KR20100075585A - 당단백질 ｖｉ (ｇｐｖｉ) 억제제의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈소판 GPVI 의 억제제를 사용함으로써 재관류 손상 및/또는 경색을 완화시키는 방법을 기술한다. 상기 방법은 심장 발작 또는 예정 심장 수술 동안 또는 후에 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 2007 년 10 월 31 일에 출원된 미국 출원 제 60/984,334 호, "당단백질 VI (GPVI) 억제제의 용도" 의 우선권의 이점을 주장하고, 이는 전부 그대로 참조인용된다.
발명의 분야
본 발명은 항체, 단백질 단편, 및 소분자 화합물을 포함하는 혈소판 막 당단백질 Vl (GPVI) 의 억제제를 이용한 재관류 손상 및/또는 경색의 억제방법에 관한 것이다.
심장 발작은, 심장에 혈액을 공급하는 관상 동맥이 막힐 때 발생한다. 폐색은 보통 죽상동맥경화 및 혈전 형성의 결과로서 동맥이 좁아지고 폐쇄되기 때문에 발생한다. 혈액 공급의 부족은 허혈로서 지칭된다. 심근은 오직 단기간의 산소 결핍을 견딜 수 있고, 20-120 분 미만 이내에 경색될 것이다. 심근 세포가 주로 정기적으로 분화되기 때문에, 심장은 재생할 능력이 매우 제한적이다. 심장 발작이 있는 환자는 남은 그의 삶을 위해 경색된 조직을 갖는 심장을 이식할 것이다. 경색된 심근은 혈액을 펌프할 능력이 저하되기 때문에, 이러한 환자는 신체로의 혈액 공급을 유지시키는 능력이 저하될 것이다.
심장 발작 후, 울혈심부전이 이어질 수 있고, 환자는 또한 심장 발작이 재발할 수 있다. 심부전이 있는 환자는 움직임이 저하되고, 생활의 질이 떨어지며, 수명이 단축된다.
미국 심장 협회 (American Heart Association) 의 가장 최근 통계에 따르면, 미국에서만 매년 심장 발작 수가 1,200 만 건에 이른다 (Thorn 등, Circulation, 113:e85-151, 2006). 현재 미국에서 심장 발작을 앓는 5 백만의 사람들과 매년 550,000 건의 신규 사례가 있다 (Thorn 등, Circulation, 113:e85-151, 2006).
폐색된 관상 동맥은 혈관형성술 및/또는 혈전용해 요법으로 개통될 수 있어서, 그 결과 상기 허혈 근육의 재관류를 이끌어낸다. 재관류가 허혈 근육을 구제하는데 필수적이면서, 재관류 자체는 근육에 추가 손상을 역설적으로 유발시킬 수 있다. 이상적으로, 심장 발작 치료는 발작 중 심근 경색을 최소화시키는 것을 수반할 수 있다. 그러나, 심장 발작의 발생을 예상하기가 통상 어렵기 때문에, 예방 치료가 있을 것 같지 않다. 따라서, 재관류 손상을 완화시키는 (예를 들어, 구급차 또는 응급실에 행해지는) 치료와 병용하는 혈관형성술 및/또는 혈전용해 요법이 더욱 현실적일 수 있다. 재관류 손상을 완화시키는 치료는 심장 발작/허혈의 회복을 향상시키고, 심부전으로 발전할 가능성을 제한할 것으로 예상된다. 심근 경색을 완화하는 치료는 인명을 구조할 것으로 예상되고, 입원 기간을 단축시키고, 생활의 질을 향상시키며, 고위험 환자의 총 의료비를 줄여 줄 수 있다.
불행히, 상기 치료는 현재 이용가능하지 않다. 다양한 치료가 시도되어 왔고, 모두 실패로 나타났다 (Downey 및 Cohen 의 리뷰 참조, Prog Cardiovasc Dis, 48:363-371, 2006). 아스피린, 클로피도그렐, 및 ReoPro® 과 같은 항혈전성 치료개입은 관상 동맥의 폐색/재폐색을 막기 위해 현재 추천된다. 그러나, 이는 재관류 손상에 대해 직접적인 보호를 제공하지 못한다. 아스피린은 사실 내생의 심장보호 통로 일부를 방해할 수 있고, 경색을 증가시킬 수 있다 (Gross 등, J Pharmacol Exp Ther, 310:185-191, 2004).
발명의 요약
본 발명은 혈소판 당단백질 VI (GPVI) 의 억제제, 즉 혈소판 표면에 존재하는 주요 콜라겐 수용체를 투여함으로써 환자의 재관류 손상 및/또는 경색을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 재관류 손상 및/또는 경색 치료용 약제의 제조를 위한 억제제의 용도를 제공한다.
GPVI 는 혈소판 및 거핵세포에서 발현될 뿐이고, 혈관 내피에 가려진 대부분의 혈전형성 (thrombogenic) 매트릭스 단백질 중 하나인 콜라겐과 결합한다. 죽상경화판의 파열, 허혈, 및 재관류 손상은 혈소판을 비롯하여 혈액 성분에 콜라겐을 노출시킬 수 있다. 혈소판 GPVI 와 콜라겐의 결합은 손상된 혈관 부위에서 혈소판의 접착, 이어지는 혈소판 활성 및 응집에 중심 역할을 한다. 혈소판 GPVI 의 억제제는 혈관벽에 발견되는 콜라겐 및 혈소판 GPVI 사이의 상호작용을 차단한다. 앞서 GPVI 억제제가 혈소판 활성을 감소시키는 것을 보여주었고, 본 발명은 직접적인 심장보호 효과를 뜻밖에 제공하며, 재관류 손상 및/또는 경색을 억제하는데 유용하다는 것을 보여준다.
혈소판 GPVI 의 억제제는 항체, 단백질 단편, 또는 소분자 화합물일 수 있다. 항체는 단일클론 항-GPVI 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단일클론 항체는 활성 항체 단편을 포함한다. 활성 항체 단편은 화학적으로, 효소적으로 또는 재조합으로 제조된 Fab 단편 또는 F(ab)2 단편, 또는 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 하나 이상의 상보성 결정 부위 (CDR) 를 포함하는 펩티드 단편일 수 있다. 예시적인 항체는 생쥐 단일클론 항체 OM1, OM2, OM3, 및 OM4 및 이들의 인간화 버전 또는 이들의 활성 단편을 포함한다. 펩티드 단편은 GPVI 및 가용성 GPVI 의 콜라겐-결합 영역을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적인 설명
"경색" 은 일반적으로 동맥 혈액 공급의 상류 방해로 인한 조직의 괴사를 지칭한다. 산소화된 혈액의 부족은 세포를 아사시킨다. 경색은 임의 장기에 영향을 줄 수 있지만, 심장과 같은 대사 활성 및 높은 에너지 요구를 갖는 조직에서 매우 자주 및 더 빨리 (<20-120 분) 발생한다.
본원에서 용어 "심근 경색" 은 보통 심근 부분으로의 심장 혈류의 급격한 감소로부터 발생하는 심근 괴사를 지칭한다. 심근은 손상 없이 허혈을 매우 단기간만 (<5 분) 지속시킬 수 있다. 혈류가 재개하지 않으면 가역적 손상이 일반적으로 5 내지 20 분 사이에서 발생한다. 장기간의 허혈은 보통 영구 손상, 즉 세포사/괴사/경색을 일으킨다. 심근이 재생할 능력이 매우 제한적이기 때문에, 근육 상실이 영구적일 수 있다. "내피 기능부전 (endothelial dysfunction)" 은 허혈 및 재관류로부터 발생하는 정상 기능의 상실 또는 내피 괴사를 지칭한다.
"재관류 손상" 은, 허혈 기간 후 혈액 공급이 조직으로 되돌아갈 때 일어나는 손상을 지칭한다. 혈액에서 산소 및 영양의 부재는, 순환의 복원이 결과적으로는 정상 기능의 복원보다 오히려 산화적 스트레스의 유발을 통해 산화적 손상 및 염증을 일으키는 상태를 만들어낸다. "심근 재관류 손상" 은 심근에서 발생하는 재관류 손상을 지칭하고, "내피 재관류 손상" 은 내피에서 발생하는 재관류 손상을 지칭한다.
본원에서 "환자" 는 경색 및/또는 재관류 손상의 발생률, 가능성, 또는 정도를 감소시키는 치료를 필요로 하는 임의 사람 또는 인간이 아닌 동물을 지칭한다. "환자" 는 또한 관상 동맥 질환 (CAD), 전신성 고혈압, 이판성 대동맥판, 비후형심장근육병증, 또는 승모판탈출증과 같은 심혈관 장애로 진단된 환자; 심장 발작 및/또는 심부전 (울혈심부전 (CHF) 포함)을 경험하거나 경험했던 환자; 및 예를 들어 심장 바이패스 수술 중 관상 동맥 혈류의 일시적 폐색을 필요로 하는 예정 심장 수술을 받는 환자를 포함하는 심장 발작을 겪고 있거나 위험에 노출된 대상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료되고자 하는 인간이 아닌 동물은 마우스, 래트, 토끼, 어류, 조류, 햄스터류, 개, 고양이, 돼지, 말, 소 및 인간이 아닌 영장류를 비롯하여 길들여진 척추동물 및 야생 척추동물 모두를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "억제하다" 는 임의 표현형 특징의 감소 또는 중단, 또는 상기 특징의 발생률, 정도 또는 가능성의 감소 또는 중단을 지칭한다. 따라서, "재관류 손상 및/또는 경색의 억제" 는 재관류 손상 및/또는 경색에서의 측정가능한 감소 또는 중단을 지칭한다.
"혈소판 GPVI 의 억제제" 는 혈소판 GPVI 의 기능을 억제할 수 있는 항체, 단백질 단편, 또는 소분자 화합물을 지칭한다. 혈소판 GPVI 의 기능은 예를 들어 혈관벽에 발견되는 콜라겐과 혈소판 GPVI 의 상호작용을 포함한다. 기타 기능은 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집, 고정된 콜라겐과 혈소판 접착, 콜라겐에 의해 유도된 ATP 분비, 및 콜라겐에 의해 유도된 트롬복산 A2 형성을 포함한다.
용어 "항체" 는 당업계에 잘 공지되어 있고, 단일클론 항체를 포함한다. 본 발명의 단일클론 항체는 화학적, 효소적 또는 재조합으로 제조된 Fab 단편, 또는 F(ab)2 단편, 또는 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 하나 이상의 상보성 결정 부위 (CDR) 를 포함하는 펩티드 단편과 같은 활성 항체 단편을 포함한다. 항-GPVI 항체가 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체와 결합한다면, 상기 항체는 해리 상수 (Kd) 가 10-7 M 이하인 "특이적적인 결합" 이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 항-GPVI 항체는 Kd 10-8 M 이하에서 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체와 특이적으로 결합한다. 추가 구현예에서, 본 발명의 항-GPVI 항체는 Kd 10-9 M 이하에서 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체와 특이적으로 결합한다. 결합 파트너 또는 항체의 친화도는 통상적인 기술, 예를 들어 125I-표지된 IgG 또는 이의 단편의 포화 결합 등온선을 측정하거나, Motulsky 에 의해 [Analyzing Data with GraphPad Prism (1999), GraphPad Software Inc., San Diego, CA] 에 기재된 바와 같은 비선형-회귀 분석을 이용하여 비표지된 IgG 에 의한 125I-표지된 IgG 의 동종 대체에 의한 기술을 이용하여 용이하게 측정될 수 있다. 다른 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Scatchard 등에 의해 [Ann. NY Acad. Sci., 51:660 (1949)] 에 기재된 기술이다.
미국 특허 출원 공개 제 2007/0207155 호에는 단일클론 항체의 제조 및 이들의 인간화가 상세히 기재되어 있다. 미국 특허 출원 공개 제 2007/0207155 호에는 또한 상기 기재된 결합 성질을 갖는 단일클론 항체 OM1, OM2, OM3, 및 OM4 뿐만 아니라 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 하나 이상의 상보성 결정 부위 (CDR) 를 포함하는 펩티드 단편이 기재되어 있다. 게다가, GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체는 미국 특허 제 6,998,469 호 및 미국 특허 출원 공개 제 2007/0207155 호 (이들 둘 모두는 전부 그대로 본원에 참조인용됨) 에 기재되어 있다.
"소분자 화합물" 은 크기가 1500 Da 이하의 유기, 비단백질 화합물을 지칭한다. 소분자 화합물은 합성이거나 천연 추출물로부터 유도될 수 있다. 주요한 구조적 특징은 소분자와 단백질의 결합에 드는 엔트로피 비용을 감소시키는 경질, 다중 고리 코어 구조이다. 본 발명의 소분자 화합물은 혈소판 GPVI 와 콜라겐의 상호작용을 포함하나 이에 한정되지 않은 혈소판 GPVI 의 기능을 억제한다.
상기 논의한 바와 같이, "펩티드 단편" 은 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 하나 이상의 CDR 을 포함하는 펩티드 단편을 포함하고, 이의 예는 미국 특허 출원 공개 제 2007/0207155 호에 개시되어 있다. 기타 펩티드 단편은 GPVI 의 콜라겐 결합 영역을 포함할 수 있다. 전체 GPVI 서열은 [Clemetson 등, J. Biol. Chem. 274:29019-24 (1999)]; WO 00/68377; [Jandrot-Perrus 등, Blood 96:1798-807 (2000)]; 및 [Ezumi 등, Biochem Biophys Res Commun. 277:27-36 (2000)] 에 개시되어 있고, GPVI 에 일차 콜라겐 결합 표면을 나타낸다. [O'Connor 등, J. Biol. Chem. 281(44):33505-10 (2006)]; [Dumont 등, J. Mol. Biol. 361 (5):877-87 (2006)]; [Horii 등, Blood 108(3):936-42 (2006)]; [O'Connor 등, J Thromb Haemost. 4(4):869-73 (2006)]. 게다가, GPVI 의 세포 밖 영역을 포함하는 가용성 GPVI (sGPVI) 는 GPVI 와 콜라겐의 결합을 억제하고, 따라서 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제하는 것으로 나타낸다. [Jandrot-Perrus 등, Blood 96:1798-807 (2000)].
환자의 치료는 약학적 유효량의 혈소판 GPVI 억제제의 투여를 포함한다. 당업계에서 통상의 기술 중 하나는 상기 억제제를 투여하기 위한 최적 투여량 및 투여 계획을 실증적으로 결정할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 약학적 유효량은 환자의 재관류 손상, 경색, 또는 허혈 질환을 억제시키는 양이다.
약학적 유효량은 치료 과정에 걸쳐 단일 투여량 또는 반복 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 억제제는 당업자에게 익숙한 임의 방법, 예를 들어 일시 주입 (bolus injection), 지속 주입, 또는 간헐적 주입에 의한 정맥내 (IV) 투여로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 억제제는 복강내 (IP), 체내, 관절내, 심실내, 척수강내, 근육내 (IM), 피하, 국소, 편도선, 점막, 비강내, 경피, 질내, 경구 또는 흡입으로 투여될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 실증되나, 이는 임의 방식으로 한정하는 것을 의도하지 않는다.
도 1 은 야생형 및 GPVI 녹아웃 마우스의 심근 경색 면적의 비교를 보여준다. 심근 경색은 30 분 허혈 및 24 시간 재관류 후, 야생형 마우스에 비해 GPVI 녹아웃 마우스에서 유의하게 더 작았다. 각 백색 원은 각 마우스의 경색 면적을 나타내고, 흑색 원은 군 평균 ± SD 를 나타낸다. t-시험으로 데이타를 분석하였고, p<0.05 가 통계적으로 유의한 것으로 여겨진다.
도 2a 는 허혈 및 재관류 후 야생형 및 GPVI-녹아웃 마우스의 심근에서 P-셀렉틴 발현의 비교를 나타낸다. 심장내막 및 중간심근의 대표적인 형광 이미지를 나타낸다. 선녹색 (또는 흑백 버전의 도에서 밝은 희끄무레한 색)으로 보여지는 P-셀렉틴 발현은 GPVI-녹아웃 마우스의 심근에서 감소되었다 (어두운 배경의 형광은 심근의 자가형광으로 인한 것이었다). 야생형 마우스 심장 5 개 및 GPVI-녹아웃 마우스 심장 5 개 각각에서 유사한 결과를 얻었다. 도 2b 는 높은 P-셀렉틴 발현을 갖는 구역의 정량을 보여준다. GPVI-녹아웃 (KO) 마우스는 야생형 (WT) 마우스 (n=5) 보다 유의하게 낮은 수준의 P-셀렉틴을 갖고, 이는 GPVI 가 심근에서 혈소판 활성 및 응집을 유도하는데 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
도 3 은 허혈 후 재관류로 인한 야생형 마우스의 심장에서의 콜라겐의 노출을 보여준다. 왼쪽 화면은 30 분 허혈, 이어서 15 분 재관류를 실시한 심장의 대표적인 부분을 나타낸다. 선녹색 (또는 흑백 버전의 도에서 밝은 희끄무래한 색) 은 노출된 콜라겐을 나타낸다 (어두운 배경의 형광은 심근의 자가형광으로 인한 것이었다). 3 마리의 추가 동물로부터 유사한 결과를 얻었다. 오른쪽 화면은 후속 재관류 없이 30 분 허혈에 노출된 심장의 대표적인 부분을 보여준다. 녹색 형광이 아닌 것 (또는 흑백 버전의 도에서 밝은 희끄무래한 색이 아닌 것) 이 명백한데, 이는 콜라겐이 노출되지 않은 것을 나타낸다. 2 마리의 추가 동물로부터 유사한 결과를 얻었다. 이러한 데이타 모두는 내피 손상이 재관류 중 발생하는 것을 나타낸다.
도 4a 는 원숭이에서 항-GPVI 항체 OM2 의 경색-완화 효과를 보여준다. 상기 도는 표시된 치료 군의 각각에 대한 회귀선을 이용하여 위험 지역 대 경색 구역의 산포도를 나타낸다. 대조군 원숭이의 경색은 위험 구역의 면적에 직선적으로 관련하였다. 모든 데이타 지점이 대조군의 회귀선 미만 (p<0.05) 이기 때문에, OM2 로 단일 또는 두배 투여량으로 치료를 한 원숭이는 심근 경색이 감소하였다. 게다가, 단일 또는 두배 투여량으로 치료한 원숭이에서의 감소가 유사한데, 이는 OM2 에 의한 보호가 재관류 기간 중 발생하는 것을 시사한다. 경색 데이타를 분산분석 (ANOVA) 으로 분석하였다. 도 4b 는 OM2 에 의한 원숭이의 혈액에서의 혈소판 응집의 억제를 나타낸다. OM2 투여 (2 ㎎/㎏) 전 (투여 전) 및 후 (투여 4 시간 후) 원숭이로부터 혈액 시료를 추출하였다. 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집은 전혈 응집계를 이용하여 생체외 검정으로 측정하였다. 도 4b 는 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집의 대표적인 측정값을 나타낸다. 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집은 OM2 를 받은 동물의 전혈에서 완전히 억제되었다.
도 2a 는 허혈 및 재관류 후 야생형 및 GPVI-녹아웃 마우스의 심근에서 P-셀렉틴 발현의 비교를 나타낸다. 심장내막 및 중간심근의 대표적인 형광 이미지를 나타낸다. 선녹색 (또는 흑백 버전의 도에서 밝은 희끄무레한 색)으로 보여지는 P-셀렉틴 발현은 GPVI-녹아웃 마우스의 심근에서 감소되었다 (어두운 배경의 형광은 심근의 자가형광으로 인한 것이었다). 야생형 마우스 심장 5 개 및 GPVI-녹아웃 마우스 심장 5 개 각각에서 유사한 결과를 얻었다. 도 2b 는 높은 P-셀렉틴 발현을 갖는 구역의 정량을 보여준다. GPVI-녹아웃 (KO) 마우스는 야생형 (WT) 마우스 (n=5) 보다 유의하게 낮은 수준의 P-셀렉틴을 갖고, 이는 GPVI 가 심근에서 혈소판 활성 및 응집을 유도하는데 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
도 3 은 허혈 후 재관류로 인한 야생형 마우스의 심장에서의 콜라겐의 노출을 보여준다. 왼쪽 화면은 30 분 허혈, 이어서 15 분 재관류를 실시한 심장의 대표적인 부분을 나타낸다. 선녹색 (또는 흑백 버전의 도에서 밝은 희끄무래한 색) 은 노출된 콜라겐을 나타낸다 (어두운 배경의 형광은 심근의 자가형광으로 인한 것이었다). 3 마리의 추가 동물로부터 유사한 결과를 얻었다. 오른쪽 화면은 후속 재관류 없이 30 분 허혈에 노출된 심장의 대표적인 부분을 보여준다. 녹색 형광이 아닌 것 (또는 흑백 버전의 도에서 밝은 희끄무래한 색이 아닌 것) 이 명백한데, 이는 콜라겐이 노출되지 않은 것을 나타낸다. 2 마리의 추가 동물로부터 유사한 결과를 얻었다. 이러한 데이타 모두는 내피 손상이 재관류 중 발생하는 것을 나타낸다.
도 4a 는 원숭이에서 항-GPVI 항체 OM2 의 경색-완화 효과를 보여준다. 상기 도는 표시된 치료 군의 각각에 대한 회귀선을 이용하여 위험 지역 대 경색 구역의 산포도를 나타낸다. 대조군 원숭이의 경색은 위험 구역의 면적에 직선적으로 관련하였다. 모든 데이타 지점이 대조군의 회귀선 미만 (p<0.05) 이기 때문에, OM2 로 단일 또는 두배 투여량으로 치료를 한 원숭이는 심근 경색이 감소하였다. 게다가, 단일 또는 두배 투여량으로 치료한 원숭이에서의 감소가 유사한데, 이는 OM2 에 의한 보호가 재관류 기간 중 발생하는 것을 시사한다. 경색 데이타를 분산분석 (ANOVA) 으로 분석하였다. 도 4b 는 OM2 에 의한 원숭이의 혈액에서의 혈소판 응집의 억제를 나타낸다. OM2 투여 (2 ㎎/㎏) 전 (투여 전) 및 후 (투여 4 시간 후) 원숭이로부터 혈액 시료를 추출하였다. 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집은 전혈 응집계를 이용하여 생체외 검정으로 측정하였다. 도 4b 는 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집의 대표적인 측정값을 나타낸다. 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집은 OM2 를 받은 동물의 전혈에서 완전히 억제되었다.
실시예
1
GPVI 의
결실은 마우스의 심장을 보호한다.
동일 연령대 (age-matched) 의 야생형 및 GPVI 녹아웃 마우스를 1 - 1.5 % 이소플루란으로 마취시키고, 기관내 튜브를 통해 관을 삽입하고, 압력 조정 인공호흡기를 부착하였다. 실내 공기 (100 % 산소로 보충됨, 4:1 부피비) 로 동물을 환기시켰다. 수술을 시작하기 전, 마우스에 젠타마이신 (gentamicin) (0.7 ㎎/㎏ IM) 을 투여하였다. 디지탈 온도계에 연결된 직장 탐색자(probe) 로 체온을 주의 깊게 모니터하고, 전기 담요 및 태양등을 이용하여 실험 내내 37 내지 37.5 ℃ 사이로 유지시켰다. 예비 연구에서, 혈압 측정 및 혈압가스 분석을 위해 경동맥에 카테터를 삽입하였다. 이는 상기 실험 과정을 이용하여 마우스가 생리학적 혈류역학을 유지할 수 있음을 확보하기 위한 것이었다.
해부 현미경을 이용하여, 왼쪽 개흉술을 통해 흉부를 개봉하였다. 8-0 나일론 봉합사 (Ethicon, Inc. Johnson & Johnson Co. Somerville, NJ) 를, 좌심방 끝으로부터 좌전하행관상동맥 2-3 ㎜ 아래에 테이퍼 바늘을 통과시키고, 플라스틱 튜브에 봉합사 끝을 통과시켰다. 관상동맥 폐색은 튜브에 대항하여 봉합사를 당김으로써 유발되었다. 관상동맥 폐색 및 재관류의 성공적인 수행은 허혈 및 재관류 후 허혈의 소실 동안 외관 검사 (즉, 봉합사를 당겨 디지탈 심근에서 옅은 색으로 전개 및 수축 후 충혈로 인한 선홍색의 복귀를 주목함) 를 통해 확인하였다. 허혈을 30 분 지속하였다. 폐색을 해제시킨 후, 층들에서 흉부를 봉합사로 봉합하였다. 케토펜(Ketofen) 투여량 (2.5 ㎎/㎏, IM) 을 주입하였다. 자발적 호흡이 증가하면서, 마우스에서 산소호흡기를 제거하고, 풍부한 산소를 함유한 공기가 있는 온도/습도 조절 유닛에 위치시켰다. 마우스가 정상 자세 능력을 얻은 후, 마우스를 24 시간 동안 케이지로 돌려보냈다.
연구 결과 (2 일째), 마우스에 헤파린 (1 U/g IP) 을 주었고, 이어서 펜토바르비탈 나트륨 (100 ㎎/㎏ IP) 으로 마취시켰다. 심장을 절제하고, Langendorf 장치를 이용하여 대동맥 카눌라 (23-게이지 바늘)을 통해 크렙스-헨설렛 (Krebs-Henseleit) 용액으로 관류시켰다. 경색되고 이어서 재관류된 부위 (위험 부위) 를 기술하기 위해서, 이전의 폐색 부위에서 관상 동맥을 묶고, 대동맥 기부를 생리 식염수 중 형광 입자 (직경 1 - 10 ㎛, Duke Scientific, Palo Alto, CA) 의 1 % 용액으로 관류시켰다 (30 분에 걸쳐 1 ㎖). 상기 과정의 결과로서, 앞서 폐색된 관상 동맥에 의해 공급된 좌심실 (LV) 의 부분 (위험 구역) 을 UV 광에서 형광의 부재로 확인하였고, 반면 LV 의 나머지는 감청색으로 염색되었다. 심장을 20 분 동안 냉동시키고, 이어서 5-7 개의 가로 슬라이스로 절단하였다. 눈에 보이는 심근으로부터의 경색을 기술하기 위해서, 심장 슬라이스를 포스페이트 완충액 (pH 7.4, 37 ℃) 중 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC) 의 1 % 용액에 20 분 동안 인큐베이트시켰다. 상기 슬라이스를 10 % 중성 완충 포름알데히드에 고정시키고, 24 시간 후 사진을 찍었다. 경색, 허혈성-재관류 (위험 구역), 및 비허혈성 부위의 경계를 추적하였다. 컴퓨터화된 면적측정법으로 대응하는 구역을 측정하였고, 상기 측정값으로부터 경색 면적을 위험 구역의 백분율로서 계산하였다.
위험 구역 면적은 야생형 및 GPVI 녹아웃 마우스에서 유사하였다 (각각 0.020 ± 0.004 ㎤ 및 0.022 ± 0.005 ㎤). 야생형 마우스의 경색 구역 (경색 면적) 은 위험 구역의 평균 45 ± 18 % 이었다. 경색 구역 (경색 면적) 은 위험 구역의 평균 22 ± 8 % 으로 GPVI-녹아웃 마우스에서 유의하게 더 작았다. 상기 데이타는 도 1 에 요약하였다.
실시예
2
GPVI
녹아웃 마우스의 심근에서 P-
셀렉틴
발현의 감소
혈소판 α-과립에 저장되어 있고, 활성 중인 혈소판 표면으로 급속히 이동시킬 수 있는 P-셀렉틴의 발현으로 혈소판의 활성을 측정하였다. 면역조직학을 이용하여 P-셀렉틴 발현을 조사하였다.
마우스의 생체내 심허혈 / 재관류: 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 마우스 심장 허혈 및 재관류를 수행하였다. GPVI 녹아웃 및 야생형 마우스에 좌전하행관상동맥 (LAD) 폐색 30 분, 이어서 재관류 15 분을 수행하였다. LAD 의 재관류 15 분 후, 심장을 적출하고, DPBS 를 이용하여 세척하고 나서, 단축 부분을 둘로 절단하고, 즉시 4 % 파라포름알데히드 및 0.1 M 포스페이트 완충액에 담가 조직을 고정시켰다. 2 시간 후, 조직을 밤새 25 % 수크로오즈로 전이시켰다.
P- 셀렉틴 면역형광 검출: 2 일째, 심장 조직을 20 ㎛ 가로단면으로 절단하고, 약 30 분 동안 건조하였다. 각 슬라이드 상의 절편을 PAP 펜 고리로 둘러싸고, 약 10 분 동안 건조하였다. 슬라이드를 0.01 M PBS-0.1 % Triton (PBST) 으로 헹구고, 정상 당나귀 혈청 (10 % NDS, PBST) 으로 30-60 분 동안 실온에서 인큐베이트 시켰다. 토끼 항-마우스 P-셀렉틴 다클론성 항체 (Chemicon International) 를 이용하여 P-셀렉틴을 검출하고, FITC-항-토끼 IgG (Jackson ImmunoResearch lab) 로 시각화하였다.
형광 이미지: Zeiss Confocal 현미경 (LSM510) 또는 통상적인 형광 현미경을 이용하여 형광 이미지를 얻었다. 488 ㎚ 에서 형광이 여기하였고, 540 ㎚ 에서 검출하였다. 30 분 허혈 및 15 분 재관류 후, 높은 수준의 P-셀렉틴을 야생형 마우스의 심근 (심장내막 및 중간심근)에서 검출하였다 (도 2a). 매우 적은 P-셀렉틴 발현이 GPVI-녹아웃 마우스의 심근에서 검출되었다. 발현의 수준을 정량화하기 위해서, 허혈 구역 내에서 진한 녹색 형광으로 구역의 면적을 결정하였다. 데이타는, P-셀렉틴 발현 구역의 총 면적이 야생형 마우스에 비해 GPVI-녹아웃 마우스의 심장에서 유의하게 감소한 것을 보여주었다 (도 2b).
실시예
3
내피
재관류
손상
건강한 혈관을 갖는 정상 심장에서, 긴장된 내피는 혈관벽의 세포 밖 매트릭스에서 콜라겐이 순환 혈액 성분과 접촉하는 것을 방해한다. 허혈 및 재관류 중에서와 같이 내피가 손상된다면, 콜라겐이 노출될 수 있다. GPVI 가 선택적으로 콜라겐과 결합하기 때문에, GPVI 를 사용하여 내피 재관류 손상을 생체내 조사하였다. 이러한 목적을 위해, 재조합 sGPVI 를 형광 태그 FITC (sGPVI-FITC) 로 표지하였고, sGPVI-FITC 를 마우스에 정맥내로 주입하였다. 주입된 sGPVI-FITC 는 내피 손상으로 인해 노출된 콜라겐과 결합하였다. 노출된 콜라겐과 결합한 sGPVI-FITC 의 수준은 형광 현미경 하에서 조직학적으로 결정될 수 있고, 내피 손상에 대한 양을 제공하였다.
심허혈 발증 10 분 전 야생형 마우스에 sGPVI-FITC (2 ㎎/㎏) 을 주입하였다 (30 분). 일부 동물에서, 허혈, 이어서 재관류를 수행하였다 (15 분). 재관류를 겪은 심장에서, 혈관의 유의한 표지를 관찰하였고 (도 3), 이는 내피의 유의한 손상 및 그 결과 순환 혈액 성분에 대한 콜라겐의 노출을 나타낸다. 대조적으로, 재관류를 겪지 않은 심장에서 sGPVI-FITC 으로 혈관의 표지가 관찰되지 않았다 (도 3). 상기 데이타는 허혈 심장 조직의 재관류가 내피 손상을 일으키는 것을 보여준다.
실시예
4
항-
GPVI
항체에 의한 심장보호 효과
체중이 2.0-2.5 ㎏ 인 중국 사이노몰거스 원숭이 (Cynomolgus monkey) 를 사용하였다. 실험에 선택된 원숭이를 밤새 금식시키고 케타민 (10 ㎎/㎏ IM) 으로 진정시켰다. 추가적으로, 아트로핀 (0.05 ㎎/㎏ IM) 을 주입하였다. 정맥내 카테터를 다리 정맥에 삽입하였다. 펜토바르비탈 나트륨 (10-15 ㎎/㎏ IV) 으로 마취시키고, 추가 용량을 실험 내내 투여하였다. 중간 자궁경부 절제를 통해 기관을 노출시키고, 기관내 튜브를 도입하였다. 작은 동물의 인공호흡기 및 40 % O2/ 60 % N2 기체 혼합물의 도움으로 동물을 환기시켰다. 혈압 측정 및 동맥 혈액 시료의 수집을 위해 경동맥에 카눌라를 삽입하였다. 4번째 늑간 사이의 공간에서 왼쪽 개흉술을 수행하였고, 심장을 노출시켰다. 좌전하행관상동맥은 가끔씩 보였지만, 상부 지방에 의해 보통 가려져 있었다. 가능한 동맥의 기원에 가까운 심실간 홈에서 혈관 다발 아래에, 바늘에 끼운 2-0 봉합사를 통과시켰다. 봉합사의 끝을 짧은 길이의 폴리에틸렌 카테터를 무분별적으로 통과시켜 올가미를 형성하였다. 올가미를 10 초 동안 당길 때 심장 전벽의 청색증 및 수축 중단, 그리고 올가미가 풀릴 때 조직 충혈 및 수축의 재개를 관찰함으로써 올가미의 결과를 확인하였다. 미소구체 주입을 위해 좌심방 부속기관 (appendage) 에 카테터를 삽입하였다. ECG 납을 부착하여 심박수 및 QRS 형태를 측정하였다. 전기 담요를 사용하여 원숭이를 38 ℃ 로 가온시키고 직장으로 측정하였다.
20 분 이상 동안 수술 준비의 완료 및 평형화 후, 기준심박수, 혈압 및 ECG 를 기록하고, 관상 동맥을 90 분 동안 폐색하였다. ECG, 심박수, 및 혈압을 연속적으로 모니터하고, 5 분 동안 매분, 10 분, 그리고 폐색이 종결할 때까지 10 분마다 기록하였다. 폐색 기간 마지막에, 올가미를 풀고, 관상 동맥을 재관류시켰다. 다시 ECG, 심박수, 및 혈압을 5 분 동안 매분, 10 분, 그리고 4 시간의 재관류 기간 마지막까지 10 분 마다 기록하였다. 심실 세동이 생긴다면, 전기 세동제거기를 사용하여 리듬을 동조률 (sinus) 로 전환시켰다.
재관류 4 시간 후, 심장을 제거하고, 관류 장치상에서 대동맥 기부에 노출시켰다. 식염수를 역행으로 관류시켜 관상 동맥 및 심장으로부터 혈액을 세척하고, 그리고 나서 관상 동맥을 재폐색시킨 후 재관류에 2-9 ㎛ 녹색 형광 미소구체 (Microgenics Corp., Freemont, CA) 를 첨가하였다. 따라서, 형광 미소구체는 오직 개방 관상 동맥에 의해 관류된 심근에 들어갔고, 위험 구역 (또는 위험 지역) 은 형광 미소구체를 함유하지 않은 심근 구역으로서 경계를 표시하였다. 심장을 드라이 아이스에 넣어 냉동시키고 나서, 심장의 장축과 수직으로 2-3 ㎜ 슬라이스를 절단하였다. 1 % 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC) (GFS Chemicals, Powell, OH) 에 슬라이스를 인큐베이트 시키고, 37 ℃ 에서 8-10 분 동안 가온시키고 나서, TTC 에 의해 착색된 조직 및 비착색된 조직 사이의 색 대조의 개선 및 조직 보존을 위해 10 % 포르말린에 넣었다. TTC 는 온전한 NADH 저장량을 갖는 정상적으로 관류된 조직을 붉은 벽돌색으로 착색시키는 반면, 보조인자가 방출되고 세척된 경색 조직은 비착색되고, 백색 또는 아마도 심근 출혈로부터 흑색이다. 정확히 2 ㎜ 로 분리된 플라스틱 플레이트 사이에 슬라이스를 압축하였다. UV 광에서 확인되는 위험 지역 부위 및 백색광에서 확인되는 경색 부위의 면적을 플라스틱 오버레이 (overlay) 상에서 추적하였다. 면적측정법으로 구역을 측정하였고, 상기 구역에 2 ㎜ 를 곱하여 부피를 계산하였다.
항-GPVI 항체의 투여 없이 관상 동맥 폐색 (90 분) 및 재관류 (4 시간) 를 대조 동물에 실시하였다. 항-GPVI 항체 처리된 군 중 하나에서, 두배 투여량 (각 2 ㎎/㎏) 의 OM2 Fab 단편 (단일클론 마우스 항-인간 GPVI 항체; Matsumoto 등, Thromb Res, 119:319-329, 2007 ; 및 미국 특허 출원 공개 제 2007/0207155 호 참조) 을 동물에 투여하는데, 제1 투여량은 허열 10 분 전에 투여하고, 제2 투여량은 재관류 직전에 투여하였다. 두번째 항-GPVI 항체 처리된 군에서, 면역형광 데이타 (도 1-3 참조) 가 재관류 중 GPVI 의 역할을 지원하기 때문에, 동물은 재관류 직전에 단일 투여량 (2 ㎎/㎏) 의 OM2 Fab 단편을 동물에 투여하였다. 통계적으로 유의한 것으로 여겨지는 <0.05 의 p 값을 이용하여, ANOVA 로 심근 경색을 분석하였다.
경색 면적은 백분율 그래프보다 위험 지역 면적에 대해서 도표화하였다. 이는 대조군 동물의 경색 면적/위험 지역 면적 도표가 원점을 통하지 않기 때문에, 또한 설치류에 대해서는 발견되지 못했기 때문이다 (Ytrehus 등, Am J Physiol, 267:H2383-H2390, 1994). Flameng 등 (Basic Res Cardiol 85:392-403, 1990) 이 개코원숭이에 주목한 바와 같이, 위험 지역 면적이 또한 마카크(macaque) 원숭이에서 경색 면적의 중요한 결정 요인이다. 따라서, 위험 지역이 작을 때, 경색 면적은 임의 치료개입의 부재에서조차 예상대로 작을 것이다. 위험 지역이 0.6 ㎤ 미만일 때, 대조군 원숭이에서 조차 경색은 예상되지 않는다. 경색 면적이 위험 지역 면적에 대해 도표화될 때, OM2 항체 (두배 또는 단일 투여량) 는 오른쪽으로 이동하는 회귀선으로서 유의한 심장보호 효과를 보여주었다. 상기 이동은 동일한 위험 지역 면적에서 OM2-처리된 원숭이가 더 작은 경색 면적을 갖는 것을 보여준다. 두배 투여량 또는 단일 투여량의 OM2 으로 치료된 원숭이에서 보호 정도는 유사하였고, GPVI 를 통한 혈소판-콜라겐 상호작용은 재관류 손상을 유발시키고, 상기 상호작용의 억제는 심장을 보호한다는 것과 일치한다.
OM2 가 상기 원숭이에서 혈소판 활성을 억제하는지를 조사하기 위해서, 혈액 시료를 OM2 투여 전후 추출하였다. 전혈 응집계 (Chrono-log, Corporation, PA) 를 이용하여 생체외 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집을 측정하였다. 혈액을 식염수로 1:1 (v/v) 희석시키고, 응집이 콜라겐 (0.5 ㎍/mL; Horm, Nycomed, 독일) 에 의해 시작되기 전에 응집계에서 혈액을 5-10 분 동안 37 ℃ 에서 인큐베이트 시켰다. 혈액 시료에서 전극의 임피던스의 증가로서 10 분 동안 응집을 모니터하였다 (Aggro/link v 4.75, Chrono-log).
도 4b 는 OM2 투여 전 (투여 전) 및 4 시간 후 (투여 4 시간 후) 취한 혈액 시료에서 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집의 대표적인 측정값을 보여준다. 상기 데이타는 생체외 검정법으로 측정한 바와 같이, 재관류 전에 원숭이에 투여된 OM2 (2 ㎎/㎏) 가 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집을 완전히 억제하였음을 나타낸다. 0.4 ㎎/㎏ 으로 투여된 OM2 는 유사한 억제를 보여주었다 (데이타는 없음).
본 명세서는 본 명세서 내에서 언급된 문헌의 교시를 근거로 완전히 이해되고, 모든 문헌은 전부 그대로 본원에 참조인용된다. 본 발명의 기타 구현예는 명세서를 고려하고 본원에 개시된 발명의 실시로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 명세서 및 실시예는 오직 예시로서 여겨질 뿐이고, 본 발명의 정확한 범주 및 사상은 하기 청구항에 나타내는 것으로 의도된다.
Claims (30)
- 혈소판 GPVI 및 콜라겐 사이의 상호작용을 억제하는 혈소판 당단백질 VI (GPVI) 의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 재관류 손상 및/또는 경색 억제를 필요로 하는 환자의 재관류 손상 및/또는 경색의 억제 방법.
- 제 1 항에 있어서, 재관류 손상 및/또는 경색이 심근 재관류 손상 및/또는 심근 경색인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 재관류 손상 및/또는 경색이 내피 재관류 손상 및/또는 내피 기능부전인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 환자가 심장 발작을 앓는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 환자가 관상 동맥 혈류의 일시적 폐색을 야기하는 예정 수술을 필요로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 억제제가 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 항체인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 항체가 OM1, OM2, OM3, 및 OM4 로부터 선택되는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 항체가 OM2 인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 항체가 인간화된 방법.
- 제 6 항에 있어서, 항체가 화학적, 효소적 또는 재조합으로 제조된 Fab 단편, F(ab)2 단편, 또는 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 하나 이상의 상보성 결정 부위 (CDR) 를 포함하는 펩티드 단편으로부터 선택되는 활성 항체 단편인 방법.
- 제 10 항에 있어서, 활성 항체 단편이 OM1, OM2, OM3, 및 OM4 로부터 선택되는 항체의 단편인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 항체가 OM2 인 방법.
- 제 10 항에 있어서, 활성 항체 단편이 인간화된 방법.
- 제 1 항에 있어서, 억제제가 GPVI 의 펩티드 단편인 방법.
- 제 14 항에 있어서, GPVI 의 펩티드 단편이 GPVI 의 콜라겐-결합 영역인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 펩티드 단편이 가용성 GPVI (sGPVI) 인 방법.
- 재관류 손상 및/또는 경색 치료용 약제 제조를 위한, 혈소판 GPVI 및 콜라겐 사이의 상호작용을 억제하는 혈소판 당단백질 VI (GPVI) 의 억제제의 용도.
- 제 17 항에 있어서, 재관류 손상 및/또는 경색이 심근 재관류 손상 및/또는 심근 경색인 용도.
- 제 17 항에 있어서, 재관류 손상 및/또는 경색이 내피 재관류 손상 및/또는 내피 기능부전인 용도.
- 제 17 항에 있어서, 억제제가 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 항체인 용도.
- 제 20 항에 있어서, 항체가 OM1, OM2, OM3, 및 OM4 로부터 선택되는 용도.
- 제 21 항에 있어서, 항체가 OM2 인 용도.
- 제 20 항에 있어서, 항체가 인간화된 용도.
- 제 20 항에 있어서, 항체가 화학적, 효소적, 또는 재조합으로 제조된 Fab 단편, F(ab)2 단편, 또는 GPVI 폴리펩티드, 펩티드, 또는 이의 자연 발생 변이체에 특이적인 하나 이상의 상보성 결정 부위 (CDR) 를 포함하는 펩티드 단편으로부터 선택되는 활성 항체 단편인 용도.
- 제 24 항에 있어서, 활성 항체 단편이 OM1, OM2, OM3, 및 OM4 로부터 선택되는 항체의 단편인 용도.
- 제 25 항에 있어서, 항체가 OM2 인 용도.
- 제 24 항에 있어서, 활성 항체 단편이 인간화된 용도.
- 제 17 항에 있어서, 억제제가 GPVI 의 펩티드 단편인 용도.
- 제 28 항에 있어서, GPVI 의 펩티드 단편이 GPVI 의 콜라겐-결합 영역인 용도.
- 제 28 항에 있어서, 펩티드 단편이 가용성 GPVI (sGPVI) 인 용도.
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