DE19932720C2 - Verfahren zur Messung der Wirkung von Stoffen auf die Erregbarkeit zentralnervöser Zellen oder Zellverbände - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Wirkung eines Stoffes auf einen neuronalen Zellverband, wobei in einem ersten Verfahrenschritt der Zellverband in eine Lösung gebracht wird, und in einem zweiten Verfahrensschritt die bioelektrische Aktivität des Zellverbandes gemessen wird, in einem dritten Schritt über die Veränderung mindestens einer Ionenkonzentration der Umgebungslösung definierte Aktivitätszustände des neuronalen Verbandes eingestellt werden, und in einem vierten Verfahrensschritt der zu testende Stoff der Lösung beigefügt wird, wobei während und/oder nach der Zugabe des Stoffes die Aktivität des Zellverbandes und deren Veränderung zum Ausgangswert gemessen wird. Anhand der Veränderung der bioelektrischen Aktivität wird auf die Wirkungsweise der Substanz rückgefolgert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mes­ sung der Wirkung von Stoffen auf Zellen oder Zellverbände des ZNS gemäß dem Oberbegriff des Anspruch 1.

In der pharmazeutischen Industrie werden zahlreiche neue Substanzen für unterschiedliche erwünschte Wirkungsprofi­ le entwickelt. Die meisten Substanzen werden systematisch wirksam (im Blutkreislauf) und üben erwünschte aber auch unerwünschte Effekte auf das Zentralnervensystem aus. In der medizinischen Forschung ist dagegen oft eine Erkran­ kung mit einer Beteiligung des zentralen Nervensystems (ZNS) bekannt und die mögliche Wirksubstanz soll aus zahlreichen anderen Stoffen (z. B. aus dem Blut) identi­ fiziert werden. Die multiplen Ebenen der neuronalen Si­ gnalerzeugung, bzw. -fortleitung und -weiterverarbeitung nehmen dabei eine Schlüsselrolle für die Funktion des zentralen Nervensystems ein und sind Ansatzpunkt für die gewünschten oder unerwünschten Wirkungen von Substanzen, wie z. B. Narkosemitteln oder Nervengiften. Die Prüfung der Wirkung dieser Stoffe, wie z. B. pharmakologische Substanzen oder Toxine, auf das zentrale Nervensystem verlangt aufwendige und oft langwierige Testverfahren, die sowohl Versuche an Tieren, Organen, Organteilen (z. B. Hirnschnitten) und einzelnen Zellen bzw. Zellverbänden beinhalten. In den bisherigen klassischen Verfahren wer­ den zunächst Tierversuche unternommen, bei denen die Sub­ stanzen in hohen Dosen in den Körperkreislauf eingeführt werden. Nach der Einführung der Substanz werden die all­ gemeinen Auswirkungen beobachtet. Diese beinhalten z. B. Verhaltensänderungen und die Letalität. Im nächsten Schritt wird in Einzelanalysen unter Zuhilfenahme von elektrophysiologischen Methoden (Hirnströme-EEG; Mikro­ elektroden in Zellarealen; Glaselektroden an einzelnen Zellen, Patch-Clamp-Technik) oder optischen Verfahren (intrazelluläres Fluoreszenzverhalten) von Hirnteilen (z. B. Hirnschnitten) oder einzelnen Nervenzellen, deren bio­ elektrische Kennlinien untersucht. Dazu muß oft der unge­ fähre Wirkort im Nervensystem, z. B. an der neuronalen Membran (Ionenkanäle) oder Synapse (prä-postsynaptisch) bekannt sein.

Es existieren eine Vielzahl von Veröffentlichungen, die sich mit dem vorbeschriebenen Verfahren auseinanderset­ zen. Es sind hierbei u. a. zu nennen:
1. Koller, H. et al., Paroxysmal long-lasting depola­ rizations in cultured hippocampal neurons are ge­ nerated by activation of NMDA and non-NMDA recep­ tors, SYNAPSE, 3, 1993, 214-20. Dieser Aufsatz be­ schreibt die Untersuchung von kultivierten Neuronennetzen, die spontan erhöhte Aktivität aufwie­ sen.
2. Koller, H. et al., Lipopolysaccarides and leuko­ triene B4 induce independently regulated elec­ trophysiological and immunological responses in cultured astrocytes, JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY, (1994 Dec) 55 (2) 179-85. Dieser Aufsatz beschrie­ bent Astrozyten, die nicht in der Lage sind, Akti­ onspotenziale zu generieren.
3. Rose, G & Siebler, M., Cooperative effects of neu­ ronal ensembles, EXPERIMENTAL BRAIN RESEARCH, (1995) 106 (1) 106-10. Dieser Aufsatz untersucht ein Simulationsmodell, daß das Auftreten von ko­ operativer Aktivität in einfachen neuronalen Net­ zen postuliert.
4. Koller, H. et al., Cerebrospinal fluid from multi­ ple sclerosis patients inactivates neuronal Na+ current, Brain, 119 (1996) 457-465. Dieser Aufsatz beschäftigt sich mit Veränderung der Na⁺ Leitfä­ higkeit auf Einzellebene.
5. Koller, H. et al., Tumor necrosis factor-alpha in­ creases intracellular Ca2+ and induces a depolari­ zation in cultured astroglial cells, Brain, 119 (1996) 2021-2027. Dieser Aufsatz beschreibt durch TNF-alpha hervorgerufene Änderungen der zellulären Eigenschaften von kultivierten Astrozyten und Neu­ ronen.
6. Koller, H., Siebler, M., Schmalenbach, C., and Müller, H. W., GABA and Glutamate Receptor Develop­ ment of Cultured Neurons from Rat Hippocampus, Septal Region and Neucortex, Synapse, 5 (1990) 59­ -64.
7. Gopal, K. V. and Gross, G. W., Auditory cortical neurons in vitro: cell culture and multichannel extracellular recording., Acta Otolaryngol. (Stockh.), 116 (1996) 690-696.
8. Rhoades, B. K. and Gross, G. W., Potassium and cal­ cium channel dependence of bursting in cultured neuronal networks., Brain Res., 643 (1994) 310-­ 318.
9. Marty, A. and Neher, E., Tight-seal whole-cell re­ cording. In: Sakmann, B., Neher, E. (Eds.), Sin­ gle-channel recording, Plenum Press, New York, 1995, pp. 31-51.
10. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., and Sigworth, F. J., Improved patch-clamp techni­ ques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches, Pflugers Arch., 391 (1981) 85-100.
11. Murphy, T. H., Blatter, L. A., Wier, W. G., and Bara­ ban, J. M., Spontaneous synchronous synaptic calci­ um transients in cultured cortical neurons, J. Neurosci., 12 (1992) 4834-4845.
12. Gross, G. W., Harsch, A., Rhoades, B. K., and Gopel, W., Odor, drug and toxin analysis with neuronal networks in vitro: extracellular array recording of network responses., Biosens. Bioelectron., 12 (1997) 373-393.
13. Robinson, H. P., Torimitsu, K., Jimbo, Y., Kuroda, Y., and Kawana, A., Periodic bursting of cultured cortical neurons in low magnesium: cellular and network mechanisms, Jpn. J. Physiol., 43 Suppl 1: S 125-30 (1993) S 125-30.
14. Siebler, M., Koller, H., Stichel, C. C., Müller, H. W., and Freund, H. J., Spontaneous activity and recurrent inhibition in cultured hippocampal net­ works., Synapse, 14 (1993) 206-213.
15. Bacci, A. Verderio, C., Pravettoni, E., and Mat­ teoll, M., Synaptic and intrinsic mechanisms shape synchronous oscillations in hippocampal neurons in culture., E. J. Neurosci., 11 (1999) 389-397.
16. Jimbo, Y., Robinson, H. P., and Kawana, A., Simul­ taneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture., IEEE Trans. Biomed. Eng., 40 (1993) 804-810.
17. Furshpan, E. J., Seizure-like activity in cell cul­ ture., Epilepsy Res., 10 (1991) 24-32.
18. Harsch, A., Ziegler, C., and Gopel, W., Strychnine analysis with neuronal networkd in vitro: extra­ cellular array recording of network responses, Biosens. Bioelectron., 12 (1997) 827-835.
19. Gross, G. W., Rhoades, B. K., Azzazy, H. M., and Wu, M. C., The use of neuronal networks an multielec­ trode arrays as biosensors., Biosens. Bioelec­ tron., 10 (1995) 553-567.

Nachteilig bei den vorgenannten Verfahren ist, daß sie langwierig sind und eine schnelle Abschätzung der Wirkung der Substanz auf die Zellen des zentralen Nervensystems nicht oder nur unzureichend möglich ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Ver­ fahren bereitzustellen, mit dem eine schnelle Abschätzung möglich ist, ob und in welchen Konzentrationsbereichen eine Testsubstanz eine Wirkung auf die allgemeine Erreg­ barkeit eines Nervenzellverbandes ausübt.

Diese Aufgabe wird erfinderisch mittels eines Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Weitere vor­ teilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens ergeben sich durch die Unteransprüche.

Die Abkürzungen "M", "mM" und "µM" stehen für die Einhei­ ten mol/l, mmol/l bzw. µmol/l.

Das Verfahren setzt für seine Anwendung ein Netzwerk aus hinreichend vielen intakten Nervenzellen (Neuronen) vor­ aus, welche über synaptische Verbindung in hoher Zahl elektrochemisch miteinander verbunden sind. Hinreichend heißt, daß eine starke Netzwerkaktivität durch überkriti­ sche rekurrente Erregungen (Exzitation) hervorgerufen werden kann. Der Zellverband kann z. B. in Form von Zell­ kulturen aus embryonalen Neuronen des Hippocampus oder Cortex von Säugetieren (z. B. Ratten, Mäuse) hergestellt werden. Hierzu wird von embryonalen Säugetieren Hirngewe­ be verschiedener Regionen entnommen. Diese Gewebestücke werden mechanisch in einer speziell gekühlten Lösung durch Titruation in einer Glaspipette zerkleinert, bis einzelne Zellen vorliegen, nach dem die Zellverbindung durch Proteinlöser aufgedaut sind. Auf den Zelltyp abge­ stimmt werden dann in einer Dichte von 10.000 bis 500.000 Zellen/cm² die Neurone auf ein Deckglas oder ein Multie­ lekrodenarray (Neurochip) aufgebracht. Das Deckglas/der Chip muß dafür vorher sterilisiert, gereinigt und mit ei­ ner Haftschicht z. B. mit Laminin oder Poly-L-Lysin be­ deckt werden. Das Deckglas liegt in einer kleinen Pla­ stikschale, welche mit Nährmedium gefüllt ist. Danach werden die Plastikschalen in einen Brutschrank gebracht (ca. 37° Celsius, Stickstoff-Sauerstoff-Kohlendioxid- Gemisch). Die Zellen setzen sich dann auf der Glasfläche ab, heften an und Zellausläufer wachsen aus, bis schließ­ lich ein neues Netzwerk bzw. ein Zellverbund gebildet ist. Dieser Zellverbund kann dann nach einigen Tagen elektrophysiologisch untersucht werden. Das so erzeugte neuronale Netzwerk (Zellverband) ist vorteilhaft auf ei­ ner zweidimensionalen Fläche angeordnet, so daß es für verschiedenste Meßverfahren leicht zugänglich ist.

Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß neu­ ronale Zellverbände mit hinreichender Zelldichte und sy­ naptischer Kontaktierung spezifische Zustandsformen der bioelektrischen Aktivität (Aktionspotentiale bzw. Spikes) zeigen, die sich über die neuronale Erregbarkeit sowie der Wirksamkeit der synaptischen Übertragung einstellen lassen. Es existieren in den oben beschriebenen Zellver­ bänden drei gut voneinander unterscheidbare Zustandsfor­ men der bioelektrischen Aktivität.

So ist zum Beispiel ein erster Aktivitäts-Zustand dadurch gekennzeichnet, daß die Neuronen nur selten und zufällig pulsen (Bildung spontaner Aktionspotentiale bzw Spikes).

Ein zweiter Aktivitäts-Zustand ist dadurch gekennzeich­ net, daß Spikes periodisch auftreten, wobei die Spikes synchron über viele Zellen auftreten. Die Oszillation der Gesamtaktivität liegt hierbei im Bereich von 0,1 bis 5 Hz.

Ein dritter Aktivitäts-Zustand zeichnet sich durch hohe kontinuierliche (unkorrelierte) Spikeaktivität aus. Zu­ mindest der zweite und dritte Aktivitäts-Zustand setzt jeweils eine starke Interaktion der Zellen im Verband voraus. Wird erfindungsgemäß der Nährstofflösung, welche an die Zusammensetzung des Nervenwassers angepaßt ist, eine Substanz/Stoff hinzugesetzt, welche z. B. die Im­ pulsfähigkeit oder synaptische Übertragung zwischen den einzelnen Zellen verändert, verändert sich auch das Ver­ halten des Zellverbandes. So kann sich der Zustand derart ändern, daß z. B. ein Wechsel vom zweiten Aktivitäts- Zustand zum ersten oder dritten Aktivitäts-Zustand er­ folgt. Veränderungen der Oszillationsfrequenz im zweiten Aktivitäts-Zustand sind dabei zusätzlich geeignet, die Wirkung von Stoffen zu detektieren.

Durch gezielte Veränderung der extrazellulären Lösung (Nährstoff- und Elektrolytlösung) kann die synaptische Übertragungseffizienz verändert werden (Steigerung/Hem­ mung) und damit der Aktivitäts-Zustand des Zellverbandes stabil und gut reproduzierbar eingestellt, sowie eine Ab­ stimmung der Oszillation (Frequenz, Varianz der Periode) vorgenommen werden. Mittels dieser Kalibrierungsmöglich­ keit kann insbesondere ein und derselbe Zellverband mehr­ fach und reproduzierbar in den gleichen Zustand gebracht und mehrfach für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Erfassung der Netzwerkaktivität der Neuronen erforderlich. Da die hohe Aktivität durch den kooperativen Effekt der rekurrenten Exzitation angetrieben wird, ist das Verhalten der ein­ zelnen Neurone repräsentativ für das gesamte Netzwerk, so daß Messungen an wenigen, sogar an einzelnen Neuronen, genügen. Hierfür bieten sich Standardmethoden der Elek­ trophysiologie an. Hier sei nur beispielhaft die intra­ zelluläre oder extrazelluläre elektrische Messung bzw. Signalaufnahme genannt. Für die intrazelluläre Messung kann z. B. das Zellmembranpotential mittels einer Patch- Clamp-Messung erfolgen. Bei dieser Technik wird mit einer Patch-Pipette die Membran eines einzelnen Neurons ange­ saugt (cell-attached-modus)damit ein hoher Übergangswi­ derstand zwischen Pipette und Neuron (GigaOhm) ensteht und damit kleinste Zellströme (pA) gemessen werden kön­ nen. Alternativ kann z. B. der Zellverband auf kommerziell verfügbaren Multi-Elektroden-Platten (Neuronenchips) ge­ züchtet werden und die elektrische Aktivität extrazellu­ lär abgeleitet werden. Desweiteren bieten optische Ver­ fahren zur Detektion der neuronalen Aktivität, z. B. die Fluoreszenzmessung des intrazellulären Calciums mit dem Farbstoff Fluo-3 Acetoxylmethyl (AM) Ester neben der Mul­ tielektrodenplatte Möglichkeiten zur simultanen Erfassung mehrerer Neuronen. Hierdurch kann die Meßzeit zur Charak­ terisierung der beschriebenen Aktivitäts-Zustände ver­ kürzt werden. Je nach gewählter Methode wird der zeitli­ che Verlauf des Membranpotentials eines Neurons, seine Impulsrate, die Spikeaktivität mehrerer Neurone oder - im Falle der Farbstoffmessung - die aktivitätsabhängige Ver­ änderung einer Farbstoffkonzentration aufgenommen.

Mittels spezieller Signalanalyse werden die Aktivitäts- Zustände des Netzwerks identifiziert. Hierzu kann z. B. eine Mustererkennung, welche sich neuronaler Netzwerkal­ gorithmen oder der Fuzzy-Logic bedient, Verwendung fin­ den. Dabei manifestieren sich die Veränderungen der Aktivitäts-Zustände bei der Zugabe von Testsubstanzen durch eine Verlagerung der Netzwerkaktivität im Zustandsdia­ gramm. Dies läßt sich unter anderem quantifizieren durch Abbruch der erhöhten Aktivität, Veränderung der Oszilla­ tionsfrequenz oder der Varianz der Oszillationsperiode.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Scree­ ning von Substanzen hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und/oder Netzwerkverhalten vorteilhaft möglich. Da die Aktivitäts- Zustände auf der Interaktion von zellulären und synapti­ schen Mechanismen beruhen, reagieren die Zellverbände sehr sensibel auf die Wirkung von extrazellulär zugegebe­ nen Substanzen. Hierdurch läßt sich die Wirkung des zu testenden Stoffes bzw. der zu testenden Substanz sehr gut und insbesondere reproduzierbar testen. Zusätzlich er­ laubt die Kenntnis der Abhängigkeiten der Netzwerkzustän­ de von extrazellulär manipulierbaren Größen (neuronale Erregbarkeit und Wirksamkeit der synaptischen Übertra­ gung) eine gute Kalibrierung und damit das Einstellen ei­ nes definierten Testzustandes. Das gesamte Verfahren eig­ net sich hervorragend zur Automatisation, wodurch es ins­ besondere die Möglichkeit zur schnellen und kostengünsti­ gen Testung von verschiedensten Substanzen eröffnet.

Nachfolgend wird anhand von Diagrammen das erfindungsge­ mäße Verfahren näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 eine Computersimulation des Verhaltens ei­ nes Zellverbandes in unterschiedlichen Lö­ sungen, mit denen die neuronale Erregbar­ keit und die synaptische Effizienz ein­ stellbar sind;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Patch- Clamp-Messung;

Fig. 3 den Membran-Potentialverlauf an einem Neu­ ron in den drei Aktivitäts-Zuständen;

Fig. 4 zeigt den Membranpotentialverlauf beim Auswaschen von Mg²⁺ und der Reduktion der CA²⁺-Konzentration;

Fig. 5 einen schematischen Ablauf des erfindungs­ gemäßen Verfahrens.

Fig. 1 zeigt eine Computersimulation, aus der sich das Netzwerkverhalten des Zellverbandes ableiten läßt. Darge­ stellt ist die Varianz der zeitaufgelösten mittleren Rate an Aktionspotentialen (AP) im Netzwerkmodell in Abhängig­ keit von der synaptischen Effizienz, das heißt der Wirk­ samkeit der synaptischen Übertragung sowie der neuronalen Erregbarkeit. Die Varianz ist ein Maß für das wiederholte Auftreten gebündelter Aktionspotentiale (Burst) im Netz­ werk. Der Zustand A ist gekennzeichnet durch geringe, un­ korrelierte Aktivität. Der angehobene Bereich gibt den Zustand 2 wieder, in dem eine hohe unkorrelierte Aktivi­ tät zu verzeichnen ist. Der Zustand 3 zeichnet sich durch eine sehr hohe, kontinuierliche Aktivität des Netzwerks aus. Im zweiten Zustand erhöht sich die Oszillationsfre­ quenz bei steigender neuronaler Erregbarkeit und steigen­ der synaptischer Effizienz in einem relativ großen Be­ reich linear. Aus diesem Grund ist der zweite Zustand als Ausgangszustand besonders geeignet, die Wirkung von Stof­ fen zu detektieren.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung einer Patch- Clamp-Messung. Hierbei wird ein einzelnes Neuron N aus der Zellkultur 3 mit einer Patch-Pipette 4 angesaugt (Cell-attached Modus). Für intrazelluläre Messungen (who­ le-cell Modus) wird die Membran unter der Pipettenöffnung aufgerissen. Durch Spülung wird die gewünschte extrazel­ luläre Lösung 2 eingewaschen. Hierfür dienen die Zuführ- und Abführleitungen 7 und 8. Die Testsubstanzen können entweder als Konzentrat zugegeben oder bereits gelöst der Spüllösung 2 beigegeben werden. Mittels der elektrischen Kontakte 5 und 6 können die Aktionspotentiale detektiert werden.

Fig. 3 zeigt den Membran-Potentialverlauf an einem Neuron unter verschiedenen extrazellulären Bedingungen. Die ge­ zeigten Verläufe sind charakteristisch für die drei Akti­ vitäts-Zustände. Der erste Zustand ist mit A bezeichnet und wurde in einer Kalibrierlösung (150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 2.8 mM CaCl₂, 2 mM KCl, 10 mM HEPES sowie 10 mM Succrose) gemessen. Für den zweiten Zustand, welcher mit B bezeichnet ist, wurden die Mg-Ionen aus der Kalibrier­ lösung für den Zustand A ausgewaschen sowie die Ca²⁺- Konzentration auf 1 mM gesenkt. Der dritte Zustand, wel­ cher mit C bezeichnet ist, stellte sich bei Erhöhung der K⁺-Konzentration auf ca. 6 mM ein. Gemäß des Zustandsdia­ gramms (Fig. 1) bewirkt allgemein die Verminderung der Ma­ gnesium-Konzentration sowie der Angleich des Magnesi­ um/Calcium Gradienten eine Steigerung der synaptischen Effizienz. Die Erhöhung der Kalium Konzentration steigert die neuronale Erregbarkeit.

Die Fig. 4 zeigt den Membranpotentialverlauf beim Auswa­ schen von Mg²⁺ und der Reduktion der CA²⁺-Konzentration. Es ist deutlich zu erkennen, daß aus der unkorrelierten instabilen Oszillation eine stabile Oszillation im Zell­ verband (Netzwerk) wird. Hierdurch wurde der Zellverband vom ersten Aktivitäts-Zustand in den zweiten Aktivitäts- Zustand gebracht.

Der Membranpotentialverlauf B zeigt die Änderung des Zu­ standes des Zellverbands bei der Zugabe eines Teststof­ fes. Im dargestellten Fall wurde zuerst eine stabile Os­ zillation eingestellt (kalibriert - zweiter Aktivitäts- Zustand), wonach dann 100 µM 4-Aminopyridin zugegeben wurde. Der Zeitpunkt der Zugabe des Teststoffes ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Entsprach die Netzwerk- Aktivität zuerst dem zweiten Zustand, ändert sich die Netzwerk-Aktivität durch die Zugabe des Teststoffes in den dritten Zustand, welcher durch hohe aber unkorrelier­ te Aktivität gekennzeichnet ist. Die Art der Änderung ist indirekt ein Maß für die Wirkung des Stoffes auf den Zellverband, woraus sich ableiten läßt, wie der Stoff auf das zentrale Nervensystem eines Lebewesens wirken wird.

Die Fig. 5 zeigt einen schematischen Ablauf des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens. Die Fig. 6 ist in drei Spalten mit den Überschriften neuronaler Verband, Manipulation und Signalanalyse aufgeteilt. Die Spalte "neuronaler Ver­ band" steht für den Zellverband und dessen Aktivitätszu­ stand. Die mittlere Spalte "Manipulation" zeigt an, wel­ che Handlungen von dem Bedienpersonal bzw. von einer das Verfahren durchführenden Maschine vorgenommen werden. Die rechte dritte Spalte "Signalanalyse" gibt an, welche Mes­ sungen durchgeführt werden.

Begonnen wird das Verfahren damit, daß der Zellverband in eine Kalibrierlösung eingewaschen wird, wie es durch die Bezugszeichen 100 und 101 angegeben ist. Nach dem Einwaschen der Kalibrierlösung wird die Aktivität des Zellver­ bandes gemessen und analysiert, 103. Um den erforderli­ chen Testzustand 200 zu erreichen, wird bei 104 die Io­ nenkonzentration modifiziert. Die Schleife, bestehend aus den Verfahrensschritten 102, 103 und 104 wird so lange durchlaufen, bis der gewünschte Testzustand 200 erreicht wurde. Die Charakteristika des Testzustandes werden er­ mittelt und abgespeichert. Anschließend wird die Testsub­ stanz der Lösung zugegeben, 301. Durch die Zugabe der Testsubstanz zur Lösung wird eventuell das Verhalten des Zellverbandes verändert, wodurch sich der Ist-Zustand 300 verändert. Diese Veränderung des Ist-Zustandes über die Zeit wird ständig durch die Messung der Aktivität, 302, gemessen und ausgewertet. Die Menge der zugegebenen Test­ substanz wird ebenfalls protokolliert, so daß durch den Vergleich zwischen Testzustand und Ist-Zustand die Wir­ kungsweise der Testsubstanz auf den Zellverband ermittel­ bar ist. Durch das wiederholte Durchführen des Verfahrens mit unterschiedlichen Mengen der Testsubstanz kann eine Dosis-Wirkungskurve ermittelt werden, welche für die spä­ tere Medikamentierung der Testsubstanz von entscheidender Bedeutung ist. Ebenfalls kann mittels des Verfahrens die Wirkung der Testsubstanz auf den Zellverband über die Zeit hin ermittelt werden. Die zeitliche Entwicklung hängt vom Wirkungsmechanismus der Testsubstanz ab (rever­ sibel, nichtreversibel, . . .) so daß hieraus weitere Er­ kenntnis über die Testsubstanz gewonnen werden kann. Es versteht sich von selbst, daß das erfindungsgemäße Ver­ fahren mittels unterschiedlichster Meßmethoden zur Er­ mittlung der Aktivitäts-Zustände des Zellverbands durch­ geführt werden kann. Es ist daher unter anderem möglich, sogenannte "Neuro-Chips" zu verwenden, bei denen die Zellverbände auf einen Mikrochip aufgebracht werden, wobei die Neuronen mit dem Mikrochip zusammenwirken bzw. - wachsen, wodurch relativ einfach die Aktivitäts-Zustände bzw. die Aktions-Potentiale der Neuronen meßbar und aus­ wertbar sind. Durch derartige Neuro-Chips ist es möglich, an vielen Neuronen direkt die Aktivität zu ermitteln, wo­ durch die Aktivitäts-Zustände des Zellverbandes noch bes­ ser ermittelbar sind.

Claims (12)

1. Verfahren zur Messung der Wirkung eines Stoffes auf einen Zellverband, dadurch gekenn­ zeichnet, daß
in einem ersten Verfahrensschritt der neuronale Zellverband in eine Lösung gebracht wird, und
in einem zweiten Verfahrensschritt die bio­ elektrische Aktivität des Zellverbandes gemessen und über Veränderung mindestens einer Ionenkon­ zentration der extrazellulären Lösung ein defi­ nierter Aktivitätszustand eingestellt wird, und
in einem dritten Verfahrensschritt der zu testende Stoff der Lösung beigefügt wird, wobei während und/oder nach der Zugabe des Stoffes die Aktivität des Zellverbandes und deren Änderung gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zustandsänderung der Aktivität ein Maß für die Wirkung der Substanz auf den neuronalen Zellverband ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, da­ durch gekennzeichnet, daß für das Verfahren ein Netzwerk aus hinreichend vielen Nerven­ zellen (Neuronen) verwendet wird, welche über synap­ tische Verknüpfungen in hoher Zahl elektrochemisch miteinander verbunden sind.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für die Zellverbände insbesondere embryonale Neuronen (Hippocampus, Cortex) oder Hirnschnittpräparate von Säugetieren verwendet werden können.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellverbände auf eine zweidimensionale Fläche oder auf einen "Neuro-Chip" aufgebracht werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Zustand der Aktivität des Zellverbandes durch Messung an einer oder mehreren Zellen ermittelt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Verfahrensschritt der Zellverband entweder in einen ersten Aktivitäts-Zustand gebracht wird, in dem die Neuronen nur gering und unkorreliert pulsen bzw. aktiv sind, oder in einen zweiten Aktivitäts-Zustand gebracht wird, bei dem periodische Pulsfolgen (Spike­ folgen) ermittelt werden können, die insbesondere synchron über viele Zellen auftreten, oder in einen dritten Aktivitäts-Zustand gebracht wird, bei dem ei­ ne hohe und kontinuierliche Pulsaktivität meßbar ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivitäts-Zustände über die neuronale Erregbarkeit und/oder die synaptische Übertragungseffizienz einge­ stellt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die extrazelluläre Lösung (künstliches Nervenwasser) ist und sich die Lösung insbesondere zusammensetzt aus 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgCl₂, 2.8 mmol/l CaCl₂, 2 mmol/l KCl, 10 mmol/l HEPES sowie 10 mmol/l Succrose.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Aktivitäts-Zustand durch das Verhältnis der Magnesium-Calciumionen gem. Anspruch 9 einstellbar ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, da­ durch gekennzeichnet, daß sich der dritte Aktivitäts-Zustand ausgehend vom zweiten Akti­ vitätszustand durch Erhöhung der extrazellulären K⁺- Konzentration einstellt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ermittlung einer Dosis-Wirkungskurve das Verfahren mehrfach mit unterschiedlichen Konzentrationen des Test-Stoffes zur (Kalibrier-)Lösung durchgeführt wird.