimulierenden Hormons (FSH). Diese beiden Hormone sind die Hauptsteuermittel der reproduktiven Funktion.
Im Mittelhirn vieler Wirbeltiere wurde eine zweite Form von GnRH, GnRH-II, identifiziert. Als Folge davon wurde die ursprüngliche Form des GnRH in GnRH-I umbenannt.
Es wurde gezeigt, dass die GnRH-Rezeptor-Expression bei einer Anzahl von bösartigen humanen Tumoren, z.B. Brust-, Eierstock- und Gebärmutterschleimhautkrebs, eine wesentliche Komponente in einem autoregulatorischen Zellproliferationsprozess ist. Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, dass einige mit GnRH-Rezeptor wechselwirkende Liganden (Agonisten und Antagonisten) eine dosisabhängige antiproliferative Wirkung auf Zelllinien zeigen, die von reproduktiven Tumoren abstammen. Anders als bei GnRH-Rezeptoren im Hypophysenvorderlappen aktiviert die Aktivierung dieser peripheren Rezeptoren in reproduktivem Gewebe unterscheidbare Signalisierungsmodalitäten und scheint positiv sowohl auf klassische Antagonisten wie Agonisten zu reagieren. Trotz der Unterschiede im Zellsignalisierungsverhalten scheinen die geklonten Sequenzen der peripheren GnRH-Rezeptoren identisch mit denjenigen des Hypophysen-GnRH-Rezeptors zu sein. Deshalb wäre ein Verfahren zum Auswählen neuartiger GnRH-Rezeptorliganden, die anstelle jener, die in der Hypophyse durch GnRH aktiviert werden, spezifisch die tumorspezifischen Transduktionspfade in Krebsgewebe aktivieren, hochgradig wünschenswert. Ein solches Verfahren würde die Auswahl von Liganden des GnRH-Rezeptors mit erhöhter Selektivität erlauben und zusätzlich jegliche Nebenwirkungen, die durch GnRH-Behandlung hervorgerufen werden, vermindern, weil wir glauben, dass die gegenwärtigen auf GnRH-Rezeptor basierenden Therapeutika durch das Induzieren von Tumorprogression von gutartigen zu bösartigeren steroidunabhängigen Phänotypen weniger als optimal sind. Deshalb wirken die herkömmlichen GnRH-Rezeptor-basierten Antitumorwirkstoffe hauptsächlich durch das Senken des Steroidserumspiegels, um so das steroidabhängige Wachstum des reproduktiven Tumors zu vermindern. Langwierige Behandlungen unter Verwendung der klassischen auf GnRH-Rezeptor basierenden Therapeutika, mögen zunächst Tumorregression bewirken, aber letztendlich unterstützen sie das Wachstum aggressiverer Tumorarten.
GnRH-Agonisten werden in großem Umfang bei der Behandlung von sexualhormonabhängigen Krebsarten angewandt. Man nimmt an, dass die vorherrschende Wirkungsweise durch Desensibilisierung der Hypophysengonadotropine stattfindet. Ein wesentliches Beweisstück deutet jedoch auf einen direkten inhibitorischen Effekt der GnRH-Analoge auf diese Krebszellen hin. Diese Effekte scheinen durch G☐i G-Protein anstelle der vorherrschenden G☐q-Bindung bei Gonadotropinen vermittelt zu werden. Anders als die G☐q-Verbindung kann die G☐i-Verbindung durch Agonisten und Antagonisten aktiviert werden. Dies lässt uns daran denken, dass der Rezeptor, der mit den Tumorzellen zu tun hat, nicht der Gonadotropin-Typ 1-GnRH-Rezeptor sein mag. Die Identifizierung eines Typ 2-GnRH-Rezeptors beim Krallenaffen, der sowohl durch GnRH-Agonisten als auch bestimmte Antagonisten aktiviert werden kann, lässt daran denken, dass dieser Rezeptor der Vermittler antiproliferativer Effekte in Krebszellen sein könnte. Umfangreiche Versuche, diesen Rezeptor beim Menschen zu identifizieren, waren jedoch nicht dazu in der Lage, das Vorhandensein einer herkömmlichen Typ 2-Rezeptortransskription, die sich in einen vollständig funktionstüchtigen Rezeptor umsetzen lassen würde, zu zeigen. Die einzigen vollständigen Transskriptionen, die in Krebszellen vorhanden sind, verschlüsseln den Typ 1-GnRH-Rezeptor. Wir haben deshalb gefolgert, dass die unterschiedliche Pharmakologie (Aktivität der Agonisten und bestimmter Antagonisten) von antiproliferativen Effekten auf Unterschiede bei der Aktivierungspharmakologie der Typ 1-Rezeptoren bei Bindung an unterschiedliche intrazelluläre Signalisierungsleitungspfade (z.B. via G☐i) zurückzuführen ist. Wir berichten hier über ausführliche Untersuchungen der molekularen Leitungspfade, die Antiproliferation und Apoptose vermitteln in Krebszellen des Reproduktionstraktes, in gutartigen hyperplastischen Zellen und in HEK293 Zellen, die dauerhaft den Typ 1-GnRH-Rezeptor expressivieren. Diese überraschenden Ergebnisse deuten zum ersten Mal an, dass es möglich ist, Verbindungen zu identifizieren, die über Typ 1-GnRH-Rezeptor wirken und die in Tumor- und hyperplastischen Zellen antiproliferativ wirken, die aber gleichzeitig in der Hauptsache keinen Effekt auf die Typ1-GnRH-Rezeptor-vermittelten Leitungspfade vom Typ derjenigen haben, die in der Hypophyse gefunden werden, wie beispielsweise die PLCβ-Aktivierung. Ohne Bindung an jeglicher Theorie nehmen wir an, dass diese Verbindungen die aktive Form des GnRH-Rezeptors, der eher an G☐i als an G☐q bindet, stabilisieren; mit anderen Worten nehmen wir an, dass es unterschiedliche G☐i- und G☐q-Bindung durch den GnRH-Rezeptor gibt und, dass die Verbindungen auf den G☐i-vermittelten und nicht auf den G☐q-vermittelten Leitungspfad einwirken.
Deshalb ist es ein Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zum Identifizieren einer Testverbindung, vorzugsweise eines GnRH-Rezeptorliganden, die einen Antitumoreffekt aufweist, während sie unbezogene Transduktionssignale, wie die G☐q-PLC-β-Kaskade, die in der Hypophyse stattfinden, nicht signifikant aktiviert. In einem ersten Aspekt weist das Verfahren folgende Schritte auf:

(a) Auswählen mindestens einer Testverbindung;
(b) Testen der Verbindung auf Antitumoreffekt;
(c) Auswählen mindestens eines unterscheidbaren intrazellulären Ereignisses, das zumindest teilweise durch den GnRH-Rezeptor moduliert wird;
(d) Testen der Fähigkeit der Testverbindung, das ausgewählte intrazelluläre Ereignis nicht zu modulieren; und
(e) Auswählen der Testverbindung, die selektiv einen Antitumoreffekt zeigt und die zumindest das genannte andere ausgewählte intrazelluläre Ereignis nicht moduliert.

Dieses Verfahren erlaubt in einem frühen Stadium und in vitro die Unterscheidung zwischen Testverbindungen, die das Potential zu Antitumorverbindungen haben, die aber ungewollte Transduktionssignale aktivieren, und, als solche verworfen werden sollten, und es erlaubt die Identifizierung von Testverbindungen, die signalspezifisch sind und ein größeres Potential als therapeutisches Mittel haben.
Obwohl das Verfahren dazu genutzt werden kann, zwischen schon bekannten GnRH-Agonisten/Antagonisten zu unterscheiden, kann es auch zum Testen anderer Verbindungen genutzt werden. In diesem Fall kann das Verfahren dieser Erfindung vorteilhafter Weise einen einleitenden Schritt aufweisen, in welchem die Testverbindung auf ihre Kapazität geprüft wird, an einen GnRH-Rezeptor zu binden und/oder diesen zu modulieren. Vorteilhafterwieise werden Verbindungen, die eine Affinität zum Binden des GnRH-Rezeptors haben, in dem Testverfahren dieser Erfindung verwendet. Typischerweise hat die Verbindung einen K_D-Wert für das Binden des GnRH-Rezeptors zwischen 0.1 und 10 nM, wie beispielsweise ungefähr 1 nM, auf. Ob die Testverbindung an den GnRH-Rezeptor bindet oder nicht, kann durch die Anwendung von Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, wie ein konkurrierender Radioligandenbindungstest, bestimmt werden. Die Testverbindung könnte jede Verbindung sein, aber typischerweise ist sie eine organische Verbindung zwischen 100 und 10000 Dalton, vorzugsweise zwischen 500 und 5000 Dalton. Typischerweise ist die Testverbindung eine Verbindung aus einer Sammlung von Testverbindungen, wie jenen, die durch die Verwendung kombinatorischer chemischer Techniken hergestellt wurden. Außerdem ist die Testverbindung typischerweise ein GnRH-Analog.
Es wird anerkannt werden, dass in den hier beschriebenen Verfahren, die Drogen-Screening-Verfahren sein können, ein Ausdruck, der den Fachleuten wohl bekannt ist, die ausgewählte Testverbindung eine drogenartige Verbindung oder Führungsverbindung zur Entwicklung einer drogenartigen Verbindung sein könnte.
Der Ausdruck „drogenartige Verbindung" ist den Fachleuten wohl bekannt und könnte die Bedeutung einer Verbindung einschließen, die spezielle Eigenschaften aufweist, welche sie zur Verwendung im medizinischen Bereich, z.B. als aktiver Bestandteil eines Medikaments, geeignet erscheinen lassen mögen. So kann z.B. eine drogenartige Verbindung ein Molekül sein, das mit Techniken der organischen Chemie hergestellt werden kann oder, was weniger bevorzugt ist, durch mit molekularbiologische oder biochemische Techniken, und es ist vorzugsweise ein kleines Molekül, das kleiner als 15000 Daltons und wasserlöslich sein kann. Eine drogenartige Verbindung mag zusätzlich Merkmale von Bioverfügbarkeit zeigen.
Der Ausdruck „Führungsverbindung" ist Fachleuten ähnlich wohl bekannt und kann die Bedeutung einschließen, dass die Verbindung, auch wenn sie selbst nicht zur Verwendung als Droge geeignet ist (zum Beispiel, weil sie gegen ihr beabsichtigtes Zielobjekt nur schwach wirksam, nicht selektiv in ihrer Funktionsweise, instabil, schwach löslich, schwierig herzustellen ist oder eine schwache Bioverfügbarkeit hat), einen Ausgangspunkt für das Auslegen anderer Verbindungen, die wünschenswertere spezielle Eigenschaften haben mögen, bereitstellen kann.
Der Test auf Antitumoreffekte in Schritt (b) des Verfahrens des ersten Aspektes der Erfindung kann jeder bereits im Stand der Technik für das Testen der Antitumoraktivität von GnRH-Liganden verwendete Test sein. Wie weiter unten beschrieben wird, könnten die Liganden zum Beispiel wegen ihres antiproliferativen Effektes auf Chorionkarzinomzellkulturen beurteilt werden. Es wird anerkannt werden, dass die Antitumoraktivität der Verbindung auch durch Bestimmen leicht erfasst werden könnte, ob die Testverbindung fähig ist, einen tumorspezifischen Typ1-GnRH-Rezeptortransduktionspfad zu aktivieren, der zu einem antiproliferativen Effekt führt. Typischerweise können Zellen mit dem Liganden behandelt werden, und sein Effekt auf das Zellwachstum könnte als die Fähigkeit gemessen werden, numerisches Zellwachstum über eine Zeitspanne von z.B. 5 Tagen zu verzögern. Nur lebensfähige Zellen werden gezählt, z.B. durch Zählen jener Zellen, die wirksam Tryptan-Blau-Farbstoff ausschließen können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Antitumoreffekt durch die Bestimmung gestestet, ob die Testverbindung durch GnRH-Rezeptor vermittelte Signalisierung durch G☐i aktiviert. G☐i ist ein heterotrimeres Guaninnukleotid bindendes Protein. Typischerweise hemmt es das Enzym Adenylatzyklase. In den Ausdruck G☐i ist auch jegliches Mitglied der G☐i-Unterfamilie eingeschlossen, einschließlich G☐o, welches hauptsächlich im zentralen Nervensystem gefunden wird. Ob eine Testverbindung durch GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via G☐i aktiviert oder nicht, kann durch Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, bestimmt werden. Wie genauer in Beispiel 1 beschrieben wird, kann dies zum Beispiel durch Bestimmen erreicht werden, ob die Testverbindung fähig ist, durch Forskolin (FSK) stimulierte Anreicherung von intrazellulärer cAMP in einer geeigneten Zelle (wie beispielsweise einer, die ausreichend G☐i und Adenylatzyklase bereit stellt, um das Experimentieren zu erleichtern), die mit dem Typ1-GnRH-Rezeptor transfiziert ist, zu antagonisieren. Folglich werden in einer Ausführungsform Zellen (z.B. humane embryonale Nierenzellen (Human Embryonic Kidney = HEK)), die beständig Typ1-GnRH-Rezeptor expressivieren, mit der Testverbindung vorinkubiert, anschließend mit Forskolin stimuliert, und cAMP wird kolorimetrisch gemessen. Dies wird mit der cAMP- Menge, die erzeugt wird, wenn äquivalente Zellen mit Forskolin, aber nicht mit der Testverbindung behandelt werden, verglichen. Es gibt eine Verminderung der cAMP-Spiegel in jenen Zellen, wo die Testverbindung eine solche mit der Fähigkeit, G☐i zu aktivieren, ist. G☐i-Aktivierung kann außerdem anhand ihrer direkten Zuordnung zu dem Rezeptor gemessen werden, aber dies wird verglichen mit Verfahren, die Umsätze (z.B. die cAMP-Produktion) messen, weniger bevorzugt. Die Beteiligung von G☐i an einem Signaltransduktionereignis kann durch die Verwendung von Pertussistoxin, welches G☐i inaktiviert, erfasst werden; mit anderen Worten, G☐i vermittelte Signalisierungsereignisse sind empfindlich gegenüber Pertussistoxin.
JNK und/oder p38☐-Phosphorilierung können ebenfalls als Marker für den Antitumoreffekt und die G☐i-Signalisierung verwendet werden und können so verwendet werden, um den Effekt der Testverbindungen zu testen (siehe Beispiel 1 und die Legende zu den 7 und 8). Auf ähnliche Weise könnte auch ein gegenüber Pertussistoxin (PTX) empfindlicher ERK-Test verwendet werden, zum Beispiel unter Anwendung einer ähnlichen Methodik wie in Bezug auf JNK und p38☐-Phosphorilierung beschrieben (z.B. unter Verwendung von für phosphorilisierte ERK1 selektiven Antikörpern). Typischerweise werden Zellen vor der Stimulation mit 200 ng/ml PTX für 16 Stunden vorinkubiert. Die Stimulationsdauer beträgt im Allgemeinen 4 bis 5 Minuten. Besonders bevorzugt ist es, wenn Testverbindungen ausgewählt werden, die dazu in der Lage sind, einen 2-fachen oder höheren Anstieg der Erk1/2-Phosphorilierung über dem Basiswert in einer gutartigen hyperplastischen Prostatazelle zu erzeugen.
Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass GnRH-Liganden einen proapoptotischen Phänotyp in Tumorzellen induzieren können, und dies könnte eine weitere, wenn auch indirekte Möglichkeit zum Testen des Antitumoreffektes einer Verbindung sein. Deshalb kann das Verfahren vorteilhafterweise den Schritt aufweisen, den GnRH-Liganden auf die Fähigkeit zu testen, einen proapoptotischen Zustand in Zellkulturen zu induzieren. Das Bestimmen, ob eine Testverbindung einen proapoptotischen Effekt hat oder nicht, könnte insbesondere in Verbindung mit anderen Testmitteln zur Beurteilung des Antitumoreffektes nützlich sein, weil dieser Test einen starken Hinweis liefert, ob eine Testverbindung in vivo drogenartig ist. In dem Beispiel 1 war die extrazelluläre Expression von Phosphotidylserin-(PS)-phospholipid das zelluläre Ereignis, das gewählt wurde, um zelluläre Apoptose anzuzeigen. Extrazelluläre Expression von PS kann ohne weiteres bestimmt werden, indem Gebrauch von markiertem (z.B. durch fluoreszent markiertem) Annexin-V gemacht wird, welches selektiv PS bindet. Die Messung von Kaspase oder Prokaspase kann bei der Bestimmung ob die Verbindung proapoptotisch ist oder nicht, nützlich sein. Solche Messungen können anhand geeigneter Enzymsubstrate in einem Screeningformat mit hohem Durchsatz durchgeführt werden.
Es wird anerkannt werden, dass mehr als ein Verfahren verwendet werden kann, um zu erfassen, ob die Testverbindung einen Antitumoreffekt hat, und es könnte vorteilhaft sein, wenn mehr als ein solches Verfahren zur Anwendung kommt. Zum Beispiel kann die Fähigkeit einer Testverbindung, G☐i zu aktivieren, anhand des cAMP-Anreicherungstests, wie oben beschrieben, gemessen werden, ebenso die Fähigkeit der Testverbindung, einen proapoptotischen Zustand in Zellkulturen zu induzieren, zum Beispiel durch Messung extrazellulärer PS-Expression durch Annexin-V-Bindung.
Vorzugsweise ist in Schritt (c) das mindestens eine unterscheidbare intrazelluläre Ereignis, das zumindest teilweise durch den GnRH-Rezeptor moduliert wird, die Aktivierung des Typ1-GnRH-Rezeptorleitungspfads, der in der Hypophyse aktiviert wird (der Hauptteil der Hypophysenfunktion ist G☐q vermittelt). Vorzugsweise ist das unterscheidbare intrazelluläre Ereignis die Aktivierung des G☐q-Signalisierungsleitungspfades. G☐q ist ein Guaninnukleotid bindendes Protein, das spezifisch das Enzym Phospholipase Cβ aktiviert. Mit G☐q schließen wir G☐11 und G☐16 ein, welche beide anstelle von G☐q in verschiedenen zellulären Umständen zur Aktivierung von Phospholipase Cβ gesetzt werden können. In Schritt (d) werden die Testverbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das ausgewählte intrazelluläre Ereignis (z.B. den G☐q-Signalisierungspfad) nicht zu modulieren, unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren, getestet. Zum Beispiel kann, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, die Aktivierung des G☐q-Signalisierungspfads durch Messung der Inositolphosphatproduktion bestimmt werden, die (der Typ 1-Rezeptor vermittelten Aktivierung von G☐q folgend) durch die Produktion von Phospholipase Cβ (PLCβ) vermittelt wird. PLCβ wird durch U73122 (erhältlich von Calbiochem Corporation, CA, USA) gehemmt.
Bei Rezeptorstimulationen auf hohem Niveau kann G☐i PLCβ-Aktivierung verursachen, um zu zeigen, dass PLCβ via G☐q und nicht via G☐i aktiviert wird, wird deshalb PTX verwendet, um G☐i zu hemmen, so dass die PTX-resistente Inositolphosphaterzeugung ein Hinweis auf G☐q-vermittelte Aktivierung der PLCβ-Aktivierung ist. Auf diese Weise können Verbindungen, die G☐q nicht aktivieren, einfach ausgewählt werden.
In Schritt (e) werden jene Testverbindungen, die einen selektiven Antitumoreffekt zeigen und zumindest das ausgewählte intrazelluläre Ereignis nicht modulieren, für weitere Untersuchungen ausgewählt. Es wird besonders bevorzugt, wenn Verbindungen ausgewählt werden, die selektiv Signalisierung via G☐i aktivieren und Signalisierung via G☐q nicht modulieren.
Mit „Antitumoreffekt" meinen wir einen beobachtbaren und/oder messbaren Effekt. Wenn Aktivierung der GnRH-Rezeptor-vermittelten Signalisierung via G☐i verwendet wird, um den Antitumoreffekt zu erfassen, könnte ein beobachtbarer und/oder messbarer Effekt derjenige von stromab liegenden Ereignissen sein, wie hier beschrieben wird. Wenn Induktion eines proapoptotischen Zustands in Zellkulturen verwendet wird, um den Antitumoreffekt zu erfassen, kann ein beobachtbarer und/oder messbarer Effekt derjenige von stromab liegenden Ereignissen sein, wie sie hier beschrieben werden, einschließlich der Messung von PS an der Oberfläche gefärbter Zellen, zum Beispiel unter Verwendung von Annexinbindung.
Wenn JNK- und/oder p38☐-Phosphorilierung als Marker verwendet wird, schließt ein beobachtbarer und messbarer Effekt die Verwendung von Radiofluoreszenzimmuntestplattentests ein, oder Expression eines Markergens, wie Luziferase, in Zellen, dessen Expression mindestens teilweise durch auf JNK- und/oder p38☐-reagierende Reporterelemente gesteuert wird.
Mit dem Begriff „zumindest das ausgewähltes intrazelluläres Ereignis nicht modulierend" meinen wir, dass die Testverbindung das Ereignis in der Hauptsache moduliert. Es wird anerkannt werden, dass eine Testverbindung einen Effekt auf das erwähnte Ereignis haben kann, dass aber der Effekt im Zusammenhang der Erfindung nicht wesentlich ist. Wenn zum Beispiel das ausgewählte intrazelluläre Ereignis die Aktivierung des G☐q-Signalisierungspfads ist, ist die Testverbindung, die für weitere Untersuchungen ausgewählt wird, eine solche, die diesen Leitungspfad in der Hauptsache nicht aktiviert. Es wird besonders bevorzugt, wenn die ausgewählte Testverbindung ein Antagonist eines Typ 1-Rezeptor vermittelten G☐q-Signalisierungsereignisses ist. Es wird jedoch besonders bevorzugt, dass die Testverbindung eine solche mit hoher Wirksamkeit bezüglich der Aktivierung des G☐i-Leitungspfads ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Testverbindungen ausgewählt, die ein großes Potential als Agonist der G☐i-Stimulation haben, wobei die Verbindung ein geringes Potential zur G☐q-Stimulation hat. Deshalb ist zum Beispiel in Bezug auf die vorhandene Zellproliferation (vermittelt durch G☐i-Stimulation) oder über PTX-unempfindliche Aktivierung der PLC-β (vermittelt durch G☐q) die folgende Tabelle hilfreich, um die Auswahl einer Testverbindung mit den gewünschten Eigenschaften zu verstehen.

Agonistenpotential – G☐i	Agonistenpotential – G☐q
Mittel A hoch	Mittel Y hoch
Mittel B	Mittel X
Mittel C	Mittel Z
Mittel Z	Mittel A
Mittel Y	Mittel C
Mittel X niedrig	Mittel B niedrig

Das wünschenswerteste Mittel wäre Mittel B, weil es ein hohes G☐i-Potential in Verbindung mit dem niedrigsten Potential, G☐q zu stimulieren, aufweist.
Es wird anerkannt werden, dass die ausgewählten Testverbindungen solche sind, die nicht Agonisten des Typ1-Rezeptor vermittelten G☐q-Signalisierungsereignisses sind oder nur vernachlässigbare Kapazität zur Aktivierung von G☐q-Leitungspfaden haben. Obwohl zum Beispiel GnRH-I die Fähigkeit zeigt, Zellwachstum zu verringern, besitzt es den Nachteil, dazu fähig zu sein, Gonadotropin-Sekretion von der Hypophyse zu verursachen (d.h. es ist ein Agonist des Typ1-Rezeptor vermittelten G☐q-Signalisierungsereignisses). Es wird deshalb anerkannt werden, dass die ausgewählten Testverbindungen sich wie GnRH I an dem peripheren Tumorort verhalten, aber nicht wie GnRH I im Bereich der Hypophyse.
Testverbindungen, die bei dem Verfahren ausgewählt werden, sind typischerweise jene, die ein hohes Verhältnis von G☐q EC50/G☐i EC50 zeigen. EC50 bedeutet die Konzentration der Testverbindung, die zu 50% der Maximalreaktion von G☐q- oder G☐i-Aktivierung führt. Je kleiner die EC50 desto höher das Potential. Es wird bevorzugt, wenn Testverbindungen mit einem G☐q EC50/G☐i EC50-Verhältnis > 10 ausgewählt werden; noch mehr wird bevorzugt, wenn solche mit einem Verhältnis > 50 ausgewählt werden.
In einem bevorzugten Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl einer Testverbindung als ein potentiell therapeutisches Mittel oder eine drogenartige Verbindung oder eine Führungsverbindung ein, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

a) Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via G☐i aktiviert;
b) Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via G☐q aktiviert; und
c) Auswählen der Testverbindung, die selektiv die Signalisierung via G☐i aktiviert und nicht die Signalisierung via G☐q aktiviert.

Es wird anerkannt werden, dass wir mit „aktiviert nicht die Signalisierung via G☐q" meinen, dass die Signalisierung via G☐q nicht wesentlich aktiviert wird. Deshalb ist die ausgewählte Testverbindung eine solche, die zu vernachlässigende Aktivität zur Aktivierung von G☐q-Leitungspfaden hat. Vorzugsweise wird das Verfahren verwendet, um Testverbindungen auszuwählen, die zur Behandlung von Krebs oder Hyperplasie des reproduktiven Gewebes geeignet sind oder die wenigstens drogenartige Verbindungen oder Führungsverbindungen für diese Indikationen sind. Das Verfahren oder der Test der Erfindung kann auch als Forschungswerkzeug verwendet werden, um die unterschiedlichen Aktivierungszustände der GnRH-Rezeptoren zu untersuchen und zu definieren und um den biologischen Leitungspfad, der durch einen spezifischen Zustand ausgelöst wird, genau zu bestimmen. Dies wiederum hat wichtige und offensichtliche medizinische Auswirkungen auf den Entwurf von Drogen, besonders auf die Auswahl von Kandidatenverbindungen, die keine unerwünschten Nebeneffekte auslösen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann das Testen der Verbindung auf Antitumoreffekte (z.B. durch Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via G☐i aktiviert) und das Testen hinsichtlich der Fähigkeit der erwähnten Testverbindung, das ausgewählte intrazelluläre Ereignis nicht zu modulieren (z.B. Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via G☐q aktiviert oder nicht), unter Anwendung der oben erwähnten Verfahren an derselben Zelllinie gleichzeitig durchgeführt werden. Typischerweise würde eine Anzahl von Zellen auf mehrere Wachstumsplatten aufgeteilt werden, und G☐i-(z.B. Hemmung der Forskolin-induzierten cAMP-Anreicherung) und G☐q-(PLCβ-Aktivierung)Tests werden gleichzeitig durchgeführt. Vorteilhafterweise ist das Verfahren ein solches, das in Screening-Systemen mit hoher Durchlaufrate Angewendet werden kann; zum Beispiel können beide der zuvor erwähnten Tests in handelsüblich verfügbaren Radioimmuntest-basierten Mehrlochplattenformaten durchgeführt werden.
Es wird anerkannt werden, dass die Testverbindungen, die durch das Verfahren ausgewählt wurden, weiter auf ihren Antitumoreffekt in Modellsystemen wie Tiermodellsystemen getestet werden können. Testverbindungen können ferner in klinischen Prüfungen auf ihre Wirksamkeit bei der Behandlung von reproduktiven Tumoren oder Hyperplasien getestet werden.
Zusätzlich oder als Alternative könnten die Testverbindungen als drogenartige Verbindung oder Führungsverbindung, die die Grundlage für weitere Entwürfe von Drogen ist, verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Testverbindung synthetisiert und kann verpackt und als Medikament dargeboten und/oder in zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung zubereitet werden.
Die GnRH-Rezeptorliganden, die gemäß des Verfahrens der Erfindung ausgewählt wurden, sind ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Es wird anerkannt werden, dass bevorzugte Verbindungen, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung ausgewählt wurden, solche sind, die (a) an einen GnRH-Rezeptor binden und (b) selektiv Signalisierung via G☐i aktivieren und keine Signalisierung via G☐q aktivieren. Es wird auch bevorzugt, wenn die ausgewählten Verbindungen solche sind, die mit dem GnRH-Rezeptor wechselwirkende Mittel sind, die GnRH-vermittelte (via G☐q-Aktivierung) Gonadotropinfreisetzung aus der Hypophyse hemmen und direkt auf das Tumorzellwachstum wirken, insbesondere bei nicht-steroidresistenten Tumoren.
Der Ligand 135-25 mit der Formel:
Ac-D-Nal(2)-D-4-ClPhe-D-Pal-Ser-1-MePal-D-IsopropylLys-Leu-IsopropylLys-Pro-D-AlaNH₂ (wobei MePal 1-Methyl-3-(3'-pyridyl)-alanin ist) hat in vitro starke und selektive Antitumoraktivität gezeigt und ist gemäß des Verfahrens der Erfindung ausgewählt worden. So ist die Verwendung des Ligenaden 135-25 (unten auch Ant135-25 genannt) bei der Herstellung einer Droge zur Behandlung von Tumoren, Sexualhormon-abhängigem Krebs oder Gewebehyperplasie ein weiterer Gegenstand der Erfindung.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung oder Formulierung, die Ant135-25 aufweist und ein pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist, ist nützlich zur Behandlung von Tumoren, Sexualhormon-abhängigem Krebs oder Hyperplasie von reproduktivem Gewebe. Der/die Träger muß in dem Sinne "akzeptabel" sein, dass er kompatibel mit Ant135-25 und nicht gesundheitsschädlich für dessen Empfänger ist. Typischerweise werden die Träger Wasser oder Kochsalzlösung sein, die steril und keimfrei sein werden.
Vorzugsweise ist die Formulierung eine Einheitsdosierung, die von dem aktiven Inhaltsstoff eine tägliche Dosis oder Einheit, eine tägliche Unterdosis oder einen angemessenen Bruchteil davon enthält.
Ausgehend von der hier beschriebenen Arbeit wird zusätzlich gezeigt, dass die Verbindung 135-25 zur Behandlung dieser Krankheiten von Nutzen ist.
Ant135-25 hat Anwendungsmöglichkeiten sowohl in der Tier- als auch in der Humanmedizin, deshalb könnte der Patient ein Tier (typischerweise ein Säugetier wie ein Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schaf oder ein Schwein) oder ein Mensch sein. Vorzugsweise wird die Verbindung zur Behandlung von Menschen verwendet. Typischerweise wird die Verbindung in einem Medikament zur Behandlung von Sexualhormon-abhängigen Tumoren wie Tumoren (oder Krebs) der Brust, Prostata, Eierstock, Endometrium oder Hoden verwendet.
Es könnte von besonderem Vorteil sein, jene Patienten zu behandeln, bei denen es sich nach einer Biopsie gezeigt hat, dass sie Tumore mit einem hohen Grad an Steroidunabhängigkeit haben.
Bereits bestehende Therapien entziehen Tumoren die Steroide, die für ihr Wachstum erforderlich sind, wobei sie wahrscheinlich ein zu vernachlässigendes Potential bezüglich der direkten Tumorzellzerstörung haben. Die Verbindung Ant135-25 (und andere Verbindungen, die durch Anwendung des Screening-Verfahrens identifizierbar sind) haben eine Kapazität, die Hormonsekretion der Hypophyse zu steuern und die Tumorzelle direkt zu zerstören. Neoplasmen, die steroidunabhängig wachsen, sind größtenteils gegenüber den bestehenden Therapien resistent, weil ihre direkte Antitumorwirksamkeit nicht spezifisch dafür ausgewählt worden ist. Zusätzlich induzieren herkömmliche, auf Agonisten basierende Tumortherapeutika den ungewollten Nebeneffekt des "Aufflammens" ("Flare") von anfänglicher übermäßiger Hypophysenhormonfreisetzung, von der wir glauben, dass sie durch Verwendung von dem beschriebenen und durch Anwenden des hiesigen Screening-Verfahrens identifizierbare Ant135-25 vermieden werden kann. Weil die Verbindungen vom Prinzip her auf den Tumor wirken, tritt eine Desensibilisierung der Hypophyse nicht auf, und die Verbindungen führen weniger wahrscheinlich zu Resistenzen gegen die Verbindung.
Wenn Hyperplasie behandelt wird, ist es besonders bevorzugt, gutartige Prostatahyperplasie (BPH) oder uterine Fibroide (auch als Leiomyome bekannt) zu behandeln.
Die Verbindung Ant135-25 wird normalerweise zur Verabreichung auf jedem parenteralen Weg in Form einer pharmazeutischen Formulierung vorgesehen sein, die den aktiven Inhaltsstoff wahlweise in Form einer nicht toxischen organischen oder anorganischen Säure oder Base, eines Zusatzsalzes in einer pharmazeutisch akzeptablen Dosierungsform aufweist. Abhängig von der Krankheit und dem zu behandelnden Patienten sowie dem Darreichungsweg können die Zusammensetzungen in unterschiedlichen Dosierungen dargereicht werden. Insbesondere kann Ant135-25 zur Aufbringung direkt auf die Gebärmutterschleimhaut vorgesehen sein.
In der Therapie von Menschen kann Ant135-25 zur alleinigen Verabreichung vorgesehen sein, es wird aber im Allgemeinen zur Verabreichung in Beimischung mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger vorgesehen sein, der/das in Bezug auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und die normale pharmazeutische Praxis ausgewählt wird.
Ant135-25 kann auch zur parenteralen Verabreichung vorgesehen sein, zum Beispiel intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intrathekal, intraventrikulär, intrasternal, intrakranial, intramuskulär oder subkutan (welches ein bevorzugter Verabreichungsweg ist), oder es kann für die Verabreichung durch Infusionstechniken vorgesehen sein. Am besten wird es in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet, die andere Substanzen, wie zum Beispiel genug Salze oder Glukose, enthalten könnte, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen. Die wässrigen Lösungen sollten, wenn notwendig, entsprechend gepuffert sein (vorzugsweise auf einen pH-Wert von 3 bis 9). Die Herstellung geeigneter parenteraler Formulierungen unter sterilen Bedingungen wird leicht mit Hilfe von pharmazeutischen Techniken, die Fachleuten wohl bekannt sind, durchgeführt.
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, schließen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers werden lassen, enthalten können; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensions- und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Behältnissen, zum Beispiel in abgedichteten Ampullen und Phiolen, mit Einzeldosen oder Mehrfachdosen dargeboten werden, und sie könnten unter gefriergetrockneten (lyophilisierten) Bedingungen gelagert werden, die lediglich den Zusatz des sterilen flüssigen Trägers, zum Beispiel Wasser für Injektionen, unmittelbar vor Anwendung, erfordern. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen könnten aus sterilem Puder, Granulaten und Tabletten der zuvor beschrieben Art präpariert werden.
Das tägliche Dosierungsniveau für parenterale Verabreichung von Ant135-25 an humane Patienten wird gewöhnlich zwischen 1 bis 1000 mg pro Erwachsenem (z.B. zwischen 0,015 bis 15 mg/kg) zur Darreichung in Einzel- oder aufgeteilten Dosen liegen. In jedem Fall wird der Arzt die aktuelle Dosierung, die am geeignetsten für jeden individuellen Patienten sein wird, bestimmen, und sie wird sich je nach Alter, Gewicht und Reaktion des einzelnen Patienten unterscheiden. Die oben genannten Dosierungen dienen als Beispiel für den Durchschnittsfall. Es kann natürlich individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche berechtigt sind, und solche liegen im Rahmen dieser Erfindung.
Ant135-25 kann auch für die Verabreichung intranasal oder durch Inhalation vorgesehen werden und wird zweckmäßigerweise in Form einer Trockenpuderinhalator- oder einer Aerosolspraydarreichung aus einem Druckbehälter, einer Pumpe, einem Spray oder einem Vernebler unter Verwendung eines geeigneten Treibgases, z.B. Dichlorfluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, eines Hydrofluoralkans wie 1,1,1,2-Tetrafluorethan (HFA 134A3) oder 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluorpropan (HFA 227EA3), Kohlendioxid oder anderem geeigneten Gas, ausgetragen. Im Falle Aerosols unter Druck kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zur Austragung einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Der Druckbehälter, die Pumpe, das Spray oder der Vernebler kann eine Lösung oder Suspension der aktiven Verbindung enthalten, z.B. unter Verwendung einer Mischung aus Ethanol und des Treibgases als das Lösungsmittel, das zusätzlich ein Gleitmittel, z.B. Sorbitantrioleat, enthalten kann. Kapseln und Patronen (hergestellt z.B. aus Gelatine) zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator könnten dahingehend formuliert werden, dass sie eine Pudermischung einer Verbindung der Erfindung und eine geeignete Puderbasis, wie Laktose oder Stärke, enthalten.
Aerosol- oder Trockenpuderformulierungen werden vorzugsweise so vorbereitet, dass jede abgemessene Dosis oder jeder Hub mindestens 1 mg einer Verbindung der Erfindung zur Austragung an den Patienten enthält. Es wird anerkannt werden, dass die Gesamttagesdosis mit einem Aerosol sich von Patient zu Patient unterscheiden wird und in einer Einzeldosis oder, wie eher üblich, in aufgeteilten Dosen über den Tag verabreicht werden kann.
Alternativ kann Ant135-25 zur Verabreichung in Form eines Suppositoriums oder Pessars vorgesehen sein, oder es kann topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder eines Feinpuder angewandt werden. Die Verbindung kann auch zur transdermalen Verabreichung, zum Beispiel durch Verwendung eines Hautpflasters, vorgesehen sein.
Die Verbindung kann zur topischen Auftragung auf die Haut als geeignete Salbe formuliert werden, die die aktive Verbindung suspendiert oder gelöst enthält zum Beispiel in einer Mischung mit einem oder mehreren der folgenden Stoffe: Mineralöl, flüssiges Petroleum, weißes Petroleum, Propylenglykol, Polyoxyethylenpolyoxypropylenverbindung, emulgierendes Wachs und Wasser. Alternativ können sie formuliert werden als geeignete Lotion oder Creme, suspendiert oder gelöst zum Beispiel in einer Mischung eines oder mehrerer der folgenden Stoffe: Mineralöl, Sorbitanmonostearat, Polyethylenglykols, flüssiges Paraffin, Polysorbat 60, Cetylesterwachs, Cetearylalkohol, 2-Oktyldodekanol, Benzylalkohol und Wasser.
Zur tierärztlichen Verwendung ist Ant135-25 zur Verabreichung als geeignete akzeptable Formulierung gemäß der normalen tiermedizinischen Praxis vorgesehen, und der tiermedizinische Chirurg wird die Dosierungsverordnung und den Verabreichungsweg bestimmen, die für ein bestimmtes Tier am geeignetsten sind.
Es wird anerkannt werden, dass ein weiteres Mittel, wie zum Beispiel ein Antikrebsmittel, zur Verabreichung an den Patienten vorhanden sein kann.
Chemotherapeutika zur Krebsbehandlungen schließen ein: Alkylierende Mittel, einschließlich der Stickstoffsenfgase wie Mechlorethamin (HN₂), Zyklophosphamid, Ifosfamid, Melphalan (L-Sarkolysin) und Chlorambuzil; Ehtylenimid und Methylmelamin wie Hexamethylmelamin, Thiotepa; Alkylsulfonate wie Busulfan; Nitrosoharnstoffe wie Carmustin (BCNU), Lomustin (CCNU), Semustin (Methyl-CCNU) und Streptozocin (Streptozotocin); und Triazene wie Decarbazin (DTIC; Dimethyltriazenimidazolcarboxamid); Antimetabolite einschließlich Folsäureanaloge wie Methotrexat (Amethopterin); Pyrimidinanaloge wie Fluoruracil (5-Fluoruracil; 5-FU), Floxuridin (Fluordeoxyuridin; FUDR) und Cytarabin (Cytosinarabinosid); und Purinanaloge und verwandte Hemmstoffe wie Mercaptopurin (6-Mercaptopurin; 6-MP), Thioguanin (6-Thioguanin; TG) und Pentostatin (2'-Deoxycoformyzin). Natürliche Produkte einschließlich der Vincaalkaloide wie Vinblastin (VLB) und Vincristin; Epipodopyllotoxine wie Etoposid und Teniposid; Antibiotika wie Dactinomycin (Actinomycin D), Daunorubicin (Daunomycin; Rubidomycin), Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin (Mithramycin) und Mitomycin (Mitomycin C); Enzyme wie L-Asparaginase; und Stoffe zur Modifikation der biologischen Reaktion wie Interferonalphenome. Diverse Mittel einschließlich Platinkoordinationskomplexe wie Cisplatin (cis-DDP) und Carboplatin; Anthrazendione wie Mitoxantron und Anthracyclin; substituierter Harnstoff wie Hydroxyharnstoff; Methylhydrazinderivate wie Procarbazin (N-Methylhydrazin, MIH); und adrenocortical hemmende Mittel wie Mitotan (o,p'-DDD) und Aminoglutethimid; Taxol und Analoge/Derivate; und Hormonagonisten/-antagonisten wie Flutamid und Tamoxifen. Andere Mittel schließen Paclitaxel, Bombesin, Antagonisten des Gastrin freisetzenden Peptids (GRP), und Iressa (Gefitinib; ein EGP-Antagonist) ein.
Die Erfindung wird nun genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und nicht-einschränkenden Beispiele beschrieben werden.
1 zeigt die antiproliferativen Effekte der GnRHR-wechselwirkenden Liganden auf humane JEG-3 Chorionkarzinomzellen. JEG-3-Zellsubkulturen geringer Dichte wurden fünf Tage fortgesetzt behandelt mit den angegebenen Dosen an GnRH-I (a), GnRH-II (b), Antagonist 135-18 (c) oder Antagonist 135-25 (d), die direkt zu Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium zugegeben wurden, das mit 10% FCS, Glutamin und Penizillin/Streptomycin angereichert war. Die Liganden wurden alle 24 Stunden aufgefüllt. Am Ende der Stimulationsdauer wurden die Zellen mit Trypsin von den Wachstumsböden entfernt und mit Tryptanblaufarbstoff (der in nicht lebensfähige Zellen eintritt) gemischt. Aus diesem Grund wurden nur lebensfähige Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers vierfach für jede Ligandendosis gezählt. Die Balken in jedem Histogramm stellen den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von n = 4 Experimenten dar. Sowohl GnRH-I als auch GnRH-II zeigen einen starken und dosisabhängigen antiproliferativen Effekt auf JEG-3 Zellen. Antagonist 135-25 (Ant135-25) entfaltete ein ähnliches Potential und eine ähnliche Wirksamkeit wie GnRH-I und -II, wohingegen Antagonist 135-18 (Ant135-18) eine viel geringere Stärke und Wirksamkeit im Vergleich zu 135-25, GnRH-I und GnRH-II zeigte.
2 zeigt die antiproliferativen Effekte der GnRH-wechselwirkenden Liganden auf humane gutartige hyperplastische Prostatazellen (BPH-1). BPH-1 Zellsubkulturen geringer Dichte wurden fünf Tage fortgesetzt behandelt mit den angegebenen Dosen an GnRH-I (a), GnRH-II (b), Ant135-18 (c) oder Ant135-25 (d), die direkt zu RPMI 1640-Medium, das mit 10% FCS, Glutamin und Penizillin/Streptomyzin angereichert war, zugegeben wurden. Die Liganden wurden alle 24 Stunden aufgefüllt. Am Ende der Stimulationsdauer wurden die Zellen mit Trypsin von den Wachstumsböden entfernt und mit Tryptanblaufarbstoff (der in nicht lebensfähige Zellen eintritt) gemischt. Aus diesem Grund wurden nur lebensfähige Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers vierfach für jede Ligandendosis gezählt. Die Balken in jedem Histogramm stellen den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von n = 4 Experimenten dar. Sowohl GnRH-I als auch in geringerem Ausmaß GnRH-II zeigt einen starken und dosisabhängigen antiproliferativen Effekt auf JEG-3 Zellen. Antagonist 135-25 entfaltete ein ähnliches Potential und eine ähnliche Wirksamkeit wie GnRH-I, wohingegen Ant135-18 eine viel geringere Stärke und Wirksamkeit im Vergleich zu Ant135-25 und GnRH-I zeigte.
3 zeigt die antiproliferativen Effekte der GnRH-wechselwirkenden Liganden auf humane embryonale Nierenzellen (HEK293), die den Typ I des humanen GnRHR expressivieren. Es wurde ein identisches Verfahren wie in 1 angewandt, um Zellwachstum zu messen. Auf Grund des viel höheren Niveaus der GnRH-Expression in den SCL60-Zellen (HEK293-Zellen, die beständig den humanen Typ I GnRHR überexpressivieren) ist eine größere antiproliferative Wirksamkeit für GnRH-I (a), -II (b) und Ant135-25 (d) offensichtlich. Jedoch entfaltet Ant135-18 (c) im Vergleich zu den anderen Liganden immer noch eine geringe Wirksamkeit.
4 zeigt die GnRH-induzierten apoptotischen Ereignisse bei JEG-3 und BPH-1 Zellen. a) GnRH-induzierte Plasmamembrantranslokation von Phosphatidylserin, gemessen unter Anwendung von Färbung mit rekombinantem Protein Annexin-V-FITC. Alle 12 Tafeln stellen entweder Phasenkontrastbilder (1, 4, 7, 10), konfokale Lasermikroskopbilder (2, 5, 8, 11) oder zusammengeführte Phasenkontrast-/konfokale Bilder (3, 6, 9, 12) dar. Die Tafeln 1 bis 3 stellen unbehandelte JEG-3 Kontrollzellen für die Zellen in den Tafeln 4 bis 6 dar, die über 24 Stunden mit GnRH-I (100 nM) behandelt wurden. Alle Zellen wurden, während sie lebten, einem rekombinanten Protein Annexin-V ausgesetzt, das an FITC-Fluorophor konjugiert war. Das Annexin-V wird spezifisch nur an Phosphatidylserin(PS)-Lipide binden, die gewöhnlich nur auf der intrazellulären Seite der Plasmamembranlipiddoppelschicht expressiviert werden. Ein frühes Zeichen von Apoptose ist die Translokation dieser PS-Lipide von der intrazellulären Seite der Membran an die äußere Seite der Doppelschicht. Wie in Tafel 2 oder 5 zu sehen ist, gibt es keine wesentliche Expression von Annexin-V-reaktivem PS auf der extrazellulären Oberfläche der Plasmamembran. Die Tafeln 10 bis 12 stellen Zellen dar, die über 48 Stunden GnRH I ausgesetzt waren, während die Tafeln 7 bis 9 als unstimulierte zeitgleiche Kontrollen dienen. Es ist offensichtlich in Tafel 11, dass es eine signifikante Expression von extrazellulärem Annexin-V-reaktiven PS an der JEG-3-Zellmembran gibt. Identische Ergebnisse wurden von ähnlicher GnRH-I-Behandlung von BPH-1 Zellen (die Daten werden in weiteren Figuren gezeigt) gewonnen. GnRH-I induziert eine erhöhte Expression der proapoptotischen Proteasen Spaltcaspase 3 und Procaspase 3 sowohl in JEG-3 Zellen (b) als auch in BPH-1 Zellen (c). Die zellulären Spiegel von Caspase 3 und Procaspase 3 wurden anhand von spezifischen Immunblots von JEG-3- oder BPH-1-Ganzzelllysaten von Zellen, die über den dargestellten Zeitraum fortgesetzt mit GnRH-I stimuliert wurden, erfasst.
5 zeigt, dass GnRHR-wechselwirkende Liganden durch extrazelluläre Signale regulierte Kinase (ERK1/2) sowohl in BPH-1 als auch JEG-3 Zellen stimulieren. a) GnRH-I induziert eine starke und dosis-abhängige Aktivierung von ERK1/2 in BPH-1 Zellen. Die Tafel stellt einen repräsentativen Anti-Phospho-ERK1/2-Ganzzellenlysatimmunblot der stimulierten BPH-1-Zellextrakte dar. Das Phospho-spezifische Antiserum identifiziert nur die aktivierte Form von ERK1/2 während das Anti-ERK2-Serum gleichermaßen mit inaktiven und aktiven Formen von ERK2 reagiert. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, als ähnliche Untersuchungen an JEG-3-Zellen durchgeführt wurden, was andere Untersuchungen der GnRH-induzierten JEG-3-Zellaktivierung bestätigte. Tafel b) stellt das Ausmaß der ERK1/2-Phosphorilierung und damit der Aktivierung dar, die durch mehrere GnRH-wechselwirkende Liganden (alle mit einer Dosis von 100 nM für 10 Minuten) in JEG-3 Zellen induziert wurde. Jeder Balken des Histogramms repräsentiert den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei bis vier Experimentwiederholungen. Sowohl GnRH-I als auch Ant135-25 aktivieren ERK1/2 in einem ähnlichen Ausmaß, wobei GnRH-II weniger effektiv und Ant135-18 am wenigsten effektiv ist. Tafel c) stellt das Ausmaß der ERK1/2-Aktivierung dar, die durch Stimulation mit GnRH-I, -II, Ant135-25 und Ant135-18 in BPH-1-Zellen induziert wurde. Ein JEG-3 ähnliches Muster der Ligandenaktivierung der BPH-1 Zellen wurde beobachtet. Jeder Balken des Histogramms repräsentiert den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei bis vier Experimentwiederholungen.
6 zeigt die Induktion von Inositolphosphatanreicherung durch GnRHR-wechselwirkende Liganden in BPH-1 Zellen. BPH-1 Zellen wurden mit ³H-Myoinositol (|☐Ci/ml) für 48 Stunden (60 Minuten) vor Ligandenstimulation vorinkubiert. Liganden-stimulierte Inositolphosphatproduktion wurde in Anwesenheit von 10 mM LiCl gemessen. Tafeln a bis d zeigen, dass nur hohe Dosen an GnRH-I und Ant135-25 irgendeine wesentliche Anreicherung von Inositolphosphaten bewirken, was daran denken lässt, dass Typ I-GnRHR-Expression in diesen Zellen vorherrschend ist. Dies ist durch RT-PKR (Daten nicht gezeigt) bestätigt worden; die geringe Aktivität von GnRH-II auf die Inositol-Anreicherung ist wahrscheinlich auf die geringere Empfindlichkeit des Inositolphosphattests im Vergleich zu dem hochgradig verstärkten ERK1/2-Aktivierungstests zurückzuführen. Die hohen Dosen an GnRH-I, die jedoch erforderlich sind, um wesentliche Inositolphosphatanreicherung zu induzieren, ließ daran denken, dass die Hauptursache der PLC-β-Aktivierung, G☐q, nicht der Mechanismus sein mag, durch welchen die Inositolphosphatanreicherung induziert wird. IP-Anreicherung kann als Anzeige/Marker für G☐q-Aktivierung verwendet werden, weil die Aktivierung von PLCβ PTX-resistent ist. Tafel e zeigt, dass ein G☐i-Mechanismus für diesen GnRH-I-Hochdosiseffekt verantwortlich sein mag. Folglich wurde die Kapazität der hohen GnRH-I-Dosis (50 ☐M), eine Inositolphosphatanreicherung zu induzieren, durch eine 16-stündige Vorinkubation von BPH-1-Zellen mit 200 ng/ml Pertussistoxin (PTX) aufgehoben. Im Gegensatz zur induzierten Inositolphosphatanreicherung wurde die starke Zell-Mitogen-lysophosohatidische Säure (LPS) unempfindlich gegenüber der PTX-Vorinkubation, was daran denken lässt, dass die LPS-GPCR in diesen Zellen immer noch die PLC-β-Aktivierung unabhängig von G☐i stimulieren kann.
7 zeigt die GnRH-induzierte Aktivierung von JNK- und p38-Mitogen-aktivierten Proteinkinasen in JEG-3- und BPH-1-Zellen. Die Aktivierung zweier weiterer Formen der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) wurde in JEG-3- und BPH-1-Zellen durch Überexpressivieren myc-markierter Konstrukte von JNK2 oder p38☐ untersucht. Immunpräzipitierung dieser Konstrukte nach GnRHR-Ligandenstimulation jeder der Zelllinien erlaubte die Einschätzung des Maßes der Kinasenaktivierung durch Verwendung von Antiserum, das für die aktive, phosphorilierte Form der Kinase spezifisch war. Es gab in beiden Zelllinien eine starke Stimulation dieser MAPK, jedoch schien es eine Zellabhängigkeit der stimulierten Kinase zu geben, und so wurde in JEG-3-Zellen nur eine signifikante Aktivierung von immunpräzipitiertem myc-JNK2 gezeigt (Tafel a, p38☐-Daten nicht gezeigt), während in BPH-1 Zellen nur eine signifikante Aktivierung von myc-p38☐ detektiert wurde (Tafel b, JNK2-Daten nicht gezeigt). Sowohl in Tafel a als auch in Tafel b lag die angewandte Dosis von GnRH-I bei 100 nM. Die betreffenden Histogramme in jeder Tafel repräsentieren den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei Experimentwiederholungen des Zeitablaufs.
8 zeigt die Liganden-spezifische Aktivierung von JNK- oder p38-MAPK in JEG-3- und BPH-1-Zellen. Tafel a zeigt, dass sowohl GnRH-I als auch Ant135-25 das myc-JNK2-Konstrukt gemessen durch seinen aktivierten Phosphorilierungszustand wirksam aktivieren können, während eine ähnliche zelluläre Stimulation mit Ant135-18 daran scheiterte, JNK wirksam zu aktivieren. Die eingesetzten Immunblots stellen den Phosphorilierungszustand der immunpräzipitierten JNK2 dar, der ansteigt, während der Spiegel des gänzlich unphosphorilierten Proteins (detektiert mit ☐-JNK-Antiseren) unverändert bleibt. Das Histogramm unten stellt den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei Experimentwiederholungen der oben erwähnten Western Blots dar. Stimulation der BPH-1-Zellen mit demselben Bereich von Liganden (Tafel b) ergibt ein ähnliches Muster der MAPK-Aktivierung, aber in diesem Fall p38☐. Deshalb aktivieren sowohl GnRH I als auch Ant135-25 wirksam p38☐, während Ant135-18 dies nicht tut. Die eingesetzten Immunblots stellen eine zunehmende Phosporilierung von p38☐ ohne Zunahme beim gesamten p38☐-Protein dar. Das Histogramm darunter stellt den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei Experimentwiederholungen der oben erwähnten Western Blots dar.
9 zeigt, dass GnRH I und Ant135-25 das G☐i-Typ G-Protein aktivieren. Sowohl in BPH-I-als auch in JEG-3-Zellen können GnRH und Ant135-25 durch Forskolin (FSK) stimulierte intrazelluläre cAMP-Anreicherung antagonisieren. Die Tafeln a und b stellen jeweils die Effekte von FSK, GnRH-I und Ant135-25 auf intrazelluläre Spiegel von cAMP in BPH-1- und JEG-3-Zellen dar, die unter Verwendung eines kolorimetrischen Biomol cAMP-Testkits gemessen wurden. Wie in den Tafeln a und b gesehen werden kann, hebt eine Einzelstimulationen mit FSK (2 ☐M, 15 Minuten) die intrazellulären cAmp-Spiegel stark an. Mit ansteigenden Zeiten der Vorexposition (10, 30, 60 Minuten) gegenüber GnRH-I oder Ant135-25 wurde das Ausmaß der FSK-stimulierten cAMP-Anreicherung jedoch wesentlich verringert. Die stärkste Hemmung der FSK-stimulierten cAMP-Anreicherung wurde bei einer 60 minütigen Vorexposition sowohl für GnRH-I als auch Ant135-25 gesehen. In den Tafeln c (BPH-1) und d (JEG-3) kann die GnRH-I und Ant135-25 vermittelte Hemmung der FSK-stimulierten cAMP-Anreicherung (in beiden Fällen 60-minütige Vorexposition) spezifisch durch eine 16-stündige Vorinkubation der Zellen mit 200 ng/ml PTX gehemmt werden. Jedes Histogramm in den Tafeln a bis d stellt den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei bis vier Experimentwiederholungen des cAMP-Anreicherungstests dar.
10 zeigt, dass GnRH I- und Ant135-25-Aktivierung von JNK oder p38 abhängig von G☐i-Stimulation ist. Stimulation von JNK in JEG-3-Zellen und von p38a in BPH-1-Zellen und deren Empfindlichkeit gegenüber PTX-Vorexposition wurde durch Messen des Grades an Phosphorilierungsaktivierung von immunpräzipitierten myc-JNK2 oder myc-p38☐ erfasst. Tafel a stellt einen repräsentativen Western Blot von immunpräzipitierter myc-JNK2 von JEG-3 Zellen dar, die entweder mit GnRH-I (100 nM) oder Ant135-25 (100 nM) stimuliert wurden. Der Phosphorilierungszustand von JNK wurde durch GnRH-I und Ant135-25 ohne wesentliche Veränderung bei den insgesamt immunpräzipitierten JNK-Spiegeln (eingeschätzt durch Immunblot mit a-myc-Antiseren) angehoben. Der Anstieg bei der JNK-Phosphorilierung wurde jedoch mit der PTX-Vorinkubation (16 Stunden, 200 ng/ml) beseitigt. Die Histogramme in den Tafeln b und c stellen den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts von drei Experimentwiederholungen der oben erwähnten Western Blot Experimente (Tafel a) dar. Tafel d stellt ein identisches Experiment zu dem in Tafel a dar, außer dass der Phosphorilierungszustand des immunpräzipitierten myc-p38a gemessen ist. So ist wie bei JEG-3-Zellen die Aktivierung von MAPK durch sowohl GnRH I als auch durch Ant135-25 äußerst empfindlich gegenüber der PTX-Vorexposition (16 Stunden, 200 ng/ml). Die Histogramme in den Tafeln e und f stellen den Mittelwert +/– Standardabweichung des Mittelwerts der drei Experimentwiederholungen der oben erwähnten Western Blot Experimente (Tafel d) dar.
11 zeigt Hemmung von GnRH-I-vermittelter Apoptose durch selektive Hemmung von JNK- oder p38-MAPKs. Der Beitrag der GnRH-I-vermittelten JNK- oder p38-Aktivierung zum proapoptotischen Phänotyp der JEG-3- oder BPH-1-Zellen (wie in 4 gezeigt) wurde durch die Verwendung eines chemischen MAPK-Hemmstoffs erfasst. Tafel a stellt konfokale Phasenmikroskopbilder von JEG-3-Zellen dar, die mit 100 nM GnRH-I in An- oder Abwesenheit einer hohen Dosis (20 ☐M) an SB203580 stimuliert wurden. Diese Dosis an SB203580 hebt die Fähigkeit von GnRH I effektiv auf, JNK in diesen Zellen zu stimulieren, während sie die Aktivierung von ERK1/2-MAPKs nicht wesentlich beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Unstimulierte Zellen (1, 4, 7) zeigen keine Annexin-V-FITC-Färbung als Indikator einer normalen Zellmembranmorphologie; mit 48-stündiger fortgesetzter GnRH-I-Behandlung fangen die Zellen an, anti-Annexin-V-FITC immunreaktiv zu werden (2, 5, 8) und zeigen dabei, dass sie angefangen haben, in einen proapoptotischen Zustand einzutreten. Wenn jedoch GnRH-I in Gegenwart von SB203580 inkubiert wird, gibt es einen wesentlichen Rückgang beim Ausmaß der Zellen, die in einen proapoptotischen Zustand eintreten (3, 6, 9). Eine ähnliche experimentelle Ansatz wurde für die Übertragung dieser Untersuchung auf BPH-1-Zellen angewandt, jedoch konnte, weil die MAPK während der Untersuchung in diesen Zellen p38 war, eine viel niedrigere Dosis an SB203580 (1 ☐M) angewandt werden, weil die Verbindung im Vergleich zu JNK eine viel höheres Hemmpotential auf p38 hat. Wie bei Tafel a wurde kein signifikanter Effekt dieser SB203580-Konzentration auf GnRH-vermittelte ERK-Aktivierung in BPH-1-Zellen gefunden; diese Dosis dämpfte sogar die GnRH-vermittelte Aktivierung von p38☐ (Daten nicht gezeigt). Wie bei dem Effekt der Coinkubation von SB203580 mit GnRH in JEG-3-Zellen verhinderte der Einschluss des chemischen Hemmstoffs, dass GnRH einen proapoptotischen Zustand in den BPH-1-Zellen induzierte (vergleiche 2, 5, 8 mit 3, 6, 9).
12 zeigt, dass Ant135-25 ein unterscheidbares pharmakologisches Profil gegenüber Ant135-18 besitzt. Unter Verwendung von zwei Zelllinien, die eine einzige GnRH-Rezeptorpopulation expressivieren, kann gezeigt werden, dass Ant135-25 keine wesentliche biologische Aktivität auf den Typ II-GnRHR auszuüben scheint, von dem davon ausgegangen wird, dass er der Ort der GnRH-Wirkungsweise in peripheren Tumorzellen ist. Die Histogramme in den Tafeln a und b repräsentieren Daten der Inositolphosphatanreicherung von HEK293-Zellen, die beständig nur den Typ I-GnRH-Rezeptor (SCL60) expressivieren. In Tafel a übt GnRH I (10 nM) eine typische agonistische Aktivität auf seinen zugehörigen Rezeptor aus, was durch den wesentlichen Anstieg von freigesetzten Inositolphosphaten gezeigt wird, jedoch scheinen am Typ I-GnRH-Rezeptor sogar hohe Dosen von Ant135-18 wenig klassische agonistische Kapazität zu haben. In Tafel b werden SCL60-Zellen anstelle von Ant135-25 parallel mit GnRH-I stimuliert, doch wird wiederum keine klassische agonistische Aktivität gezeigt. In den Tafeln c und d wurden die freigesetzten erzeugten Inositolphosphate in den proto-gonadotropen Zellen (aT4), die beständig den Typ II-GnRH-Rezeptor des Krallenaffen (bezeichnet als aT4-II) expressivieren, gemessen. In Tafel c resultiert die Stimulation der Zellen mit GnRH II (10 nM) in eine ähnliche Wirkungsweise wie GnRH I auf SCL60-Zellen, jedoch übt Ant135-18 eindeutig eine dosisabhängige agonistische Aktivität auf diese Typ II-GnRH-Rezeptor expressivierenden Zellen aus. Im Gegensatz dazu, siehe Tafel d, rufen sogar hohe Dosen an Ant135-25 keine Freisetzung von freien Inositolphosphaten hervor. In beiden Zelllinien SCL60 und aT4-II wurden die hier gemessenen freien Inositolphosphate in einer weitgehend PTX-unempfindlichen Weise freigesetzt, was daran denken lässt, dass Ant135-25 in gewissem Ausmaß einen agonistischen Effekt hauptsächlich nur in zellulären Umgebungen ausübt, wo der GnRH-Rezeptor (Typ I) vorherrschend an G☐i-Typ G-Proteine gekoppelt ist.
Beispiel 1: Entwicklung von auf GnRH-basierten Antitumortherapeutika
Vier GnRH-Rezeptorliganden (GnRH I, GnRN II und zwei synthetische GnRH-Antagonisten 135-18 und 135-25) wurden gescreent.
Antagonist 135-18 weist die Formel auf: Ac-D-Nal(2)-D-4-ClPhe-D-Pa-Ser-Ile-D-IsopropylLys-Leu-IsopropylLys-Pro-D-AlaNH₂.
Antagonist 135-25 weist die Formel auf: Ac-D-Nal(2)-D-4-ClPhe-D-Pal-Ser-1-MePal-D-IsopropylLys-Leu-IsopropylLys-Pro-D-AlaNH₂.
Verwendete Abkürzungen:

Ac-D-Nal(2)

ist Acetyl-D-2-Naphtylalanin;

D-4-ClPhe

ist D-4-Chlorphenylalanin;

D-Pal

ist D-Pyridylalanin;

Ser

ist Serin;

MePal

ist Methylpyridylalanin;

Ile

ist Isoleucin;

D-IsopropylLys

ist D-Isopropyllysin;

Leu

ist Leucin;

Pro

Ist Prolin:

Ala

ist Alanin.

MATERIAL UND METHODEN
Diese werden in den Legenden zu den Figuren beschrieben.
ERGEBNISSE
GNRH UND LIGANDENANALOGE VERMITTELN EINEN ANTIPROLIFERATIVEN EFFEKT AUF KREBSGEWEBE
Fortgesetzte Behandlung von Einzelschichten aus entweder JEG-3 humaner Chorionkarzinome, humanen benignen Prostatahyperplasie(BPH-1)- oder HEK293-Zellen, die beständig den Typ I-GnRH-Rezeptor (SCL60) der Ratte expressivierten, resultierten in eine Verzögerung des zellulären reproduktiven Wachstums von allen drei dieser Zelltypen. Jeder Zelltyp wurde mit anfänglich minimaler Konfluenz (10–20%) plattiert, um 5 Tage lang ein normales fortgesetztes Zellwachstum zu erlauben, welches am 5. Tag nicht in 100%ige Zellkonfluenz resultieren würde. Jeder Ligand wurde für jede experimentelle Konzentration dreifach mit den Zelleinzelschichten fünf Tage lang mit Austausch des Liganden alle 12 Stunden inkubiert. Am Ende des Stimulationszeitraums wurde die Zahl der lebensfähigen Zellen über ihre Kapazität, die Aufnahme von Tryptanblaufarbstoff zu verhindern, geschätzt. In 1 kann beobachtet werden, dass es deutliche Dosis-Antwort-Beziehungen für die Hemmung des zellulären Wachstums der JEG-3-Zellen durch GnRH-I (Tafel a), GnRH-II (Tafel b) und den Antagonisten 135-25 (Ant135-25: Tafel d) gibt. Jedoch gelingt es dem Antagonisten 135-18 (Ant135-18), der chemisch Ant135-25 ähnlich ist, nicht, einen antiproliferativen Effekt ähnlicher Ausprägung wie denjenigen, der von GnRH-I, GnRH-II oder Ant135-25 erzeugt wird, zu zeigen. Deshalb lassen diese Daten daran denken, dass es anders als in kürzlich erschienenen Berichten (Grundker et al (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 1427–1430) pharmakologisch so zu sein scheint, dass GnRH-I und GnRH-II einen ähnlichen Effekt auf Zellproliferation ausüben. Zusätzlich erscheint es unwahrscheinlich, dass der antiproliferative auf GnRH basierende Effekt via einer Typ II-GnRH-Rezeptor(GnRHR)-Stimulation eintritt, weil gezeigt wurde, dass Ant135-18 einen hohen Grad an partieller agonistischer Aktivität auf Typ II GnRHR, die aus mehreren Arten (Ott et al (2002) Mol. Endocrinol. 16, 1079–1088) geklont wurden, besitzt, und doch kann er keine größere antiproliferative Wirkung als diejenige durch Ant135-25 ausüben, der überhaupt keine agonistische Aktivität beim Typ II-GnRHR des Krallenaffen zeigen kann.
GnRH und Ligandenanaloge vermitteln einen antiproliferativen Effekt auf hyperplastisches Gewebe
Unter Anwendung einer zu der im vorausgehenden Abschnitt und in 1 beschriebenen identischen Wachstums- und Stimulationsmethodik exponierten wir die hyperplastische Zelllinie BPH-1 dem gleichen Feld von GnRH-Liganden und antagonistischen Analogen aus (2). Erinnernd an 1 üben beide endogenen GnRH-Agonisten eine ähnliche Art der Wirkungsweise in Hinsicht auf ihre dosisabhängige Hemmung des BPH-1-Zellwachstums im Laufe der 5-tägigen Stimulationsdauer aus. In leichtem Gegensatz zu JEG-3 Zellen scheint GnRH-I jedoch stärker in seiner Kapazität, Zellwachstum zu stoppen, zu sein als GnRH-II. Dieses Ergebnis steht in direktem Widerspruch zu kürzlich gemachten Aussagen, dass in der Tat ein Typ II-GnRH-Rezeptor oder ein spezifischer GnRH II-Ligandeneffekt eine wesentliche Rolle bei dem antiproliferativen Effekts der GnRH-Liganden auf Tumorzellen spielt. Wie bei dem Ligandeneffekten auf JEG-3-Zellen übt Ant135-25 einen antiproliferativen Effekt auf BPH-1-Zellen mit einem ähnlichen Potential wie demjenigen von GnRH-I aus, währen Ant135-18 wieder ein geringes antiproliferatives Potential zeigt und so das Konzept bekräftigt, dass der antiproliferative Effekt, der in diesen Zellen stattfindet, nicht durch eine direkte Wirkung in Folge eines funktionellen humanen Typ II-GnRH-Rezeptors erfolgt.
GnRH und Ligandenanaloge vermitteln einen antiproliferativen Effekt auf nicht krebsartiges, nicht hyperplastisches Gewebe
Desweiteren erforschten wir die Beschaffenheit der Ligandenrezeptorspezifizität des antiproliferativen Effekts des GnRH-Rezeptorsystems durch Untersuchung der Effekte unseres Ligandenfelds auf einen Modellzellenhintergrund, z.B. SCL60-HEK293-Zellen, die beständig den Typ I-GnRHR der Ratte expressivieren. In Folge fortgesetzter Behandlung der SCL60-Zellen mit GnRH-I (3, Tafel a) gab es eine dramatische Reduktion bei der Zellwachstumsrate und einen wesentlichen Verlust bei der Gesamtzellzahl. So wie bei den BPH-1 Zellen erschien der GnRH-II-Ligand bezüglich des Stoppens des SCL60-Wachstums als weniger stark als GnRH-I. Die zwei klassischen GnRHR-Antagonisten verhalten sich in einer ähnlichen Weise wie bei den zwei vorhergehenden Zelllinien, indem sich erwies, dass Ant135-18 relativ ineffektiv bezüglich der Hemmung der SCL60-Zellproliferation ist, wohingegen Ant135-25 eine fast so erfolgreiche Wirkung wie entweder GnRH-I oder auch GnRH-II hatte. Im Vergleich sowohl zu JEG-3- als auch zu BPH-1-Zellen gab es eine beträchtlich stärkere Hemmung des Zellwachstums und einen höheren Grad an detektierbarem Zelltod, die ab 48 Stunden deutlich wurden. Diesen größeren Effekt der GnRHR-Liganden auf SCL60-Zellen schreiben wir dem viel größeren Niveau der Rezeptorexpression in SCL60-Zellen zu. Nur geringe Niveaus an Zelloberflächenrezeptorexpression wurden bei JEG-3-Zellen und BPH-1-Zellen (nicht mehr als 200 spezifische Ereignisse pro Minute für I¹²⁵-His⁵-Tyr⁶-GnRH I) festgestellt, während ein bis zu 10fach höheres Expressionsniveau in SCL60-Zellen gezeigt wird.
GnRH induziert die Erzeugung von proapoptotischen Zuständen in krebsartigen und hyperplastischen Zellen
Wir haben somit gezeigt, dass es in Folge dauerhafter GnRH-Ligandenstimulation von entweder JEG-3 oder BPH-1 eine Verzögerung des Zellwachstums gibt, jedoch waren wir daran interessiert, ob es irgendeine echte Induktion zellulärer Apoptose gibt, so wie sie, wie kürzlich berichtet wurde, in mehreren Tumorzelllinien stattfinden soll (Soon et al (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 4580–4586). Zu diesem Zweck erforschten wir, ob GnRH-Ligandenstimulation einer der beiden Zelllinien in die Erzeugung klassischer Signale von Apoptose resultierte. Anfänglich maßen wir die Effekte der GnRH-Stimulation auf die ultrastrukturelle Integrität der Plasmamembran der Zellen. Ein gut dokumentiertes frühes Ereignis bei Apoptose ist eine Umkehrung der Polarität vieler Plasmamembranmoleküle wie Phosphatidylserin (PS). In einem frühen Stadium der zellulären Apoptose erfolgt eine signifikante PS-Translokation von der inneren zur äußeren Hülle der Plasmamembran. Durch Anwendung der hohen Affinität des Annexin-V-Proteins zu exponiertem PS testeten wir, ob eine verlängerte GnRH-Exposition der JEG-3 Zellen in die Expression gegenüber Annexin-V reaktivem PS auf der äußeren Hülle der mit GnRH-I stimulierten Zellen resultierte. Unstimulierte JEG-3-Zellen konnten nach 24-stündiger Subkultur keine extrazelluläre Membran-PS zeigen, ebenso gab es nach 1-stündiger Inkubation mit Annexin-V, welches mit dem FITC-Fluorophor (Verdünnung 1:100) vorkonjugiert war, keine signifikante grüne Fluoreszenz, die in Verbindung mit den Zellen stand (4, Tafel a, Bilder 1–3). Stimulation der Zellen über 24 Stunden und ihre anschließende Inkubation mit Annexin-V-FITC zeigte, dass es zusätzlich keine signifikante Expression von extrazellulärem Membran-PS gab (4, Tafel a, Bilder 4–6). Mit einem größeren Zeitraum fortgesetzter Stimulation (48 Stunden) gab es jedoch offenkundig eine beträchtliche Menge an Annexin-V-reaktivem PS an der äußeren Membran (4, Tafel a, Bilder 10–12). Im Gegensatz dazu konnten zeitgleich kultivierte unstimulierte Zellen keinerlei Annexin-V-FITC-Färbung der äußeren Membran zeigen (4, Tafel a, Bilder 7–9). Deshalb gab es nach nur 48 Stunden fortgesetzter GnRH-I-Stimulation (100 nM) eine Induktion der Plasmamembranumkehrung, wie durch das Vorhandensein von extrazellulärem Hüllen-PS angezeigt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden nach GnRH-Stimulation von BPH-1-Zellen über einen gleichen Zeitraum erzielt (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich zur Erzeugung einer frühen Plasmamembran-PS-Umkehrung waren wir dazu in der Lage, weitere proapoptotische Ereignisse, die durch verlängerte GnRH I-Exposition in den Zellen induziert worden waren, zu zeigen. So untersuchten wir die Erzeugung proapoptotischer Caspaseenzyme, die in vielen Geweben am Zellabbau beteiligt sind. Unbehandelte Ganzzellenlysatextrakte wurden von JEG-3- oder BPH-1-Zellen gewonnen, und die zellulären Spiegel entweder von Procaspase 3 oder ihres gespaltenen und aktiven Zweitproduktes, Caspase-3, wurden mit Hilfe spezifischer Immunblots gemessen. In fortgesetzt mit 100 nM GnRH-I stimulierten JEG-3-Zellen gab es eine wesentliche Erhöhung der zellulären Spiegel von Procaspase 3, die 24–48 Stunden nach anfänglicher Ligandenstimulation offenkundig wurde (4, Tafel b). Die Erzeugung und Erhöhung der zellulären Spiegel von aktiver Caspase-3 brauchten länger, um hervor zu treten und wurden erst 48–72 Stunden GnRH-I-Inkubation in signifikanter Weise offenkundig. Ein gleiches Muster der zeitabhängigen Anstiege von Procaspase und Spaltcaspase-3 wie bei JEG-3-Zellen wurbe bei BPH-1 Zellen während GnRH-I-Stimulation gesehen (4, Tafel c), doch schien es ein schnelleres Einsetzen der Erzeugung von Spaltcaspase und einen höheren Grundspiegel von Procaspase 3 zu Beginn der fortgesetzten GnRH-Stimulation zu geben.
GnRH-Rezeptoraktivierung aktiviert Leitungspfade der stress-aktivierten Proteinkinase in hyperplastischem und krebsartigem Gewebe
Es ist von vielen Forschungsgruppen gezeigt worden (Kang et al (2000) Mol. Cell. Endocrinol. 170, 143–151; Kimura et al (1999) Cancer Res. 59, 5133–5142), dass es bei Stimulation von Tumorzelllinien eine starke und verlängerte Stimulation der durch extrazelluläre Signale regulierten Kinase(ERK)-Isoformen der Mitogen-aktivierten Proteinkinase(MAPK)-Familie gibt. Gleichzeitig mit dieser Aktivierung von ERK erfolgt jedoch das Aufscheinen der antiproliferativen Wirkung der GnRH-Analoge trotz des gut dokumentierten grundsätzlich proliferativen Effekts der ERK-Aktivierung in vielen Geweben (Gutkind (1998) J. Biol. Chem. 273, 1839–1842). So besteht ein Paradoxon darin, dass die GnRH-Analoge Zellwachstum und -proliferation zu stoppen, aber ERK-Isoformen stark zu aktivieren scheinen. Kürzlich erschienene Daten haben auch gezeigt, dass ein hemmender Effekt auf die Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) (Grundker et al, (2001) Endocrinology 142, 2369–2380) zum Teil für die antiproliferative Wirkung der GnRH-Analoge verantwortlich ist. Es gibt jedoch signifikante Anzeichen für die Erzeugung einer lang anhaltenden ERK-Aktivierung in peripheren auf GnRH ansprechenden Tumorgeweben, und tatsächlich beobachteten wir in unseren experimentellen Paradigmen eine reproduzierbare GnRH I-induzierte Aktivierung von ERK1/2-Kinasen sowohl in JEG-3- als auch in BPH-1-Zellen (5). Im Vergleich zur Stimulation anderer endogener G Protein-gekoppelter Rezeptoren, z.B. die auf LPS-ansprechenden Rezeptoren vom EDG-Typ, war der Grad der ERK1/2-Aktivierung relativ klein (Daten nicht gezeigt). Ebenso wie bei den Effekten auf Zellproliferation bemerkten wir, dass das Potential von Ant135-18, die ERK1/2-Aktivierung zu stimulieren, im Vergleich zu GnRH-I, GnRH-II und Ant135-25 beträchtlich geringer war (5, Tafeln b und c). Zusätzlich zur Aktivierung von ERK1/2-MAP-Kinasen in peripheren Tumorzellen haben viele Berichte das Fehlen einer durch GnRH-Stimulation induzierten Inositolphosphatumsatzreaktion, gezeigt. In der Tat bemerkten wir auch, dass es mit geringen Dosen (bis zu 50 ☐M) an GnRH und seiner Analoge (von 1 bis zu 1 ☐M) keinen anerkennbaren Inositolphosphatumsatz gab (6, Tafeln a bis d). Bei hohen Dosen (bis zu 50 ☐M) zeigten jedoch GnRH-I, GnRH-II und Ant135-25 alle eine kleine Kapazität, die Inositolphosphatanreicherung zu induzieren. Die Dosen, die diese Umsatz aktivierten, würden daran denken lassen, dass eher als durch PLC-β Aktivierung durch sein verwandtes G-Protein (G☐q) jene Aktivierung des Inositolumsatzes durch Gβ☐-Untereinheiten eines anderen G-Proteins, z.B. G☐i, vermittelt wurde. Deshalb zeigten wir in 6, Tafel e, dass der GnRH-induzierte minimale Inositolphosphatumsatz empfindlich gegenüber eine Vorbehandlung mit Pertussistoxin (PTX) war, während der robustere Inositolphosphatumsatz, der durch LPS-Behandlung induziert worden war (die auch einen G☐q-gebundenen Rezeptor aktiviert), vollständig unempfindlich gegenüber dem Pertussistoxin war. Daher scheint es so zu sein, dass es in Einklang mit vorangegangenen Berichten einen zu vernachlässigenden Inositolphosphatumsatz gibt, der in peripheren Tumorzellen GnRH induziert wird. Mit sehr viel höheren Dosen scheint es jedoch eine PTX-empfindliche Kapazität zu geben, den Inositolphosphatumsatz mutmaßlich durch die Gβ☐-vermittelte Aktivierung von PLC-β zu stimulieren.
Fortgesetzte Behandlung entweder von JEG-3- oder BPH-1-Zellen mit 1 mM LPS konnte jedoch das Zellwachstum nicht wesentlich verringern und verursachte unveränderlich eine leichte Erhöhung der Zellzahl nach fünf Tagen fortgesetzter Behandlung. Daher scheint es so zu sein, dass die Fähigkeit der GnRH-induzierten Stimulation entweder von JEG-3- oder BPH-1-Zellen nicht in Wechselwirkung zu ihrer antiproliferativen Wirkungsweise steht. Zusätzlich erfassten wir, ob die GnRH-Stimulation entweder der JEG-3 oder der BPH-1 in die signifikante Aktivierung irgendeiner anderen der MAPK-Isoformen resultierte. Unter Verwendung spezifischer Antiseren gegen die als Kinase aktive Form von ERK5 (oder BMK) beobachteten wir keine spezifische Aktivierung dieser MAPK-Form, unter Verwendung von Antiseren, die die aktive Form entweder von c-Jun N-terminaler Kinase(JNK)- oder von p38-MAPK erkennen, bemerkten wir jedoch, dass es in JEG-3-Zellen eine starke, wenn auch verzögerte GnRH-induzierte Aktivierung von JNK und eine ähnlich langsam beginnende Aktivierung von p38 in den BPH-1 Zellen gab. Das Aktivierungsniveau der endogenen stress-aktivierten Proteinkinasen (SAPK) war relativ klein aber größer als die GnRH-aktivierten ERK-Spiegel in diesen Zellen. Um die Gültigkeit der beobachteten SAPK-Aktivierung weiter zu erforschen, transfizierten wir die Tumorzelllinien mit myc- markiertem JNK2- oder p38-MAPK-Isoformen, stimulierten die Zellen mit GnRH und führten dann eine Immunpräzipitation mit anti-myc-Seren und einen Western Blot der Immunpräzipitate für das gesamte JNK/p38-Protein und aktive JNK/p38 durch. In 7 (Tafel a) verursacht GnRH eine vorzeigbare, zeitabhängige und verlängerte Aktivierung der immunpräzipitierten JNK2. Aktivierung von JNK2 findet typischerweise nur nach 30-minütiger GnRH-I Stimulation statt. In den BPH-1-Zellen resultierte die Stimulation mit GnRH-I auch in eine verlängerte Aktivierung des immunpräzipitierten myc-p38a. Wie bei der Aktivierung von JNK in JEG-3-Zellen gab es ungleich den ERK-Signalisierungsereignissen, die typischerweise innerhalb von 20 Minuten von der GnRH-Ligandenapplikation eintreten und ihren Spitzenwert erreichen, eine beträchtliche Verzögerung beim Einsetzen der p38-Aktivierung (7, Tafel b).
GnRH-induzierte Aktivierung von stress-aktivierten Proteinkinaseleitungspfaden ist in die Induktion eines proapoptotischen Zustandes verwickelt
Wir erforschten, ob es eine Verbindung zwischen der Kapazität von GnRH, SAPK Leitungspfade zu aktivieren, und der beobachteten Erzeugung früher Zeichen von Apoptose, z.B. den PS-Transfer von der inneren Seite der Plasmamembranhülle auf die äußere Seite, wodurch es gegenüber dem Annexin-V-FITC-Proteinkonjugat reaktiv wird, gab. Zu diesem Zweck verwendeten wir den SAPK-Hemmstoff SB203580, der in niedrigen Dosen (1 ☐M) als ein starker Hemmstoff der p38-SAPK-Aktivierung fungiert, doch in höheren Dosen (20 ☐M) eine zusätzliche hemmende Aktivität auf die JNK-Familie der SAPK-Proteine ausübt (Mangoura et al (2000) J. Dev. Neurosci. 18 693–704). Die Coinkubation der JEG-3-Zellen mit 20 ☐M SB203580 und GnRH-I über 48 Stunden resultierte in eine signifikante Verminderung des Ausmaßes der Annexin-V-FITC-Färbung der äußeren Seite der Plasmamembran (11, Tafel a, 4–6 im Vergleich zu 7–9). Dort wurde beobachtet, dass es keinen wesentlichen Unterschied bei den allgemeinen Wachstumsmustern und der Gesamtmorphologie der Zellen, die mit SB203580 behandelt worden waren, im Vergleich zu jenen, die mit GnRH alleine behandelt worden waren, oder zu denjenigen, die unstimuliert waren, gab. DMSO-Vehikelkontrollen wurden für die Behandlung mit SB203580 durchgeführt, doch zeigten diese keinen wesentlichen Effekt auf Zellwachstum oder -morphologie (Daten nicht gezeigt). In parallelen Experimenten, aber unter Verwendung einer niedrigeren spezifischeren Dosis SB203580 (1 ☐M) wurden BPH-1-Zellen mit GnRH-I mit oder ohne SB203580 über 48 Stunden coinkubiert. Wie in 11, Tafel b, Bilder 4–6, gezeigt ist, gab es eine signifikante Induktion der Annexin-V-FITC-Reaktivität an der äußeren Plasmamembranhülle, die jedoch fast vollständig durch die Cobehandlung von GnRH-I plus 1 ☐M SB203580 aufgehoben wurde. Wie bei den Experimenten an JEG-3-Zellen gab es keine signifikante beobachtbare Veränderung bei der Zellmorphologie und den Wachstumsraten weder bei den SB203580-behandelten Zellen noch den DMSO-Vehikel-behandelten Zellen. So scheint es, dass die Hemmung der GnRH-induzierten SAPK-Leitungspfade in den JEG-3- Zellen und BPH-1-Zellen die Kapazität der GnRHR-Aktivierung, zelluläre Proliferation in diesen zwei Zelllinien zu hemmen, verringert.
GnRH Liganden Aktivierung der SAPK-Leitungspfade in JEG-3- und BPH-1-Zellen erfolgt via eines G☐i-basierten Rezeptormechanismus
Wir haben gezeigt, dass es sowohl bei der Tumorzelllinie JEG-3 als auch der hyperplastischen Zelllinie BPH-1 über Typ-I-GnRH-Aktivierung eine ausgeprägte Aktivierung der SAPK-Leitungspfade gibt und dass diese Proteinkinasen mit der Erzeugung der frühen Zeichen des programmierten Zelltodes in beiden Modellen verbunden sind. Es ist von vielen experimentellen Gruppen gezeigt worden, dass die G-Protein bindenden GnRH-Rezeptoren, die in peripheren Tumorgeweben expressiviert werden, im Vergleich zu jenen im Bereich der Hypophyse abnormal sind. In der Hypophyse findet das primäre G-Protein bindende Ereignis der stimulierten GnRHR via der G☐q-Typ G-Proteine statt, was zu einem Anstieg beim intrazellulären Ca²⁺ und der möglichen Aktivierung von Proteinkinase C-Isoformen führt. Im Gegensatz dazu scheint jedoch in peripheren Geweben das primäre GnRHR-G-Protein bindende Ereignis via des Pertussistoxin-empfindlichen G☐i-G-Protein-Leitungspfades stattzufinden. Dies geschieht trotz der Tatsache, dass in diesen Zelllinien nur eine Form des GnRH Rezeptors, z.B. der Typ I-GnRHR, aufzeigbar ist. Deshalb testeten wir, ob in unseren experimentellen Paradigmen jene GnRH-Ligandenaktivierung der Zellen in die Stimulation der SAPK-Leitungspfade resultierte, die zuvor in die Erzeugung der frühen Zeichen von Apoptose durch einen G☐i-Typ G-Proteinleitungspfad verwickelt waren. Zusätzlich waren wir daran interessiert, zu beleuchten, ob es irgendeine Korrelation zwischen der GnRH I-artigen antiproliferativen Kapazität einiger GnRH-basierter Peptidantagonisten (Ant135-25) und ihrer Fähigkeit, solche atypischen G☐i-G-Proteinleitungspfade zu stimulieren, gab.
Zuerst zeigten wir, dass es tatsächliche Aktivierung von G☐i-Protein in beiden Zelllinien bei GnRH- und Ant135-25-Stimulation gab. So bemerkten wir, dass, wenn die Spiegel von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) unter Verwendung eines handelsüblichen Fluoreszenztests (Biomol) gemessen wurden, die Fähigkeit von Forskolin (1 ☐M in JEG-3 und 3 ☐M in BPH-1, ausreichend um eine 50% R_max-Antwort in jedem einzelnen Fall zu ergeben) durch ausgedehnte zelluläre Vorbehandlungszeiten (10–60 Minuten) mit entweder 100 nM GnRH-I oder Ant135-25 gedämpft wurde (9, Tafel a-BPH, Tafel b-JEG). In 9, Tafeln c (BPH) und d (JEG) wurde die Fähigkeit der 60-minütigen GnRH I- oder Ant135-25-Vorbehandlungen, um die Forskolin-vermittelte cAMP-Anreicherung zu hemmen, durch eine 16-stündige Vorbehandlung mit 200 ng/ml PTX verringert. Es scheint deshalb so zu sein, dass beide Liganden wirksam die Adenylatzyclase-hemmende Aktivität von G☐i in beiden getesteten Zellmodellen aktivieren können.
Die Fähigkeit von entweder GnRH-I oder Ant135-25, die SAPK-Leitungspfade in JEG-3- oder BPH-1-Zellen zu stimulieren, wurde abgeschätzt und, ob diese SAPK-Leitungspfadaktivierung via eines atypischen G☐i-Typ G-Proteinleitungspfades stattfand. Deshalb wurde unter Anwendung der myc-JNK2 in JEG-3 Zellen oder myc-p38a in BPH-1 transfizierten Zellen das Ausmaß der JNK- oder p38-Stimulation durch Ant135-25 erfasst. Wie in 10 (Tafeln a und d) dargestellt ist, zeigen repräsentative Western Blots, dass es bei sowohl GnRH-I-(100 nM, 30 Minuten) als auch Ant135-25-(100 nM, 30 Minuten)Stimulation ein ähnliches Niveau von JNK2- oder p38a-Aktivierung in JEG-3- beziehungsweise BPH-1-Zellen gibt. Mit einer 16-stündigen Vorinkubation mit 200 ng/ml Pertussistoxin (PTX) wurde das Vorhandensein einer signifikanten Hemmung von entweder GnRH-I oder Ant135-25, die SAPK Leitungspfade zu aktivieren, beobachtet, was daran denken lässt, dass in der Tat beide Liganden G☐i-Typ G-Proteinleitungspfade aktivieren. Die Tafeln b und c in 10 zeigen die Mittelwerte, die bezüglich der hemmenden Wirkung der PTX-Vorbehandlung auf GnRH-I- oder Ant135-25-induzierte JNK2-Aktivierung in JEG-3-Zellen zusammengetragen wurden. Die Tafeln e und f zeigen ähnliche Daten, die bei in BPH-1-Zellen durchgeführten p38a-Aktivierungsexperimenten gewonnen wurden und wiederum zeigen, dass die GnRH-I- und Ant135-25-Stimulation von p38a durch einen PTX-empfindlichen G☐i-Leitungspfad erfolgt.
Antagonist 135-25 und nicht Antagonist 135-18 stimuliert stark die Aktivierung von SAPK-Leitungspfaden in JEG-3- und BPH-1-Zellen
Wir haben gezeigt, dass bei fortgesetzter Stimulation mit entweder GnRH-I oder Ant135-25 sowohl JEG-3- als auch BPH-1-Zellen in ihren Wachstumsraten nachlassen und Zeichen eines frühen apoptotischen Zustands zeigen. Als diese Experimente jedoch unter paralleler Verwendung eines Mittels, das chemisch mit Ant135-25 verwandt ist, d.h. Ant135-18, durchgeführt wurden, war der antiproliferative Effekt, der bei diesem Mittel gesehen wurde, trotz seiner dem potenteren Ant135-25 ähnlichen Struktur minimal. Deshalb erforschten wir, ob dieses Phänomen des geringen antiproliferativen Potentials von Ant135-18 an der Kapazität lag, die G☐i-Leitungspfade zu aktivieren. Beim Testen seiner Kapazität entweder JNK2 in JEG-3-Zellen oder p38a-in BPH-1 Zellen zu aktivieren, zeigte Ant135-18 eine dramatisch geringere Wirksamkeit als GnRH-I oder Ant135-25 in Hinblick auf die Aktivierung der SAPK-Isoformen (8). Deshalb scheint es so zu sein, dass Ant135-25 ebenso wie GnRH I den Leitungspfad vom G☐i-Typ in JEG-3- oder BPH-1-Zellen angemessen aktivieren kann, während das chemisch verwandte Ant135-18 ein viel niedrigeres Potential in Hinblick auf diese Form der atypischen GnRH-Rezeptoraktivierung hat. Deshalb würden wir vorschlagen, dass diese Unfähigkeit von Ant135-18, eine produktive Kopplung zwischen dem GnRHR und dem G☐i-G-Proteinleitungspfad in diesen Modellzellen zu induzieren, im Mittelpunkt seines schwachen antiproliferativen Potentials liegt.
ANTAGONIST 135-25 ZEIGT EIN SELEKTIVES GNRH REZEPTORAKTIVIERUNGSPROFIL
Wir haben gezeigt, dass es trotz des hohen Ähnlichkeitsgrades zwischen Ant135-18 und Ant135-25 einen wesentlichen Unterschied in ihrer Kapazität gibt, bestimmte Formen der GnRH Rezeptoraktivität zu stimulieren, d.h. die Erzeugung eines antiproliferativen Effektes auf drei sowohl tumorartige als auch hyperplastische Zelllinien. Kürzlich erschienene Berichte haben daran denken lassen, dass die atypische GnRH-Rezeptorpharmakologie, die bei peripheren reproduktiven Tumorlinien beobachtet wurden, der Expression eines humanen Typ II-GnRH-Rezeptors ähnlich demjenigen, der ursprünglich von Millar et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9636–9641 geklont wurde, zuzuschreiben ist. Wir haben zuvor bei Säugetier-Typ-II-(Krallenaffe) und nicht-Säugetier-GnRH-Rezeptoren gezeigt, dass jene klassischen GnRH-Typ-I-Rezeptorantagonisten verschiedene Grade partieller agonistischer Aktivität besitzen. Wenn jedoch in der Tat die peripheren antiproliferativen Wirkungen von GnRH und verwandten Liganden auf die Modellzellen, die in der jetzigen Untersuchung verwendet wurden, entscheidend wären, dann würde man erwarten, dass Ant135-18 eine viel größere antiproliferative Wirksamkeit als Ant135-25 besitzen würde, weil der Erstgenannte eine viel größere partielle agonistische Aktivität auf nicht-Säugetier-(Daten nicht gezeigt) und Säugetier-Typ-II-GnRH Rezeptoren (12) zeigt. Wenn daher bei der Expression des Typ-I-GnRH-Rezeptors der Ratte (SCL60) in HEK293-Zellen verglichen wird, üben beide Antagonisten Ant135-18 und Ant135-25 eine klassische antagonistische Aktivität aus und zeigen keine partielle agonistische Aktivität (12, Tafeln a und b). Wenn die zwei Antagonisten jedoch vor einem zellulären Hintergrund verglichen werden, der ausschließlich den Krallenaffen-Typ II-GnRH-Rezeptor beständig expressiviert, d.h. aus ☐T4-Gonadotropinen, die den Krallenaffen-Typ II-GnRH-Rezeptor beständig expressivieren (Millar et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9636–9641), wies Ant135-18 beträchtliche partielle agonistische Aktivität auf (12, Tafel c), während Ant135-25 überhaupt keine partielle Aktivität auf den Typ II-Krallenaffen-GnRH-Rezeptor zeigte (12, Tafel d). Deshalb ist es aus einer pharmakologischen und molekularbiologischen Sichtweise äußerst unwahrscheinlich, dass die antiproliferativen Wirkungen von GnRH-I oder Ant135-25 via Stimulation eines neuartigen humanen Typ II-GnRH-Rezeptors erfolgen.
Die Fähigkeit der vier untersuchten Hauptmittel, ektopisch expressivierten Typ I- oder Typ II-GnRHR zu aktivieren, wurden getestet (12). Die durch GnRHR-Stimulation aktivierte klassische Signaltransduktionskaskade ist die G☐q-PLC-β-Kaskade. Sowohl Typ I- als auch Typ II-Rezeptoren können das G☐q-PLC-Typ G-Protein stimulieren und aktivieren PLC-β, welche Phosphatidylinositolbiphosphat (PIP₂) in Inositoltriphosphat (IP₃), andere niedrigere Inositolphosphate (IP_n) und Diazylglyzerol (DAG) spaltet. Die Hauptfunktion von IP₃ ist es, das intrazelluläre Ca²⁺ zu erhöhen, während DAG die Aktivierung spezifischer PKC(Proteinkinase C)-Isoformen verursacht. Durch Messen der Erzeugung dieser IP_n zeigten wir, dass sowohl Typ I- als auch Typ II-GnRHR durch endogene Liganden (Typ I- und II-GnRH) aktiviert wurden. Jedoch wurde nur der Typ II-Rezeptor durch 135-18 aktiviert, ohne dass Aktivierung des PLC-β Signals an dem Typ I-Rezeptor nachweisbar war (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu entwickelte das chemisch ähnliche Mittel 135-25 keine IP_n-erzeugende Kapazität bezüglich weder ektopisch expressiviertem Typ I- noch II-GnRHR (12).
Die Tafeln a und b der 12 stellen die Erzeugung freier zytoplasmatischer ³H-Myoinositole auf den Plasmamembranen der HEK293-Zellen, die den Typ I-GnRHR expressivieren, und von ☐T4-Gonadotropinen dar, die den Typ II-GnRHR des Krallenaffen expressivieren. Vor der Stimulation mit Agonisten wurden die betreffenden Zellen in Inositol-freiem Wachstumsmedium, das mit 1 ☐Ci/ml ³H-Myoinositol angereichert war, für 48 Stunden inkubiert. Durch an G-Protein gekoppelten Rezeptor(GPCR)-induzierte Aktivierung der PLC-β resultiert in die Spaltung von PIP₂ (die Tritium ³H einbezieht) in freie niedrigere Inositolphosphate (IP_n). Stimulation der Typ I- oder Typ II-GnRHR mit GnRH-I bzw. GnRH-II ergibt einen Anstieg an freien, Tritium enthaltenden Inositolphosphaten. Durch Stimulieren eines der beiden Rezeptoren mit Antagonist 135-25 (10 pM –1 ☐M) gelang es jedoch nicht, signifikante freie Inositolphosphate zu erzeugen. Deshalb scheint es so zu sein, dass der 135-25 Antagonist spezifisch unfähig ist, G☐q-Typ G-Proteine zu aktivieren, trotz des Entwickelns einer hohen Bindungsaffinität zu sowohl Typ I- als auch Typ II-GnRHR (Daten nicht gezeigt) und einer hohen antiproliferativen Wirksamkeit.
Deshalb scheint es so zu sein, dass 135-25 das Potential besitzt, Tumorzellproliferation zu verringern ohne dabei irgendeinen signifikanten Effekt auf andere GnRHR-Signalisierungsmodalitäten zu haben. Da die zwei verwendeten Antagonisten 135-25 und 135-18 sich nur leicht in ihrer chemischen Zusammensetzung unterscheiden (z.B. ein MePal-Rest in Position 5 bei 135-25 statt eines Ile bei 135-18) und doch unterschiedliche Wirksamkeiten gegenüber Tumorzellproliferation haben, mögen ihre physio-chemischen Unterschiede ein wertvoller Ansatzpunkt für Modifikationen an diesem Ort sein, um die anti-Tumorkapazität der GnRH-Liganden zu erhöhen.
DISKUSSION
In dieser laufenden Untersuchung haben wir gezeigt, dass ähnlich wie endogenes GnRH Liganden wie GnRH I, die typischerweise als „Antagonisten" beschrieben werden, hinsichtlich peripherer Tumorzellen aufgrund des veränderten pharmakologischen Profils des Rezeptors in diesen Zellen als Agonisten wirken können. Das Aufzeigen des erhöhten Potentials von Ant135-25 gegenüber Ant135-18 hinsichtlich des antiproliferativen Effekts schien auf die relativen Fähigkeiten der zwei Peptide zurückzuführen zu sein, eine aktive Form des Rezeptors, die produktiv an G☐i binden kann, zu stabilisieren. So ist die Bezeichnung von Ant135-25 als GnRH-Rezeptor-„Antagonist" in gewisser Weise falsch, weil dies nur seine Fähigkeit beschreibt, die/den G☐q-bevorzugende(n) Form/Zustand des Typ I-GnRH-Rezeptors zu aktivieren/stabilisieren. Deshalb haben wir im Wesentlichen beschrieben, dass Ant135-25 eine starke antiproliferative Wirkung zeigt, die auf seine selektive Fähigkeit zurückzuführen ist, eine G☐i-bindende Form des Typ I-GnRH Rezeptors zu aktivieren, während er völlig unproduktiv bezüglich G☐q-Bindungsformen des Rezeptors ist.
Anfängliche Hypothesen betreffend das Wesen der Divergenz bei der Signalisierung zwischen auf GnRH ansprechenden Orten in der Hypophyse und jenen in peripheren reproduktiven Geweben, ließen daran denken, dass der an diesen peripheren Orten vorhandene Rezeptor von unterscheidbarem Wesen zu jenen bei den Gonadotropinen war. Jedoch hat die kürzlich gewonnene Erkenntnis daran denken lassen, dass die zwei Rezeptorplätze in der Tat dieselben sind, jedoch ihre assoziierten Signaltransduktionsmechanismen deutlich unterscheidbar sind (Chegini et al (1996) J. Clin. Endocrinol. Metab. 81, 3215–3221; Yin et al (1998) Life Sci. 62, 2015–2023; Chatzaki et al (1996) Cancer Res. 56, 2055–2065). Diese Dichotomie dehnte sich auch auf die Effekte der Agonisten und Antagonisten der hypophysären Form der GnRH-Signalisierung aus, weil sowohl die Proliferation der endometrischen als auch der Eierstockkrebszellen durch agonistische und antagonistische GnRH-Analoge gehemmt werden können (Emons et al (1997) Trends Endocrinol. Metab. 8, 335–362). Eine Lösung dieses Problems wurde von Imai et al ((1996) J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 132–137) vorgeschlagen, indem sie spekulierten, dass das G-Protein ☐i, das möglicherweise den GnRH Rezeptor an den Effektor bindet, für die Reaktionsunterschiede zwischen peripheren Tumoren und dem Hypophysenvorderlappen verantwortlich sein könnte. Interessanterweise wurde gezeigt, dass wie in unserer Untersuchung funktionelle LPS-vermittelte G☐q-bindende Aktivität in diesen Tumorzellen vorhanden ist (Grundker et al (2001) Endocrinology 142, 2369–2380) und so ein pathophysiologischer Verlust von G-Protein die paradoxe Änderung in der Rezeptorsignalisierung nicht erklären kann. In der vorliegenden Untersuchung wurde wenig GnRH-vermittelte G☐q-Aktivierung beobachtet, aber andere Gruppen haben kürzlich gezeigt, dass in anderen reproduktiven Tumorzelllinien, wie Ishikawa-Zellen, GnRH Bindung an G☐q induzieren kann (Grundker et al (2001) Endicrinology 142, 2369–2380). Jedoch fand diese Gruppe, dass diese hervorstehende G☐q-Signalisierung nicht in die Erzeugung des antiproliferativen Effekts von GnRH verwickelt war. So ist es wahrscheinlich, dass die funktionellen Signalisierungskomplexe, die die GnRH-Rezeptoren in peripheren Tumorstellen enthalten, dazu in der Lage sind, den Rezeptor in spezifische G☐i-Bindung zu zwingen und jene Komplexe in der Hypophyse nicht. Was auch immer das Protein verantwortlich für diesen Wechsel in Funktionalität macht, es ist klar, dass zusätzliche Rezeptor-wechselwirkende Faktoren dramatisch die Art und Weise verändern können, in welcher ein gegebener Ligand sein Signal auf die intrazelluläre Umgebung richten kann, und das mit klar unterscheidbaren physikalischen Endpunkten. Dieses unterschiedliche Binden des Rezeptors zwingt uns deshalb, unsere Terminologie hinsichtlich des Wesens der Ligandenwechselwirkung mit dem GnRH-Rezeptor an diesen peripheren Tumorstellen neu zu bestimmen. So haben wir gezeigt, dass, während Ant135-25 auf dem Niveau des Hypophysenvorderlappens angemessen als ein Antagonist hinsichtlich der Aktivierung der G☐q-basierten Signalisierungsmechanismen beschrieben werden kann, er sich als wahrer Agonist in den peripheren Zellen verhält, weil er bezüglich der Stimulation der existierenden G☐i-gebundenen Typ I- GnRH-Rezeptoren annähernd gleich effektiv zu sein scheint. Zusäztlich haben wir klar gezeigt, dass eine Trennung zwischen diesen beiden Effekten in der Peripherie und der Hypophyse durch Veränderung der ersten Sequenz des GnRH-Rezeptorpeptidliganden bewerkstelligt werden kann. Deshalb resultierte die Umwandlung des einzigen Aminosäurenunterscheidungsmerkmals zwischen Ant135-18 und Ant135-25 in eine dramatische Erhöhung des Potentials des Mittels an dem G☐i-gebundenen peripheren GnRH-Rezeptor, während seine Fähigkeit, die Wirkung von GnRH an dem hypophysären G☐q-gebundenen Rezeptor funktionell zu hemmen, nicht verändert wurde.
Die Verwendung von GnRH-Analogen, sowohl Agonisten als auch Antagonisten, ist jetzt weitläufig akzeptiert mit Anwendungen in der Gynäkologie, Reproduktionsmedizin und Onkologie. Die Mechanismen der Wirkungsweise der Mehrheit dieser Therapeutika basiert auf einer Hemmung des Hypophysenvorderlappens und der Gonaden. Klassische „antagonistische" GnRH-Rezeptorliganden haben einen Vorteil gegenüber GnRH-agonistischen Peptiden, der auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass sie die Sekretion von Gonadotropinen und Sexualsteroiden sofort nach der ersten Anwendung hemmen und somit raschere therapeutische Effekte erzielen als GnRH-Agonisten, die eine wiederholte Verabreichung erfordern (Schally, A. V. (1999) Peptides 20, 1247–1262). Die wiederholte Exposition gegenüber agonistischen Mitteln ist erforderlich, weil sie eine funktionelle Herunterregulierung des GnRH-Signalisierungssystems des Hypophysenvorderlappens induzieren müssen. Unter Bedingungen wie Prostatakrebs sind klassische GnRH-"Antagonisten"-Moleküle gegenüber Agonisten spezifisch bevorzugt, weil sie das sogenannte „Aufflammen" der Krankheit vermeiden, welches bei schätzungsweise 10–20% der Patienten auftritt, wenn Agonisten als einzige Mittel gegeben werden (Schally, A. V. & Comaru-Schally, A. M. (1997) Hypothalamic and other peptide hormones. In: Holland J. F., Frei, E., Bast, R. C., Kufe, D. E., Morton, D. L., Weichselbaum, R. R., Hrgs. Cancer Medicine, 4. Aufl. Baltimore: Williams & Wilkins S. 1067–1086). Zuvor existierende antagonistische Therapien für reproduktive Tumoren schließen die Verabreichung von Cetrorelix ein, welches unter einigen Umständen eine Wachstumsverringerung von Androgen-abhängigen Prostatakrebsen zeigte (Redding et al (1992) Cancer Res. 52, 2538–2544; Korkut et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88, 884–888). Es waren jedoch beträchtlich höhere Dosen an Cetrorelix erforderlich, um das Wachstum Androgen-resistenter Tumorzellen zu verringern (Jungwirth et al (1987) Prostate 32, 164–172; Jungwirth et al (1997) Eur. J. Cancer 33, 1141–1148), was daran denken lässt, dass seine direkte antiproliferative Wirksamkeit wesentlich niedriger sein könnte als seine Fähigkeit, die Gonadotropinfreisetzung im Hypophysenvorderlappen zu verringern, was den Androgen-empfindlichen Tumor seines wachstumserhaltenden Steroids berauben würde. So scheint es, dass die Kapazität, das Tumorwachstum direkt zu verringern, spezifisch wünschenswert bei Mitteln sein könnte, die darauf zielen, aggressive Androgen-unempfindliche Prostatatumore abzubauen; daher unsere Versuche, das direkte antiproliferative Potential des antagonistischen Mittels 135-25 zu erhöhen. In der Tat war Cetrorelix in unseren Händen wesentlich weniger potent als Ant135-25 beim Vergleich seiner Fähigkeiten, PTX-empfindliche/G☐i-abhängige MAPK-Isoformenaktivierung zu stimulieren (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich scheint es so zu sein, dass Cetrorelix keinen wahren und tiefgreifenden antiproliferativen Effekt auf alle reproduktiven Tumore, die GnRH Rezeptoren expressivieren, besitzt, z.B. wurde der antiproliferative Effekt von Triptorelin (GnRH Agonist) auf LNCaP-Prostatazellen wirkungsvoll in Anwesenheit von Cetrorelix gehemmt (Ravenna et al (2000) J. Androl. 21, 549–557). So ist es möglich, dass Cetrorelix ein signifikant niedrigeres antiproliferatives Potential als Triptorelin hat und deshalb in seiner Anwesenheit als ein funktioneller Antagonist seiner Wirkungsweise handelt. In anderen experimentellen Paradigmen wurde gezeigt, dass andere klassische GnRH-Antagonisten, z.B. Antide, funktionell die antiproliferativen Effekte der klassischen GnRH-Rezeptoragonisten hemmen (Kang et al (2000) Endocrinology 141, 72–80). Deshalb ist es möglich, dass die Mehrheit der existierenden Therapeutika keinen signifikanten starken direkten Antitumoreffekt hat, der für Steroid-resistente Neoplasmen wünschenswert wäre. Ihr geringes Potential könnte auf ihr niedriges Potential hinsichtlich des Stabilisierens/Induzierens der/des G☐i-bevorzugenden Konformation/Zustands des Typ I-GnRH-Rezeptors zurückzuführen sein. Wir haben deshalb gezeigt, dass wir durch Modifizieren eines Antagonisten mit einem niedrigen direkten antiproliferativen Potential (Ant135-18) an einem Rest sein antiproliferatives Potential bedeutend erhöht haben, indem ihm erlaubt wurde, den G☐i-Typ der GnRH-Signalisierung stark zu aktivieren, der in peripheren reproduktiven Tumoren gefunden wird. Man glaubt, dass ein Mittel wie Ant135-25 mehrere Eigenschaften aufweist, die es der geläufigen GnRH-basierten Peptidbehandlung reproduktiver Neoplasmen überlegen macht, z.B. gibt es, wenn es kein Agonist ist, kein anfängliches "Aufflammen" der Krankheit (Schally, A. V. & Comaru-Schally, A. M. (1997) Hypothalamic and other peptide hormones. In: Holland J. F., Frei, E., Bast, R. C., Kufe, D. E., Morton, D. L., Weichselbaum, R. R., Hrgs. Cancer Medicine, 4. Aufl. Baltimore: Williams & Wilkins S. 1067–1086.), seine hemmende Wirkung in der Hypophyse wird die Serumspiegel der Sexualsteroide senken und dadurch das Steroid-empfindliche Neoplasmawachstum verringern, und schließlich würde sein erhöhter direkter Antitumoreffekt direkt zytotoxisch für Steroid-resistente Zellen sein, die potentiell im Neoplasma vorhanden sind.
BEISPIEL 2: BEHANDLUNG VON BRUSTKREBS
Einem vorgestellten Patienten mit Brustkrebs wird 1 bis 100 mg der Verbindung Ant135-25 täglich intravenös eine Woche lang verabreicht.
Beispiel 3: Behandlung der benigner Prostatahyperplasie (BPH)
Einem vorgestellten Patienten mit BPH wird 1 bis 100 mg der Verbindung Ant135-25 intravenös eine Woche lang verabreicht.
BEISPIEL 4: BEHANDLUNG VON PROSTATAKREBS
Dem vorgestellten Patienten mit Prostatakrebs wird ein Depot zur Austragung der Verbindung Ant135-25 verabreicht.

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer Testverbindung, die einen Antitumoreffekt aufweist, während sie unbezogene Transduktionssignale nicht signifikant aktiviert, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) Auswählen mindestens einer Testverbindung; (b) Testen der Verbindung auf Antitumoreffekt; (c) Auswählen mindestens eines unterscheidbaren intrazellulären Ereignisses, das zumindest teilweise durch den GnRH-Rezeptor moduliert wird, wobei das genannte Ereignis eine Aktivierung des Typ I-GnRH-Rezeptorleitungspfads ist, der in der Hypophyse aktiviert wird; (d) Testen der Fähigkeit der Testverbindung, das ausgewählte intrazelluläre Ereignis nicht zu modulieren; und (e) Auswählen der Testverbindung, die selektiv einen Antitumoreffekt zeigt und nicht das genannte andere ausgewählte intrazelluläre Ereignis moduliert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) der Antitumoreffekt getestet wird, indem bestimmt wird, ob die Testverbindung bei krebsartigem Gewebe einen tumorspezifischen Typ I-GnRH-Rezeptortransduktionspfad aktiviert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in Schritt (b) der Antitumoreffekt getestet wird, indem bestimmt wird, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermitteltes Signalisieren via Gαi aktiviert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in Schritt (b) der Antitumoreffekt getestet wird, indem bestimmt wird, ob die Testverbindung einen proapoptotischen Effekt auf Tumorzellen hat.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der proapoptotische Effekt durch das Bestimmen der extrazellulären Expression von Phosphatidylserin erfasst wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in dem Schritt (c) das unterscheidbare intrazelluläre Ereignis die Aktivierung des GnRH-Rezeptor-vermittelten Gαq-Signalisierungswegs ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) Auswählen mindestens einer Testverbindung; (b) Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via Gαi aktiviert; (d) Testen der Fähigkeit der Testverbindung, GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via Gαq nicht zu modulieren; und (e) Auswählen der Testverbindung, die selektiv die Signalisierung via Gαi aktiviert und nicht die Signalisierung via Gαq moduliert.
Verfahren zum Auswählen einer Testverbindung als potentielles therapeutisches Mittel oder als drogenartige Verbindung oder als Führungsverbindung, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (b) Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via Gαi aktiviert; (e) Bestimmen, ob die Testverbindung GnRH-Rezeptor-vermittelte Signalisierung via Gαq aktiviert; und (f) Auswählen der Testverbindung, die selektiv die Signalisierung via Gαi und nicht die Signalisierung via Gαq aktiviert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Testverbindung als geeignet für die Behandlung von Krebs oder Hyperplasie von reproduktivem Gewebe oder als drogenartige Verbindung oder als Führungsverbindung ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei von der Testverbindung bekannt ist oder die Testverbindung nach ihrer Kapazität ausgewählt wird, dass sie an Typ I-GnRH-Rezeptor anbindet.
Verwendung von Ac-D-Nal(2)-D-4-ClPhe-D-Pal-Ser-1-MePal-D-IsopropylLys-Leu-IsopropylLys-Pro-D-AlaNh₂ bei der Herstellung eines Medikaments zum Bekämpfen von Tumoren oder Hyperplasie von reproduktivem Gewebe, einschließlich uteriner Fibroide.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Hyperplasie von reproduktivem Gewebe uterine Fibroide sind oder benigne Prostatahyperplasie (BPH) ist.