JP2011502123A

JP2011502123A - 糖タンパク質ｖｉ（ｇｐｖｉ）阻害剤の使用

Info

Publication number: JP2011502123A
Application number: JP2010531074A
Authority: JP
Inventors: ユンゴゥリウ; ナレンドラエヌ．タンドン; 壽男滝沢; 純一上林
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2011-01-20
Also published as: EP2212416A4; AU2008319336A1; SG185307A1; US20100297116A1; RU2010121878A; CA2703770A1; KR20100075585A; EP2212416A1; ZA201002990B; BRPI0818807A2; AR069120A1; CN101874107A; IL205453A0; TW200936606A; MX2010004537A; WO2009058326A1

Abstract

本発明は、血小板ＧＰＶＩの阻害剤を用いることによる、再潅流傷害及び／又は梗塞を低減するための方法を記載するものである。この方法は、心臓発作又は待機的心臓手術の間又は後に、患者を処置するために用いることができる。

Description

本出願は、その全文が参照によって組み入れられる、２００７年１０月３１日出願の、米国出願第６０／９８４，３３４号「糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）阻害剤の使用（ＵｓｅｓｏｆａＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＶＩ（ＧＰＶＩ）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」の優先権の利益を主張するものである。

本発明は、抗体、タンパク質フラグメント、及び小分子化合物を含む、血小板膜糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）の阻害剤を用いて、再潅流傷害及び／又は梗塞を阻害する方法に関する。

血液を心臓に供給する冠状動脈が閉塞されるようになると、心臓発作が生じる。閉塞は、通常、アテローム性動脈硬化及び血栓形成の結果として動脈が狭窄及び閉鎖することによって生じる。血液供給の欠乏は虚血と呼ばれる。心筋は短期間の酸素の窮乏にしか耐えることができず、２０〜１２０分未満で梗塞形成する。心筋細胞は大部分が最終に分化しているので、心臓が再生する能力は非常に限られている。心臓発作を起こした患者は、人生の残りを梗塞形成した組織を有する心臓を保有することになる。梗塞形成した心筋は血液を押し出す能力が低下しているので、これらの患者は身体への血液供給を維持する能力が低下している。心臓発作後、うっ血性心不全が続くことがあり、患者は再発性心臓発作を経験することもある。心不全を起こした患者は運動性が低下し、生活の質が低下し、寿命が短縮する。

米国心臓協会からの最近の統計によると、米国だけで年間１２０万の心臓発作が存在する（Ｔｈｏｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１３巻、ｅ８５〜１５１頁、２００６年）。米国において心不全を有する者は現在５００万人おり、新しい症例は毎年５５０，０００存在する（Ｔｈｏｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１３巻、ｅ８５〜１５１頁、２００６年）。

遮断された冠状動脈は、血管形成術及び／又は血栓溶解療法で再開することができ、以前に虚血した筋肉の再潅流がもたらされる。再潅流は虚血した筋肉を救出するのに不可欠である一方、再潅流自体は、逆説的に、筋肉に対してさらなる損傷をもたらすことがある。理想的には、心臓発作に対する処置は、発作の間の心筋梗塞を最小にすることを伴う。しかし、心臓発作の発生を予想するのは通常困難であるので、予防的処置は見込みがない。したがって、再潅流傷害を低減する処置と併用した血管形成術及び／又は血栓溶解療法（例えば、救急車又は救急治療室において施すもの）が、より実際的であり得る。再潅流傷害を低減する処置は、心臓発作／虚血からの回復を改善し、心不全を発生する可能性を制限する可能性がある。心筋梗塞を低減する処置は救命的であることが期待でき、高リスク患者の入院期間を短縮し、生活の質を高め、医療費全体を低減することができる。

残念なことに、そのような処置は現在利用可能ではない。様々な処置が試みられ、全て失敗していると思われる（Ｄｏｗｎｅｙ及びＣｏｈｅｎ、ＰｒｏｇＣａｒｄｉｏｖａｓｃＤｉｓ、４８巻、３６３〜３７１頁、２００６年による総説を参照されたい）。アスピリン、クロピドグレル、及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）などの抗血栓剤の介入が、冠状動脈の閉塞／再閉塞を防ぐのに、現在推奨されている。しかし、これらは再潅流傷害に対する直接的な保護を提供するものではない。アスピリンは、実際、いくつかの内因性の心保護的な経路を妨害することがあり、梗塞を増大することがある（Ｇｒｏｓｓら、ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ、３１０巻、１８５〜１９１頁、２００４年）。

本発明は、血小板表面上に存在する主要なコラーゲン受容体である血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）の阻害剤を投与することによって、患者における再潅流傷害及び／又は梗塞を阻害するための方法を提供する。本発明は、再潅流傷害及び／又は梗塞を処置するための薬物を製造するためのこのような阻害剤の使用も提供する。

ＧＰＶＩは血小板及び巨核球上にのみ発現され、血管内皮下の、多くの血栓形成マトリックスタンパク質の１つであるコラーゲンに結合する。動脈硬化性プラークの破裂、虚血、及び再潅流傷害により、コラーゲンが血小板を含む血液成分に曝されることがある。血小板ＧＰＶＩのコラーゲンに対する結合は、脈管構造の損傷部位における血小板の付着、並びにその後の血小板の活性化及び凝集において中心的役割を果たす。血小板ＧＰＶＩの阻害剤は、血管壁での血小板ＧＰＶＩとコラーゲンとの間の相互作用を遮断する。ＧＰＶＩ阻害は血小板の活性化を低下させることが先に示されているが、本発明は、ＧＰＶＩ阻害も意外なことに直接的な心保護効果をもたらし、再潅流傷害及び／又は梗塞を阻害するのに有用であることを示すものである。

血小板ＧＰＶＩの阻害薬は、抗体、タンパク質フラグメント、又は小分子化合物であってよい。抗体には、それだけには限定されないが、モノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体が含まれる。モノクローナル抗体には、活性な抗体フラグメントが含まれる。活性な抗体フラグメントは、化学的に、酵素的に、又は組換えで生成されたＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、又は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含むペプチドであってよい。例えば抗体には、マウスモノクローナル抗体であるＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、及びＯＭ４、並びにこれらのヒト化バージョン、又はこれらの活性なフラグメントが含まれる。ペプチドフラグメントには、それだけには限定されないが、ＧＰＶＩのコラーゲン結合性ドメイン及び可溶性ＧＰＶＩが含まれる。

野生型マウス及びＧＰＶＩノックアウトマウスにおける心筋梗塞サイズの比較を示す図である。３０分の虚血及び２４時間の再潅流後、ＧＰＶＩノックアウトマウスにおける心筋梗塞は、野生型マウスに比べて有意に小さかった。白丸はそれぞれ個々のマウスからの梗塞サイズを表し、黒丸はグループ平均値±ＳＤを表す。データはｔ検定で分析した。ｐ＜０．０５を統計上有意とみなす。虚血及び再潅流後、野生型マウス及びＧＰＶＩノックアウトマウスの心筋層におけるＰセレクチン発現の比較を示す図である。心内膜及び中層心筋からの代表的な蛍光画像を示す。明緑色（又は白黒バージョンの図では白っぽい明色）において示すようにＰセレクチン発現は、ＧＰＶＩノックアウトマウスからの心筋層において低減された（うす暗い背景の蛍光は、心筋層の自己蛍光によるものであった）。野生型マウスからの心臓５個、及びＧＰＶＩノックアウトマウスからの心臓５個それぞれにおいて、同様の結果が得られた。Ｐセレクチン発現の高いエリアの定量化を示す図である。ＧＰＶＩノックアウト（ＫＯ）マウスは、野生型（ＷＴ）マウス（ｎ＝５）よりもＰセレクチンのレベルが有意に低く、ＧＰＶＩは心筋層における血小板の活性化及び凝集を誘発する上で重要な役割を果たすことを示唆している。虚血後の再潅流による、野生型マウスの心臓におけるコラーゲンの曝露を実証する図である。左側のパネルは、３０分虚血に曝し、その後１５分再潅流した心臓からの代表的な切片を示す。明緑色（又は白黒バージョンの図では白っぽい明色）は、曝露されたコラーゲンを表す（うす暗い背景の蛍光は、心筋層の自己蛍光によるものであった）。３匹のさらなる動物から同様の結果が得られた。右側のパネルは、３０分虚血に曝したがその後の再潅流なしの心臓からの代表的な切片を示す。緑色蛍光（又は白黒バージョンの図では白っぽい明色）は明らかではなく、コラーゲンが曝露されなかったことを示している。２匹のさらなる動物から同様の結果が得られた。これらのデータはともに、再潅流の間に内皮損傷が生じることを示している。サルにおける抗ＧＰＶＩ抗体ＯＭ２の梗塞低下効果を実証する図である。図は、示した処置を施した各群におけるリスクゾーン対梗塞エリアの分布図を回帰直線とともに示す。対照群における梗塞は、リスクゾーンのサイズと線形関係にあった。データ点は全て対照群の回帰直線の下にあることから、ＯＭ２での単回投与又は２回投与いずれかで処置したサルの心筋梗塞は低下している（ｐ＜０．０５）。さらに、この低下は、単回投与又は２回投与で処置したサルにおいて同様であり、ＯＭ２による保護が再潅流期間中に生じたことを示唆している。梗塞のデータを分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。ＯＭ２によるサルの血中の血小板凝集の阻害を実証する図である。ＯＭ２（２ｍｇ／ｋｇ）投与前（投薬前）及び投与後（投薬４時間後）、血液試料をサルから採取した。コラーゲン誘発血小板凝集を、全血の血小板凝集計を用いてｅｘｖｉｖｏアッセイにおいて測定した。図４ｂは、コラーゲン誘発血小板凝集の代表的な測定結果を示す。コラーゲン誘発血小板凝集は、ＯＭ２を投与した動物の全血において完全に阻害された。

「梗塞」とは一般的に、組織の上流の動脈の血液供給の閉塞による、組織の壊死を意味する。酸素供給された血液が欠乏すると、細胞は衰弱して死滅する。梗塞はあらゆる器官に影響を及ぼし得るが、心臓のようなエネルギー需要及び代謝活性の高い組織において、より頻繁且つより急速に（＜２０〜１２０分）生じる。

本明細書における「心筋梗塞」の語は、心筋セグメントへの冠状動脈血流量における急激な低減に通常起因する、心筋の壊死を意味する。心筋は、ほんの短期間の虚血（＜５分）しか損傷を被らずに持ちこたえることができない。血流が再開しなければ、一般的に、５分から２０分の間に可逆性の損傷が生じる。より長期間の虚血により、永久的な損傷、即ち細胞死／壊死／梗塞が通常もたらされる。心筋の再生する能力は非常に限られているので、筋肉の喪失は永久的であり得る。「内皮機能不全」は、内皮の壊死、又は虚血及び再潅流に起因する正常機能の喪失を意味する。

「再潅流傷害」は、虚血期間の後、組織への血液の供給が戻った場合にもたらされる組織に対する損傷を意味する。血液から酸素及び栄養分が欠如すると、循環の回復によって、通常機能の回復ではなく、酸化ストレスの誘発による炎症及び酸化損傷がもたらされる状態が作り出される。「心筋再潅流傷害」は心筋において生じる再潅流障害を意味し、「内皮再潅流傷害」は内皮において生じる再潅流障害を意味する。

本明細書における「患者」は、梗塞及び／又は再潅流傷害の出現率、可能性、又は程度を低減する処置を必要とする、あらゆる人間又は非ヒトの動物を意味する。「患者」は、それだけには限定されないが、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、全身性高血圧、二尖大動脈弁、肥大型心筋症、又は僧帽弁逸脱症などの心臓血管障害と診断された者；心臓発作及び／又は心不全（うっ血性心不全（ＣＨＦ）を含む）を経験しているか、又は経験した者；並びに、例えば心臓のバイパス手術中に冠状動脈血流の一時的な遮断を必要とする待機的心臓手術を受ける者を含む、心臓発作を起こしたことがあるか、起こす危険性のある対象も含む。処置すべき非ヒトの動物には、それだけには限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、サカナ、トリ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、及び非ヒトの霊長動物を含む、全ての家畜及び野生の脊椎動物が含まれる。

「阻害する」の語は、あらゆる表現型の特徴の低減若しくは休止、又はその特徴の発生率、程度、若しくは可能性における低減若しくは休止を意味する。したがって「再潅流傷害及び／又は梗塞を阻害する」は、再潅流傷害及び／又は梗塞における測定可能な低減又は休止を意味する。

「血小板ＧＰＶＩの阻害薬」は、血小板ＧＰＶＩの機能を阻害することができるあらゆる抗体、タンパク質フラグメント、又は小分子化合物を意味する。血小板ＧＰＶＩの機能には、例えば、血管壁などにおいて見出されるコラーゲンとの、血小板ＧＰＶＩの相互作用が含まれる。他の機能には、コラーゲン誘発血小板凝集、固定化したコラーゲンに対する血小板の接着、コラーゲン誘発ＡＴＰ分泌、及びコラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２形成が含まれる。

「抗体」の語は、当技術分野ではよく知られており、モノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体には、化学的に、酵素的に、又は組換えで生成されたＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、又は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含むペプチドフラグメントなどの活性な抗体フラグメントが含まれる。抗ＧＰＶＩ抗体が「特異的に結合する」とは、これらがＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に、１０^−７Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）で結合する場合である。本発明の別の一実施形態において、抗ＧＰＶＩ抗体は、１０^−８Ｍ以下のＫｄで、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的に結合する。さらなる一実施形態において、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体は、１０^−９Ｍ以下のＫｄで、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的に結合する。結合パートナー又は抗体の親和性は、通常の技術を用いて、例えば、^１２５Ｉ標識したＩｇＧ若しくはそのフラグメントの飽和結合等温線を測定することによって、又はＭｏｔｕｌｓｋｙによって、「ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍでのデータ分析（ＡｎａｌｙｚｉｎｇＤａｔａｗｉｔｈＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）」（１９９９年）、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡに記載されている非線形回帰分析を用いて、非標識ＩｇＧによる^１２５Ｉ標識ＩｇＧの相同置換によって容易に測定することができる。他の技術は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．、５１巻、６６０頁（１９４９年）によって記載されているものなど、当技術分野では知られている。

米国特許出願公開第２００７／０２０７１５５号は、モノクローナル抗体の生成及びそのヒト化を詳しく記載している。米国特許出願公開第２００７／０２０７１５５号は、上記に記載した結合特性を有するモノクローナル抗体ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、及びＯＭ４、並びにＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含むペプチドフラグメントも記載している。さらに、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体は、両方ともその全文が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９９８，４６９号、及び米国特許出願公開第２００７／０２０７１５５号において記載されている。

「小分子化合物」は、サイズ１５００Ｄａまでの、非タンパク質有機化合物を意味する。小分子化合物は、合成でもよく、又は天然物の抽出物に由来してもよい。重要な構造上の特徴はしばしば、小分子の、タンパク質に対する結合に費やされるエントロピー消費を低減する、硬い多重環コア構造である。本発明の小分子化合物は、それだけには限定されないが、コラーゲンとの血小板ＧＰＶＩの相互作用を含めた血小板ＧＰＶＩの機能を阻害する。

上記で論じたように、「ペプチドフラグメント」は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的なＣＤＲを少なくとも１つ含むペプチドフラグメントを含み、それらの例は、米国特許出願公開第２００７／０２０７１５５号に開示されている。他のペプチドフラグメントは、ＧＰＶＩのコラーゲン結合性ドメインを含むことがある。ＧＰＶＩの完全な配列は、Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、２９０１９〜２４頁（１９９９年）；ＷＯ００／６８３７７；Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓら、Ｂｌｏｏｄ、９６巻、１７９８〜８０７頁（２０００年）；及びＥｚｕｍｉら、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．、２７７巻、２７〜３６頁（２０００年）に公開されており、ＧＰＶＩ上の第一コラーゲン結合性表面はマッピングされている。Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１巻（４４）、３３５０５〜１０頁（２００６年）；Ｄｕｍｏｎｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６１巻（５）、８７７〜８７頁（２００６年）；Ｈｏｒｉｉら、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻（３）、９３６〜４２頁（２００６年）；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．、４巻（４）、８６９〜７３頁（２００６年）。さらに、ＧＰＶＩの細胞外ドメインを含んでいる可溶性ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）は、コラーゲンに対するＧＰＶＩの結合を阻害し、それによってコラーゲン誘発血小板凝集を阻害することが示されている。Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓら、Ｂｌｏｏｄ、９６巻、１７９８〜８０７頁（２０００年）。

患者の処置は、薬学的に有効な量の血小板ＧＰＶＩの阻害剤の投与を含む。当業者であれば、これらの阻害剤を投与するための、最適な投与量及び投与計画を経験的に決定することができる。それでも、薬学的に有効な量は、患者における再潅流傷害、梗塞、又は虚血の事象の阻害をもたらす量である。

薬学的に有効な量を、処置を通して、単回投与量として投与してもよく、又は多回投与量として投与してもよい。本発明の阻害剤は、ボーラス注射による静脈内（ＩＶ）投与、持続的注入、又は間欠的注入など、当業者には馴染みのあるあらゆる方法によって投与することができる。代替の実施形態において、阻害剤は、腹腔内（ＩＰ）に、体内に、関節内に、脳室内に、くも膜下腔内に、筋肉内（ＩＭ）に、皮下に、局所に、扁桃に、粘膜に、鼻腔内に、経皮で、膣内に、経口で、又は吸入によって投与することができる。

本発明を、以下の実施例によって説明するが、決してこれらに限定されるものではない。

（例１）
ＧＰＶＩの欠失はマウスにおいて心保護的である
年齢をマッチさせた野生型マウス及びＧＰＶＩノックアウトマウスを、１〜１．５％イソフルランで麻酔し、気管内チューブによって挿管し、圧力コントロールした呼吸器に取り付けた。動物を、１００％酸素で補った室内空気（体積比４：１）で換気した。手術を開始する前に、マウスにゲンタマイシン（０．７ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を投与した。体温を、デジタル体温計に接続した直腸プローブで注意深くモニターし、ヒーティングパッド及び加熱ランプを用いて実験を通して３７℃から３７．５℃の間に維持した。予備試験において、血圧測定用及び血液ガス分析用に、カテーテルを頸動脈中に挿入した。これは、マウスが、これらの実験手順を用いて確実に生理学的な血行動態を維持できるようにするためであった。

解剖顕微鏡下で、左側の開胸術によって胸部を切開した。８−０ナイロン製縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎＣｏ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）を、テーパードニードルで、左心耳先端から２〜３ｍｍの左冠状動脈前下行枝を通過させ、縫合糸の終端を、プラスチック製チューブに通した。縫合糸をチューブに逆らって引っ張ることによって、冠状動脈閉塞を誘発した。冠状動脈閉塞及び再潅流の実施の成功は、虚血及び再潅流後の回復の間、目視検査によって（即ち、縫合糸を引っ張ったときに遠位の心筋に青白い色が発生し、収縮後に充血によって明赤色が戻ることを認めることによって）確証した。虚血を３０分続けた。閉塞を開放した後、縫合糸で胸部を重ね合わせて閉じた。ケトフェン１投与量（２．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を注射した。自発呼吸を獲得したら、マウスを人工呼吸器から取り去り、酸素富化空気を含む、温度／湿度制御したユニット中に配置した。マウスが正常の姿勢能力を獲得した後、次いで、それらを２４時間ケージに戻した。

試験完了時（第２日目）、マウスにヘパリン（１Ｕ／ｇ、ＩＰ）を投与し、引き続きペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）で麻酔した。心臓を切除し、ランゲンドルフ装置を用いて大動脈カニューレ（２３ゲージ針）を通して、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液で潅流した。閉塞し、次いで再潅流した領域（リスク領域）を視覚的に示すために、冠状動脈を先の閉塞の部位で縛り、大動脈根を、１％蛍光粒子（直径１〜１０μｍ、ＤｕｋｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）の通常食塩水中溶液で潅流した（３分かけて１ｍＬ）。この手順の結果、先に閉塞した冠状動脈によって供給された左心室（ＬＶ）の部分（リスク領域）は、ＵＶライト下、蛍光の非存在によって同定され、残りのＬＶは暗青色に染色された。心臓を２０分間凍結し、引き続き５〜７個の横軸の切片に切断した。生存可能な心筋からの梗塞を視覚的に示すために、心臓切片を２０分間、１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）のリン酸バッファー（ｐＨ７．４、３７℃）溶液中インキュベートした。次いで、切片を１０％中性緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、２４時間後写真撮影した。梗塞し、虚血−再潅流した領域（リスクエリア）と非虚血の領域との境界を追跡した。対応するエリアを、コンピュータ化した面積測定法によって測定し、これらの測定値から梗塞サイズをリスクエリアのパーセント値として算出した。

リスクエリアのサイズは、野生型マウス及びＧＰＶＩノックアウトマウスの間で同様であった（それぞれ、０．０２０±０．００４ｃｍ^３及び０．０２２±０．００５ｃｍ^３）。野生型マウスにおける梗塞エリア（梗塞サイズ）は、リスクエリアの平均４５±１８％であった。梗塞エリア（梗塞サイズ）は、ＧＰＶＩノックアウトマウスでは有意に小さく、リスクエリアの平均２２±８％であった。これらのデータを図１に概略する。

（例２）
ＧＰＶＩノックアウトマウスの心筋におけるＰセレクチン発現の低減
血小板の活性化を、血小板α顆粒中に貯蔵され、活性化時に血小板表面に速やかに移動することができるＰセレクチンの発現によって測定した。Ｐセレクチン発現は、免疫組織学を用いて検査した。

マウスにおけるｉｎｖｉｖｏの心臓虚血／再潅流
マウスの心臓虚血及び再潅流を、例１において記載されている通りに行った。ＧＰＶＩノックアウトマウス及び野生型マウスに、３０分左冠状動脈前下行枝（ＬＡＤ）閉塞を受けさせ、その後１５分再潅流した。ＬＡＤを１５分再潅流した後、心臓を回収し、ＤＰＢＳを用いて洗浄し、次いで２つの短軸部分に切断し、直ちに４％パラホルムアルデヒド及び０．１Ｍリン酸バッファー中に配置して組織を固定した。２時間後、組織を２５％ショ糖に一夜移した。

Ｐセレクチンの免疫蛍光検出
２日目、心臓組織を２０μｍの横断面に切断し、約３０分間乾燥させた。各スライド上の切片をＰＡＰペンの輪で囲み、約１０分間乾燥させた。スライドを０．０１ＭＰＢＳ−０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（ＰＢＳＴ）中で漱ぎ、室温で３０〜６０分間、正常ロバ血清（１０％ＮＤＳ、ＰＢＳＴ）でインキュベートした。Ｐセレクチンを、ウサギ抗マウスＰセレクチンポリクローナル抗体（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて検出し、ＦＩＴＣ−抗ウサギＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈｌａｂ）で可視化した。

蛍光画像
蛍光画像を、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）、又は通常の蛍光顕微鏡を用いて得た。蛍光は４８８ｎｍで励起し、５４０ｎｍで検出した。虚血３０分及び再潅流１５分後、野生型マウスの心筋（心内膜及び中層心筋）中に高レベルのＰセレクチンが検出された（図２ａ）。ＧＰＶＩノックアウトマウスの心筋層では、はるかに少ないＰセレクチン発現が検出された。発現のレベルを定量するために、虚血エリア内の強力な緑色蛍光を有するエリアのサイズを測定した。データは、Ｐセレクチン発現のエリアの合計サイズが、野生型マウスに比べてＧＰＶＩノックアウトマウスの心臓において有意に低下したことを示す（図２ｂ）。

（例３）
内皮再潅流傷害
脈管構造の健常な正常心臓において、密な内皮は、血管壁の細胞外マトリックスにおけるコラーゲンが循環血の成分と接触するのを防止する。虚血及び再潅流の間など、内皮が損傷を受けると、コラーゲンが曝露されるようになることがある。ＧＰＶＩはコラーゲンに選択的に結合するので、ＧＰＶＩを用いてｉｎｖｉｖｏで内皮の再潅流障害を調査した。この目的で、組換えのｓＧＰＶＩを、蛍光タグであるＦＩＴＣで標識し（ｓＧＰＶＩ−ＦＩＴＣ）、ｓＧＰＶＩ−ＦＩＴＣをマウスに静脈内注射した。注射されたｓＧＰＶＩ−ＦＩＴＣは、内皮損傷により曝露されているコラーゲンに結合する。曝露されているコラーゲンに対するｓＧＰＶＩ−ＦＩＴＣの結合のレベルは蛍光顕微鏡下で組織学的に測定することができ、内皮損傷に対する尺度を提供するものである。

ｓＧＰＶＩ−ＦＩＴＣ（２ｍｇ／ｋｇ）を野生型マウスに注射し、１０分後、心臓虚血（３０分）を開始した。何匹かの動物では虚血の後に再潅流（１５分）を続けた。再潅流を経験した心臓において、脈管構造の著しい標識化が観察され（図３）、内皮の著しい損傷、及び結果として起こる循環血の成分に対するコラーゲンの曝露を示していた。これとは対照的に、再潅流を経験しなかった心臓において、ｓＧＰＶＩ−ＦＩＴＣでの脈管構造の標識化は観察されなかった（図３）。これらのデータは、虚血心臓組織の再潅流が内皮損傷をもたらすことを示している。

（例４）
抗ＧＰＶＩ抗体による心保護効果
体重２．０〜２．５ｋｇの、中国からのカニクイザルを用いた。実験用に選択したサルを一夜絶食させ、ケタミンで鎮静させた（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）。さらに、アトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を注射した。静脈内カテーテルを脚静脈中に挿入した。ペントバルビタールナトリウム（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）で麻酔し、実験を通してさらなる投与量を投与した。正中線頸部切開により気管を曝露し、気管内チューブを導入した。動物を、小型動物用人工呼吸器、及び４０％Ｏ_２／６０％Ｎ_２の混合ガスを用いて人工呼吸した。血圧測定及び動脈血試料採取用に、頸動脈にカニューレ挿入した。次いで、第４肋間に左開胸術を実施し、心臓を曝露した。左冠状動脈前下行枝は見えることがあるが、通常は重なる脂肪によって不明瞭であった。針上の２−０縫合糸を、動脈の開始点にできるだけ近い心室間溝における血管束の下を盲目的に通過させた。縫合糸の終端を、短い長さのポリエチレン製カテーテルに通してスネアを形成した。スネアを１０秒間引っ張ったときにチアノーゼ及び心臓の前壁の収縮の中止が観察され、次いでスネアを開放したときに組織の充血及び収縮の再開が観察されることによって、スネアの成功を確認した。微小球を注射するために、カテーテルを左心耳中に挿入した。心拍数及びＱＲＳ波形を測定するために、ＥＣＧのリード線を取り付けた。直腸測定で３８℃となるように、ヒーティングパッドを用いてサルを温めた。

手術の準備、及び少なくとも２０分間の平衡が完了した後、ベースラインの心拍数、血圧、及びＥＣＧを記録し、冠状動脈を９０分間閉塞した。ＥＣＧ、心拍数、及び血圧を継続的にモニターし、５分間毎分と１０分、次いで閉塞終了まで１０分毎に記録した。閉塞期間の終了時、スネアを開放し、冠状動脈を再潅流した。再びＥＣＧ、心拍数、及び血圧を、５分間毎分と１０分、次いで４時間の再潅流期間の終了まで１０分毎に記録した。心室細動が生じた場合は、リズムを洞に変換するために、電気除細動器を用いた。

再潅流４時間後、心臓を取り出し、潅流装置上に大動脈起始部によって吊るした。冠状動脈及び心臓から血液を洗浄するために食塩水を逆行性に潅流し、次いで冠状動脈を再閉塞した後、２〜９μｍ緑色蛍光微粒子（ＭｉｃｒｏｇｅｎｉｃｓＣｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を潅流液に加えた。このようにして蛍光微粒子は、開存性の冠状動脈によって還流される心筋のみに入り、リスクエリア（又はリスクゾーン）は、蛍光微粒子を含まない心筋の領域として境界を定められた。心臓をドライアイス上に配置して凍結させ、次いでその長軸に対して垂直に２〜３ｍｍの切片に切断した。切片を８〜１０分間、３７℃に温めた１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）（ＧＦＳＣｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｏｗｅｌｌ、ＯＨ）中でインキュベートし、次いで組織を保存するために、及びＴＴＣによって染色された組織と染色されなかった組織との間の色の対比を増強するために、１０％ホルマリン中に入れた。ＴＴＣは、インタクトなＮＡＤＨ貯蔵を有する正常に還流された組織を赤れんが色に染色し、一方、この補助因子が放出され洗い流されている梗塞組織は無染色であり、白色か、心筋内の出血から、おそらく黒色となる。切片を、正確に２ｍｍ離れたプラスチック製プレート間で圧縮した。ＵＶライト下で同定されたリスクゾーン領域、及び白色ライト下で同定された梗塞領域のサイズを、プラスチックオーバーレイ上に輪郭を描いて記録した。面積を面積測定法によって測定し、体積を、面積に２ｍｍを乗じることによって算出した。

対照の動物を、抗ＧＰＶＩ抗体の投与なしで冠状動脈の閉塞（９０分）及び再潅流（４時間）に曝した。抗ＧＰＶＩ抗体処置群の１つにおいて、動物にＯＭ２Ｆａｂフラグメント（モノクローナルマウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ、１１９巻、３１９〜３２９頁、２００７年、及び米国特許出願公開第２００７／０２０７１５５号を参照されたい）（各２ｍｇ／ｋｇ）を２回投与し、第１回を虚血１０分前に投与し、第２回を再潅流の直前に投与した。免疫蛍光のデータ（図１〜３を参照されたい）は、再潅流の間のＧＰＶＩの役割を支持するものであるので、第２の抗ＧＰＶＩ抗体処置群において、動物にＯＭ２Ｆａｂフラグメント（２ｍｇ／ｋｇ）を再潅流直前に単回投与した。心筋梗塞をＡＮＯＶＡによって分析し、＜０．０５のｐ値を統計的に有意とみなした。

梗塞のサイズを、パーセント値のグラフではなくリスクゾーンのサイズに対してプロットした。これは、齧歯動物に対しても見られたように、対照動物の梗塞サイズ／リスクゾーンのサイズのプロットが原点を通らないからである（Ｙｔｒｅｈｕｓら、ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ、２６７巻、Ｈ２３８３〜Ｈ２３９０頁、１９９４年）。Ｆｌａｍｅｎｇら（ＢａｓｉｃＲｅｓＣａｒｄｉｏｌ、８５巻、３９２〜４０３頁、１９９０年）がヒヒに対して言及したように、リスクゾーンのサイズも、マカクにおける梗塞サイズの重要な決定因子である。したがって、リスクゾーンが小さい場合、梗塞サイズは、いかなる介入の非存在下においてさえ、予想通り小さい。リスクゾーンが０．６ｃｍ^３未満である場合、対照のサルにおいても、梗塞は予想されない。梗塞のサイズを、リスクゾーンのサイズに対してプロットした場合、ＯＭ２抗体（２回又は単回投与のいずれか）は、回帰直線が右側にシフトする著しい心保護効果を示した。このシフトは、同じリスクゾーンのサイズでは、ＯＭ２処置したサルの梗塞サイズが小さかったことを示している。保護の程度は、ＯＭ２を２回又は単回投与したサルにおいて同様であり、ＧＰＶＩによる血小板−コラーゲン相互作用は再潅流障害を誘発し、このような相互作用を阻害すると心保護がもたらされるという概念と一致する。

ＯＭ２がこれらのサルにおいて血小板活性化を阻害するか否かを調査するために、ＯＭ２投与の前及び後に血液試料を採取した。次いで、ｅｘｖｉｖｏのコラーゲン誘発血小板凝集を、全血の血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を用いて測定した。血液を食塩水で１：１（ｖ／ｖ）希釈し、血小板凝集計中５〜１０分間、３７℃でインキュベートした後、コラーゲンによって凝集を開始した（０．５μｇ／ｍＬ、Ｈｏｒｍ、Ｎｙｃｏｍｅｄ、ドイツ）。凝集を１０分間、血液試料中の電極のインピーダンスの上昇としてモニターした（Ａｇｇｒｏ／ｌｉｎｋｖ４．７５、Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）。

図４ｂは、ＯＭ２投与前(投薬前)及び４時間後(投薬４時間後)に採取した血液試料中の、コラーゲン誘発血小板凝集の代表的な測定結果を示す。データは、ＯＭ２（２ｍｇ／ｋｇ）を再潅流前にサルに投与すると、ｅｘｖｉｖｏアッセイにおいて測定されるようにコラーゲン誘発血小板凝集を完全に阻害したことを実証している。０．４ｍｇ／ｋｇのＯＭ２投与は、同様の阻害を示した（データは示さず）。

本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示に照らし合わせて最も完全に理解され、それら全ての全文を参照によって本明細書に組み入れる。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書及び本明細書に開示される実施形態を考慮すれば、当業者には明らかである。本明細書及び実施例は例示にすぎず、本発明の真の範囲及び精神は以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims

再潅流傷害及び／又は梗塞の阻害を必要とする患者における前記阻害のための方法であって、血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）の阻害剤を投与することを含み、該阻害剤が血小板ＧＰＶＩとコラーゲンの間の相互作用を阻害する、上記方法。
再潅流傷害及び／又は梗塞が、心筋再潅流傷害及び／又は心筋梗塞である、請求項１に記載の方法。
再潅流傷害及び／又は梗塞が、内皮再潅流傷害及び／又は内皮機能不全である、請求項１に記載の方法。
患者が心臓発作を有したことのある、請求項１に記載の方法。
患者が、冠状動脈血流の一時的な遮断をもたらす待機的手術を必要とする、請求項１に記載の方法。
阻害剤が、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
抗体が、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、及びＯＭ４から選択される、請求項６に記載の方法。
抗体がＯＭ２である、請求項６に記載の方法。
抗体がヒト化されている、請求項６に記載の方法。
抗体が、化学的に、酵素的に、又は組換えで生成されたＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、又は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含むペプチドフラグメントから選択される活性な抗体フラグメントである、請求項６に記載の方法。
活性な抗体フラグメントが、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、及びＯＭ４から選択される抗体のフラグメントである、請求項１０に記載の方法。
抗体がＯＭ２である、請求項１１に記載の方法。
活性な抗体フラグメントがヒト化されている、請求項１０に記載の方法。
阻害薬がＧＰＶＩのペプチドフラグメントである、請求項１に記載の方法。
ＧＰＶＩのペプチドフラグメントが、ＧＰＶＩのコラーゲン結合性ドメインである、請求項１４に記載の方法。
ペプチドフラグメントが可溶性ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）である、請求項１４に記載の方法。
再潅流傷害及び／又は梗塞を処置するための薬物の製造のための血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）の阻害剤の使用であって、該阻害剤が血小板ＧＰＶＩとコラーゲンの間の相互作用を阻害する、上記使用。
再潅流傷害及び／又は梗塞が、心筋再潅流傷害及び／又は心筋梗塞である、請求項１７に記載の使用。
再潅流傷害及び／又は梗塞が、内皮再潅流傷害及び／又は内皮機能不全である、請求項１７に記載の使用。
阻害剤が、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な抗体である、請求項１７に記載の使用。
抗体が、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、及びＯＭ４から選択される、請求項２０に記載の使用。
抗体がＯＭ２である、請求項２１に記載の使用。
抗体がヒト化されている、請求項２０に記載の使用。
抗体が、化学的に、酵素的に、又は組換えで生成されたＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、又は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド、又は天然に存在するそれらの変異体に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含むペプチドフラグメントから選択される活性な抗体フラグメントである、請求項２０に記載の使用。
活性な抗体フラグメントが、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、及びＯＭ４から選択される抗体のフラグメントである、請求項２４に記載の使用。
抗体がＯＭ２である、請求項２５に記載の使用。
活性な抗体フラグメントがヒト化されている、請求項２４に記載の使用。
阻害薬がＧＰＶＩのペプチドフラグメントである、請求項１７に記載の使用。
ＧＰＶＩのペプチドフラグメントが、ＧＰＶＩのコラーゲン結合性ドメインである、請求項２８に記載の使用。
ペプチドフラグメントが可溶性ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）である、請求項２８に記載の使用。