CN101874107A - 糖蛋白ⅵ(gpvi)抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明记载了一种通过使用血小板GPVI抑制剂来减少再灌注损伤和/或梗塞的方法。该方法用于在心脏病发作或在选择性心脏手术期间或之后治疗病患。

Description

糖蛋白Ⅵ(GPVI)抑制剂的用途

相关申请

本申请要求于2007年10月31日提交的美国申请No.60/984,334，“Uses ofa Glycoprotein VI(GPVI)Inhibitor(糖蛋白VI(GPVI)抑制剂的用途)”的优先权，将其全部内容以引用的方式并入本申请。

技术领域

本发明涉及用血小板膜糖蛋白VI(GPVI)抑制剂来抑制再灌注损伤和/或梗塞的方法，所述抑制剂包括抗体、蛋白质片段和小分子化合物。

背景技术

当向心脏供血的冠状动脉阻塞时会导致心脏病发作。通常由于动脉粥样硬化和血栓的形成引起动脉血管变窄和关闭而导致阻塞的发生。血液供应的缺乏称为缺血。心肌只能耐受短时间的氧气匮乏并且会在20-120分钟内发生梗死。因为心肌细胞很大程度上是终极分化的，所以心脏的再生能力极其有限。曾有心脏病发作的病患在其余生都会携带一颗带有梗塞组织的心脏。由于梗塞的心肌泵血能力降低，因此这些病患保持对身体供血的能力也会降低。心脏病发作以后，继而会发生充血性心力衰竭，可能还会导致心脏病再次发作。心力衰竭的病患的活动能力减弱、生活质量下降并且寿命缩短。

根据美国心脏协会的最新统计，仅在美国每年就有1,200,000例心脏病发作(Thom等人，Circulation，113：e85-151，2006)。目前美国有5,000,000心力衰竭的病患并且每年新增550,000病例(Thom等人，Circulation，113：e85-151，2006)。

阻塞的冠状动脉可以用血管成形术和/或溶栓剂治疗而被重新打通，从而使先前缺血的肌肉再灌注。虽然再灌注对救治缺血的肌肉非常必要，但矛盾的是，再灌注本身也会对肌肉产生额外的损伤。对心脏病发作理想的治疗方法是在心脏病发作期间使心肌梗塞最小化。然而，由于通常对心脏病发作的发生很难作出预测，预防治疗就变得不可能。因此，血管成形术和/或溶栓剂治疗与减少再灌注损伤治疗(例如，在救护车或急救室内施用)的结合可能会更加可行。降低再灌注损伤的治疗将会促进心脏病发作/缺血的恢复，并能限制形成心力衰竭的可能性。可以预期降低心肌梗塞的治疗能够挽救高危病患的生命、缩短住院时间、提高生活质量并减少总的卫生保健开支。

然而不幸的是，目前还没有这样的治疗方法。虽然曾尝试了各种各样的治疗方法但都没有成功。(参见Downey和Cohen的综述文章，Prog CardiovascDis(心血管病进展)，48：363-371，2006)。抗血栓干预，如阿司匹林、氯吡格雷和ReoPro目前被推荐用于预防冠状动脉的闭塞/再闭塞。然而，它们对再灌注损伤并不能提供直接的保护。事实上，阿司匹林会阻碍内源性心肌保护途径，并增加梗塞的发生(Gross等人，J Pharmacol Exp Ther，310：185-191，2004)。

发明内容

本发明提供一种通过施用血小板糖蛋白VI(GPVI)抑制剂来抑制病患的再灌注损伤和/或梗塞的方法，其中，所述血小板糖蛋白VI(GPVI)是存在于血小板表面的主要胶原蛋白受体。本发明还提供所述抑制剂在制备用于治疗再灌注损伤和/或梗塞的药物中的用途。

GPVI专一地表达在血小板和巨核细胞上并和胶原蛋白结合，所述胶原蛋白是在血管内皮下最易形成血栓的基质蛋白质。动脉粥样硬化斑块的破裂、缺血和再灌注损伤会使胶原蛋白暴露于包含血小板的血液成分。血小板GPVI和胶原蛋白的结合对血小板在受损伤血管部位的粘附以及随后的血小板活化和聚集起关键作用。血小板GPVI抑制剂阻止血小板GPVI和存在于血管壁的胶原蛋白之间的相互作用。虽然抑制GPVI以前曾显示降低血小板的活化，但令人意外的是，本发明显示抑制GPVI还具有直接保护心脏的效果，能用于抑制再灌注损伤和/或梗塞。

所述血小板GPVI抑制剂可以为抗体、蛋白质片段或小分子化合物。所述抗体包括，但不限于，单克隆抗-GPVI抗体。单克隆抗体包括活性抗体片段。活性抗体片段可以为化学、酶解或重组制备的Fab片段、F(ab)₂片段或包含至少一个对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的互补性决定区(CDR)的肽。示例性的抗体包括鼠科的单克隆抗体OM1、OM2、OM3和OM4以及它们的人源化变体或其活性片段。肽片段包括，但不限于，GPVI和可溶性GPVI的胶原蛋白结合区域。

附图说明

图1所示为野生型鼠和GPVI敲除鼠心肌梗塞尺寸的比较。在30分钟缺血和24小时再灌注后，与野生型鼠相比，GPVI敲除鼠的心肌梗塞尺寸明显变小。每个空白圆圈表示来自个体鼠的梗塞尺寸，而涂黑的圆圈表示组平均值±SD。用t检验对数据进行分析，并认为p＜0.05具有统计学意义。

图2a所示为在缺血和再灌注之后，对野生型鼠与GPVI敲除鼠的心肌内血小板选择蛋白表达的比较。显示了心内膜和中层心肌的典型荧光图像。在GPVI敲除鼠心肌内呈亮绿色(或在黑白版的图片中为亮白色)的血小板选择蛋白的表达减少(昏暗背景荧光是由于心肌的自发荧光造成的)。相似的结果也分别从5例野生型鼠和5例GPVI敲除鼠的心脏获得。图2b显示了对有血小板选择蛋白高表达的区域的定量。GPVI敲除(KO)鼠的血小板选择蛋白的水平明显低于野生型(WT)鼠(n＝5)，这表明GPVI在诱发心肌内血小板活化和聚集中起着重要的作用。

图3所示为野生型鼠在缺血后由于再灌注而在其心脏内出现的胶原蛋白暴露。左图显示经过30分钟的缺血接着进行15分钟再灌注后的心脏的典型切片。亮绿色(或在黑白版的图片中为亮白色)表示暴露出来的胶原蛋白(昏暗背景荧光是由于心肌的自发荧光造成的)。从另外3只动物也获得了类似的结果。右图显示经过30分钟的缺血而没有后续再灌注的心脏的典型切片。没有出现绿色的荧光(或在黑白版的图片中没有亮白色)，这表明没有胶原蛋白暴露。从另外2只动物也获得了类似的结果。综上所述，这些数据表明在再灌注期间发生了内皮损伤。

图4a证实了猴子体内抗-GPVI抗体OM2的梗塞减少的作用。该图显示了风险带(risk zone)和梗塞区的散布图，其中为每个标明的治疗组绘制回归线。在对照组猴子中梗塞与风险带的尺寸呈线性相关。因为所有的数值点都在对照组的回归线以下(p＜0.05)，所以无论是给予一次剂量还是两次剂量，OM2治疗的猴子都减少了心肌梗塞。而且，在用一次剂量或两次剂量治疗的猴子中梗塞减少是相似的，这表明在再灌注期间OM2发挥了保护作用。通过方差分析(ANOVA)来分析梗塞数据。图4b证实了OM2对猴子血液中的血小板聚集的抑制作用。在施用OM2(2mg/kg)之前(给药前)和之后(给药后4小时)从猴子体内抽取血样。用全血集合度计在采用活体材料的实验中测定胶原蛋白诱发的血小板聚集。图4b显示胶原蛋白诱发的血小板聚集的典型测量数值。在接受OM2的动物的全血中，胶原蛋白诱发的血小板聚集被完全抑制。

具体实施方式

“梗塞”通常是指由于其动脉血供的上游阻塞而引起的组织坏死。缺少含氧的血液会使细胞因缺少营养而坏死。梗塞会影响任何器官，但在如心脏这些需要高能量和高代谢活动的组织中会更经常和更快速(小于20-120分钟)地发生。

术语“心肌梗塞”在本申请中是指由于流向心肌区域的冠状动脉血流突然减少而引起的心肌坏死。心肌仅能承受很短时间(小于5分钟)的缺血而不致遭受损伤。在5-20分钟内血流不能恢复一般会产生可逆的损伤。更长时间的缺血通常会产生永久性的损伤，即细胞死亡/坏死/梗死。由于心肌的再生能力非常有限，肌肉的损失会是永久性的。“内皮功能失调”是指由于缺血和再灌注而引起的内皮坏死或正常功能的丧失。

“再灌注损伤”是指一段时间的缺血后，当血供重新回到组织时所引起的组织损伤。来自血液的氧气和营养成分的缺失会造成这样的状况：循环的恢复会导致由氧化应激所诱发的炎症和氧化性损伤而不是正常功能的恢复。“心肌再灌注损伤”是指发生在心肌的再灌注损伤，而“内皮再灌注损伤”是指发生在内皮的再灌注损伤。

“病患”在本申请中是指需要治疗来降低梗塞和/或再灌注损伤的发生、可能性或程度的任何人或非人类的动物。“病患”也包括那些曾遭受过心脏病发作或有心脏病发作风险的个体，其包括，但不限于，那些已经被诊断为心血管失调的人，例如冠状动脉疾病(CAD)、系统性高血压、二叶主动脉瓣病、肥厚型心肌病或二尖瓣脱垂症的个体；那些正在或曾遭受心脏病发作和/或心力衰竭(包括充血性心力衰竭(CHF))的个体；以及那些需要暂时阻断冠状动脉血流(例如在心脏搭桥手术期间)的进行选择性心脏手术的个体。要治疗的非人类的动物包括所有驯养的或野生的脊椎动物，包括，但不限于，小鼠、大鼠、兔子、鱼、鸟、仓鼠、狗、猫、猪、羊、马、牛和非人类的灵长类动物。

术语“抑制”是指任何表型特征的减少或停止，或者是指所述特征的发生、程度或可能性的减少或停止。因此，“抑制再灌注损伤和/或梗塞”是指再灌注损伤和/或梗塞可衡量的减少或停止。

“血小板GPVI抑制剂”是指任何能抑制血小板GPVI功能的抗体、蛋白质片段或小分子化合物。血小板GPVI的功能包括血小板GPVI与例如在血管壁内发现的胶原蛋白之间的相互作用。其他的功能包括胶原蛋白诱发的血小板聚集、血小板粘附到固定的胶原蛋白上、胶原蛋白诱发的三磷酸腺苷分泌和胶原蛋白诱发的凝血噁烷A₂的形成。

术语“抗体”在本领域内是公知的，其包括单克隆抗体。本发明的单克隆抗体包括活性抗体片段，如通过化学、酶解或重组制备的Fab片段、F(ab)₂片段或包含至少一个对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的互补性决定区(CDR)的肽片断。如果抗-GPVI抗体与GPVI多肽、肽或其天然变体结合，其离解常数(Kd)等于或低于10^-7M，它们之间的结合就是“特异性的结合”。在本发明的另一个实施方式中，抗-GPVI抗体与GPVI多肽、肽或其天然变体以Kd等于或低于10^-8M特异地结合。在本发明的又一个实施方式中，本发明的抗-GPVI抗体与多肽、肽或其天然变体以Kd等于或低于10^-9M特异地结合。如通过测量用125I标记的IgG或其片段的饱和结合等温线，或通过用未标记的IgG同源置换¹²⁵I标记的IgG并采用非线性回归分析(如由Motusky在Analyzing Datawith GraphPad Prism(1999)，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA中记载)可以很容易地通过常规的技术来测定结合对象或抗体的亲和力。其他的技术也是本领域已知的，例如，由Scatchard等人在Ann.NY Acad.Sci.，51：660(1949)中描述的那些方法。

美国专利申请公开No.2007/0207155详细描述了单克隆抗体及其人源化抗体的制备。美国专利申请公开No.2007/0207155也记载了具有上述结合特性的单克隆抗体OM1、OM2、OM3和OM4，以及包含至少一个对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的互补性决定区(CDR)的肽片断。而且，美国专利No.6,998,469和美国专利申请公开No.2007/0207155中都描述了GPVI多肽、肽或其天然变体，将两者都以完整引用的方式并入本申请。

“小分子化合物”是指有机的非蛋白质化合物，其大小最大为1500Da。小分子化合物可是合成的或由天然产物提取物衍生。其关键的结构特征通常是一个刚性的多环的核心结构，此种结构降低了因小分子和蛋白质结合而耗费的熵值(entropic cost)。本发明的小分子化合物抑制血小板GPVI的功能，包括但不限于，血小板GPVI和胶原蛋白的相互作用。

如上所述，“肽片段”包括包含至少一个对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的CDR的肽片断，其例子记载在美国专利申请公开No.2007/0207155中。其他的肽片段可以包括GPVI的胶原蛋白结合区域。完整的GPVI序列已公开在Chemetson等人，J.Biol.Chem.274：29019-24(1999)；WO 00/68377；Jandrot-Perrus等人，Blood 96：1798-807(2000)；和Ezumi等人，Biochem BiophysRes Commun.277：27-36(2000)中，并且已经绘制了GPVI上主要的胶原蛋白结合表面(O’Connor等人，J.Biol.Chem.281(44)：33505-10(2006)；Dumont等人，J.Mol.Biol.361(5)：877-87(2006)；Horii等人，Blood 108(3)：936-42(2006)；O’Connor等人，J.Chromb Haemost.4(4：)869-73(2006))。另外，可溶性的GPVI(sGPVI)(包含GPVI的细胞外区域)也显示出能抑制GPVI和胶原蛋白的结合，因此能抑制胶原蛋白诱发的血小板聚集(Jandrot-Perrus等人，Blood96：1798-807(2000))。

对病患的治疗包括施用药理有效量的血小板GPVI抑制剂。本领域的普通技术人员可以凭经验来确定施用这些抑制剂的最佳剂量和疗程剂量。然而，药理有效量是能抑制病患的再灌注损伤、梗塞或缺血事件的量。

在整个疗程中可以用一次剂量或多次剂量来施用药理有效量。本发明的抑制剂可通过本领域技术人员所熟悉的任何方式施用，例如，静脉(IV)弹丸注射、连续输注或间歇输注。在另外的实施方式中，所述抑制剂可以通过腹膜内(IP)、体内、关节内、心室内、鞘内、肌内、皮下、局部、扁桃体、粘膜、鼻内、经皮、阴道内、口服或吸入施用。

通过下述实施例对本发明作举例说明，然而这些实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

GPVI缺失对小鼠心脏的保护

用1-1.5％的异氟醚对同龄野生型鼠和GPVI敲除鼠进行麻醉，通过气管内导管插管，并将其连结在压力控制的呼吸机上。用室内空气和100％氧气(按4∶1体积比)向动物通气。进行手术前，给予小鼠庆大霉素(0.7mg/kg IM)。在整个实验过程中，通过与数字温度计连接的直肠探条仔细监测体温并用加热板或加热灯将体温保持在37-37.5℃。在预先的研究中，将导管插入颈动脉以检测小鼠的血压并进行血气分析。这样是为了保证采用这些实验步骤中小鼠能保持生理性的血流动力。

借助解剖显微镜，通过左胸廓切开术打开胸腔。用锥形针将8-0尼龙缝线(Ethicon，Inc.Johnson & Johnson Co.Somerville，NJ)从左前降支冠状动脉下方距左心耳顶端2-3mm处穿过，缝线的末端穿过一个塑料管。相对于塑料管拉动缝线使冠状血管闭塞。在缺血及其再灌注后的消退期间，冠状血管闭塞和再灌注的成功进行是通过目测(即通过观察当拉动缝线时远端心肌的苍白色以及由于放气后充血而恢复的亮红色)来证实的。缺血持续30分钟。在解除闭塞后，用缝线逐层关闭胸腔。注射一个剂量的酮保泰松(Ketofen)(2.5mg/kg，IM)。在恢复自主呼吸以后，将小鼠从通气机处移开并放置到控温控湿并富含氧气的设备里。在小鼠获得正常姿态能力后，将其放回笼中过24小时。

在实验结束的时候(第二天)，给小鼠施用肝素(1U/g IP)，随后用戊巴比妥钠(100mg/kg IP)麻醉。切除心脏并采用朗根多夫器(Langendorf apparatus)通过主动脉插管(23-计量注射针)用Krebs-Henseleit溶液灌注。画出闭塞区域然后是再灌注区域(风险区域)的轮廓，在先前闭塞的位置扎紧冠状动脉并用1％的荧光颗粒(直径1-10μm，Duke Scientific，Palo Alto，CA)的生理盐水溶液灌注主动脉根部(3分钟内1mL)。该操作的结果是，由先前闭塞的冠状动脉供应的左心室(LV)部分(风险区域)由于没有荧光而在紫外光下被测定，而左心室的其余部分被染成深蓝色。将心脏冷冻20分钟，然后切成5-7片横切片。为了呈现梗塞区与存活心肌的轮廓，将心脏切片在磷酸盐缓冲液(pH7.4，37℃)中用1％氯化三苯基四唑(TTC)培养20分钟。将切片在10％的中性缓冲甲醛中固定，24小时后拍照。显示梗塞、缺血-再灌注(风险区域)和无缺血区域的边界。用计算机化求积法来测定相应的面积，并由这些测量数据计算出梗塞的尺寸作为风险区域的百分比。

野生型鼠和GPVI敲除鼠的风险区域大小类似(分别为0.020±0.004cm³和0.022±0.005cm³)。野生型鼠的梗塞区域(梗塞尺寸)平均为风险区域的45±18％。GPVI敲除鼠梗塞区域(梗塞尺寸)明显变小，平均为风险区域的22±8％。这些数据总结在图1中。

实施例2

GPVI敲除鼠心肌内血小板选择蛋白表达的降低

血小板的活化是通过血小板选择蛋白的表达来测定的，所述血小板选择蛋白储存在血小板α-颗粒内，一旦被活化，能很快地转移到血小板的表面。采用免疫组织学来测定血小板选择蛋白的表达。

小鼠体内心脏缺血/再灌注：如实施例1所述进行小鼠心脏缺血/再灌注。GPVI敲除和野生型鼠接受左前降支冠状动脉(LAD)闭塞30分钟，然后再灌注15分钟。LAD的15分钟再灌注后，取出心脏并用DPBS清洗，然后按短轴切成两个部分并立即放入4％低聚甲醛和0.1M磷酸盐缓冲液中以固定组织。2小时后，将该组织转移到25％蔗糖中过夜。

血小板选择蛋白的免疫荧光测定：在第二天，将心脏组织切成20μm的横切片并使其干燥约30分钟。将每个载玻片上的切片用PAP笔作圆环标注，并使其干燥约10分钟。在0.01M PBS-0.1％Triton(PBST)中轻洗载玻片，并在室温下用正常驴血清(10％NDS，PBST)培养30-60分钟。用兔抗-小鼠血小板选择蛋白多克隆抗体(Chemicon International)对血小板选择蛋白进行检测，并用FITC-抗-兔IgG(Jackson ImmunoResearch lab)显影。

荧光图像：采用Zeiss共聚焦显微镜(LSM510)或常规的荧光显微镜获得荧光图像。在480nm激发荧光并在540nm测定。在缺血30分钟和再灌注15分钟后，在野生型鼠的心肌(心内膜和中层心肌)内检测到高水平的血小板选择蛋白(图2a)。在GPVI敲除鼠的心肌内检测到相当少的血小板选择蛋白表达。为了定量表达水平，测定在缺血区域内有强绿色荧光的区域尺寸。数据显示，与野生型鼠相比，GPVI敲除鼠的心脏内血小板选择蛋白表达区域的总面积尺寸明显减少(图2b)。

实施例3

内皮再灌注损伤

在具有健康脉管系统的正常心脏中，紧密的内皮阻止在血管壁的胞外基质中的胶原蛋白与循环血液成分的接触。如果内皮遭到损伤，例如在缺血和再灌注期间，胶原蛋白可能会暴露出来。因为GPVI选择性地与胶原蛋白结合，GPVI被用来检测体内的内皮再灌注损伤。为了这个目的，用荧光标记物FITC标记重组体sGPVI(sGPVI-FITC)，并将sGPVI-FITC静脉注射到小鼠体内。注射入的sGPVI-FITC与由于内皮损伤而暴露的胶原蛋白结合。sGPVI-FITC与暴露胶原蛋白结合的水平可以在荧光显微镜下进行组织学测定，并为内皮损伤提供了测量方法。

在野生型鼠心脏缺血(30分钟)发生前10分钟，将sGPVI-FITC(2mg/kg)注射到其体内。在其中一些动物中，缺血后再进行再灌注(15分钟)。经过再灌注的心脏中观察到脉管系统的明显标记(图3)，这表明内皮的明显损伤，因此表明胶原蛋白暴露于循环的血液成分。相反，在没有经过再灌注的心脏中，没有观察到用sGPVI-FITC标记的脉管系统(图3)。这些数据显示缺血心脏组织的再灌注导致内皮损伤。

实施例4

抗-GPVI抗体的心脏保护作用

使用来自中国的重量为2.0-2.5kg的猕猴。实验选用的猴子禁食过夜并用氯胺酮(10mg/kg 1M)镇静。另外再注射阿托品(0.05mg/kg 1M)。将一个静脉内导管插入到腿部静脉。用戊巴比妥钠(10-15mg/kg IV)完成麻醉并在实验过程中施用追加剂量。通过正中颈部切口暴露气管，并插入气管导管。借助小型的动物呼吸机和40％O₂/60％N₂的混合气体为动物通气。将一导管插入颈动脉以测定血压并收集动脉血样。在第四肋间内进行左胸廓切开术并暴露心脏。左前降支冠状动脉偶尔能看到，但通常由于覆盖的脂肪而被遮挡。将穿在针上的2-0缝线在室间沟内盲穿过血管束下面，并尽可能接近动脉的起点。缝线的末端穿过一个很短的聚乙烯导管以形成一个圈套器。圈套器的成功通过以下现象来证实：当圈套器被拉紧10秒钟时观察到心脏前壁的发绀和收缩的停止，以及当圈套器被放开时组织的充血和收缩的恢复。将一根导管插入左心耳用于微球注射。连结ECG导连用于测量心率和QRS形态。用加热板对猴子加温使测得的直肠温度达到38℃。

在完成手术准备工作并平衡至少20分钟后，记录基线心率、血压和ECG，并将冠状动脉闭塞90分钟。连续监测ECG、心率和血压，并在5分钟内每分钟记录一次，在10分钟时记录一次，此后每10分钟记录一次直到闭塞结束。在闭塞期结束时，释放圈套器并使冠状动脉再灌注。同样，连续监测ECG、心率和血压，并在5分钟内每分钟记录一次，在10分钟时记录一次，此后每10分钟记录一次直到4小时再灌注期结束。如果发生心室纤颤，使用电除颤器使节律转变成窦性。

4小时的再灌注后，取出心脏并通过主动脉根部将其挂在灌注仪器上。逆行灌注盐水以冲洗来自冠状动脉和心脏的血液，在冠状动脉再次闭塞后，将2-9μm绿色荧光微球(Microgenics Corp.，Freemont，CA)加入灌注液。这样，荧光微球只进入由开放的冠状动脉灌注的心肌，而风险区域(或风险带)作为不含荧光微球的心肌区域被划分出来。将心脏放置在干冰上冷冻，垂直于其长轴将其切成2-3mm的切片。将切片在加热至37℃的1％氯化三苯基四唑(TTC)(GFSChemicals，Powell，OH)中培养8-10分钟，然后放入10％福尔马林中进行组织防腐以及提高被TCC染色和没有被TCC染色的组织之间的颜色对比。TTC将含有保存完好的NADH的正常灌注组织染成砖红色，然而其中已经释放出并被洗掉辅助因子的梗塞组织未被染色而呈白色，或者由于心肌内出血而呈黑色。将切片压在正好相隔2mm的塑料板之间。将在紫外光下识别的风险带区域和在白光下识别的梗塞区域的尺寸描绘在塑料覆盖物上。用求积法测定面积并通过将面积乘以2mm来计算体积。

对照组动物在没有施用抗-GPVI抗体的情况下进行冠状动脉闭塞(90分钟)和再灌注(4小时)。在一个抗-GPVI抗体处理组中，动物接受了两次剂量的OM2Fab片段(单克隆鼠抗-人GPVI抗体；参见Matsumoto等人，Thromb Res，119：319-329，2007；和美国专利申请公开No.2007/0207155)(每次2mg/kg)，第一次剂量在缺血10分钟前施用，而第二次剂量正好在再灌注前施用。因为免疫荧光数据(参见图1-3)支持了GPVI在再灌注期间所起的作用，所以在第二个抗-GPVI抗体处理组中，动物正好在再灌注前接受了一次剂量的OM2 Fab片段(2mg/kg)。通过ANOVA分析心脏梗塞，p值＜0.05被认为具有统计学意义。

以风险带的尺寸为横坐标绘制梗塞尺寸的图而不是将其绘制成百分比图。这是因为没有找到对照组动物的梗塞尺寸/风险带尺寸的图表的来源，对于啮齿动物也有这样的问题(Ytrehus等人，Am J Physiol，267：H2383-H2390，1994)。如Flameng等人(Basic Res Cardio 185：392-403，1990)所指出对狒狒的那样，在猕猴中风险带的尺寸也是梗塞尺寸的一个重要决定因素。因此，当风险带的尺寸小时，即使没有任何干预，也可预测梗塞的尺寸会小。而当风险带的尺寸小于0.6cm³时，即使在对照组猴子中，也可以预期没有梗塞。当以风险带的尺寸为横坐标绘制梗塞尺寸的图时，由于回归线向右移动，OM2抗体(无论两次剂量还是一次剂量)显示出明显的心脏保护作用。这种移动表明在同样的风险带尺寸下，OM2处理的猴子具有更小的梗塞尺寸。用两次和一次剂量OM2处理的猴子中保护程度相似，这与下述观点一致：通过GPVI的血小板-胶原蛋白的相互作用诱发再灌注损伤以及对这种相互作用的抑制提供了心脏保护。

为了研究OM2是否在这些猴子身上抑制了血小板的活化，在施用OM2前后抽取血样。然后用全血集合度计(Chrono-log，Corporation PA)测定体外胶原蛋白诱发的血小板聚集。用盐水1∶1(v/v)稀释血液，并在被胶原蛋白(0.5μg/mL；Horm，Nycomed，德国)诱发开始聚集以前，先将其在37℃下在集合度计中培养5-10分钟。随着在血样中电极阻抗的增加监测聚集(Aggro/link v4.75 Chrono-log)。

图4b显示在OM2施用前(给药前)和4小时后(给药后)采集的血样中胶原蛋白诱发的血小板聚集的典型测量值。这些数据表明在再灌注之前对猴子施用的OM2(2mg/kg)完全抑制了胶原蛋白诱发的血小板聚集(通过体外分析方法测量)。以0.4mg/kg施用的OM2显示了相似的抑制作用(数据未显示)。

参照本说明书内引用的文献可以更透彻地理解说明书，将这些文献以引用方式完整并入本申请。根据在此披露的本发明的说明和实施，本发明的其他实施方式对本领域技术人员是显而易见的。认为本说明书和实施例仅是为了解释和说明，随附的权利要求书表明了本发明的真正的实质和范围。

Claims (30)

1.一种包括施用血小板糖蛋白VI(GPVI)抑制剂来按其需要抑制病患再灌注损伤和/或梗塞的方法，其中，所述抑制剂抑制血小板GPVI和胶原蛋白之间的相互作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述再灌注损伤和/或梗塞为心肌再灌注损伤和/或心肌梗塞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述再灌注损伤和/或梗塞为内皮再灌注损伤和/或内皮功能失调。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病患曾有心脏病发作。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病患需要进行致使冠状动脉血流暂时阻断的选择性手术。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抑制剂为对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述抗体选自OM1、OM2、OM3和OM4中。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述抗体为OM2。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述抗体已被人源化。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述抗体为活性抗体片断，其选自化学、酶解或重组制备的Fab片断、F(ab)₂片断或包含至少一个对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的互补性决定区(CDR)的肽片断中。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述活性抗体片断为选自OM1、OM2、OM3和OM4中的抗体片断。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述抗体为OM2。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述活性抗体片断已被人源化。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抑制剂为GPVI的肽片断。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述GPVI的肽片断为GPVI的胶原蛋白结合区域。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述肽片断为可溶性GPVI(sGPVI)。

17.血小板糖蛋白VI(GPVI)抑制剂在用于制备治疗再灌注损伤和/或梗塞的药物中的用途，其中，所述抑制剂抑制血小板GPVI和胶原蛋白之间的相互作用。

18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述所述再灌注损伤和/或梗塞为心肌再灌注损伤和/或心肌梗塞。

19.根据权利要求17所述的用途，其中，所述再灌注损伤和/或梗塞为内皮再灌注损伤和/或内皮功能失调。

20.根据权利要求17所述的用途，其中，所述抑制剂为对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的抗体。

21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述抗体选自OM1、OM2、OM3和OM4中。

22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述抗体为OM2。

23.根据权利要求20所述的用途，其中，所述抗体已被人源化。

24.根据权利要求20所述的用途，其中，所述抗体为活性抗体片断，其选自化学、酶解或重组制备的Fab片断、F(ab)₂片断或包含至少一个对GPVI多肽、肽或其天然变体具特异性的互补性决定区域(CDR)的肽片断中。

25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述活性抗体片断为选自OM1、OM2、OM3和OM4中抗体片断。

26.根据权利要求25所述的用途，其中，所述抗体为OM2。

27.根据权利要求24所述的用途，其中，所述活性抗体片断已被人源化。

28.根据权利要求17所述的用途，其中，所述抑制剂为GPVI的肽片断。

29.根据权利要求28所述的用途，其中，所述GPVI的肽片断为GPVI的胶原蛋白结合区域。

30.根据权利要求28所述的用途，其中，所述肽片断为可溶性GPVI(sGPVI)。

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