KR101881662B1 - 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제를 포함하는 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of diabetic complications and screening method for agent for preventing or treating diabetic complications}
본 발명은 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
고혈당증 및 후속 대사 변화는 혈관의 점진적 손상과 장애로 인한 당뇨 합병증으로 발전된다. 특히, 당뇨성 망막증은 혈관 누수에 의해 유발되는 주요 미세 혈관 합병증 중 하나이며 성인 실명의 주요 원인이다. 당뇨성 망막증은 초기 단계의 비증식성 당뇨성 망막증과 후기 단계의 증식성 당뇨성 망막증을 포함하는 두 개의 병원성 프로세스를 가진다. 비증식성 당뇨성 망막증에서, 망막 혈관은 지속적인 고혈당에 의해 손상되고, 이에 따라, 혈류 변화, 망막 혈관 주위 손실, 동맥류, 기저막 비후 및 혈관 누출이 초래된다. 증식성 당뇨성 망막증 단계에서, 다수의 혈관이 폐쇄되고, 저산소증으로 인한 신혈관 형성이 시작되며, 망막 박리에 의해, 심각한 시력 손상이 발생한다. 따라서, 당뇨성 망막증의 억제를 위해, 초기 단계의 혈관구조 변화와 누출의 방지가 필요하다.
당뇨성 망막증 초기 단계의 망막 혈관 누출은 주로 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-매개성 스트레스 섬유 형성 및 혈관 내피 (VE)-카데린 붕괴에 의해 야기된다. 망막증은 거의 모든 제 1형 당뇨병 환자 및 제 2형 환자의 > 60 %에서 발생한다. 고혈당 상태에 의한 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 그 수용체의 상향 조절은 세포내 활성 산소 종 (ROS) 수준을 증가시킨다. 세포내 ROS의 생성은 미세 섬유 재조직화를 통해, VE-카데린의 내재화 및 안정성의 손실을 직접적 또는 간접적으로 초래한다. 그러나, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 혈관 완전성 붕괴를 유도하는 분자 메커니즘은 명확히 밝혀지지 않았다.
또한 조직 트랜스글루타미나제로 알려진 트랜스글루타미나제 2 (TGase 2)는 TGase 패밀리의 구성원으로서, Ca2 + 의존적 방식의 글루타민 잔기의 리신 잔기로의 아미노기 전이 반응을 통한 단백질 가교 반응을 촉매한다. TGase 2는 도처에서 발현되며, 세포 사멸, 증식, 세포 접착, 이동 및 세포 골격 재조직화를 포함한 다양한 세포 과정에 관여한다. TGase 2는 또한 심혈관 질환, 염증, 소아 지방 변증, 신경 퇴행성 질환, 및 출혈성 또는 허혈성 뇌졸중을 포함한 다양한 질환에 관련된다. TGase 2는 망막 및 렌즈를 포함한 안구 조직에서 발현되며, 백내장 및 녹내장을 포함한 안구 질환에 관여할 수 있다. 그러나, 망막증을 포함한 미세 혈관 당뇨병 합병증의 발병에 관여하는 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할은 전혀 알려져 있지 않다.
이에, 본 발명자는, 망막증을 포함한 미세 혈관 당뇨병 합병증의 발병에 관여하는 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
Bhatt MP, Lim YC, Ha KS. C-peptide replacement therapy as an emerging strategy for preventing diabetic vasculopathy. Cardiovasc Res 2014;104:234-244
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 망막증을 포함한 미세 혈관 당뇨병 합병증의 발병에 관여하는 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 규명하여 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제를 포함하는 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2)의 활성 억제를 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 TGase 2가 당뇨성 혈관병증뿐만 아니라 당뇨성 혈관 투과성 등의 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증에 있어서 핵심 효소임을 밝혔으며, 본 발명의 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 이용하여, TGase 2를 당뇨 합병증 및 안구 질환의 치료를 위한 강력한 치료표적으로 활용 가능하다.
도 1은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 TGase 2 활성화는 HREC에서 세포내 Ca2+ 및 ROS 수준의 증가에 의해 매개됨을 나타내는 도이다. (Acitivity 활성; Control 대조군;Incubation time 인큐베이션 시간;Intracellular 세포내; Fold 배수; Generation 생성)
도 2. TGase 2 저해제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 스트레스 섬유 형성, VE-카데린 붕괴 및 내피 세포 단층 투과성을 억제함을 나타내는 도이다. (Distance 거리; Cadherin 카데린; Dextran passage 덱스트란 통과)
도 3은 TGase 2 siRNA는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 저해함을 나타내는 도이다.
도 4는 TGase 2 및 cSrc의 저해제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 β-카테닌 붕괴 및 내피 세포 투과성을 억제함을 나타내는 도이다. (Dasatinib 다사티닙)
도 5는 당뇨병의 마우스 망막에서, 생체내 TGase 2 활성의 증가 및 C 펩타이드 또는 다양한 저해제의 유리체내 주입에 의한 그의 저해를 나타내는 도이다. (Ststyemic delivery of BAPA by left ventricle injection 좌심실 주입에 의한 BAPA의 전신 전달; Retina 망막; Probing with FITC-conjugated streptavidin FITC-접합 스트렙타비딘에 의한 프로빙; Imaging by confocal microscopy 공초점 현미경에 의한 이미지화; Normal 정상; Diabetic 당뇨병)
도 6은 TGase 2 저해제의 유리체내 주입은 당뇨병 마우스의 혈관 누출을 억제함을 나타내는 도이다.
도 7은 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입은 당뇨병 마우스 망막에서, 생체내 TGase 활성화, 혈관 누출 및 TGase 2 발현을 억제함을 나타내는 도이다.
도 8은 당뇨병 TGase 2-/- 마우스 망막에서의 TGase 2 활성화 및 혈관 누출 없음 및 당뇨성 망막증에서 TGase 2의 역할에 대한 개략도이다. (Non-diabetic 비당뇨병; Hyperglycemia 고혈당증; Expression 발현; Reactive oxygen species production 활성 산소 종 생성; Activation 활성화; Stress fiber formation 스트레스 섬유 형성; Disruption 붕괴; Vascular leakage 혈관 누출; Diabetic retinopathy 당뇨성 망막증; Mice 마우스)
도 9a는 TGase 2-/- 마우스의 유전체 검사. 3주령 마우스의 꼬리에서 DNA를 채취하여 특정 위치 PCR 실험을 통해 + 또는 - 대립유전자 사이에 다른 밴드 사이즈를 나타낸 결과이다(Forward 1 primers= 정상 유전자 형질(WT, 465bp, +)을 나타냄, Forward 2 primers= 유실된 유전자 형질(null, 427bp, -)을 나타냄.).
도 9b는 TGase 2-/- 마우스의 임상 데이터를 나타낸다.
도 10a는 정상 마우스와 스트렙토조토신 당뇨병 마우스 망막 혈관 에서 생체내의 TGase 2 활성을 나타낸다.
도 10b는 정상 마우스와 스트렙토조토신 당뇨병 마우스에서 FITC-덱스트란의 혈관외 유출을 평가하기 위해 당뇨병 마우스의 대측성 눈에 PBS 주입한 결과이다(Scale bar, 150 μm).
도 11은 시스테아민과 도파민의 구조이다.
도 12a는 도파민의 DPPH scavenging 활성도 효과 실험 결과에 관련한 도면이다.
도 12b는 시스테아민의 DPPH scavenging 활성도 효과 실험 결과에 관련한 도면이다.
도 12c는 도파민의 농도 의존적 TGase 2 활성 억제 효과에 대한 도면이다.
도 12d는 시스테아민의 농도 의존적 TGase 2 활성 억제 효과에 대한 도면이다.
도 13a는 도파민의 혈관내피세포에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유발 활성산소 억제 효과에 대한 도면이다.
도 13b는 도파민의 TGase 2 활성화 억제 효과에 대한 도면이다.
도 13c는 시스테아민의 혈관내피세포에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유발 활성산소 억제 효과에 대한 도면이다.
도 13d는 시스테아민의 TGase 2 활성화 억제 효과에 대한 도면이다.
도 14는 당뇨병 마우스 망막에서 도파민과 시스테아민의 유리체 주입에 의한 생체내(in vivo) TGase 2 활성도 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 15는 도파민과 시스테아민의 유리체내 주입에 의한 당뇨병 마우스 망막에서 혈관누수 억제 효과를 나타내는 도면이다.
본 발명에서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 당뇨병 마우스의 망막에서 접착 결합 붕괴 및 혈관 누출을 유도하는 분자 메커니즘을 규명하였다. 구체적으로, 본 발명자는 ROS 증가에 의한 TGase 2 활성화가 당뇨성 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도 혈관 누출에 주요 역할을 한다고 가정하여, 마우스 망막에서의 생체내 TGase 2 활성 분석을 설계하고, 고혈당이 당뇨병성 망막에서 TGase 2를 활성화시켜, 혈관 누출을 유도한다는 것을 입증하였다. TGase 2 저해제 또는 TGase 2 siRNA는 인간 망막 내피 세포 (HREC)에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도 스트레스 섬유 형성 및 VE- 카데린 붕괴를 억제하였다. 본 발명의 시험관내 연구 결과는 스트렙토조토신 유도 당뇨병 마우스를 사용하여 검증하였다. 또한, 당뇨성 망막에서 생체내 TGase 2 활성이 증가하고, TGase 2 저해제 및 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입이 당뇨성 망막에서 고혈당으로 유도된 TGase 2 활성 및 혈관 누출을 억제한다는 것을 실험적으로 입증하였으며, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 유도로 인한 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 당뇨병 TGase 2-/- 마우스에서 추가로 입증하였다. 이와 같은, 본 발명의 실험결과는 TGase 2가 당뇨성 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도에 의해 혈관 완전성 붕괴 및 혈관 누출에서 중추적인 역할을 한다는 것을 시사한다.
이하, 본 발명을 구성별로 상세히 설명한다.
본 발명은, 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제를 포함하는 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
본 발명자는, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 세포 내 Ca2 + 및 ROS 수준의 순차적 증가에 의해 TGase 2를 활성화시키고, 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 통해 혈관의 손상을 유도한다는 것을 실험적으로 밝혀냈다. ROS 매개 TGase 2 활성화는 당뇨병 마우스 내피 세포의 혈관 에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 인해 혈관 붕괴 및 망막의 고혈당증-유도와 미세혈관 누출에 있어서 중추적인 역할을 하였다. 따라서, TGase 2는 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 또는 TGase 2-관련 안구 질환을 치료하기 위한 잠재적 치료 표적이 될 수 있음을 확인하였으며, 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제를 포함하는 약제학적 조성물이 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 및 치료에 유용함을 확인하였다.
본 발명의 상기 당뇨성 합병증은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 유도된 혈관의 붕괴에 의한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 당뇨성 합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 심혈관계 질환, 당뇨성 뇌졸중, 당뇨성 신장증, 당뇨성 말초신경증 및 당뇨성 암전이 중 어느 하나일 수 있으며, 당뇨성 망막증인 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증은 고혈당증에 의해 유도된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 TGase 2 활성을 억제하는 모든 물질을 포함하며, TGase 2-특이적 siRNA 또는 C 펩타이드일 수 있다. 또한, 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 TGase 2 의 메커니즘을 억제하는 방식에 따라, 경쟁적 억제제, 가역적 억제제, 비가역적 억제제의 세가지로 분류할 수 있으며, 본 발명의 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 상기 경쟁적 억제제, 가역적 억제제, 비가역적 억제제 모두를 포함한다. 경쟁적 억제제로는 푸트레신(putrescine), 5-(바이오틴아미도)펜틸아민, 모노단실 카다베린(monodansyl cadaverine;MDC), 시스타민(cystamine), 도파민 (dopamine), 시스테아민(cysteamine) , 2-머캅토에틸아민(2-mercaptoethylamine;MEA), 에탄올아민 (ethanolamine), 스페르미딘(spermidine), 히스타민(histamine), 및 플루오레세인 카다베린(fluorescein cadaverine) 중 하나 이상일 수 있으며, 가역적 억제제는 GTP, GMP-PCP, GTPγS, GDP, LDN-27219, [2-(phenylethynyl)-3-(2-(pyrrolidin-1-yl)ethoxy) quinoxaline;GK13], 및 [2-(phenylethynyl)-3-(2-(pyridin-2-yl)ethoxy) pyrido[3,2-b]pyrazine];GK921] 중 하나 이상일 수 있으며, 비가역적 억제제는 요오도아세트아미드(iodoacetamide), 3-헤일로-4,5-디하이드로이소옥사졸 (3-halo-4,5-dihydroisoxazles, 벤질옥시카르보닐-L-글루타민일글라이신(carbobenzyloxy-L-glutaminylglycine;Cbz-gln-gly), β-unsaturated amides, 에폭시드(epoxides), 1,2,4-티아디아졸(1,2,4-thiadiazoles), 말레인이미드(maleinimides), 클로로아세트아마이드(chloroacetamides), 글루텐 펩타이드 시퀀스 (gluten peptide sequence), factor XIIIa 저해제, 및 2-[(2-oxopropyl)싸이오 이미다조늄 파생물 2-[(2-oxopropyl)thio imidazolium derivates] 중 하나 일 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 모노단실 카다베린(monodansyl cadaverine;MDC), 시스타민, 시스테아민, 도파민(dopamine), 에타놀아민(ethanolamine), C 펩타이드 및 TGase 2-특이적 siRNA 중 하나 이상인 것이 바람직하다.
저 분자량 저해제가 TGase 2 아미노기 전이활성을 억제하는 것으로 보고된 바 있으며, 생체내에서 가장 광범위하게 이용되는 TGase 2 저해제는 시스타민이다. 시스타민은 신증 시스틴증의 각막 결정 치료에 이용되고 있다. 시스타민은 헌팅톤병 및 낭포성 섬유증에 대한 임상 실험에 사용된 바 있다. 본 발명을 통해 시스타민과 모노단실 카다베린이 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 증가한 ROS 생성 및 TGase 2 활성화를 억제하여 망막에서 혈관 누수를 억제하는 효과를 입증하였다.
또한, 신경전달물질인 도파민(dopamine)은 인체 내에서 신경세포를 보호 하는 효과가 있으며, 트란스글루타미나제 2(TGase 2)를 억제 하는 효과를 갖는다. 본 발명은 도파민이 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 증가되는 ROS 생성과 TGase 2활성을 저해하여 혈관 누수를 억제하는 효과를 가짐을 입증하였다.
도11 에서 보여지는 바와 같이, 시스테아민은 시스타민의 모노머(monomer) 또는 환원된 형태(reduced form)으로 항산화 효과 및 트란스글루타미나제2(TGase 2)를 억제하는 효과를 동시에 갖는다. 본 발명은 시스테아민이 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 증가되는 ROS 생성과 TGase 2활성을 저해하여 혈관 누수를 억제하는 효과를 가짐을 입증하였다.
이에, 본 발명자는 당뇨병성 망막증 초기 단계인 혈관 누출에 생체 내(in vivo) TGase 2 활성 분석과 혈관 누출 연구를 통해 트랜스글루타미나제 2 (TGase 2)가 핵심 효소임을 밝혔으며, 시스타민, 모노단실 카다베린, 도파민(dopamine)과 시스테아민(cysteamine)이 망막에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 증가되는 활성산소와 TGase 2 활성화를 저해함으로써 혈관 누수를 억제한다는 것을 입증하였다.
상기 siRNA 는 5'-AAGAGCGAGAUGAUCUGGAAC-3'의 서열(서열번호 1)을 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 TGase 2-특이적 siRNA는 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 또는 기타 TGase 2-관련 안구 질환의 예방에 있어서, 안구에 국소적으로 적용될 수 있는 또 다른 표적 분자일 수 있다.
상기 C 펩타이드는 EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ 의 서열(서열번호 2)을 갖는 것일 수 있다. 특히, 상기 C 펩타이드는 인간 C 펩타이드일 수 있으며, 상기 인간 C 펩타이드는 인슐린과 등몰 농도로 β-세포로부터 미세 순환계로 방출되는 31-아미노산 펩타이드이다. C 펩타이드는 마우스 대동맥에서 ROS 매개 TGase 2활성화 및 내피성 세포 사멸을 억제하여, 당뇨성 혈관 병증을 억제한다. C 펩타이드는 또한, 당뇨병 마우스 망막에서 ROS 매개 스트레스 섬유 형성 및 VE- 카데린 붕괴를 억제하여 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 매개 미세 혈관 투과성을 억제한다. 본 발명에서, C 펩타이드의 유리체내 주입이 당뇨성 망막에서 TGase 2의 ROS-매개 활성화를 억제한다는 것을 입증하였다. 따라서, C 펩타이드는, ROS와 TGase 2를 포함하는 세포내 사건을 저해하여, 당뇨성 혈관 병증과 망막증에 유익한 효과를 제공 할 수 있다 (도 5c).
상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 TGase 2가 활성화 되는 것을 저해하는 것일 수 있으며, 상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는, TGase 2에 의한 혈관의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 붕괴 및 망막의 미세혈관 누출을 저해하는 것일 수 있다.
상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 항산화 효과를 갖는 것일 수 있다.
내피 세포에서, 접합 결합부는 VE-카데린 및, β-카테닌을 비롯한 다수의 단백질 파트너로 이루어진다. VE-카데린은 β-카테닌과 직접 상호작용하며, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 그의 티로신 인산화 및 후속 해리에 의해, 접합 결합부 붕괴를 유도한다. 난소 암세포에서, TGase 2는 결국 β-카테닌을 인산화시키고, E-카데린으로부터 β-카테닌을 방출시키는 c-Src를 집합시킨다. 따라서, 본 발명자는, β-카테닌 및 c-Src이 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 접합 결합부 붕괴 및 혈관 누출에 참여할 수 있는지 여부를 시험하였다. 본 발명에서, TGase 저해제 시스타민은 HREC에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 c-Src 인산화, β-카테닌 분해 및 내피 투과성을 저해하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 c-Src 인산화를 차단하는 다사티닙은 또한 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 β-카테닌 분해 및 내피 투과성을 억제하였다. 이러한 결과는, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 c-Src 인산화, VE-카데린 으로부터의 β-카테닌의 해리 및 후속 접합 결합부의 분해를 포함한 TGase 2-매개 세포내 사건을 통해, 내피 세포의 혈관 누출을 유도한다는 것을 제시한다.
한편, 본 발명의 조성물은, 약학 조성물로써 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
아울러, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수도 있다.
한편, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으나, 삼투압 펌프(osmotic pump)를 이용한 피하주사(subcutaneous injection), 피내주사(intradermal injection), 정맥주사(intravein injection), 복강주사(intraperitoneal injection) 또는 안구주사 (intravitreal injection)에 의해 투여되는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물 또는 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는, "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양"으로 투여될 수 있다. "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양"이란, 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여경로, 제거 속도, 치료 지속 기간, 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 이러한 "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
아울러, 본 발명의 방법 또는 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
특히, 사람의 당뇨성 망막증 예방 또는 치료를 위한 경우, 본 발명의 조성물의 안구주사법을 이용한 1회 투여량은 C-peptide 0.03 μg 내지 30μg, 시스타민 0.11 mg 내지 112.6 mg, 모노단실 카다베린 0.06 mg 내지 66.5 mg, 도파민 0.96 μg 내지 962.5 μg, 시스테아민 0.39 mg 내지 394 mg, TGase 2 siRNA 0.66 nmol 내지 660 nmol 정도일 수 있다. 또한 osmotic pump, 피하주사, 정맥주사, 복강주사 등을 이용한 억제제의 혈중 농도는 C-peptide 0.01nM 내지 10 nM, 시스타민 0.5 μM 내지 500 μM, 모노단실 카다베린 0.2 μM 내지 200 μM, 도파민 0.005 μM 내지 5 μM, 시스테아민 0.005 mM 내지 5mM, TGase 2 siRNA 1 nM 내지 1000 nM 정도일 수 있다. 그러나 사용량이 상기의 범위에 한정되는 것은 아니며, 상기 하루 사용량의 범위 내에서, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있음은 물론이다.
상기 투여량은 마우스와 사람 눈의 크기는 3mm, 24mm 이며 부피 기준으로 512배이기 때문에 사람의 안구 투여량은 마우스 투여량에 512배를 한 것이며 사람 안구 투여범위는 투여량의 1/100 내지 10배로 산정하였다. osmotic pump, 피하주사, 정맥주사, 복강주사 등을 이용한 억제제의 혈중 농도 범위는 세포에 처리한 농도의 1/100 내지 10배로 산정하였다.
또한, 본 발명은 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2)의 활성이 억제되는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 활성 저해능을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. TGase 2는 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 또는 TGase 2-관련 안구 질환을 치료하기 위한 잠재적 치료 표적이 될 수 있으며, TGase 2의 활성을 억제하는지 여부를 측정하여 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2)의 활성이 억제되는지 여부를 측정하는 단계는 당뇨가 진행된 후 초기단계인 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증의 증식성 단계에서 확인 할 수 있다. 상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2)의 활성이 억제되는지 여부와 활성 제해능를 검출하는 수단으로, (FITC-접합 스트렙타비딘의 형광 강도를 측정 함으로써, TGase 2 활성을 공초점 현미경으로 정량적으로 분석 할 수 있다. 또한 BAPA의 좌심실 주입을 통해 전신으로 전달하고 FITC-접합 스트렙타비딘에 의한 프로빙 과정을 거쳐 공초점 현미경에서 이미지화 하여 확인 가능 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
당뇨성 망막증 등의 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증은 주로 혈관 내피 성장인자 (VEGF)-유도 혈관 누출에 의해 야기된다. 구체적으로, 고혈당으로 대사에 이상이 생겨 망막의 미세혈관에 혈류 변화, 망막혈관주위 손실과 혈관 누출 등이 발생하며, 당뇨병성 망막혈관 누출의 주 원인은 혈관 내피 성장인자 (VEGF)라고 보고되어 있다. 그러나, 기본적인 메커니즘은 명확히 밝혀진 바가 없었다. 이에, 본 발명자는 마우스 망막에서 생체내(in vivo) 트랜스글루타미나제2 (TGase 2) 활성 분석을 설계하고, 고혈당이 당뇨병성 망막에서 TGase 2를 활성화시켜 혈관 누출을 유도한다는 것을 입증하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 내피 세포에서 세포내 Ca2 + 및 활성 산소 종 (ROS) 수준의 순차적 증가를 통해 TGase 2 활성을 증가시켰으며, TGase 2 저해제 시스타민, 모노단실카다베린, 시스테아민, 도파민, C-peptide 및 에탄올아민 또는 TGase 2 siRNA는 내피 투과성 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도 스트레스 섬유 형성 및 혈관 내피(VE) 카데린 붕괴를 억제하였다. TGase 2 저해제 또는 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입(intravitreal injection)은 당뇨병 마우스 망막에서 고혈당 유도 TGase 2 활성 및 미세 혈관 누출을 성공적으로 억제하였다. C 펩타이드 또는 ROS 스캐빈저 또한 당뇨병 마우스의 망막에서 TGase 2 활성화를 억제하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할은 당뇨병 TGase 2-/- 마우스를 사용하여 더욱 뒷받침되었다. 따라서, 본 발명자의 실험결과는 TGase 2의 ROS 매개 활성화가 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 자극함으로써 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도 혈관 누출에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예 및 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
참조예
(1) 세포 배양
HREC는 응용 세포 생물학 연구소 (세포 시스템, 커클랜드, WA)에서 구입하고 HUVEC는 자체적으로 분리하여, 20% 소 태아 혈청, 3 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장인자, 5 μ/ml 헤파린, 100 μ/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 M199 배지의 2% 젤라틴-코팅 플레이트에서 성장시켰다. 실험을 위해, 세포를 1% 소 태아 혈청 및 항생제가 보충된 저-혈청 배지에서 6 시간 동안 인큐베이션 하였다.
(2) 세포내 Ca 2 + 수준 및 ROS 생성의 측정
세포내 Ca2 + 수준의 변화를 전술한 바와 같이 관찰하였다 (11). 커버 슬립의 세포를 37℃에서 30분 동안 2 μM Fluo4-AM 및 다양한 저해제를 사용하여 공동 인큐베이션시켰다. 커버 슬립을 공초점 현미경 (FV-300, 올림푸스 도쿄, 일본)으로 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 존재 하에 매 10 초에 스캔하였다. 피크의 단일 세포 형광 강도를 실험마다 무작위로 선택된 10 개의 세포에서 측정하였다.
세포내 ROS의 생성을 전술한 바와 같이 염색한 2', 7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 (H2DCFDA, Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 측정하였다. 세포를 30분 동안 전처리하고, 10분 동안 저-혈청 배지 (페놀 레드-불함유)에서 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 10 μM H2DCFDA로 공동 인큐베이션시켰다. 표지된 세포를 공초점 현미경으로 즉시 분석하였다 (Fluoview-300; Olympus). 단일 세포 형광 강도를 실험마다 무작위로 선택된 10 개의 세포에서 측정하였다. 세포내 ROS의 수준을, 처리 세포의 평균 형광 강도를 대조군 세포와 비교하여 측정하였다 (배수).
(3) 인사이투 TGase 2 활성의 측정
인사이투 TGase 2 아미노기 전이 활성을 이전에 발표된 절차에 따라 공초점 현미경 분석에 의해 결정하였다. 요약하면, 세포를 37℃에서 마지막 1 시간 동안 1 mM 5-(비오틴아미도)펜틸아민 (BAPA)으로 인큐베이션시킨 후, 30분 동안 PBS 중의 3.7% 포름알데히드로 고정시키고, 30분 동안 PBS 중의 0.2% 트리톤 X-100으로 투과시켰다. 20 mM Tris (pH 7.6), 138 mM NaCl 및 0.1% Tween 20 중의 2% BSA의 블로킹 용액으로 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 1 시간 동안 블로킹 용액 중에서 Cy3-접합 스트렙타비딘 (1:200, v/v)으로 처리하였다. 염색된 세포의 단일 세포 형광강도를 실험마다 무작위로 선택된 10 개의 세포에서 공초점 현미경으로 측정하였다. 처리 세포의 평균 형광강도를 대조군 세포의 것과 비교하여 TGase 2 활성을 측정하였다 (배수).
(4) 인간 TGase 2-특이적 작은 간섭 RNA에 의한 형질주입
전술한 바와 같이, HREC를 인간 TGase 2-특이적 siRNA로 형질주입시켰다. 요약하면, 세포를 제조자의 지시에 따라, siLentFect 지질 시약 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여, 다양한 농도의 인간 TGase 2-siRNA 또는 100 nM 대조군 siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO)로 형질주입시켰다. 표시 농도에 의한 형질 주입 6 시간 후, 배지를 새로운 배약 배지로 교체한 후, 형질주입된 세포를 24 시간 동안 추가로 인큐베이션 시켰다.
(5) 웨스턴 블롯 분석
세포를 30분 동안 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 10 μg/ml 아프로티닌 및 10 μg/ml 레우펩틴이 함유된 빙냉 용해 완충액으로 인큐베이션시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 붕괴시키고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에 옮겼다. 이 막을 실온에서 1 시간 동안 0.1% Tween이 포함된 TBS 중 5% 탈지유로 블로킹하였다. 이 막을 TGase 2 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 p-Src (Tyr416) 항체 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)로 프로빙한 후, 호스래디시 퍼옥시다제 접합 이차 항체로 인큐베이션 시켰다. 단백질 밴드를 화학발광 기질 (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 시각화하였다.
(6) HREC에서의 액틴 필라멘트, VE - 카데린 및 β- 카테닌의 시각화
액틴 필라멘트 및 VE-카데린을 전술한 바와 같이 시각화하였다. 액틴 필라멘트의 시각화를 위해, 세포를 37℃에서 1 시간 동안 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리한 후, 3.7% 포름알데하이드로 고정시키고, 0.2% Triton X-100으로 투과시켰다. 세포를 실온에서 1 시간 동안 Alexa Fluor 488 팔로이딘 (1:200, Molecular Probes)으로 인큐베이션시키고, 액틴 필라멘트를 공초점 현미경으로 관찰하였다. VE-카데린의 시각화를 위해, 세포를 30분 동안 TGase 2 저해제로 사전 인큐베이션시킨 후, 37℃에서 90분 동안 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하였다. 고정 및 투과 후, 세포를 4℃에서 모노클로날 VE-카데린 항체 (1:200, Santa Cruz Biotechnology)로 하룻밤 인큐베이션 시켰다. 다음에, 세포를 FITC 접합 염소 항-마우스 항체 (1:200, Sigma)로 프로빙시킨 후, 공초점 현미경을 이용하여, VE-카데린을 시각화하였다. 점선으로 나타낸 바와 같이, 접합 결합부는 VE-카데린의 히스토그램에 의해 표시하고, 실험마다 무작위로 선택된 10 개의 세포의 단일 세포 수준에서, 피크 형광 강도를 이용하여, 정량적으로 분석하였다.
β-카테닌의 시각화에서, 세포를 30분 동안 저해제로 사전 인큐베이션시킨 후, 90분 동안 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하고, 3.7% 포름알데하이드로 고정시킨 다음, 0.2% Triton X-100으로 투과시켰다. 세포를 4℃에서 모노클로날 β-카테닌 항체 (1:200, Santa Cruz Biotechnology)로 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포를 FITC 접합 염소 항-마우스 항체 (1:200, Sigma)로 프로빙한 후, 공초점 현미경을 사용하여 시각화하였다. 갤러리 생성을 위한 이미지는 마이크로소프트 파워 포인트 2010 소프트웨어를 사용하여 작은 크기로 절단하였다.
(7) 시험관내 투과성 분석
시험관내 투과성 분석을 전술한 바와 같이 수행하였다 (11). HREC를 합류 (confluence)시까지, Transwell® Permeable Supports (Costar, Corning, NY, USA)의 젤라틴-코팅 삽입물 (0.4 μm 폴리카보네이트 막)에서 성장시켰다. 0.5ml의 배양 배지 중의 약 1.0×105 세포를 상기 막의 상측면에 시딩(seeding) 한 후, 하부 구획에 첨가하였다. 5일 동안 배양시킨 후, 삽입물 상의 세포를 30분 동안 50μM 시스타민, 20μM 모노단실 카다베린 (MDC) 또는 100nM 다사티닙 (BioVision, Milpitas, CA)로 사전 인큐베이션시킨 후, 90분 동안 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하고, 마지막 60분 동안 1 mg/ml 40 kDa FITC-덱스트란 (Sigma)으로 인큐베이션시켰다. 내피 단층을 통해 하부 챔버로 분산된 FITC-덱스트란의 양을 마이크로플레이트 분광형광계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
(8) 저해제 또는 마우스 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입
스트렙토조토신 주입 2주 후, 당뇨병 마우스의 한쪽 안구에, 2 μl TGase 2 저해제 (50 mM 시스타민 또는 20 mM MDC), 1 μM C 펩타이드 (American Peptide Company, Sunnyvale, CA), ROS 스캐빈저 (2 μM Trolox 또는 500 mM NAC), 또는 65 μM 마우스 TG2-특이적 siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO)를 유리체내로 주입하고, 동량의 PBS 또는 마우스 대조군 siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO)를 반대쪽 안구에 주입하였다. 비당뇨병 마우스의 안구에 또한 2 μl PBS 또는 마우스 대조군 siRNA를 유리체내 주입하였다. 저해제 또는 C 펩타이드의 경우 24시간 후 또는 마우스 TGase 2 siRNA의 경우 48시간 후, 마우스 망막의 생체내 TGase 2 활성 및 혈관 누출 측정을 실시하였다.
(9) 마우스 망막에서의 생체내 TGase 2 활성의 측정
마우스 망막에서, 생체내 TGase 2 아미노잔기 전이 활성을 공초점 현미경에 의해 측정하였다 (도 5a). TGase 2 저해제 및 C 펩타이드의 유리체내 주입 24시간 후 또는 마우스 TGase 2-특이적 siRNA의 주입 48시간 후, 마우스를 2.5% 아베르틴 (avertin)에 의해 깊이 마취시킨 후, 48 μl의 100 mM BAPA를 좌심실에 주입하였다. BAPA를 10분 동안 순환시킨 후, 마우스를 자궁 경부 전위에 의해 희생시켰다. 안구 적출 후, 바로 45분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 망막을 Maltese 십자구조로 해부한 후, 실온에서 30분 동안 PBS 중의 0.2 % 트리톤 X-100으로 투과시켰다. 30분 동안 블로킹 용액으로 인큐베이션 한 후, 망막을 실온에서 1 시간 동안 블로킹 용액 중의 FITC-접합 스트렙타비딘 (1:200, v/v)으로 처리하였다. 염색된 망막의 표면 혈관 (그룹 당 n = 8)을 공초점 현미경을 사용하여 분석한 후, 형광 강도를 Fluoview 소프트웨어 (FV-300)로 분석하였다. 생체내 TGase 2 활성을 정상 및 당뇨병 마우스 망막에서 형광 강도를 이용하여 정량적으로 측정하였다.
(10) 망막 혈관 누출 측정
전술한 바와 같이, 마우스 망막의 미세 혈관 누출은 형광 안저 방법에 의해 조사하였다. 요약하면, TGase 2 저해제 또는 마우스 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입 24 시간 또는 48 시간 후, 개별적으로, 마우스를 깊이 마취시키고, 좌심실에 1.25 mg의 500 kDa FITC-덱스트란 (Sigma)을 주입하였다. 상기 염료 5분 동안 순환시키고, 마우스를 경추 탈골에 의해 희생시켰다. 안구를 적출한 후, 즉시 45분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 망막을 몰타 십자구조(Maltese cross-configuration)로 해부하여, 유리 슬라이드에 접착하였다. 상기 망막의 표면 혈관 (그룹 당 n = 8)을 공초점 현미경에 의해 관찰한 후, 망막 혈관으로부터 분출된 FITC-덱스트란의 형광 강도를 측정함으로써, 혈관 누출을 Fluoview 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석하였다.
(11) 망막의 액틴 필라멘트 및 VE - 카데린의 시각화
액틴 필라멘트의 염색을 위해, 마우스를 자궁 전위에 의해 희생시키고, 안구를 4℃에서 4% 파라포름알데히드로 하룻밤 동안 즉시 고정시켰다. 몰타 십자구조로 해부한 후, 망막을 1 시간 동안 PBS 중의 1.0% Triton X-100으로 투과시킨 후, 실온에서 2 시간 동안 Alexa Fluor 488 팔로이딘 (1:200, Molecular Probes)으로 인큐베이션시켰다. VE-카데린 염색의 경우, 적출된 안구를 실온에서 45분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, -20℃에서 3분 동안 아세톤으로 고정시켰다. Maltese 십자구조로 해부한 후, 망막을 실온에서 4 시간 동안 PBS 중의 1.0% Triton X-100으로 투과시킨 후, 4℃에서 모노클로날 VE-카데린 항체 (1:100, BD Pharmingen)로 인큐베이션시켰다. 그 후, 망막을 실온에서 2 시간 동안 FITC-접합 염소 항 마우스 항체 (1:300, Sigma)로 인큐베이션시켰다. 망막의 표면 혈관의 액틴 필라멘트 VE-카데린을 공초점 현미경으로 시각화하였다.
(12) TGase 2 발현의 면역화학염색 및 시각화
마우스 안구를 4°C에서 4% 파라포름알데히드로 하룻밤 고정시킨 후, 4°C에서 30% 자당으로 하룻밤 인큐베이션시키고, OCT에서 동결시켰다. 동결 절편을 마이크로톰-저온 유지 장치 (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여, 10 μm로 절단한 후, PBS로 3회 세척하였다. 95℃에서 20분 동안 0.01 M 구연산 완충액 (pH 6.0)을 이용하여, 항원 검색을 수행하였다. 실온에서 20분 동안 냉각 후, 절편을 PBS 중의 0.1% Tween 20으로 3회 세정하고, 30분 동안 블로킹 용액으로 인큐베이션시켰다. 이어서 절편을 블로킹 용액 중의 TGase 2 항체 (1:200, Santa Cruz Biotechnology)로 하룻밤 인큐베이션시킨 후, 실온에서 2 시간 동안 FITC-접합 염소 항 마우스 항체 (1:300, Sigma)로 프로빙하였다. TGase 2 발현을 공초점 미생물에 의해 시각화하였다.
(13) 통계 분석
Origin 6.1 소프트웨어 (OriginLab, Northampton, MA)를 이용하여 데이터 프로세싱을 수행한 후, 적어도 3회의 독립 실험의 평균 ± SD로 표시하였다. 통계적 유의성은 ANOVA를 사용하여 측정하였다. p < 0.05의 값을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 1: TGase 2 -/- 및 당뇨병 마우스 모델의 생성
6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 KOATECH (한국 평택)로부터 구하였다. TGase 2-/- 마우스 (C57BL/6)를 전술한 바와 같이, 상동 재조합에 의해 TGase 2의 엑손 5 및 6을 붕괴시킴으로써 제조하였다. 전술한 바와 같이, 100 mM 시트르산염 완충액 (pH 4.5)으로 새로 제조된 스트렙토조토신 (150 mg/kg 체중, Sigma)의 단일 복강내 주입에 의해, 당뇨병 마우스를 생성시켰다. TGase 2-/- 마우스의 유전자형과 임상 데이터는 도 9에 나타낸다. 19 mM을 초과하는 비-단식 혈당치, 다뇨증 및 당뇨(glucosuria)를 가지는 마우스는 당뇨병이 있는 것으로 간주하였다. 실험은 강원대학교의 기관 동물관리 및 이용 윤리위원회의 지침을 엄격히 준수하여 수행하였다.
실험예 1: 혈관 내피 성장 인자( VEGF )가 내피 세포의 세포내 Ca 2 + 및 ROS 수준의 증가에 의해 TGase 2를 활성화시킴을 확인
본 발명자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 HREC에서 TGase 2를 활성화할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 공초점 현미경을 사용하여 인사이투 TGase 2 활성 분석을 수행하였다. 당뇨병성 망막의 혈관 누출은 주로 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 발생되는 것으로 보고되었다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 배양시간 의존적 방식으로 인사이투 TGase 2 활성을 증가시켰으며, 2 시간에서 최대 활성화를 나타내었다 (p < 0.001, 도 1a). 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 TGase 2 활성화는 ROS 스캐빈저 N-아세틸 시스테인 (NAC) 및 Trolox 또는 Ca2 + 킬레이터 BAPTA-AM에 의해 억제되었으며 (p < 0.001, 도 1b), 이는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 세포내 ROS 및 Ca2 + 수준의 증가를 통해 TGase 2를 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다. 예상한 바와 같이, TGase 2 저해제 시스타민 및 MDC는 TGase 2 활성의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 증가를 억제하였다 (p < 0.001, 도 1b).
본 발명자는 인간 TGase 2 siRNA의 내피 세포로의 형질주입에 의한, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 TGase 2 활성화에서 TGase 2의 역할을 조사하였다. 인간 TGase 2 siRNA는 투여량-의존적 방식으로 단백질 발현을 억제하였으며, 100 nM에서 최대효과를 나타내었다 (도 1c). TGase 2 siRNA는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 TGase 2 활성화를 완전히 억제하였으며 (p < 0.001), 반면에, 대조군 siRNA는 효과를 나타내지 않았다 (도 1d). TGase 2 siRNA 또는 대조군 siRNA 단독의 경우, TGase 2 활성에 대해 미미한 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 인사이투 TGase 2 활성의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유도 증가가 대부분 TGase 2에 의해서는 기여하였지만, TGase 패미리의 다른 구성원에 의해서는 기여하지 않았는다는 것을 입증한다.
본 발명자는 내피 세포에서 다양한 저해제를 이용하여, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 TGase 2 활성화에서 세포내 ROS 및 Ca2 +의 역할을 연구하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 세포내 Ca2 + 수준을 증가시켰으며, 이는 BAPTA-AM에 의해 억제되었으나 (p < 0.001), ROS 스캐빈저 또는 TGase 2 저해제에 의한 경우 그러하지 않았다 (도 1e). 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 세포내 ROS 생성을 유도하였으며, 이는 ROS 스캐빈저 또는 BAPTA-AM에 의해 현저히 억제되었으나 (p < 0.001), TGase 2 저해제의 경우 그러하지 않았으며 (도 1f), 이는 세포내 Ca2 + 가 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 ROS 생성에 관련된다는 것을 제시한다. 이들 결과는, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 내피 세포에서 세포내 Ca2 + 및 ROS 수준의 순차적 증가를 통해 TGase 2를 활성화시킨다는 것을 설명해준다.
도 1의 내용을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 도 1은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 TGase 2 활성화는 HREC에서 세포내 Ca2 + 및 ROS 수준의 증가에 의해 매개됨을 나타내는 도이다. (a, b) HREC를 TGase 2 저해제 (50 μM 시스타민 및 20 μM MDC), 5 μM Ca2 + 킬레이터 BAPTA-AM 또는 ROS 스캐빈저 (1 mM NAC 또는 0.5 μM Trolox)의 존재 하에, 지정 시간 (a) 또는 2 시간 (b) 동안 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 인큐베이션 하였다. 인사이투 TGase 2 활성은 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 공초점 현미경으로 측정하였다. (a) 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 처리 시간에 따른 트랜스글루타미나제 활성도 변화. (b) 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 트랜스글루타미나제 활성화에 대한 다양한 저해제의 효과. (c, d) HREC를 인간 TGase 2-특이적 siRNA (TGase 2 siRNA) 또는 100 nM 대조군 (Ctrl) siRNA의 지정 농도 (c) 또는 100 nM (d)로 형질 주입하였다. 내피 세포를 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하고, 인사이투 TGase 활성의 공초점 현미경 측정을 실시하였다. (c) TGase 2 siRNA에 의한 TGase 2 발현의 투여량-의존적 저해. TGase 2 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. (d) 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 트랜스글루타미나제 활성화를 TGase 2 siRNA로 억제. (e,f) 세포내 Ca2 + (e) 및 ROS (f)의 증가에 대한 다양한 저해제의 효과. 세포내 Ca2 + 및 ROS 수준을 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 공초점 현미경으로 측정하였다. 결과는 3 개의 독립 실험의 평균 ± SD로 표시된다. ***p < 0.001.
실험예 2: 혈관 내피 성장 인자( VEGF )-유도 스트레스 섬유 형성, VE - 카데린 붕괴 및 내피 세포의 투과성에서 TGase 2의 역할
혈관 내피 성장 인자(VEGF) 매개 혈관 누출에 있어서, TGase 2의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자는 HREC에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 스트레스 섬유 형성 및 접합 결합부 붕괴에 대한 시스타민과 MDC의 효과를 연구하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 스트레스 섬유 형성을 활성화시켰으며, 이는 두 개의 TGase 2 저해제에 의해 억제되었다 (도 2a). 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 VE-카데린 분해를 유도하였으며, 이는 TGase 2 저해제에 의해 억제되었다 (도 2b). 두 개의 세포-세포 접촉을 교차하는 흰색 라인으로 나타낸 바와 같이, VE-카데린의 안정성 변화는 상대적 형광 강도의 분포를 나타내는 라인 프로파일(line profile)로 표시하였다. VE-카데린 분해를 또한 히스토그램의 피크 형광 강도를 측정하여 정량적으로 분석하였다 (도 2c). HREC를 사용한 시험관내 내피 세포 단층 투과성 분석으로 혈관 누출에 대한 TGase 2의 역할을 추가로 조사하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 시험관내 내피 투과성을 증가시켰으며, 이는 TGase 2 저해제에 의해 억제되었다 (p < 0.01; 도 2d). 따라서, TGase 2는 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 통해, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 내피 세포 투과성에 연관될 가능성이 있다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 확인하기 위해, 본 발명자는 내피 세포에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴에 대한 인간 TGase 2 siRNA의 효과를 조사하였다. 도 2의 연구결과와 부합되게, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 대조군 siRNA로 형질 주입된 내피 세포에서 스트레스 섬유 형성을 활성화시켰으나, TGase 2 siRNA-처리 세포의 경우에는 그러하지 않았다 (도 3a). TGase 2 siRNA 또는 대조군 siRNA 단독의 경우, 스트레스 섬유 형성에 현저한 효과를 나타내지 않았다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 대조군 siRNA-처리 내피 세포에서 VE-카데린 붕괴를 유도하였으며, 이는 TGase 2 siRNA 형질 주입에 의해 억제되었다 (p < 0.001; 도 3b 및 C). TGase 2 siRNA 또는 대조군 siRNA 단독의 경우, VE-카데린 붕괴에 대해 효과를 나타내지 않았다. 종합하면, TGase 2 는 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 통한 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-매개 내피 투과성에 있어서 중요한 역할을 한다.
다음에, 본 발명자는 β-카테닌 및 c-Src이 HREC에서 TGase 2-매개 내피 투과성에 연관되어 있는지 여부를 조사하였다. TGase 2가 c-Src-의존적 메커니즘을 통해 β-카테닌 신호 전달을 조절한다는 것이 보고되었다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 β-카테닌 분해를 유도하였으며, 이는 TGase 2 저해제인 시스타민 및 Src 패미리 키나제 저해제 다사티닙에 의해 억제되었다 (도 4a). 시스타민은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 유도되는 c-Src 인산화 (Tyr416)를 억제하였다. 다사티닙은 VRGF-유도 c-Src 인산화 (도 4b) 및 내피 투과성 (도 4c)를 차단하였다. 이들 결과는, TGase 2가 c-Src 및 β-카테닌을 포함한 메커니즘을 통한 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 접합 결합부 분해에 연관되어있다는 것을 암시한다.
도 2 내지 4의 내용을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
도 2는 TGase 2 저해제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 스트레스 섬유 형성, VE-카데린 붕괴 및 내피 세포 단층 투과성을 억제함을 나타내는 도이다.
(a-c) HREC를 30분 동안 50 μM 시스타민 (Cys) 및 20 μM MDC로 사전 인큐베이션하고, 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하였다. 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 스트레스 섬유 및 VE-카데린을 염색하고, 공초점 현미경으로 시각화하였다 (n = 3). (a) 스트레스 섬유의 대표 이미지. 스케일 바, 30 μm. (b) VE-카데린의 대표 이미지. 스케일 바, 10 μm. 접합 결합부는 점선으로 나타낸 바와 같이, VE-카데린의 히스토그램으로 제시한다. (c) 단일-세포 수준에서, 히스토그램의 피크 형광 강도를 이용하여, 접합 결합부를 정량적으로 분석하였다. 결과는 3 개의 독립 실험의 평균 ± SD로 표시된다. (d) 시험관내 내피 세포 단층 투과성 분석. Transwell® Permeable Supports의 삽입물 상의 HREC를 30분 동안 50 μM 시스타민 및 20 μM MDC로 인큐베이션시킨 후, 90분 동안 10 ng/mL 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하였다. 하부 챔버로 분산된 FITC-덱스트란의 양을 마이크로플레이트 분광형광계로 측정하였다 (n = 3). **p < 0.01.
도 3은 TGase 2 siRNA는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 저해함을 나타내는 도이다.
HREC를 100 nM 인간 TGase 2-특이적 siRNA (TGase 2 siRNA) 또는 100 nM 대조군 (Ctrl) siRNA으로 형질 주입시켰다. 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 내피 세포를 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리한 후, 스트레스 섬유 (a) 및 VE-카데린 (b)의 공초점 현미경 시각화를 실시하였다 (n = 3). (a) 스트레스 섬유의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 형성의 TGase 2 siRNA. 스케일 바, 30 μm. (b) VE-카데린의 대표 이미지 및 VE-카데린 히스토그램으로 나타낸 접합 결합부. 스케일 바, 10 μm. (c) 접합 결합부를 단일-세포 수준에서, 히스토그램의 피크 형광 강도를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 결과는 3 개의 독립 실험의 평균 ± SD로 표시된다. ***p < 0.001.
도 4는 TGase 2 및 cSrc의 저해제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 β-카테닌 붕괴 및 내피 세포 투과성을 억제함을 나타내는 도이다. HREC를 30분 동안 50 μM 시스타민 (Cys) 또는 100 nM 다사티닙으로 사전 인큐베이션시킨 후, 15분 (b) 또는 90분 (a,c) 동안 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 처리하였다. (a) β-카테닌을 공초점 현미경으로 시각화하였다. 스케일 바, 30 μm. (b) Tyr416에서의 cSrc 인산화를 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. (c) 시험관내 내피 세포 단층 투과성 분석. 결과는 3 개의 독립 실험의 평균 ± SD로 표시된다. **p < 0.01, ***p < 0.001.
실험예 3: 고혈당증은 당뇨성 망막에서 TGase 2를 활성화시켜 혈관 누출을 유도함
본 발명자는 시험관내 연구 결과를 입증하기 위해 당뇨병 마우스의 망막에서 고혈당증-유도 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 추가로 조사하였다. 이 연구를 위해, 본 발명자는 마우스 망막에서 공초점 현미경을 사용한 생체내 (in vivo) TGase 2 활성 분석을 설계하였다 (도 5a). 이 분석에서, TGase 2 유사기질인 BAPA를 마우스의 좌심실에 주입시켜, 전신 혈액 순환계로 전달시켰으며, 망막에서 비오틴화 단백질을 FITC-접합 스트렙타비딘으로 프로빙하였다.
생체내 TGase 2 활성은 정상 망막에 비해 스트렙토조토신 당뇨병 마우스 망막의 혈관 및 신경절 세포에서 매우 증가 하였으며 (n = 8), 이러한 고혈당증-유도 TGase 2 활성화는 TGase 2 저해제 시스타민 및 MDC의 유리체내 주입에 의해 억제되었다 (도 5b 및 도 10). 이어서, 본 발명자는 망막 조직에서 FITC-접합 스트렙타비딘의 형광 강도를 측정하여, 생체내 TGase 2 활성을 정량적으로 분석하였다. 당뇨병 마우스 망막의 평균 TGase 2 활성은 정상 마우스 보다 대략 2 배 높았다 (p < 0.001, n = 8; 도 5c). TGase 2 저해제는 당뇨성 망막의 혈관 및 신경절 세포에서 고혈당증-유도 TGase 2 활성도 증가를 억제 하였다 (p < 0.001, n = 8; 도 5C). 이러한 결과는, 본 발명자의 생체내 공초점 현미경 분석에 의해, 당뇨성 망막에서 고혈당증에 의한 TGase 2 활성화가 성공적으로 분석된다는 것을 입증한다.
다음에, 본 발명자는 마우스 안구로의 시스타민과 MDC의 유리체내 주입 후, 형광 혈관 조영술에 의해 당뇨성 망막의 혈관 누출에 있어서, TGase 2의 역할을 조사하였다. 높은 수준의 FITC-덱스트란의 혈관외 유출이 당뇨병 마우스 망막에서 관찰되었으며; TGase 2 저해제가 주입된 반대쪽 안구의 망막의 경우, 이러한 누출이 차단되었다 (도 6a 및 도 10). 당뇨병 마우스 망막의 형광 강도는 대조군 마우스에 비해 대략 3 배 높았다 (p < 0.001, n = 8); 그러나 시스타민 및 MDC는 혈관 누출을 억제하였다 (p < 0.001, n = 8, 도 6b). 이러한 결과는 고혈당증이 당뇨병 마우스 망막에서 TGase 2를 활성화시킴으로써 혈관 누출을 유도한다는 것을 제시한다.
본 발명자는 고혈당증이 당뇨성 망막에서 스트레스 섬유 형성 및 접합 결합부 분해를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. 시험관내 결과와 일치되게, 액틴 필라멘트 염색은 정상에 비해 당뇨성 망막에서 향상된 스트레스 섬유 형성을 나타내었다 (도 6c). VE-카데린 염색은 정상에서 결합부를 따라 연속적인 VE-카데린 분포를 나타내었으나, 당뇨성 망막의 경우, 빈번히 붕괴된 접합 결합부를 나타내었다 (도 6d). 이러한 결과는 고혈당증이 당뇨병 마우스 망막에서 스트레스 섬유 형성 및 접합 결합부 붕괴에 의한 혈관 누출을 유도한다는 것을 설명해주고 있다.
도 5 내지 6의 내용을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
도 5는 당뇨병의 마우스 망막에서, 생체내 TGase 2 활성의 증가 및 C 펩타이드 또는 다양한 저해제의 유리체내 주입에 의한 그의 저해를 나타내는 도이다. (a) 마우스 망막에서, TGase 2 활성을 측정하기 위한 개략도이다 (b,c) 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스의 한쪽 안구에 2 μl 시스타민 (당뇨병 + Cys), MDC (당뇨병 + MDC), C 펩타이드 (당뇨병 + C-pep), Trolox (당뇨병 + Trolox) 또는 NAC (당뇨병 + NAC) 를 유리체내 주입하고, 반대쪽 안구에 동량의 PBS를 유리체내 주입하였다 (당뇨병). 또한 비당뇨병 마우스의 양쪽 안구에 2 μl PBS를 유리체내 주입하였다 (정상). 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 망막에서, TGase 2 활성을 공초점 현미경으로 시각화한 후, 정량적으로 측정하였다 (그룹 당 n = 8). (B) 망막의 대표적 TGase 2 활성 이미지. 사각형 영역은 각 이미지 하단의 확대 이미지로 표시된다. 스케일 바, 100 μm. (C) 망막에서, 형광 강도를 측정함으로써, 생체내 TGase 2 활성을 측정하였다. *** p < 0.001.
도 6은 TGase 2 저해제의 유리체내 주입은 당뇨병 마우스의 혈관 누출을 억제함을 나타내는 도이다. (a,b) 스트렙토조토신 당뇨병 마우스의 안구에 PBS (당뇨병), 시스타민 (당뇨병 + Cys) 또는 MDC (당뇨병 + MDC)를 유리체내 주입하였다. 또한, 비당뇨병 마우스의 안구에 PBS를 유리체내 주입하였다 (정상). 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 망막의 혈관 누출을 공초점 현미경으로 시각화하였다 (그룹 당 n = 8). (a) 망막의 대표적 형광 이미지이다. 사각형 영역은 각 이미지 하단의 확대 이미지로 표시된다. 스케일 바, 150 μm. (b) (a)의 FITC-덱스트란의 형광 강도를 측정하여, 망막 투과성을 정량화하였다. (c,d) 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 정상 및 당뇨병 마우스 망막의 스트레스 섬유 및 VE-카데린을 공초점 현미경으로 시각화하였다 (그룹 당 n = 6). (c) 스트레스 섬유의 대표 이미지이다. 스케일 바, 50 μm. (d) VE-카데린의 대표 이미지이다. 화살표는 붕괴된 접합 결합부를 나타낸다. 스케일 바, 50 μm. ***p < 0.001.
실험예 4: 당뇨성 망막에서 혈관 내피 성장 인자( VEGF )-유도 ROS 생성에 의한 TGase 2 활성화
본 발명자는 당뇨성 망막에서 고혈당증-유도 TGase 2 활성화에 대한 ROS 스캐빈저 Trolox 및 NAC의 효과를 조사하였다. Trolox는 당뇨성 망막에서 고혈당증-유도 TGase 2 활성화를 억제하였으며 (p < 0.001, 도 5c), 이는 도 1b의 시험관내 결과와 일치하는 것이다. NAC에 의해 유사한 저해 효과가 관찰되었다 (p < 0.01; 도 5d). C 펩타이드가 당뇨성 망막에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-자극 ROS 생성을 억제하여, 혈관 투과성을 저해하기 때문에, 고혈당증-유도 TGase 2 활성화에서의 세포내 ROS의 역할을 추가로 연구하였다. 인간 C 펩타이드는, 인슐린과 등몰 농도로, β-세포로부터 미세 순환으로 배출되는 31-아미노산 펩타이드다. C 펩타이드의 유리체내 주입은 당뇨성 망막에서 TGase 2 활성화를 차단시켰다 (p < 0.001; 도 5b 및 d). 당뇨성 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-매개 혈관 누출에서 세포내 ROS의 역할을 고려하면, 이들 결과는, TGase 2가 당뇨성 망막에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-증가 세포내 ROS에 의해 활성화된다는 것을 제시한다
실험예 5: TGase 2 siRNA의 유리체내 주입은 당뇨성 망막에서 TGase 2 활성화, 혈관 누출 및 TGase 2 발현을 억제함
당뇨성 망막의 혈관 투과성에서 TGase 2의 역할을 확인하기 위하여, 당뇨병 마우스에 마우스 TGase 2-특이적 siRNA를 유리체내 주입하고, 망막의 생체내 TGase 2 활성 및 혈관 누출 분석을 실시하였다. 생체내 TGase 2 활성은 정상 망막에 비해, 대조군 siRNA가 주입된 당뇨성 망막에서 현저히 더 높았으며 (p < 0.001, n = 8), TGase 2 siRNA-주입된 반대쪽 안구의 망막의 경우에는 차단되었고 (p < 0.001, n = 8, 도 7a), 이는 당뇨성 망막의 고혈당증-유도 TGase 2 활성화가 대부분 TGase 2에 의해 이루어졌다는 것을 입증하는 것이다. 다음에, 본 발명자는 당뇨성 망막에서 고혈당증-유도 혈관 누출에 대한 TGase 2 siRNA 유리체내 주입의 효과를 분석하였다. 혈관 누출은 정상 망막에 비해 대조군 siRNA가 주입된 당뇨성 망막에서 분명하였으며 (p < 0.001, n = 8), 이는 TGase 2 siRNA-주입된 반대쪽 안구의 망막에서 차단되었다 (p < 0.01, n = 8, 도 7b). TGase 2는 망막의 모든 층에서 발현되었으며, 신경절 세포와 내부 얼기 층에서 더 높은 수준이었고, 이는 TGase 2 siRNA에 의해 현저히 억제되었다 (도 7c). 이러한 결과는 TGase 2가 당뇨성 망막에서 고혈당증-유도 혈관 누출에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 입증한다.
도 7의 내용을 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 7은 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입은 당뇨병 마우스 망막에서, 생체내 TGase 2 활성화, 혈관 누출 및 TGase 2 발현을 억제함을 나타내는 도이다.
(a,b) 당뇨병 마우스의 안구에 대조군 또는 TGase 2-특이적 siRNA를 유리체내 주입하였다. 또한, 비당뇨병 마우스의 안구에 대조군 siRNA를 유리체내 주입하였다. 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 망막의 생체내 TGase 2 활성 및 혈관 누출을 공초점 현미경으로 시각화하고, 정량적으로 측정하였다 (그룹 당 n = 8). (a) 생체내 TGase 2 활성을 나타낸다. 스케일 바, 100 μm. (b) 혈관 누출을 나타낸다. 스케일 바, 150 μm. (c) 망막 횡단면의 TGase 2 발현의 대표 이미지 (n = 4)이다. 스케일 바, 50 μm. 발현 수준은 점선으로 나타낸 바와 같이, 히스토그램으로 제시한다. GLC, 신경절 세포 층; IPL, 내부 얼기 층; INL, 내부 핵 층; OPL, 바깥 얼기 층. **p < 0.01, ***p < 0.001.
실험예 6: 당뇨병 TGase 2 -/- 마우스의 망막에서의, TGase 2 활성화 및 혈관 누출 없음
당뇨성 망막의 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 추가로 확인하기 위해, 2주째에, C57BL/6 및 TGase 2-/- 마우스의 망막에서, 생체내 TGase 2 활성 및 혈관 누출을 측정하였다 (n = 8). 비당뇨병 C57BL/6 마우스에 비해, 비당뇨병 TGase 2-/- 마우스 망막에서, TGase 2 활성이 급격하게 저하되었으며 (p < 0.001), 이러한 저하된 TGase 2 활성은 당뇨병 TGase 2-/- 마우스에서 고혈당증에 의해 변화되지 않았다 (p = 0.468). 예상한 바와 같이, 당뇨병 C57BL/6 마우스의 경우, TGase 2 활성이 증가되었으며 (p < 0.001), 이는, 당뇨성 망막에서 대부분의 TGase 2 활성화가 TGase 2에 의해 이루어졌다는 것을 확인시키는 것이다. 다음에, 본 발명자는 비당뇨병 및 당뇨병 TGase 2-/- 마우스 망막의 혈관 누출을 연구하였다 (n = 8). 비당뇨성 TGase 2-/- 마우스에 비해, 당뇨성 TGase 2-/- 마우스 망막의 경우, 혈관 누출이 유도되지 않았으며 (p = 0.682, n = 8; 도 8b 및 c), 이는 도 7의 TGase 2 siRNA 의 유리체내 주입을 이용한 생체내 실험과 일치한다. 4주째의 당뇨병 TGase 2-/- 마우스 망막의 경우, 혈관 누출이 또한 검출되지 않았다 (데이터 미제시). 본 발명자의 연구결과는, 세포내 ROS-유도 TGase 2 활성화가 당뇨성 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 매개 혈관 누출에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다.
도 8의 내용을 설명하면 다음과 같다. 도 8은 당뇨병 TGase 2-/- 마우스 망막에서의 TGase 2 활성화 및 혈관 누출 없음 및 당뇨성 망막증에서 TGase 2의 역할에 대한 개략도이다.
(a-c) 연구 설계 및 방법에 개시된 바와 같이, 비당뇨병 및 당뇨병 C57BL/6 마우스 및 비당뇨병 및 당뇨병 TGase 2-/- 마우스의 망막에서의 생체내 TGase 2 활성 및 혈관 누출을 공초점 현미경으로 시각화한 후, 정량적으로 측정하였다 (그룹 당 n = 8). (a) 당뇨병 TGase 2-/- 마우스의 망막에서 TGase 2 활성화 없음을 나타낸다. (b) 비당뇨병 및 당뇨병 TGase 2-/- 마우스 망막에서의 FITC-덱스트란의 대표적 형광 이미지이다. 스케일 바, 150 μm. (c) 당뇨병 TGase 2-/- 마우스의 망막에서 혈관 누출 없음을 나타낸다. (d) 당뇨성 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관 누출에서 TGase 2의 역할을 도시하는 제안 모델이다.
실험예 7: 생체 외(in vitro) 실험을 통한 dopamine 과 시스테아민의 항산화 효과와 TGase 2 활성도 억제 효과 분석
본 발명자는 도파민 과 시스테아민이 혈관내피세포(HUVEC)에서 항산화 효과와 TGase 2 활성도 억제에 미치는 영향을 분석하기 위해 DPPH radical scavenging activity 와 단백질 칩 기반 TGase 2 활성도 분석을 실시했다. 도파민 과 시스테아민 은 ROS scavenger로 알려진 N-아세틸 시스테인(NAC)와 아스코르브산(ascorbic acid)과 유사한 항산화 효과를 보였다 (도 12 a,b). 또한 도파민 과 시스테아민 모두 농도 의존적으로 TGase 2 활성도를 억제했다 (도 12 c,d). 따라서 도파민 과 시스테아민은 항산화 효과와 TGase 2 활성도 억제 효과를 동시에 가지고 있음을 알 수 있다.
실험예 8: 혈관내피세포( HUVEC )에서 도파민 과 시스테아민에 의한 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유발 활성산소 생성과 TGase 2 활성화의 억제
도파민 과 시스테아민이 혈관내피세포(HUVEC)에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 유발 활성산소 생성과 TGase 2 활성화를 억제할 수 있는지 여부를 분석하였다. 혈관내피세포에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 활성산소(ROS) 생성과 TGase 2 활성도를 증가시켰으며, 이는 도파민 과 시스테아민에 의해 억제되었다(도 13 a 내지 d). 이 결과를 통해 도파민 과 시스테아민이 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의한 혈관세포 내 활성산소 생성과 TGase 2 활성화을 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있었다.
실험예 9: 도파민 과 시스테아민의 당뇨병성 마우스 유리체내 주입을 통해 당뇨병 망막에서 증가되는 TGase 2 활성도 차단
본 발명자는 시험관내 연구 결과를 입증하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 마우스 망막의 TGase 2 활성도를 시각화한 후 형광 강도를 측정함으로써 TGase 2 활성도를 정량적으로 분석하였다. 도파민은 마우스 유리체내 0.5mM, 시스테아민은 500mM을 주입하였다. 당뇨병성 마우스의 망막 내 TGase 2 활성도는 정상 마우스 망막에 비해 현저히 증가 하였으며, 도파민 과 시스테아민의 유리체내 주입에 의해 억제되었다 (도 14).
실험예 10: 당뇨성 망막에서 도파민 과 시스테아민의 유리체내 주입을 통해 혈관 누수의 억제 효과
마우스 안구에 도파민 과 시스테아민의 유리체내 주입 후, 형광 혈관 조영술을 통해 당뇨병성 망막의 혈관누수를 분석하였다. 당뇨병 마우스 망막내의 혈관 누수는 정상 망막에 비해 현저히 높았으며 (n=6), 도파민 0.5mM과 시스테아민 500mM 의 유리체내 주입에 의해 혈관 누수가 차단되었다(도 15).
실험 예 3 내지 4의 내용의 결과는 도파민 과 시스테아민이 당뇨병성 망막에서 TGase 2 활성화 억제와 혈관 누수가 효과적으로 차단된다는 것을 in vivo 연구를 통해 입증하였다.
따라서 도파민 과 시스테아민은 당뇨병성 망막증의 혈관 누수에 중요하게 작용하는 TGase 2 활성과 활성산소 생성을 억제하여 혈관 누수를 차단함으로써 혈관 누수와 관련된 당뇨병성 합병증(망막증, 신장증 등)의 치료에 이용될 수 있다는 것으로 보였다.
본 발명에서, 본 발명자는 공초점 현미경을 사용한 생체내 TGase 2 활성 분석을 설계하였으며, 당뇨병 마우스 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관 누출에서 TGase 2의 중추적 역할을 탐구하였다. 본 발명자는, 고혈당증이 당뇨성 망막에서 TGase 2를 활성화하여 혈관 누출을 유도한다는 것을 입증하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 내피 세포에서, Ca2 + 및 ROS 수준의 순차적 증가를 통해 TGase 2를 활성화시켰다. 스트레스 섬유 및 접합 결합부 붕괴의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 형성은 TGase 2 저해제 시스타민 및 MDC 또는 TGase 2 siRNA에 의해 저해되었다. 당뇨병 마우스 망막의 경우, 생체내 TGase 2 활성이 또한 증가하였으며, 이는 TGase 2저해제의 유리체내 주입에 의해 억제되었다. 또한, 마우스 TGase 2 siRNA의 유리체내 주입은 당뇨성 망막에서 고혈당증-유도 TGase 2 활성화 및 미세 혈관 누출을 억제하였다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 ROS 생성 및 혈관 누출을 저해하는 C 펩타이드는 당뇨성 망막에서 생체내 TGase 2 활성화를 억제하였다. ROS 스캐빈저 N-아세틸-시스테인 및 Trolox은 또한 당뇨성 망막에서 TGase 2의 고혈당증-유도 활성화를 억제하였다. 당뇨병 TGase 2-/- 마우스를 이용하여, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관 누출에서의 TGase 2의 역할을 추가로 입증하였다. 따라서, TGase 2의 ROS-매개 활성화는, 당뇨병 마우스 망막에서 스트레스 섬유 형성 및 VE-카데린 붕괴를 자극함으로써, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관 누출에서 핵심 역할을 한다 (도 8d).
TGase 2는 당뇨병 합병증의 발병에 중요한 효소일 가능성이 있다. 각막, 망막, 섬유주대, 렌즈 등 다양한 안구 조직에서 TGase 2가 발현된다 (24,32); 그러나 당뇨성 망망증에서의 TGase 2의 역할은 아직 알려지지 않았다. 본 연구에서, 본 발명자는 당뇨병 마우스 망막의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 혈관 누출에서의 TGase 2의 주요 역할을 규명했다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of diabetic complications and screening method for screening method for agent for preventing or treating diabetic complications <130> HY160791 <150> KR 10-2016-0058382 <151> 2016-05-12 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagagcgaga ugaucuggaa c 21 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln 20 25 30

Claims (12)

  1. 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제로 도파민을 포함하는 당뇨성 합병증의 예방 및 치료용 조성물로서,
    상기 당뇨성 합병증은 당뇨성 혈관누출(vascular leakage)에 의한 것이며,
    상기 도파민(dopamine)은 항산화 효과를 가지며,
    상기 도파민은 세포 내 활성산소 종(ROS) 생성 억제, 세포 내 Ca2+ 수준 억제, TGase2 활성도 억제 및 혈관 누수의 억제작용을 가진 것이며,
    안구주사법으로 도파민 0.96 μg 내지 962.5 μg을 1회 투여가능한, 당뇨성 합병증 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 당뇨성 합병증은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 유도된 혈관의 붕괴에 의한 것인, 약제학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 당뇨성 합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 심혈관계 질환, 당뇨성 뇌졸중, 당뇨성 신장증, 당뇨성 말초신경증 및 당뇨성 암전이 중 어느 하나인, 약제학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 당뇨성 합병증은 당뇨성 망막증인, 약제학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈관 누수에 의해 유발되는 당뇨성 합병증은 고혈당증에 의해 유도된 것인, 약제학적 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 의해 TGase 2가 활성화 되는 것을 저해하는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 트란스글루타미나제 2(Transglutaminase 2; TGase 2) 저해제는, TGase 2에 의한 혈관의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도 붕괴 및 망막의 미세혈관 누출을 저해하는 것인, 약제학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
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WO2014025127A1 (ko) * 2012-08-06 2014-02-13 강원대학교 산학협력단 Ｃ-펩타이드를 포함하는 당뇨성 혈관누출에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080287386A1 (en) * 2004-01-30 2008-11-20 Quark Biotech, Inc. Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of fibrotic conditions and other diseases
WO2012153125A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-15 Aston University Novel compounds and methods for use in medicine
WO2015095257A2 (en) * 2013-12-18 2015-06-25 Emory University Managing visual dysfunction or loss of vision for diabetic subjects

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