KR101620942B1

KR101620942B1 - C-펩타이드를 포함하는 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101620942B1
Application number: KR1020147035710A
Authority: KR
Inventors: 하권수; 임영철
Original assignee: 주식회사 아모그린텍; 강원대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2016-05-13
Also published as: EP2881119B1; US20140148386A1; EP2881120A1; CN104640559A; EP2881120B1; KR20150035713A; US9119816B2; US9457063B2; KR101646054B1; US20140128323A1; EP2881120A4; KR20150035714A; CN104602699B; CN104602699A; WO2014025127A1; CN104640559B; WO2014025146A1; EP2881119A1; EP2881119A4

Abstract

본 발명은 C-펩타이드를 이용한, 당뇨성 혈관신생 장애 및 당뇨성 상처치유 장애의 예방 또는 치료 방법, 또는 이를 위한 조성물에 대한 것이다. 본 발명에서 제공하는 C-펩타이드는 내피세포의 화학주성 이동 유발 작용, 손상영역으로의 세포이동 촉진 작용, 모세혈관-유사 네트워크의 형성 촉진 작용 및 ERK1/2 및 Akt의 인산화와 NO 생성 유도 작용억제 등을 통하여 혈관 신생을 촉진할 수 있으므로, 당뇨성 혈관신생 장애에 따른 다양한 당뇨성 합병증의 예방 또는 치료에 널리 활용 가능하다.

Description

C-펩타이드를 포함하는 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION INCLUDING C-PEPTIDE FOR PREVENTING OR TREATING DIABETIC ANGIOGENIC DISORDERS}

본 발명은 C-펩타이드를 이용한 당뇨병 관련 질병의 예방 또는 치료에 대한 것으로, 구체적으로 C-펩타이드를 이용한 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료방법, C-펩타이드를 이용한 당뇨성 상처치유 장애의 예방 또는 치료방법 또는 이를 위한 조성물에 대한 것이다.

당뇨병(diabetes)은 인슐린의 분비 결함 또는 인슐린 작용의 결함에서 기인한 만성 고혈당증(hyperglycemia)의 특징을 나타내는 다중적 병인의 대사장애를 말하며, 혈중의 포도당이 비정상적으로 높은 상태가 장기간 지속될 경우 만성적인 대사장애와 이에 따른 만성적 혈관손상으로 다양한 합병증이 발생한다. 당뇨병에 걸린 후 10년이 지나면 체내의 거의 모든 기관이 손상을 받아 합병증이 유발된다. 특히, 당뇨병 환자에게서는 혈관신생이 조절되지 않는다. 상기 혈관신생은 상처 및 허혈성 조직손상을 회복시키기 위하여 필수적으로 요구되지만, 당뇨병 환자에서는 이러한 혈관신생이 정상적으로 진행되지 않는다. 따라서, 당뇨병 환자에게서 신생혈관 조절장애를 치료하기 위한 방법의 개발이 요구되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 당뇨병 합병증은 혈관내피세포성장인자(VEGF; Vascular endothelial growth factor)와 관련이 있는데, VEGF는 ERK1/2 및 Akt의 인산화와, NO 생성을 유도하여 혈관신생을 촉진하는 한편, 혈관누출인자로서 작용하여 황반부종 등을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 인간의 C-펩타이드(C-peptide)는 인슐린 전구체로부터 절단된 아미노산으로 구성된 펩타이드로서, 순환계에서는 췌장 β-세포에 의하여 인슐린과 동일한 몰농도로 분비된다. 제1형 당뇨병뿐만 아니라 제2형 당뇨병 후기에는 인슐린과 마찬가지로 C-펩타이드가 결핍되고, 이에 따라 주요 합병증으로서 신체의 상처 치유 기능을 손상시킨다. 이러한, 상처 치유 기능의 손상은 전신 감염, 통증, 궤양, 절단에 이르는 합병증을 초래하며, 결국 치사에 이르게 되는 경우도 있다.

이러한 C-펩타이드(C-peptide)는 당뇨병의 진단에 사용되고 있으나, 이를 이용한 당뇨성 혈관신생 장애를 치료하기 위한 방법에 대해서는 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 당뇨성 혈관신생 장애를 치료하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, C-펩타이드를, 생리학적 혈관신생 부전을 방지하거나 또는 당뇨병에서 상처치유를 자극하는데 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 C-펩타이드(C-peptide)를 이용한 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 C-펩타이드(C-peptide)를 이용한 당뇨성 상처치유 장애의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)의 유효량을당뇨성 혈관신생 장애의 발병이 우려되거나, 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 유효성분으로 포함하는, 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)의 유효량을 당뇨성 상처치유 장애의 발병이 우려되거나, 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨성 상처치유 장애의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 유효성분으로 포함하는, 당뇨성 상처치유 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 C-펩타이드를 포함하는 약학조성물은 혈관신생을 촉진하여, 당뇨성 혈관신생 장애로 인한 다양한 당뇨성 합병증뿐만 아니라 당뇨성 상처치유 장애 등 혈관신생을 필요로 하는 다양한 증상의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 C-펩타이드가 HUVECs에서 세포이동과 상처치유를 유도할 수 있음을 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 1a 및 도 1는 트랜스웰 이동성 분석결과를 나타내는데, HUVECs를 Transwell® Permeable Supports의 상부 웰에 접종하고, 하부 웰에 10 ng/ml VEGF 또는 적절한 농도의 C-펩타이드(C-Pep)가 존재한 상태로 12시간 동안 배양한 결과이다.
도 1a는 상기 필터의 하부 면으로 이동한 세포의 영상을 촬영한 결과이며,
도 1b는 상기 이동한 세포를 계수하여(n=3) 화학주성 이동을 정량한 결과이다.
도 1c는, 6웰 배양용기에 포화 배양된 세포층을 손상시키고, 10 ng/ml VEGF 또는 0.5 nM C-펩타이드를 가한 다음 24시간 동안 배양하여, 공초점현미경을 사용하여 영상을 촬영한 결과이며,
도 1d는 손상된 영역으로 이동한 세포를 계수하여(n=3) 정량한 결과로, 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균±표준편차로 표시하였다. *p＜0.05, **p＜0.01, CON: 대조군.
도 2는 C-펩타이드가in vitro 및 in vivo에서 혈관신생을 유도할 수 있음을 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 2a 및 도 2b는 C-펩타이드에 의해 유도된 용량의존적 관형성 분석결과를 나타내는데, 적정 농도의 C-펩타이드(C-Pep)를 포함하는 마트리겔 층에서 24시간 동안 HUVECs를 배양하였다(n=3).
도 2a는 공초점현미경을 이용하여 관형성 영상을 촬영한 결과를 나타내며,
도 2b는 C-펩타이드에 의해 용량의존적 관형성이 유도됨을 확인하기 위하여, 상기 도 2a에서 얻어진 영상으로부터 관의 길이를 측정하여 상대적인 관의 길이(％)를 나타낸 결과이다.
도 2c는 10 ng/ml VEGF 또는 0.5 ng/ml C-펩타이드에 의해 관형성이 유도됨을 나타내는 그래프이며,
도 2d는 in vivo 마트리겔 플러그 분석결과를 나타내는데, 100 ng/ml VEGF 또는 5 nM C-펩타이드를 포함하는 0.5 ml 마트리겔을마우스에 피하주사고(n=8) 7일 후에 마우스로부터 제거한 후 사진기(Sony, Tokyo, Japan)로 촬영하여 나타내었다.
도 3은 C-펩타이드가 HUVECs에서 ERK1/2 및 Akt의 인산화와, NO 생성을 유도함을 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 3a 및 도 3b는 HUVECs에 적정시간동안 10 ng/ml VEGF 또는 0.5 nM C-펩타이드를 처리한 결과를 나타내는데,
도 3a는ERK1/2의 인산화를 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인한 결과로, 단백질의 인산화 수준은 단백질의 총량을 사용하여 정규화하고, 자극되지 않은 대조군 수준(CON)과 비교하여 표시하였다.
도 3b는Akt의 인산화를 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인한 결과로, 단백질의 인산화 수준은 단백질의 총량을 사용하여 정규화하고, 자극되지 않은 대조군 수준(CON)과 비교하여 표시하였다.
도 3c는 HUVECs에 10 ng/ml VEGF 또는 0.5 nM C-펩타이드를 2시간 동안 처리하고, 공지된 방법에 따라, 공초점현미경을 사용하여 세포내 NO 수준을 확인한 결과를 나타내는데, 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균±표준편차로 표시하였다. *p＜0.05, **p＜0.01.
도 4는 다양한 억제제가 C-펩타이드 및 VEGF에 의해 유도된 관형성을 방지함을 나타내는 그래프로,
도 4a는HUVECs를 마트리겔 층 위에 접종하고, 각각의 농도의 L-NAME, PD98058 및 와트마닌의존재하에 0.5 nM C-펩타이드(C-pep)를 처리하고 24-30시간동안 배양하였으며, 공초점현미경을 이용하여 관형성을정량하여, 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균±표준편차로 표시하였다.
도 4b는HUVECs를 마트리겔 층 위에 접종하고, 각각의 농도의 L-NAME, PD98058 및 와트마닌의존재하에 10 ng/ml VEGF를 처리하고 24-30시간동안 배양하였으며, 공초점현미경을 이용하여 관형성을정량하여, 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균±표준편차로 표시하였다.
도 5는 C-펩타이드의당뇨성-상처 치유 장애의 치료효과를 나타낸 그래프로,
도 5a는 건강한 마우스 그룹(healthy; n = 12 per group), 당뇨성 마우스 그룹(diabetic; n = 12 per group) 및 C-펩타이드-투여 당뇨성 마우스 그룹(diabetic+C-pep; n = 12 per group)의 손상부위를, 피부 손상 후 각각 4일 및 10일째에 비교하여 나타낸 그래프이다.**, p＜0.01, N.S. no significant difference.
도 5b는 상기 4-mm-지름-피부 상처를 디지털 사진을 통해 관찰한 결과이다.
도 6은 C-펩타이드가NIH3T3 세포에서 세포 이동 및 VEGF 발현을 유도함을 나타내는 그림이다. 도 6a 및 도 6b는 트랜스웰 이동성 분석결과를 나타내는데, NIH3T3를 Transwell® Permeable Supports의 상부 웰에 접종하고, 하부 웰에1 ng/ml FGF-2 또는 C-펩타이드(C-Pep)가 존재하는 상태로 12시간 동안 배양한 결과이다.
도 6a는 상기 필터의 하부 면으로 이동한 세포의 영상을 촬영한 결과이며,
도 6b는 상기 이동한 세포를 계수하여(n=3) 화학주성 이동을 정량한 결과이다.
도 6c는 상처치유분석 결과로, 6웰 배양용기에 포화 배양된 세포층을 손상시키고, 1 ng/ml FGF-2또는 0.5 nM C-펩타이드를 가한 다음 24시간 동안 배양하여, 공초점현미경을 사용하여 영상을 촬영한 결과이며,
도 6d는 손상된 영역으로 이동한 세포를 계수하여(n=3) 정량한 결과로, 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균±표준편차로 표시하였다. *p＜0.05, **p＜0.01, CON: 대조군.
도 7. C-펩타이드가 상처 부위 주변에서 모근 재생 및 혈관 형성을 증가시킴을 나타내는 도면이다.
도 7a는 정상 마우스(Normal; n=6), 당뇨성 마우스(Diabetic;n=6), 및 C-펩타이드 투여된 당뇨성 마우스(Diabetic+C-peptide; n=6)의 뒷다리로부터 제거된 피부의 대표적 사진을 나타낸다. 사각형으로 나타낸 부분을 확대하여 각 사진의 아래부분에 나타내었다. 모근 및 혈관은 정상 마우스 및 C-펩타이드 투여된 당뇨성 마우스에서 발달되었으나, 당뇨성 마우스에서는 발달되지 않았다 (화살표 부분).
도 7b는 각 마우스의 등쪽 피부의 혈관이 PECAM-1 항체 (위 부분)로 가시된 그림과, 모근이 가시화된 그림이다(중간 부분). C-펩타이드는 모근 및 혈관의 수를 증가시킨다. Scale bar = 200 mm.
도 8은 C-펩타이드유도성 혈관신생 및 당뇨성-상처치유장애 예방의 가능성 있는 신호전달 경로를 나타내는 개략도로서, C-펩타이드는 ERK1/2, Akt 및 NO 생성에 관여하는 경로를 통해 혈관신생을 활성화하며, 혈관신생 강화를 통해 지연된 상처치유를 개선한다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 발명자들은 당뇨병 환자에게서 신생혈관 조절장애 및 이로 인한 당뇨성 상처치유 장애를 치료하기 위한 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, C-펩타이드가 혈관신생에 필수적인 내피세포 이동을 자극하고, 모세혈관-유사 네트워크의 형성을 촉진할 수 있어, 결과적으로 in vitro 및 in vivo에서 C-펩타이드가 혈관신생을 활성화시킬 수 있으며; C-펩타이드가 ERK1/2, PI3K/AKT 및 NO 생성에 관여하는 신호전달 경로를 통해 혈관신생을 자극할 뿐만 아니라, ERK1/2, Akt 및 NO 생성에 관여하는 신호전달이 C-펩타이드유도성 혈관신생에도 관여함을 알 수 있었다.또한, 이러한 C-펩타이드의 혈관신생 작용에 의해 당뇨성-상처 치유 장애가 예방 또는 치료됨을 확인하였다.

이에, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 이용한당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물; 및 당뇨성상처치유 장애의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 첫 번째 실시양태로서, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 이용한 당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)의 유효량을당뇨성 혈관신생 장애의 발병이 우려되거나, 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는,당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 유효성분으로 포함하는,당뇨성 혈관신생 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 C-펩타이드는 용량의존적으로 혈관내피세포와 섬유아세포의 화학주성 이동을 유발시키고(도 1a, 1b, 도 6a 및 도 6b), 손상영역으로의 세포이동을 자극하며(도 1c, 1d, 도 6c 및 도 6d), 용량의존적으로 모세혈관-유사 네트워크의 형성을 자극하고(도 2a 및 2b), 마트리겔에서 신생혈관을 형성할 수 있음을 확인하였으며(도 2d),C-펩티드가 HUVECs에서 ERK1/2 및 Akt의 인산화와, NO 생성을 유도함으로(도 3) VEGF와 동일한 작용에 의해 혈관 신생을 촉진함을 실험적으로 확인하였다. 따라서, 본 발명의 C-펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은당뇨성 혈관신생 장애 예방 또는 치료 방법 또는 이를 위한 약학조성물로서 사용할 수 있다. 이러한 C-펩타이드의당뇨성 혈관신생 장애 예방 또는 치료효과는 인간뿐만 아니라 당뇨성 혈관신생 장애가 발생할 수 있는 모든 동물에서도 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명의 용어 "C-펩타이드(C-peptide)"란, 포유류, 조류 등에서 인슐린과 함께 분비되는 펩타이드로서, 그의 전구체인 프로인슐린은 인슐린과 C-펩타이드로 구성되어 있으며, 인슐린과 같이 췌장의 랑게르한스섬의 β-세포에서 생성되는 것으로, 21 내지 31개의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명에서 C-펩타이드는 인간의 C-펩타이드는 물론, 개, 고양이, 랫트, 침팬지, 마우스, 소, 등을 포함하는 포유류 또는 지빠귀 등을 포함하는 조류의 C-펩타이드를 포함한다.

예를 들어, 인간(Homo sapiens, 서열번호 1), 랫트(Rattusnorvegicus, 서열번호 2) 및 침팬지(Pan troglodytes, 서열번호 3) 유래의 C-펩타이드는 31개의 아미노산 서열로 구성되고, 마우스(Musmusculus, 서열번호 4) 유래의 C-펩타이드는 29개의 아미노산 서열로 구성되며, 소(Bostaurus, 서열번호 5) 유래의 C-펩타이드는 26개의 아미노산 서열로 구성되며, 지빠귀(Turdusmerula, 서열번호 6) 및 붉은발 부비(Sula sula, 서열번호 7) 유래의 C-펩타이드는 21개의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 C-펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 C-펩타이드는 본 발명에서 제공하는 방법 또는 조성물의 유효성분으로서 사용되는데, 상기 방법 또는 조성물은 인간뿐만 아니라, 당뇨성 혈관신생 장애에 의한 질병이 발생할 수 있는 모든 동물에게 적용될 수 있으며, 이때 적용되는 대상동물에서 유래된 C-펩타이드를 사용함이 바람직하다. 예를 들어, 사람을 대상으로 하는 방법 또는 조성물은 유효성분으로서 인간 유래의 C-펩타이드(서열번호 1)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, C-펩타이드가 당뇨병 모델 마우스의 혈관을 신생할 수 있음을 확인하였으며, 따라서 C-펩타이드 또는 C-펩타이드를 포함하는 조성물은 당뇨성 혈관신생 장애 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 용어 "당뇨성 혈관신생 장애"란, 당뇨병에 의한 혈관신생 장애 그 자체를 의미하거나, 당뇨성 혈관신생 장애에 기인한 질환일 수 있으며, 구체적으로, 뇌졸증, 신장질환, 심장질환 및 족부궤양으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있다.

구체적으로, 이와 같은 본 발명의 방법 또는 조성물의 당뇨성 혈관신생 장애에 의한 질병의 예방 또는 치료 효과는, C-펩타이드의 내피세포의 화학주성 이동 유발 작용, 손상영역으로의 세포이동 촉진 작용, 모세혈관-유사 네트워크의 형성 촉진 작용 및 ERK1/2 및 Akt의 인산화와 NO 생성 유도 작용 중 하나 이상에 의한 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법 또는 조성물은 인간뿐만 아니라 당뇨병이 발생할 수 있는 모든 동물에서 나타나는 다양한 당뇨성 합병증의 발병시 수반되는 당뇨성 혈관신생 장애를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은, 약학 조성물로써 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼,시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

아울러, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수도 있다.

한편, 본 발명의 방법 또는 조성물에 있어서의, C-펩타이드 또는 C-펩타이드를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으나, 삼투압 펌프(osmotic pump)를 이용한 피하주사(subcutaneous injection), 피내주사(intradermal injection),정맥주사(intravein injection), 복강주사(intraperitoneal injection) 또는 안구주사(intravitreal injection)에 의해 투여되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 C-펩타이드는, "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양"으로 투여될 수 있다. "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양"이란, 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여경로, 제거 속도, 치료 지속 기간, 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 이러한 "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.

아울러, 본 발명의 방법 또는조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 두 번째 실시양태로서, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 이용한 당뇨성상처치유 장애의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)의 유효량을당뇨성상처치유 장애의 발병이 우려되거나, 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는,당뇨성상처치유 장애의 예방 또는 치료방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 유효성분으로 포함하는,당뇨성상처치유 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 제 2 실시예에 의하면, C-펩타이드는 당뇨병 모델 마우스에서 나타나는 당뇨성 상처치유 장애를 치료할 수 있음을 확인하였고, 따라서, 상기 C-펩타이드 또는 C-펩타이드를 포함하는 조성물은당뇨성상처치유 장애의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 이러한 C-펩타이드의 당뇨성 상처치유 장애 예방 또는 치료효과는 인간뿐만 아니라 당뇨성 상처치유 장애가 발생할 수 있는 모든 동물에서도 동일하게 적용될 수 있다. 본 발명의 용어 "당뇨성 상처치유 장애"란, 당뇨병에 의한 상처치유 장애 그 자체를 의미하거나, 당뇨성 상처치유 장애에 기인한 질환일 수 있으며, 구체적으로, 뇌졸증, 신장질환, 심장질환 및 족부궤양으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있다.

구체적으로, 이와 같은 본 발명의 방법 또는 조성물의 당뇨성 상처치유 장애의 예방 또는 치료 효과는, C-펩타이드의 내피세포의 화학주성 이동 유발 작용, 손상영역으로의 세포이동 촉진 작용, 모세혈관-유사 네트워크의 형성 촉진 작용 및 ERK1/2 및 Akt의 인산화와 NO 생성 유도 작용 중 하나 이상에 의한 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 "C-펩타이드(C-peptide)" "용법" , "투여" , "유효량(약제학적으로 유효한 양)" 등에 대한 일련의 내용은,상기 첫 번째 실시양태에서 설명한 바와 동일하다.

발명의 실시를 위한 형태

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험의 준비

실시예 1-1: 실험동물

6주령 웅성 C57BL/6 마우스를 나라 바이오텍(서울, 한국)에서 입수하였다. 상기 마우스를 12시간 명/암주기로 온도조절 상자에서 사육하였다. 모든 실험은 강원대학교의 실험윤리위원회의 지침에 따라 수행하였다.

실시예 1-2: 세포배양

HUVECs를 공지된 방법에 따라 인간의 제대혈로부터 분리하고, 3-6기 세포를 실험에 사용하였다. 상기 세포를 M199 배양배지(20％ FBS, 3 ng/ml bFGF, 5 U/ml heparin, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin) 포함)를 포함하는 2％ 젤라틴 코딩 커버슬라이드, 디쉬 또는 플레이트에서 접종하고, 37℃를 유지하는 5％ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

ATCC(American Type Culture Collection)로부터 수득된 NIH3T3 섬유아세포(fibroblasts)를 10％ calf serum, 100 U/ml 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 공급된 DMEM 배양 배지에서 배양하였다.

실험을 위해, HUVECs는 저-혈청 배지(M199는 1％ FBS를 처리한 점만 제외하고 상기와 동일하게 처리) 에서 6시간 동안 serum-starved하였고, 10 ng/ml VEGF 또는 다양한 농도의 C-펩타이드로 일정 시간 동안 처리하였다.

NIH3T3 세포는 저-혈청 배지(DMEM은 0.1％ calf serum을 처리한 점만 제외하고 상기와 동일하게 처리) 에서 12시간 동안 serum-starved하였다.

실시예 1-3: 통계분석

하기 각 실시예에서 수득한 데이터는 Origin 6.1(OriginLab, Northampton, MA)을 이용하여 가공하였고, 통계적 유의성은 t-test 및 ANOVA를 이용하여 결정하였다. 이때, p 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 분석하였다.

실시예 2: 혈관신생에 미치는 C-펩타이드의 효과

실시예 2-1: 트랜스웰 이동성 분석(Transwell migration assay)

혈관신생시에는 내피세포의 이동과 모세혈관-유사 네트워크의 형성이 수반된다. C-펩타이드가 혈관신생을 유도할 수 있는지의 여부를 평가하기 위하여, Transwell® Permeable Supports (Costar, Corning, NY)를 이용한 HUVECs 및 NIH3T3 세포의 트랜스웰 이동성 분석을 통하여 C-펩타이드가 내피세포의 이동을 자극할 수 있는지의 여부를 확인하였다.

구체적으로, 필터의 하부면을 2％ 젤라틴용액 5㎕로 코팅하고, 하부 웰에 VEGF 또는FGF-2 또는 C-펩타이드를 포함하는 저혈청배지를 안치시켰다. HUVECs 또는 NIH3T3 세포를 각 웰당 1 × 10⁵ 세포를 포함하는 저혈청 배지200㎕이 분주된 상부 웰에 놓고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 100％ 메탄올을 사용하여 15분 동안 각 세포를 고정하고, 헤마톡실린과에오신으로 염색한 후 건조시켰다. 3회의 임의로 선택된 시험의 이동된 세포의 평균 수치를 a fluorescence inverted microscope(Olympus)를 사용하여 이동 범위로 정량화 하였다.

그 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 실험 결과, C-펩타이드는 용량의존적으로 내피세포의 화학주성 이동을 유발시켰고, 최대 효과를 나타내는 용량은 0.5 nM임을 알 수 있었다(도 1a 및 1b).

실시예 2-2: 상처치유 분석(Wound healing assay)

상처치료 분석을 통해 C-펩타이드가 혈관신생에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 젤라틴이 코팅된 6웰 배양용기에서 HUVECs 및 NIH3T3를 배양하였다. 포화배양된 세포층을 수득하고, 상기 세포층을 저-혈청 배지에서 6시간 동안 starved한 후, 1 μM calcein-AM을 사용하여 30분 동안 염색시키고, 플라스틱 긁개로 손상시켰다. 저-혈청 배지 및 세포 잔해를 제거한 후, VEGF 또는 C-펩타이드가 포함된 저혈청배지 2㎖로 대체시키고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 이동된 세포의 수를 공초점현미경(FV-300, Olympus)으로 수득된 영상으로부터 계수하였다.

그 결과를 도 1c 및 1d에 나타내었다. 상기 결과를 통해, C-펩타이드(0.5 nM)는 손상영역으로의 세포이동을 유의하게 자극함을 알 수 있었다(p＜0.01, 도 1c 및 1d).

아울러, 공지된 바와 같이, VEGF 역시 내피세포의 화학주성 이동과 상처치유를 자극함을 확인하였다(p＜0.01, 도 1).

따라서, C-펩타이드는 내피세포 이동을 자극하며, 이는 혈관신생에 필수적이다.

실시예 3: 관형성 분석(Tube formation assay)

C-펩타이드가 in vito에서 혈관신생을 촉진시킬 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, HUVEC을 이용한 마트리겔 층에서 관형성 분석법을 수행하였다.

공지된 방법에 따라, 성장인자-감소된 마트리겔(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)상에서 HUVECs가 모세혈관-유사 네트워크를 형성하는지의 여부를 확인하였다: 구체적으로, 24웰 배양플레이트를 제조사의 매뉴얼에 따라 마트리겔로 코팅하였다. 한편, HUVECs를 웰당 4 × 10⁵ 세포/웰의 밀도로 마트리겔층 위에 접종한 다음, VEGF 또는 C-펩타이드를37℃에서 24-30시간동안 처리하였다. 반응이 종료된 후, 공초점현미경을 이용하여 결과영상을 촬영하고, 촬영된 결과영상에서 FV-300 소프트웨어를 이용하여 관의 길이를 측정함으로써, 관형성의 수준을 정량분석하여도 2a, 2b 및 도 2c에 나타내었다.

그 결과, 상기 실시예 2의 세포이동성 분석의 결과와 마찬가지로, C-펩타이드는 용량의존적으로 모세혈관-유사 네트워크의 형성을 자극하고, 0.5nM에서 최대효과를 나타내었고(도 2a 및 2b), VEGF는 C-펩타이드의 효과와 유사하게 모세혈관-유사 네트워크의 형성을 유도함을 확인하였다(도 2c).

따라서, C-펩타이드는in vitro에서 혈관신생에 필수적인 내피세포의 이동을 유발시키고, 모세혈관-유사 네트워크의 형성을 촉진할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: in vivo 마트리겔 플러그 분석(Matrigel plug assay)

마트리겔 플러그 분석을 이용하여 C-펩타이드가in vivo에서 혈관신생을 유도하는지의 여부를 확인하고자 하였으며, 이를 위하여, 공지된 방법에 따라 in vivo마트리겔 플러그 분석을 수행하였다.

구체적으로, 100 ng/ml VEGF 또는 5 nM C-펩타이드 및 10U 헤파린을 포함하는 0.5㎖ 마트리겔을 마우스에 피하주사하여, 고형젤 플러그를 형성시켰다. 7일이 경과한 시점에서, 상기 마트리겔 플러그를 피하지역에서 제거하고 사진기(Sony, Tokyo, Japan)로 촬영하여 도 2d에 나타내었다.

그 결과, 마트리겔 플러그를 이식하고 1주일이 경과한 시점에서, C-펩타이드를 포함하는 마트리겔은대조군에 비하여 높은 수준으로 신생혈관을 형성하였고, 이러한 결과는 VEGF 처리결과와 유사하였다(도 2d).

따라서, in vitro 및 in vivo에서 C-펩타이드가 혈관신생을 활성화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: C-펩타이드의 작용과 관련된 세포내 신호전달 기작

실시예 5-1: ERK1/2 및 Akt 인산화에 미치는 C-펩타이드의 효과

ERK1/2 및 Akt의 활성화는 세포이동 및 관형성을 유도하는 혈관신생에서 중요한 역할을 수행하기 때문에, HUVECs에서 ERK1/2 및 AKT의 인산화에 미치는 C-펩타이드의 효과를 확인하고자 하였다.

ERK1/2 및 Akt의 인산화를 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인하였다. 즉, HUVECs를 ice-cold lysis buffer (50 mMTris-HCl, pH 7.5, 1％ Triton X-100, 150 mMNaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 10 g/mL aprotinin, 및 10 g/mL leupeptin)로 처리한 후, 4°C에서 10분 동안 18,000g으로 원심분리하였다. 이에 따라 수득된 세포 분해물(lysates)을 SDS-PAGE 로 전개하였고, 폴리비닐이딘플루오라이드 막으로 전이하였다.

그 후, 단백질 밴드를 X-ray 및 화학 발광 기질에 노출시켜 시각화 하였다(Pierce, Rockford, IL).단백질의 인산화 수준은 단백질의 총량을 사용하여 정규화하고, 자극되지 않은 대조군 수준(CON)과 비교하여 표시하여 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

그 결과, C-펩타이드는 시간의존적으로 ERK1/2 인산화를 증가시키고, 15분에 최대로 자극하였으며, 이러한 ERK1/2 활성화는 60분까지 유지됨을 알 수 있었다(도 3a).

또한, 상기 결과와 유사하게, C-펩타이드는Akt의 인산화를 시간의존적으로 유도할 수 있으며, 그의 최대효과는 15분임을 확인하였다(도 3b).

아울러, VEGF 역시 시간의존적으로 ERK1/2 및 Akt 인산화를 유도함을 알 수 있었다(도 3a 및 3b).

실시예 5-2: NO 생성에 미치는 C-펩타이드의 효과

Akt의 인산화는 VEGF에 의한 NO 생성을 증가시키고, 이는 혈관신생을 매개하는 주요 인자이기 때문에, C-펩타이드가 NO 생성을 자극할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였으며, 이를 위하여 공지된 방법에 따라, DAF-FM DA(diaminofluorescein-FM diacetate, Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 세포내 NO 수준을 측정하였다.

구체적으로, 젤라틴 코팅된 원형 커버슬라이드에서 성장한 HUVECs에 적정시간 동안 VEGF 또는 C-펩타이드를 포함하는 페놀레드가 없는 저혈청 배지를 처리하여 배양하고, 마지막 1시간 동안 2μM DAF-FM DA를 처리하여 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양된 각 세포를 저혈청배지로 세척하고 공초점현미경으로 관찰하였다. 세포내 NO의 수준은 처리된 세포와 처리되지 않은 대조군 세포의 형광강도를 비교하여 측정하고, 측정된 값은 배수차(fold difference)로서 표시하였다.

그 결과, HUVECs를 C-펩타이드로 처리하면 세포내 NO의 수준을 유의하게 증가시킴을 확인하였고(도 3c, p＜0.05), VEGF 처리에 의해서도 세포내 NO의 수준이 증가함을 알 수 있었다(p＜0.01).

실시예 5-3: C-펩타이드유도성 혈관신생에 미치는 ERK1/2, PI3K/Akt 및 NO 생성의 역할

C-펩타이드유도성 혈관신생에서 ERK1/2, PI3K/Akt 및 NO의 역할을 각각 PD98059, 와트마닌(wortmannin) 및 L-NAME(L-NG-nitroarginine methyl ester)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, HUVECs에 의해 C-펩타이드로 자극된 관 형성은 용량의존적으로 ERK1/2의 억제제인 PD98059에 의해 억제되었고, 10μM에서 최대 억제효과를 나타내었으며, PI3K/Akt 억제제인 와트마닌과 NOS의 억제제인 L-NAME 역시 C-펩타이드유도성 관 형성을 용량의존적으로 억제하였다(도 4a).

한편, VEGF-유도성 관형성은 PD98059, 와트마닌 및 L-NAME의 처리에 의해 저해되었다(도 4b).

상기 각 결과를 종합하면, C-펩타이드는 ERK1/2, PI3K/AKT 및 NO 생성에 관여하는 신호전달 경로를 통해 혈관신생을 자극할 뿐만 아니라, ERK1/2, Akt 및 NO 생성에 관여하는 신호전달이 C-펩타이드유도성 혈관신생에도 관여함을 알 수 있었다.

실시예 7: C-펩타이드의당뇨성-상처 치유 장애 치료효과

먼저, 스트렙토조토신(streptozotocin)을 포함하는 100 mM 시트르산 완충액(pH 4.5)을 단회 복강주사(150 mg/kg 체중)하여 당뇨병 모델 마우스를 제작하고, 급성 저혈당성 쇼크를 방지하기 위해 하룻밤 동안 10％ 수크로스를 공급하였다. Accu-Chek Active blood glucose monitor(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 혈당을 측정하고 Uriscan (TD Diagnostics, Young-In, Korea)을 사용하여 당뇨를 측정하여, 스트렙토조토신 주사 2일 후 상기 마우스에서 고혈당증이 유발됨을 확인하였다. 1주일 후의, 16 mM 이상의 비-절식 혈당 수준을 나타내며, 다뇨증이고, 당뇨성인 마우스를 당뇨성으로 정의하며, 이를 실험에 사용하였다. 스트렙토조신 주사 후 2주 후에, 당뇨성 마우스의 그룹에 PBS 내의 C-펩타이드를 함유하는 Alzet mini-osmotic pump 2004 (DIRECT, Cupertino, CA) 를 피하 이식하여,35 pmol/kg/min 의 속도로 2주 동안 공급하였다. 다른 당뇨성 그룹 및 정상 그룹은 sham operations을 수행하였다.

상처의 생성 전에, 마우스의 등쪽 부위 등의 피부를 Veet cream 을 사용하여 면도하였다. 생검펀치를 이용하여 마우스 뒷다리 뒤쪽면에 총-두께 지름 4 mm 의 피부 상처를 생성하고, 상처 치유를 디지털 카메라로 모니터하였다. 상처 크기는 버니어캘리퍼스(vernier calipers)를 사용하여 상처 마진을 투사함에 의해 2일 간격으로 측정하였고, 디지털 카메라로 모니터하였다.

C-펩타이드가 당뇨성 마우스에서 상처 치유를 촉진할 수 있는지 평가하기 위해, C-펩타이드를 35 pmol/kg/min의 전달 속도로 당뇨성 마우스의 피하에 이식된 피하 삼투 미니펌프를 사용하여 투여하였다. 지름 4 mm의 상처가 정상 마우스, 당뇨성마우스 및 C-펩타이드 투여된 당뇨성 마우스의 뒷다리 뒤쪽면에 생성되었다(당뇨성 마우스는 4주 동안 STZ-유도됨). 상처가 생긴 당뇨성 마우스는 정상 마우스에 비해 매우 느린 상처 회복 속도를 나타냈다. 그러나, 삼투성 펌프를 사용하여 C-펩타이드가 공급된 당뇨성 마우스에서는 정상 마우스와 비교하였을 시, 피부 상처 발생 후 4 및 10일째에, 상처부위에 별다른 차이가 없었다 (도 5a. 반면에 정상, 당뇨성 및 C-펩타이드 투여 당뇨성 마우스를 비교하면, 4일째 및10일째에 매우 큰 차이가 있음을 알 수 있다 (도 5b).

실시예 8:C-펩타이드의섬유아세포 이동 활성화 효과

화학주성 섬유아세포 이동에 대한 C-펩타이드의 역할을 평가하기 위해, C-펩타이드를 NIH3T3 세포에 12시간 동안 처리하였다. C-펩타이드는섬유아세포의 화학주성 이동을 용량-의존적으로 촉진하였으며, 1 nM에서 최대 효과를 나타내었다 (도 6a및 도 6b).

C-펩타이드-촉진된 세포 이동은 상처-치유 분석으로 추가 측정되었다. C-펩타이드(0.5 nM)는 상처 부위로의 세포이동을 유의하게 촉진하였다 (p＜0.01; 도 6c 및도 6c). FGF-2역시섬유아세포에서의 화학주성 이동 및 상처 치유를 촉진하였다 (p＜0.01; 도 6). 따라서, C-펩타이드는섬유아세포 이동을 촉진하며, 이는 상처 입은 피부의 상처-치유 과정에서 필수적이다.

실시예 9: C-펩타이드의 모근 재생 및 혈관 형성 촉진 효과

C-펩타이드의 모근 재생 및 혈관 형성 촉진 효과를 관찰하기 위해, 총량 면역 염색법(Whole-mount immunostaining)을 이용하여 실험을 수행하였다. 즉, 상처발생 후 14일 경과 후, 마우스를 희생시킨 후, 모근 및 혈관을 관찰하기 위해 마우스 등의 피부를 제거하였다. 모든 죽은 마우스로부터의 피부 조직을 그 치료 부위의 손상을 막기 위하여 가위를 사용해 제거하고, 제거된 피부 조직을 바로 PBS 내의 4％ paraformaldehyde로 overnight 동안 고정하고, -20℃ 의 메탄올에 overnight 동안 보관하였다. 면역조직화학을 위하여, 조직 샘플은 TBS 내의 0.1％ TritonX-100 의 2％ BSA 로 블록하였으며, 염소-다중클로날 혈소판 내피 세포 부착 분자-I 항체와 함께 2일 동안 배양하였고, 그 후 Alexa-546-conjugated rabbit anti-goat IgG 를 사용하여 overnight하며 탐지하였고, 공초점 현미경으로 관찰하였다.

실험 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7을 참고하면, 당뇨성 마우스의 상처를 둘러싼 피하 조직에서의 모근 및 혈관의 수는 사진(도 7a) 및 PECAM-1 염색 (도 7b)에 의해 평가된 정상 마우스의 경우에 비해 유의하게 적음을 확인할 수 있다. 또한, C-펩타이드 투여된 마우스 피부는, 당뇨성 마우스에 비하여 상처의 치유 촉진과 함께, 모근 재생 및 혈관 형성의 유의한 증가를 나타내었다.

이러한 결과는 C-펩타이드가 당뇨성 상처 치유 장애, 특히 미소순환계가 손상된 당뇨병 환자에 있어서의, 당뇨성 상처 치유 장애 치료에 매우 우수한 치료적 가치를 가짐을 알 수 있다.

<110> KANGWON NATIONAL UNIVERSITY UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION AMOGREENTECH CO., LTD. <120> Composition comprising C-peptide for preventing or treating the diabetic impaired angiogenesis <130> FC13059PCK <150> US 61/680,184 <151> 2012-08-06 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> C-peptide of Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> C-peptide of Rattus norvegicus <400> 2 Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Pro Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Glu Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> C-peptide of Pan troglodytes <400> 3 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln 20 25 30 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> C-peptide of Mus musculus <400> 4 Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Glu Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gln Thr Leu Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln 20 25 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> C-peptide of Bos taurus <400> 5 Glu Val Glu Gly Pro Gln Val Gly Ala Leu Glu Leu Ala Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Pro Pro Gln 20 25 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> C-peptide of Turdus merula <400> 6 Ser Gly Pro Leu His Gly Glu Leu Gly Glu Leu Pro Phe Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Phe Glu Lys Val 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> C-peptide of Sula sula <400> 7 Ser Gly Pro Leu His Gly Glu Val Gly Glu Leu Pro Phe Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Phe Glu Lys Val 20

Claims

C-펩타이드(C-peptide)를 포함하는 당뇨성 혈관신생 장애에 의한 족부궤양의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 C-펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 족부궤양의 예방 또는 치료는 C-펩타이드의 내피세포의 화학주성 이동 유발 작용, 손상영역으로의 세포이동 촉진 작용, 모세혈관-유사 네트워크의 형성 촉진 작용 및 ERK1/2 및 Akt의 인산화와 NO 생성 유도 작용 중 하나 이상에 의한 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 C-펩타이드(C-peptide)는 mini-osmotic pump를 이용한 피하주사법으로 30 내지 36.5 pmol/kg/min 1회 투여가능한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 인간의 치료를 위한 것인 조성물.
C-펩타이드(C-peptide)를 포함하는 족부궤양의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 C-펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서,
상기 족부궤양의 예방 또는 치료는 C-펩타이드의 내피세포의 화학주성 이동 유발 작용, 손상영역으로의 세포이동 촉진 작용, 모세혈관-유사 네트워크의 형성 촉진 작용 및 ERK1/2 및 Akt의 인산화와 NO 생성 유도 작용 중 하나 이상에 의한 것인 조성물.
제6항에 있어서,
상기 C-펩타이드(C-peptide)는 mini-osmotic pump를 이용한 피하주사법으로 30 내지 36.5 pmol/kg/min 1회 투여가능한 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 인간의 치료를 위한 것인 조성물.