WO2014025127A1 - Ｃ-펩타이드를 포함하는 당뇨성 혈관누출에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ｃ-펩타이드를 포함하는 당뇨성 혈관누출에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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하권수
임영철
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Definitions

  • the present invention relates to the prevention or treatment of diabetes-related diseases using C-peptide, specifically, a method for the prevention or treatment of diseases caused by diabetic vascular leakage using C-peptide, and the prevention of diabetic retinopathy or To a method of treatment or a composition therefor.
  • Diabetes is a metabolic disorder of multiple etiologies that is characterized by chronic hyperglycemia due to a deficiency in insulin or a deficiency in insulin action. Metabolic disorders and subsequent vascular damage lead to various complications. After 10 years of diabetes, almost every organ in the body is damaged, causing complications. In particular, diabetic patients have abnormal vascular leakage, and diabetic vascular leakage causes complications such as diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic vascular dysfunction, and diabetic inflammation.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • C-peptide human C-peptide is a peptide consisting of amino acids cleaved from insulin precursor, secreted in the same molar concentration as insulin by pancreatic ⁇ -cells in the circulation.
  • C-peptide deficiency is a major complication and leads to diabetic retinopathy, the leading cause of blindness in adults.
  • C-peptide is used for diagnosing diabetes, a method for treating diabetic vascular leakage or a disease caused by diabetic vascular leakage has not been reported yet. It is true.
  • a first object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a disease caused by diabetic vascular leakage using C-peptide, or a composition therefor.
  • a second object of the present invention is to provide a method for preventing or treating diabetic retinopathy using C-peptide, or a composition for the same.
  • the present invention comprises the step of administering an effective amount of C-peptide (C-peptide) to an animal concerned or onset of a disease caused by diabetic vascular leakage, diabetic vascular leakage It provides a method for preventing or treating a disease by.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases caused by diabetic vascular leakage, comprising C-peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating diabetic retinopathy, comprising administering an effective amount of C-peptide to an animal concerned or suffering from developing diabetic retinopathy. Provide a method.
  • the present invention comprises a C-peptide (C-peptide) as an active ingredient, diabetic It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetic retinopathy.
  • C-peptide C-peptide
  • the pharmaceutical composition comprising the C-peptide provided in the present invention can inhibit VEGF-induced VE-cadherin degradation and inhibit extravascular leakage, it is widely used for the prevention or treatment of various diabetic complications involving vascular leakage. Can be. Brief description of the drawings
  • FIG. La is a representative fluorescence image of the retina, in which a rectangular region is enlarged and shown at the bottom of each image.
  • FIG. 2A shows HUVECs pre-incubated for 30 min with 1 mM NAC, 0.5 mM Trolox or 5 ⁇ ⁇ - ⁇ , 0.5 nM
  • FIG. 2B shows VEGF-induced
  • HUVECs were incubated for 30 minutes by treatment with an appropriate concentration of C-peptide and treated with 10 ng / ml VEGF. Degree
  • FIG. 3 is a photograph showing that the Cpeptide inhibits VEGF-induced stress fiber formation and disruption of adhesion junctions.
  • Figure 3 shows that C-peptide inhibits VEGF-induced stress fiber formation.
  • Figure 4b is a histogram of the VE-cadherin adhesive bond portion shown in the dotted line.
  • FIG. 4c confirms that the C-peptide restores the degradation of the hyperglycemia-induced adhesive junction in the retina of diabetic mice.
  • intravitreal injection of 2 ⁇ C-peptide into one eye of diabetic mice diabetes + C-peptide; Diabetic + C-Pep
  • PBS intravitreal inject ion
  • Normal mice non-diabetic mice
  • FIG. 5 shows anti-VEGF and R0S inhibitors prevent vascular leakage in the retina of diabetic mice, with 2 ⁇ C-peptide in one eye of diabetic mice.
  • FIG. 5A shows fluorescence images of each retina (Bar, 100 ⁇ )
  • FIG. 5B shows quantitative analysis of retinal permeability by fluorescence intensity measurement of the entire retinal tissue. * p ⁇ 0.01. .
  • Figure 6a is a result of evaluating the residual amount of C-peptide after administering C-peptide to the mouse by the method of an osmotic pump (osmotic pump).
  • 6B and 6C show VEGF when C-peptide was administered to mice by intradermal injection.
  • Figure 6d is a graph showing the residual amount of C-peptide with time after administration of the C-peptide by the method of intravitreal injection.
  • FIG. 7 is a schematic representation of a possible signaling pathway of VEGF-induced vascular leakage inhibition by C-peptide, indicating that C-peptide inhibits VEGF-induced R0S production and inhibits vascular leakage.
  • the present inventors conducted various studies to develop a method for treating vascular leakage of diabetic retinopathy in diabetic patients, while VEGF shows the effect of producing intracellular R0S through intracellular calcium levels.
  • the peptide does not affect the level of intracellular sheath and has the effect of inhibiting VEGF-induced intracellular R0S increase; C-peptide inhibits the formation of stress fibers in endothelial cells and the degradation of VE-cadherin stimulated by VEGF; It was found that C-peptide inhibited VEGF-induced intracellular R0S production, which stimulates stress fiber formation and degradation of adhesive junctions as a result of blood vessel leakage, and inhibited blood vessel leakage in the retina of diabetic model mice.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a disease caused by diabetic vascular leakage using C ⁇ peptide, or a composition therefor; And a method for preventing or treating diabetic retinopathy, or a composition therefor.
  • the present invention provides a method for preventing or treating diabetic vascular leakage using C-peptide, or a composition therefor.
  • the present invention comprises the step of administering an effective amount of C-peptide (C-peptide) to the animal concerned or concerned with the development of the disease due to diabetic vascular leakage.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a disease caused by vascular leakage.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by vascular leakage, including C-peptide (C-peptide) as an active ingredient.
  • C-peptide 1 of the present invention refers to a peptide secreted with insulin in mammals, birds, and the like, and its precursor proinsulin is composed of insulin and C-peptides, It is generated from ⁇ -cells of Langerhans Island and is composed of 21 to 31 amino acid sequences.
  • C-peptide includes not only human C-peptide, but also dogs, cats, rats, chimpanzees, mice, cows, and the like. And C-peptides of birds including mammals or thrushes.
  • C-peptides from human C sapiens, SEQ ID NO: 1), ⁇ (Rat t us norvegicus, SEQ ID NO: 2) and chimpanzee (/ 3 ⁇ 473 troglodytes, SEQ ID NO: 3) consist of 31 amino acid sequences
  • C-peptides derived from the mouse are composed of 29 amino acid sequences
  • bovine peptides os iaurus, SEQ ID NO: 5
  • C peptides from us werula, SEQ ID NO: 6) and red hair booby / a sula, SEQ ID NO: 7) consist of 21 amino acid sequences.
  • C-peptide of the present invention may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 7.
  • the Cpeptide is used as an active ingredient of the method or composition provided by the present invention, and the method or composition is not only human, but also all diseases in which diabetic vascular leakage may occur. It may be applied to an animal, and it is preferable to use a C-peptide derived from a target animal to be applied.
  • a method or composition for humans may include human-derived C-peptide (SEQ ID NO: 1) as an active ingredient.
  • SEQ ID NO: 1 human-derived C-peptide
  • Inhibits R0S production does not affect intracellular calcium ion (Ca 2+ ) levels of C-peptide, inhibits stress-fiber formation of C-peptide And inhibition of adherens junction proteolysis of C-peptide It may be by one or more of the actions.
  • the prevention or treatment of diabetic vascular leakage of the C-peptide of the present invention can be equally applied to all animals that can develop diabetes as well as humans.
  • the effect since the effect is exhibited by inhibiting VEGF-induced VE-cadherin degradation induced by diabetes mellitus, the effect may be applied to peripheral blood vessels of other tissues as well as the retinal region identified in the embodiment of the present invention. have. That is, the diabetic blood vessel leakage in the present invention may be a retinal vessel leakage or other peripheral vessel leakage.
  • the method or composition of the present invention is a diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic vascular dysfunction, diabetic inflammation and the like, which are found in all animals that can develop diabetes as well as humans. It can be used to prevent or treat vascular leakage accompanying the development of complications.
  • the composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent as a pharmaceutical composition.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, adjuvants, stabilizers, diluents, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, adsorptive delay agents and the like.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, xylly, malty, starch, glycerin, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl salose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyridone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • compositions of the present invention may be used in the form of powder, granules, tablets, capsulants, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and the like, or sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include sperm, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • Such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate and sucrose in the lecithin-like emulsifier. (sucrose)
  • lactose, gelatin, and the like may be mixed and prepared.
  • Liquid preparations for oral administration may include suspending agents, liquid solutions, emulsions, syrups, and the like, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for non-oral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and freeze drying agents.
  • the non-aqueous preparation and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, etc. may be used.
  • the administration route of the C-peptide or the composition comprising the C-peptide may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue, but may be an osmotic pump. Avoid using 0 1!
  • the C-peptide of the present invention may be administered in an "effective amount” or "pharmaceutically effective amount”.
  • Effective amount or “pharmaceutically effective amount 1 " means a sufficient amount to have a prophylactic or therapeutic effect and an amount that will not cause side effects or serious or excessive immune reactions.
  • Disorder, severity of the disorder, activity of the specific compound, route of administration, rate of clearance, duration of treatment, drug used in combination or concurrently, age, weight, sex, diet, general health status, and pharmaceutical industry and medicine A variety of factors, including known factors, are known to those skilled in the art in consideration of the determination of such "effective amount” or “pharmaceutically effective amount", for example as described in Gi lman et al.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the composition may also be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • the present invention provides a method for preventing or treating diabetic retinopathy using C-peptide, or a composition therefor.
  • a method for preventing or treating diabetic retinopathy comprising administering an effective amount of a peptide (C-peptide) to an animal concerned or suffering from developing diabetic retinopathy.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic ret inopathy, comprising C-peptide as an active ingredient.
  • the C-peptide can suppress extravasation in the retina of the diabetic model mouse, and thus, the C-peptide or C-peptide is included.
  • the composition to be used can be used for the prevention or treatment of diabetic retinopathy.
  • the prevention or treatment of diabetic retinopathy of C-peptide can be equally applied to all animals that can develop diabetic retinopathy as well as humans.
  • "C-peptide 1 ""use","administration" of the present invention
  • the single dose using the intraocular injection and intradermal injection of the composition of the present invention or the C-peptide of the present invention is 2.4 / zg to 60 ⁇ , preferably 18; «g, and at 1.45 pmol / kg / min for subcutaneous injection using a miniosmotic pump It may be on the order of 36.5 pmol / kg / min.
  • the amount of use is not limited to the above range, and within the range of the daily amount of use, it may be adjusted according to the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of disease. Of course.
  • mice Six-week-old male C57BL / 6 mice were obtained from Nara Biotech (Seoul, Korea). The mice were housed in a thermostat box at 12 hour light / dark cycle. All experiments were performed in accordance with the guidelines of Experimental Ethics Committee of Kangwon National University.
  • HUVECs were isolated from human umbilical cord blood according to known methods and stage 3-6 cells were used for the experiment.
  • the cells were prepared with 23 ⁇ 4) gelatin-coded coverslide, dish containing M199 culture medium (including 20% FBS, 3 ng / ml bFGF, 5 U / ml heparin, 100 U / ml penici 11 in and 100 / zg / ml streptomycin).
  • M199 culture medium including 20% FBS, 3 ng / ml bFGF, 5 U / ml heparin, 100 U / ml penici 11 in and 100 / zg / ml streptomycin.
  • the cells When used in the experiment, the cells were cultured in low serum medium (the M199 culture medium or M199 culture medium containing only 1% FBS) for 6 hours, and 10 ng / ml VEGF or various concentrations of C- for an appropriate time. Peptides were treated.
  • low serum medium the M199 culture medium or M199 culture medium containing only 1% FBS
  • 10 ng / ml VEGF or various concentrations of C- for an appropriate time.
  • Peptides were treated.
  • diabetic model mice were prepared by a single intraperitoneal injection (150 mg / kg body weight) of 100 mM citric acid buffer (pH 4.5) containing streptozotocin (streptozotocin) to mice, and 10% sucrose was supplied overnight.
  • streptozotocin streptozotocin
  • Accu-Chek Active blood glucose monitor (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) was used to confirm that hyperglycemia was induced in the mice. Then, one week later, mice with glucose levels of 16 mM or more, polyuria, and glucose (glucosuria) at the time of fasting were obtained and used in the experiments.
  • the level of retinal leakage was quantitatively analyzed using fluorescein angiography.
  • the left ventricle of the mouse was injected with 1.25 mg of 500-kDa FITC-dextran (Sigma-Aldrich) and stained by circulation for 5 minutes. Fix with aldehyde for 45 minutes.
  • the retina was cut from the fixed eyeball, cut in the shape of a Maltese cross, the cut retina was placed in a slide glass, and observed using a confocal microscope. all The level of retinal leakage was measured by measuring the intensity of FITC-dextran leaking out of the retinal tissues (6 per group) and quantitatively analyzing it using the FV-300 software.
  • Fig. La is a representative fluorescence image of the retina, in which a rectangular area is enlarged and shown at the bottom of each image.
  • Example 3 Confirmation of Effect of C-peptide on Intracellular Reactive Oxygen Species Production and Calcium Grain Levels (1) Effect of C-peptide on VEGF-Induced Intracellular R0S Production
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF and C-peptide were added to HUVECs inoculated on the cover slide. Treated and incubated and incubated using a phenol red free medium containing ⁇ 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, OR) for the last 10 minutes. Placed in the chamber, the labeled cells were quickly scanned using confocal microscopy. Intracellular R0S levels were measured by comparing the fluorescence intensity of treated cells with those of untreated control cells, and the measured values were expressed as fold differences. The experimental results are shown in FIG. 2.
  • Figure 2 is a graph showing that C-peptide inhibits the production of VEGF-induced R0S but does not affect intracellular calcium ions. 2A shows 1 mM NAC, 0.5 mM Trolox or 5 ⁇ in HUVECs
  • VEGF produced intracellular R0S ( ⁇ ⁇ 0 ⁇ 01), and it was confirmed that such R0S production was removed by treatment with antioxidants Trolox and NAC (N-acetyl-N-cysteine) (FIG. 2A).
  • BAPTA-AM a calcium ion deposition agent, also inhibited the production of VEGF-induced intracellular R0S, which means that VEGF produces intracellular R0S by increasing intracellular calcium ion.
  • Figure 2b shows the dose-dependent inhibition of C-peptide against VEGF-induced R0S formation, HUVECs incubated for 30 minutes by treatment with the appropriate concentration of C ⁇ peptide, 10 ng / ml VEGF treatment results . The C-peptide was dose-dependently inhibited the production of VEGF-induced intracellular R0S and completely inhibited the production of R0S at 0.5 nM (FIG. 2B).
  • VEGF induced a sharp increase in intracellular calcium ions and was able to maintain elevated intracellular calcium ion levels for 600 seconds.
  • BAPTA-AM reacted with VEGF to intracellular calcium It was confirmed that the change in the ionic level is suppressed.
  • C-peptide did not increase intracellular calcium ions and did not affect VEGF-induced changes of intracellular calcium ions (FIG. 2C).
  • VEGF exhibits the effect of producing intracellular R0S through intracellular calcium ion levels, whereas C-peptide inhibits VEGF-induced intracellular R0S increase without affecting the level of intracellular calcium ion. It can be seen that the effect.
  • Example 4 Confirmation of the effect of C-peptide on VEGF-induced stress fibrogenesis
  • VEGF activates the influx of VE-cadherin, a result of stress fibrosis and vascular leakage
  • C-peptide Increasing VEGF levels in endothelial cells of the retina can induce stress fiber formation through increased R0S production.
  • actin filaments in HUVECs were tested. Visualized by staining with rhodamine—phalloidin.
  • HUVECs were incubated in gelatin-coated circular coverslides in 12-well culture plates, treated with VEGF, C-peptide or R0S remover for 30 minutes, then reacted with 10 ng / ml VEGF for 1 hour at 37 0 C. I was. Cells were quickly washed with PBS and fixed for 30 minutes using PBS with 3.7% formaldehyde. Cells were then treated with PBS containing 0.2% Triton ⁇ -100 for 30 minutes and stained for 1 hour using PBS containing rhodamine-pal loidin CMolecular Probes. Using a mounting solution The stained cells were placed in slide glass, and the actin filaments were observed using a confocal microscope. The experimental results are shown in FIG. 3.
  • FIG. 3 is a photograph showing that the Cpeptide inhibits VEGF-induced stress fiber formation and breakdown of the adhesive junction.
  • VEGF can form a stress fiber, it can be seen that it is inhibited by the treatment of C-peptide.
  • stress fiber formation activated by VEGF was also inhibited by treatment with NAC and Trolox, which are R0S eliminators, indicating that intracellular R0S is essential for VEGF-induced formation of stress fibers.
  • Example 5 Confirmation of the effect of C-peptide on the degradation of the adhesive junction
  • VEGF stimulates the degradation of VE-cadher in, and this degradation is inhibited by C-peptide.
  • C-peptide Such VEGF-induced degradation of VE-cadher in was also inhibited by NAC and Trolox.
  • Intracellular R0S mediated the VEGF-induced disruption of VE-cadherin.
  • Microvessels were stained in the total amount in the retina of mice. Specifically, the retina separated from the mouse was fixed in 100% ethane for 30 minutes, fat was removed in 100% ice-cold acetone for 10 minutes, and then cleared with 0.3% Triton X-100 for 1 hour. The retina was incubated with anti-VE-cadher in antibody (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) for 24 hours at 4 ° C., goat anti-mouse FITC
  • VVEEGGFF inhibited the formation of intracellular stress fibers as well as the production of intracellular R0S, which inhibited the degradation of adhesion junctions induced by VEGF. Therefore Furthermore, the VVEEGGFF level is increased in diabetic diabetic animals and and in the retina of diabetic patients, and the experimental results of these iinn vviittrroo levels are increased. In order to further clarify the test results, anti-diabetic diabetes induced by anti-VVEEGGFF antibodies and RR00SS inhibitors by St. temtem tozozosincin The effects of mammus on retinal vascular leakage of retinal blood vessels were tested. In terms of globule volume, diabetic mauss's was seen in one eye.
  • fluorescein angiography was used to quantify the level of retinal leakage.
  • the left ventricle of the mouse was injected with 1.25 mg of 500-kDa FITC-dextran (Sigma), stained by blood circulation for 5 minutes, the eye was extracted and immediately 4% paraformaldehyde.
  • the retina was dissected from the fixed eye, cut in the shape of a Maltese cross, and the cut retina was placed in a slide glass and observed using a confocal microscope.
  • FIG. 5A Intravitreal injection of monoclonal anti-VEGF antibody significantly inhibited microvascular leakage in the retina of diabetic mice, which is associated with retinal vascular leakage in VEGF diabetic mice. It can be confirmed. Intravitreal injection of NAC and Trolox inhibitors of R0S also inhibited retinal vascular leakage in diabetic mice.
  • C-peptide prevents VEGF-induced retinal vascular leakage in inhibiting intracellular R0S production in retinal endothelial cells.
  • Example 7 Effect of Administration of C-peptide
  • Figure 6a is a result of evaluating the residual amount of C-peptide after administering C-peptide to the mouse by the method of an osmotic pump (osmotic pump).
  • osmotic pump osmotic pump
  • FIGS. 6B and 6C show an image of each treatment group.
  • VEGF intradermal inject ion
  • -Peptide inhibits microvascular leakage in local blood vessels of streptozosin-induced diabetic mice. Putting all these results together, C-peptide is a stress fiber Promoting properties and adhesion degradation by concatenating parts of it can be seen that by suppressing the fine blood vessels intracellular R0S generate all VEGF- induced resulting in the leakage of, inhibiting microvascular leakage in the retina of diabetic mice also.
  • FIG. 6D The experimental results are shown in Figure 6d.
  • FIG. 6D when intravitreal injection was used, blood vessel leakage was already inhibited after about 24 hours, and the concentration of C-peptide in the eye was measured through FIG. 6D until about 12 hours. It was confirmed that normal C-peptide remained. That is, when the C-peptide is administered by intravitreal injection from the result of FIG. 6D, the C-peptide remains in the eye at a normal value, and thus, the VEGF It was confirmed that it inhibits the leakage of capillaries.
  • C-peptide inhibits VEGF-induced intracellular R0S production, which stimulates stress fiber formation and degradation of adhesive junctions as a result of vascular leakage, thereby preventing blood vessels in the retina of diabetic mice. It has been found to inhibit leakage ⁇ Industrial applicability
  • the pharmaceutical composition comprising the C-peptide provided in the present invention can inhibit VEGF-induced VE-cadherin degradation and inhibit extravascular leakage, it is widely used for the prevention or treatment of various diabetic complications involving vascular leakage. Can be.

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Abstract

본 발명은 C-펩타이드(C-peptide)를 포함하는 당뇨성 혈관누출(vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다. 본 발명에서 제공하는 C-펩타이드는 VEGF-유도성 VE-cadherin 분해를 억제하여 혈관외 유출을 억제할 수 있으므로, 혈관누출을 수반하는 다양한 당뇨성 합병증의 예방 또는 치료에 널리 활용 가능하다.

Description

명세서
발명의 명칭
c-펩타이드를 포함하는 당뇨성 혈관누출에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물
기술분야
본 발명은 C-펩타이드를 이용한 당뇨병 관련 질병의 예방 또는 치료에 대한 것으로， 구체적으로 C-펩타이드를 이용한 당뇨성 혈관누출에 의한 질병의 예방 또는 치료방법， 및 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료방법， 또는 이를 위한 조성물에 대한 것이다. 배경기술
당뇨병 (diabetes)은 인술린의 분비 결함 또는 인슐린 작용의 결함에서 기인한 만성 고혈당증 (hyperglycemia)의 특징을 나타내는 다중적 병인의 대사장애를 말하며, 혈중의 포도당이 비정상적으로 높은 상태가 장기간 지속될 경우 만성적인 대사장애와 이에 따른 만성적 혈관손상으로 다양한 합병증이 발생한다. 당뇨병에 걸린 후 10 년이 지나면 체내의 거의 모든 기관이 손상을 받아 합병증이 유발된다. 특히， 당뇨병 환자에게서는 비정상적인 혈관누출이 나타나며， 당뇨성 혈관누출은 당뇨성 망막병증， 당뇨성 신경장애증， 당뇨성 신장병， 당뇨성 혈관기능장애， 당뇨성 염증 등의 합병증을 유발한다.
이러한 당뇨병 합병증은 혈관내피세포성장인자 (VEGF; Vascular endothelial growth factor)의 과발현과 관련이 있다. VEGF 는 혈관누출인자로서 작용할 가능성이 있고，당뇨병 중에 망막에서 VEGF의 발현 증가는 혈관신생 및 황반부종을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 아울러, 최근의 연구결과는 R0S 생성과 스트레스 섬유형성이 접착연접부 (adherens junction)에서 VE-cadherin-기반 세포간 연결을 붕괴시키는 원인이 될 수 있다고 보고되었는데， 상기 VE-cadherin 은 혈관벽의 분해를 방지하고， 내피를 통해 거대분자의 통로를 조직화하는 필수구성요소라고 알려져 있다. 한편, 인간의 C-펩타이드 (C-peptide)는 인술린 전구체로부터 절단된 아미노산으로 구성된 펩타이드로서， 순환계에서는 췌장 β-세포에 의하여 인슐린과 동일한 몰농도로 분비된다. 제 1 형 당뇨병뿐만 아니라 제 2 형 당뇨병 후기에는 인슐린과 마찬가지로 C-펩타이드가 결핍되고， 주요 합병증으로서 성인에서 실명의 주된 원인이 되는 당뇨성 망막병증이 유발된다. 이러한 C-펩타이드 (C-peptide)는 당뇨병의 진단에 사용되고 있으나， 이를 이용한 당뇨성 혈관누출의 치료, 또는 당뇨성 혈관누출에 의한 질병을 치료하기 위한 방법에 대해서는 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서， 본 발명자들은 당뇨성 혈관누출을 치료하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과， C-펩타이드를 이용할 경우， 당뇨성 망막병증에서 VEGF의 과발현에 의해 유도되는 혈관누출을 방지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 발명의 상세한설명
기술적 과제
본 발명의 첫 번째 목적은 C-펩타이드 (C-peptide)를 이용한 당뇨성 혈관누출에 의한 질병의 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 Cᅳ펩타이드 (C-peptide)를 이용한 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료방법， 또는 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다. 기술적 해결방법
본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)의 유효량을 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 발병이 우려되거나， 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는，당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)를 유효성분으로 포함하는， 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)의 유효량을 당뇨성 망막병증 (diabet ic retinopathy)의 발병이 우려되거나 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)를 유효성분으로 포함하는， 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 유리한효과
본 발명에서 제공하는 C-펩타이드를 포함하는 약학조성물은 VEGF-유도성 VE-cadherin 분해를 억제하여 혈관외 누출을 억제할 수 있으므로， 혈관누출을 수반하는 다양한 당뇨성 합병증의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있다. 도면의 간단한설명
도 1은 C-펩타이드가 당뇨병-유도성 망막누출을 저해함을 나타내는 사진 및 그래프로서， 당뇨병 모델 마우스의 한쪽 안구에 C-펩타이드 2 ^를 안구주사하고 (당뇨 +C-펩타이드; Diabetic+C-pep), 다른 쪽 안구에는 동일부피의 PBS를 안구주사하고 (당뇨; Diabetic, n=6), 정상 (비 -당뇨병)마우스에도 역시 2 ^의 PBS를 안구주사한 후 (정상; Normal, n=6), 공초점현미경으로 망막을 관찰한 결과이다. 도 la는 망막의 대표적인 형광영상으로서， 사각형의 영역을 각 영상의 하부에 확대하여 나타내었다. 도 lb는 전체 망막조직의 형광강도를 측정하여 망막누출을 정량하고 (n=6), 6회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균 ±표준편차로 표시한 결과이다. *ρ<0·05. 도 2는 C-펩타이드가 VEGF-유도성 R0S의 생성을 억제하지만， 세포내 칼슘이온에는 영향을 미치지 않음을 나타내는 그래프이다. 도 2a는 HUVECs를 1 mM NAC, 0.5 mM Trolox또는 5μΜ ΒΑΡΤΑ-ΑΜ를 처리하여 30분동안 사전 배양하고， 0.5 nM
C-펩타이드 (C-Pep) 또는 10 ng/ml VEGF를 10분동안 처리하여 자극한 후， 공초점현미경을 이용하여 세포내 R0S 수준을 확인한 결과로， 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균 ±표준편차로 표시한 결과를 나타낸다.도 2b는 VEGF-유도성
R0S형성에 대한 C-펩타이드의 용량의존적 억제를 나타내는데, HUVECs를 적정농도의 C-펩타이드를 처리하여 30분동안 배양하고， 10 ng/ml VEGF를 처리한 결과이다. 도
2c는 ΙμΜ Fluo-4 AM를 이용하여 HUVECs를 표지하고， 공초점현미경을 이용하여 단일세포에서 세포내 칼슘이온 수준을 모니터링한 결과를 나타낸다 (n=3).
도 3은 Cᅳ펩타이드가 VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성과 접착연접부의 붕괴를 억제함을 나타내는 사진아다. 도 3은 C-펩타이드가 VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성을 억제함을 나타내는데， HUVECs에 10 ng/ml VEGF또는 0.5nMC-펩타이드를 단독으로 처리하거나， 또는 0.5 nM C-peptide, 1 mM NAC 또는 0.5 mM Trolox의 존재하에서 10 ng/ml VEGF를 처리하고 1시간 동안 배양하였으며， 미세 필라멘트를 rhodamine-phalloidin으로 염색하고， 공초점현미경으로 관찰하였다 (n=3). 스케일 바는 30卿를 나타낸다.
도 4a와 도 4b는 C-펩타이드가 VEGF-유도성 유출을 억제함을 나타내는데，
HUVECs에 10 ng/ml VEGF또는 0.5nMC-펩타이드를 단독으로 처리하거나，또는 0.5 nM C-peptide, 1 mM NAC 또는 0.5 mM Trolox의 존재하에서 10 ng/ml VEGF를 처리하고 90분동안 배양한 후 (n=3), 그 결과를 나타낸 것으로， 도 4a는 VE-cadherin을 염색하고 공초점현미경으로 가시화한 결과이며 (n=3), 스케일 바는 20卿를 나타낸다. 도 4b는 도트선으로 표시된 접착연접부를 VE-cadherin의 히스토그램으로 표시한 것이다.
도 4c는 C-펩타이드가 당뇨성 마우스의 망막에서의 고혈당증-유도된 접착연접부의 분해를 회복시킴을 확인한 결과이다. 구체적으로， 당뇨성 마우스의 한쪽 눈에 2 ^의 C-펩타이드를 안구주사 (intravitreal injection)하였고 (당뇨 +C-펩타이드; Diabetic + C-Pep),동일한 용량의 PBS를 반대쪽 눈에 주사하였다 (당뇨; Diabetic, n=3) · 정상 마우스 (비ᅳ당뇨성 마우스) 역시 2 ^의 PBS를 안구주사 (intravitreal inject ion)하였다 (정상； Normal , n=3) . 망막에서 VE-cadherin을 염색하고，공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다. ( τ=3). Bar, 30 pm. 도 5는 항 -VEGF 및 R0S 저해제가 당뇨성 마우스의 망막에서의 혈관 누출을 막음을 나타내는 도면으로， 당뇨성 마우스의 한쪽 눈에 2 ^의 C-펩타이드
(Diabetic + C-Pep), 항 -VEGF (Diabetic+anti-VEGF) , N-acety卜 cysteine
(Diabetic+NAC), 또는 Trolox (Diabetic+Trolox)를 안구주사하고， 동일한 부피의
PBS를 반대쪽 눈에 주사하였고 (Diabetic; n=6 per group) , 정상마우스 (비-당뇨성 마우스) 역시 한쪽 눈에 2 ^의 PBS를 주사하여 (Normal; n=6 per group), 망막을 공초점 현미경으로 시각화한 결과이다. 도 5a는 망막 각각의 형광이미지를 나타내며 (Bar, 100 μιη) , 도 5b는 망막 조직 전체의 형광 강도 측정에 의한 망막 투과도의 정량 분석결과를 나타낸 것이다 0?=6) . *p<0.01. .
도 6a는 삼투압 펌프 (osmotic pump)의 방법으로 마우스에게 C-펩타이드를 투여한 후 C-펩타이드의 잔존량을 평가한 결과이다. 도 6b와 도 6c는 피내주사 (intradermal injection)로 마우스에게 C—펩타이드를 투여한 경우 VEGF에 의한 모세혈관의 누출을 억제효과를 확인한 결과이다.도 6d은 안구주사 (intravitreal injection)의 방법으로 C—펩타이드를 투여한 후 시간에 따른 C-펩타이드의 잔존량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 C-펩타이드에 의한 VEGF-유도성 혈관누출 억제의 가능성 있는 신호전달 경로를 나타내는 개략도로서， C-펩타이드는 VEGF-유도성 R0S 생성을 억제하여 혈관누출을 저해함을 나타낸다. 발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명자들은 당뇨병 환자에게서 당뇨성 망막병증의 혈관누출을 치료하기 위한 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과， VEGF는 세포내 칼슘이은 수준을 통해 세포내 R0S를 생성시키는 효과를 나타내는 반면， C-펩타이드는 세포내 칼슴이은의 수준에 영향을 미치지 않고， VEGF-유도성 세포내 R0S 증가를 억제하는 효과를 나타내며; C-펩타이드는 내피세포에서 스트레스 섬유의 형성 및 VEGF에 의하여 자극된 VE-cadherin의 분해를 억제하고; C-펩타이드가 혈관누출의 결과로서 스트레스 섬유 형성과 접착연접부의 분해를 자극하는 VEGF-유도성 세포내 R0S 생성을 억제하여， 당뇨병 모델 마우스의 망막에서 혈관누출을 저해함을 알 수 있었다. 이러한, C-펩타이드의 당뇨성 혈관누출 저해 기전을 도 7에 나타내었다. 이에， 본 발명은 Cᅳ펩타이드를 이용한 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료방법， 또는 이를 위한 조성물; 및 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료방법, 또는 이를 위한 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 첫 번째 실시양태로서， 본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)를 이용한 당뇨성 혈관누출 예방 또는 치료방법， 또는 이를 위한 조성물을 제공한다. 구체적으로， 본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)의 유효량을 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 발병이 우려되거나， 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는，당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료방법에 대한 것이다. 또한， 본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)를 유효성분으로 포함하는， 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 용어 "C-펩타이드 (C-peptide)1'란， 포유류， 조류 등에서 인슐린과 함께 분비되는 펩타이드로서， 그의 전구체인 프로인슐린은 인슐린과 C-펩타이드로 구성되어 있으며, 인슐린과 같이 췌장의 랑게르한스섬의 β-세포에서 생성되는 것으로， 21 내지 31개의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명에서 C-펩타이드는 인간의 C-펩타이드는 물론， 개， 고양이， 랫트， 침팬지， 마우스， 소， 등을 포함하는 포유류 또는 지빠귀 등을 포함하는 조류의 C-펩타이드를 포함한다.
예를 돌어, 인간 C sapiens, 서열번호 1), ^트 {Rat t us norvegicus, 서열번호 2) 및 침팬지 (/¾73 troglodytes, 서열번호 3) 유래의 C-펩타이드는 31개의 아미노산 서열로 구성되고， 마우스 (Mus miscuhjs, 서열번호 4)유래의 C-펩타이드는 29개의 아미노산 서열로 구성되며 소 ( os iaurus，서열번호 5)유래의 Ο펩타이드는 26개의 아미노산 서열로 구성되며， 지빠귀 (： T ri/us werula, 서열번호 6) 및 붉은발 부비 /a sula, 서열번호 7) 유래의 Cᅳ펩타이드는 21개의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 C-펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 Cᅳ펩타이드는 본 발명에서 제공하는 방법 또는 조성물의 유효성분으로서 사용되는데， 상기 방법 또는 조성물은 인간뿐만 아니라， 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병이 발생할 수 있는 모든 동물에게 적용될 수 있으며， 이때 적용되는 대상동물에서 유래된 C-펩타이드를 사용함이 바람직하다. 예를 들어， 사람을 대상으로 하는 방법 또는 조성물은 유효성분으로서 인간 유래의 C-펩타이드 (서열번호 1)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면， C-펩타이드가 당뇨병 모델 마우스의 혈관외 유출을 억제할 수 있음을 확인하였으며, 따라서 C-펩타이드 또는 C-펩타이드를 포함하는 조성물은 당뇨성 혈관누출을 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 구체적으로， 이와 같은 본 발명의 방법 또는 조성물의 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료 효과는， C-펩타이드 (Opept ide)의 세포내
R0S 생성 억제작용， C-펩타이드 (C-peptide)의 세포내 칼슘이온 (Ca2+) 수준에 영향을 미치지 않음， C-펩타이드 (C-peptide)의 스트레스 섬유 (stress-fiber) 형성 억제 작용， 및 Cᅳ펩타이드 (C-peptide)의 접착연접 (adherens junction) 단백질 분해 억제 작용 중 하나 이상에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 C-펩타이드의 당뇨성 혈관누출 예방 또는 치료효과는 인간뿐만 아니라 당뇨병이 발생할 수 있는 모든 동물에서도 동일하게 적용될 수 있다. 뿐만 아니라， 상기 효과는 당뇨병에 의해 유도되는 VEGF-유도성 VE-cadherin 분해를 억제함에 의하여 나타나는 것이므로， 본 발명의 실시예에서 확인된 망막부위뿐만 아니라 다른 조직의 말초혈관 부위에서도 상기 효과가 적용될 수 있다. 즉， 본 발명에서 상기 당뇨성 혈관누출은 망막 혈관누출 또는 그 외 말초혈관부위의 누출일 수 있다.
따라서， 본 발명의 방법 또는 조성물은 인간뿐만 아니라 당뇨병이 발생할 수 있는 모든 동물에서 나타나는 당뇨성 망막병증， 당뇨성 신경장애증， 당뇨성 신장병， 당뇨성 혈관기능장애， 당뇨성 염증 등의 다양한 당뇨성 합병증의 발병시 수반되는 혈관누출을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 한편 , 본 발명의 조성물은， 약학 조성물로써 약학적으로 허용 가능한 담체， 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 회석제 "란 임의의 및 모든 용매， 분산 매질, 코팅제， 항원보강제， 안정제, 회석제， 보존제， 항균제 및 항진균제， 등장성 작용제， 흡착지연제 등을 포함한다. 약학조성물에 포함될 수 있는 담체， 부형제， 희석제로는 락토즈， 덱스트로스， 슈크로스， 솔비를， 만니를, 자일리를, 말티를, 전분， 글리세린， 전분， 아카시아 고무， 알지네이트， 젤라틴， 칼슘포스페이트， 칼슘실리케이트， 셀를로즈， 메틸 샐를로즈， 미정질 셀를로즈， 폴리비닐 피를리돈， 물， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 탈크， 마그네슘 스테아레이트， 광물유 등이 될 수 있다. 또한， 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제， 과립제， 정제， 캡술제， 현탁액， 에멀견， 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정게， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 슈크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
아울러， 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제， 내용액제， 유제， 시럽제 등을 사용할 수 있으며， 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제，예를 들면 습윤제，감미제，방향제，보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액，비수용성제,현탁제，유제，동결 건조제제가 포함된다. 비수용성제제， 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수도 있다. 한편, 본 발명의 방법 또는 조성물에 있어서의， C-펩타이드 또는 C-펩타이드를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으나， 삼투압 펌프 (osmotic pump)를 01용한 피하주 ! "(subcutaneous injection), 피내주 Λ]·( intradermal injection) , 정맥주 ！ "(intravein injection) , ^τ¾"^ΛΚ intraperitoneal injection) 또는 안구주사 (intravitreal inject ion)에 의해 투여되는 것이 더욱 바람직하다.
또한,본 발명의 C-펩타이드는， "유효량' '또는 "약제학적으로 유효한 양''으로 투여될 수 있다. "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양1'이란， 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 층분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반웅을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며， 유효 용량 수준은 치료될 장애， 장애의 중증도， 특정 화합물의 활성， 투여경로， 제거 속도， 치료 지속 기간， 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물， 대상체의 연령， 체중， 성별， 식습관， 일반적인 건강 상태， 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 이러한 "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며， 예를 들어 문헌 [Gi lman et al . , eds. , Goodman And Gi lman' s： The Pharmacological Bases of Therapeut ics , 8th ed. , Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. , Mack Publishing Co. , East on, Pa. , 1990]에 기재되어 있다. 아울러， 본 발명의 방법 또는 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며， 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다ᅳ
본 발명의 두 번째 실시양태로서， 본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)를 이용한 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료방법， 또는 이를 위한 조성물을 제공한다.구체적으로，본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)의 유효량을 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy)의 발병이 우려되거나 발병된 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료방법에 대한 것이다. 또한， 본 발명은 C-펩타이드 (C-peptide)를 유효성분으로 포함하는， 당뇨성 망막병증 (diabetic ret inopathy)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.
상술한 바와 같이， 본 발명의 제 2 실시예에 의하면， C-펩타이드는 당뇨병 모델 마우스의 망막에서 나타나는 혈관외 유출을 억제할 수 있음을 확인하였고, 따라서， 상기 C-펩타이드 또는 C-펩타이드를 포함하는 조성물은 당뇨성 망막병증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 이러한 C-펩타이드의 당뇨성 망막병증 예방 또는 치료효과는 인간뿐만 아니라 당뇨병 망막병증이 발생할 수 있는 모든 동물에서도 동일하게 적용될 수 있다. 한편, 본 발명의 "C-펩타이드 (C-peptide)1' "용법"， "투여"，
"유효량 (약제학적으로 유효한 양)" 등에 대한 일련의 내용은， 상기 첫 번째 실시양태에서 설명한 바와 동일하다.
특히， 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료를 위한 경우， 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 C-펩타이드 (C-peptide)의 안구주사법과 피내주사법을 이용한 1회 투여량은 2.4 /zg 내지 60 β 일 수 있으며, 바람직하게는 18 ； «g이고， miniosmotic pump를 이용한 피하주사법의 경우 1.45 pmol/kg/min 에서 36.5 pmol/kg/min 정도일 수 있다. 그러나 사용량이 상기의 범위에 한정되는 것은 아니며,상기 하루 사용량의 범위 내에서，환자의 체중，연령,성별,건강상태，식이， 투여시간， 투여방법， 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있음은 물론이다. 발명의 실시를 위한 형태
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명올 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1: 실험의 준비 실시예 1-1: 실험동물
6주령 웅성 C57BL/6 마우스를 나라 바이오텍 (서울， 한국)에서 입수하였다. 상기 마우스를 12시간 명 /암주기로 온도조절 상자에서 사육하였다. 모든 실험은 강원대학교의 실험윤리위원희의 지침에 따라 수행하였다. 실시예 1-2: 세포배양
HUVECs를 공지된 방법에 따라 인간의 제대혈로부터 분리하고， 3-6기 세포를 실험에 사용하였다. 상기 세포를 M199 배양배지 (20% FBS, 3 ng/ml bFGF, 5 U/ml heparin, 100 U/ml penici 11 in및 100 /zg/ml streptomycin포함)를 포함하는 2¾)젤라틴 코딩 커버슬라이드， 디쉬 또는 플레이트에서 접종하고， 37°C를 유지하는 5> C02 배양기에서 배양하였다.
실험에 사용되는 경우에는， 상기 세포를 저혈청배지 (상기 M199 배양배지 또는 1% FBS만을 포함하는 M199 배양배지)에서 6시간 동안 배양하고， 적절한 시간동안 10 ng/ml VEGF또는 다양한 농도의 C-펩타이드를 처리하였다. 실시예 1-3: 통계분석
하기 각 실시예에서 수득한 데이터는 Origin 6. l(0r iginLab, Northampton, MA)을 이용하여 그래프화하였고， 통계적 유의성은 t-test 및 AN0VA를 이용하여 결정하였다. 이때， P 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 분석하였다. 실시예 2: 당뇨모델 동물에서의 C-펩타이드의 미세혈관누출 저해 효과확인 당뇨병 모델동물 및 당뇨병 환자의 망막에서 VEGF 수준이 증가한다. 이에， 스트렙토조토신 당뇨모델 마우스에서 당뇨성 망막병증에 의한 망막 혈관누출에 대한 C-펩타이드의 효과를 조사하였다. 먼저， 마우스에 스트렙토조토신 (streptozotocin)을 포함하는 100 mM 시트르산 완충액 (pH 4.5)을 단회 복강주사 (150 mg/kg 체중)하여 당뇨병 모델 마우스를 제작하고， 하룻밤 동안 10%수크로스를 공급하였다. 스트렙토조토신 주사 2일 후， Accu-Chek Active blood glucose monitor(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 상기 마우스에서 고혈당증이 유발됨을 확인하였다. 그 후， 1주일이 경과한 시점에서， 비ᅳ단식시 혈당 수치가 16 mM이상이고， 다뇨성 (polyuria)이며， 당뇨성 (glucosuria)인 마우스를 수득하여 실험에 사용하였으며, 이하 당뇨성 마우스라 지칭한다.
상기 당뇨성 마우스 (그룹당 6마리)의 한쪽 눈에 C-펩타이드를 포함하는 PBS(3.7//g/ml) 2!Λ를 안구주사하고, 다른 쪽 눈에는 동일 부피의 PBS를 안구주사하였다. 또한， 정상 (비 -당뇨병)마우스에도 역시 2/^의 PBS를 안구주사하였다 (정상; Normal, n=6). 위와 같은 안구주사 후， C-펩타이드를 주사한 마우스의 유리체방 (vitreous chamber) 내의 C-펩타이드 농도를 생리학적 범위 (0.9 to 2.0 nM) 내에서 12시간 동안 유지하였다.
안구주사 후 24시간이 경과한 시점에서， 형광안저조영술 (fluorescein angiography)을 이용하여 망막누출의 수준을 정량분석하였다. 망막누출의 수준을 정량분석하기 위하여， 마우스의 좌심실에 500-kDa FITC-dextran(Sigma-Aldrich) 1.25mg을 주사하고， 5분동안 혈액순환시켜서 염색시켰으며, 안구를 적출하고 즉시 4% 파라포름알데히드를 사용하여 45분동안 고정시켰다. 상기 고정된 안구로부터 망막을 절개하고， 몰타십자 형상에서 절단하였으며， 절단된 망막을 슬라이드 글라스에 안치시킨 다음， 공초점현미경을 사용하여 관찰하였다. 전체 망막조직 (그룹당 6개)에서 스며나오는 FITC-dextran의 강도를 측정하고, 이를 FV-300 software에 적용하여 정량적으로 분석함으로써， 망막누출의 수준을 측정하였다. 실험 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 C-펩타이드가 당뇨병ᅳ유도성 망막누출을 저해함을 나타내는 사진 및 그래프로서, 당뇨병 모델 마우스의 한쪽 안구에 C-펩타이드 를 안구주사하고 (당뇨 +C-펩타이드; Diabetic+C-pep, /尸 6), 다른 쪽 안구에는 동일부피의 PBS를 안구주사하고 (당뇨; Diabetic, n=6), 정상 (비 -당뇨병)마우스에도 역시 2/^의 PBS를 안구주사한 후 (정상; Normal, n=6)， 공초점현미경으로 망막을 관찰한 결과이다.
도 la는 망막의 대표적인 형광영상으로서， 사각형의 영역을 각 영상의 하부에 확대하여 나타내었다.도 la를 참고하면， FITC-dextran의 혈관외 유출수준은 당뇨병 모델 마우스의 망막 (n=6)에서 현저하게 높은 수준을 나타내었고， 이러한 누출은 C-펩타이드가 주사된 반대편 안구의 망막 (n=6)에서는 억제됨을 확인할 수 있다 (도 la).
또한， 도 lb는 전체 망막조직의 형광강도를 측정하여 망막누출을 정량하고 (n=6), 6회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균 ±표준편차로 표시하였다. *p<0.05. 도 lb를 참고하면， 당뇨병 모델 마우스의 망막에서 혈관누출에 대한 C-펩타이드의 억제효과는 전체 망막조직 (n=6)에서 FITC-dextran의 형광강도를 확인함에 의하여 정량적으로 분석， 확인 할 수 있었다 (p<0.05, 도 lb). 실시예 3: 세포내 R0S(reactive oxygen species) 생성 및 칼슘이은 수준에 미치는 C-펩타이드의 효과 확인 (1) VEGF-유도성 세포내 R0S 생성에 대한 C-펩타이드의 효과
당뇨병에서， 막막 내피세포에서의 증가된 VEGF의 발현은 세포내 R0S의 생성을 통한 망막의 혈관 누출과 관련이 있다.이에， C-펩타이드의 VEGF-유도된 R0S 생성 억제 효과 및 이에 따른 혈관 누출 억제 효과를 HUVECs을 사용하여 평가하였다.
구체적으로， 커버슬라이드에 접종한 HUVECs에 VEGF 및 C-펩타이드를 처리하여 배양하고, 마지막 10분 동안 ΙΟμΜ 2' ,7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(Molecular Probes, Eugene, OR)를 포함하는 페놀레드가 없는 배지를 사용하여 배양하였다.이어，배양이 종료된 커버슬라이드를 관류 챔버에 안치시키고， 공초점현미경을 사용하여 표지된 세포를 신속하게 스캔하였다. 세포내 R0S 수준은 처리된 세포의 형광강도를 처리되지 않은 대조군 세포와 것과 비교함으로써 측정하고， 측정된 값은 배수차로서 표시하였다. 실험결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 C-펩타이드가 VEGF-유도성 R0S의 생성을 억제하지만， 세포내 칼슘이온에는 영향을 미치지 않음을 나타내는 그래프이다. 도 2a는 HUVECs에 1 mM NAC, 0.5 mM Trolox 또는 5μΜ
ΒΑΡΤΑ-ΑΜ ( 1 , 2-b i s ( 2-am i nophenoxy ) e t hane-N , N , N- ' ,Ν'-tetraacet ic acid tetrakis(acetoxymethyl ester))를 처리하여 30분동안 사전 배양하고， 0.5 nM C-펩타이드 (C-Pep) 또는 10 ng/ml VEGF를 10분동안 처리하여 자극한 후, 공초점현미경올 이용하여 세포내 R0S 수준을 확인한 결과로, 3회 반복실험을 통해 얻어진 실험결과를 평균 ±표준편차로 표시한 결과를 나타낸다. 공지된 바와 같이，
VEGF는 세포내 R0S를 생성하고 (ρ<0·01), 이러한 R0S 생성은 항산화제인 Trolox 및 NAC(N-acetyl-N-cysteine)의 처리에 의해 제거됨을 확인할 수 있었다 (도 2a). 한편， 칼슘이온 침착제인 BAPTA-AM 역시 VEGF-유도성 세포내 R0S의 생성을 억제하였는데， 이는 VEGF가 세포내 칼슘이온의 증가에 의해 세포내 R0S를 생성함을 의미하는 것으로 분석되었다. 또한, 도 2b는 VEGF-유도성 R0S 형성에 대한 C-펩타이드의 용량의존적 억제를 나타내는데， HUVECs를 적정농도의 Cᅳ펩타이드를 처리하여 30분 동안 배양하고， 10 ng/ml VEGF를 처리한 결과이다. C-펩타이드는 용량의존적으로 VEGF-유도성 세포내 R0S의 생성을 억제하고， 0.5nM에서 R0S의 생성을 완전히 저해함을 확인하였다 (도 2b).
(2) VEGF-유도성 세포내 칼슘이온 향상에 대한 C-펩타이드의 효과
상기 결과에 따라， 세포내 칼슘이온 (Ca2+) 수준을 모니터링하기 위하여， 커버슬라이드에 접종된 세포를 30분 동안 lpMFluo-4AM과 반응시켰다. 그 후， 상기 커버슬라이드를 관류 챔버에 안치시키고 공초점현미경 (FV-300)을 이용하여 10초마다 스캔하였으며， 스캔하여 얻어진 연속영상을 처리하여 단일세포에서 세포내 칼슘이온 수준의 변화를 분석하였고， 분석결과를 상대적인 형광강도 (relative fluorescence intensity, RFI)로서 표시하였다.
실험 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c는 ΙμΜ Fluo-4 AM를 이용하여
HUVECs를 표지하고， 공초점현미경을 이용하여 단일세포에서 세포내 칼슴이온 수준을 모니터링한 결과를 나타낸다 (n=3). 도 2c를 참고하면, VEGF는 세포내 칼슘이온의 급격한 증가를 유도하였고， 증가된 세포내 칼슘이온 수준을 600초 동안 유지할 수 있었으며， 예상한 바와 같이， BAPTA-AM은 VEGF에 반웅하여 세포내 칼슘이온 수준의 변화를 억제함을 확인하였다. 이에 반하여, C-펩타이드는 세포내 칼슘이온을 증가시키지 않았고， 세포내 칼슘이온의 VEGF-유도성 변화에 영향을 미치지 않았다 (도 2c).
상기 결과로부터， VEGF는 세포내 칼슘이온 수준을 통해 세포내 R0S를 생성시키는 효과를 나타내는 반면， C-펩타이드는 세포내 칼슴이온의 수준에 영향을 미치지 않고도, VEGF-유도성 세포내 R0S 증가를 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 실시예 4: VEGF-유도성 스트레스 섬유형성에 미치는 C-펩타이드의 효과 확인
VEGF가 스트레스 섬유형성과 혈관누출의 결과인 VE-cadherin의 유입을 활성화시키기 때문에， HUVECs에서 VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성 및 접합연접부의 분해에 미치는 C-펩타이드의 효과를 확인하고자 하였다. 망막의 내피세포에서의 VEGF 수준의 증가는 R0S 생성의 증가를 통한 스트레스 섬유 형성을 유도할 수 있다. VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성에 미치는 C-펩타이드의 효과를 확인하기 위해， HUVECs 내의 액틴 필라멘트를 rhodamine— phalloidin로 염색하여 시각화하였다.
구체적으로， HUVECs를 12웰 배양 플레이트내의 젤라틴 코팅된 원형 커버슬라이드에서 배양하고， 30분 동안 VEGF, C-펩타이드 또는 R0S제거제를 처리한 다음， 370C에서 1시간 동안 10 ng/ml VEGF와 반웅시켰다. 세포를 PBS로 신속하게 세척하고， 3.7% 포름알데히드를 포함하는 PBS를 사용하여 30분 동안 고정시켰다. 그런 다음， 세포를 0.2% Triton Χ-100을 포함하는 PBS로 30분 동안 처리하고， rhodamine-pal loidinCMolecular Probes)을 포함하는 PBS를 사용하여 1시간 동안 염색하였다.설치용액 (mounting solution)을 이용하여 상기 염색된 세포를 슬라이드 글래스에 안치시키고， 공초점현미경을 이용하여 액틴 필라멘트를 관찰하였다. 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 Cᅳ펩타이드가 VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성과 접착연접부의 붕괴를 억제함을 나타내는 사진이다. 도 3은 C-펩타이드가 VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성을 억제함을 나타내는데, HUVECs에 10 ng/ml VEGF 또는 0.5 nM Ο펩타이 H를 단독으로 처리하거나， 또는 0.5 nM C-펩타이드， 1 mM NAC또는 0.5 mM Trolox의 존재하에서 10 ng/ml VEGF를 처리하여 1시간 동안 배양하였으며, 미세 필라멘트를 rhodamine-phalloidin으로 염색하고， 공초점현미경으로 관찰한 결과로 (n=3), 스케일 바는 30卿를 나타낸다. 도 3을 참고하면， VEGF는 스트레스 섬유를 형성할 수 있으나, 이는 C-펩타이드의 처리에 의해 억제됨을 알 수 있다. 또한， VEGF에 의해 활성화된 스트레스 섬유 형성은 R0S 제거제인 NAC및 Trolox를 처리함에 의하여도 억제되었는데，이로부터 세포내 R0S가 스트레스 섬유의 VEGF-유도성 형성에 필수적임을 알 수 있었다.
즉， 상기 실시예 2의 결과로부터 확인한 C-펩타이드가 VEGF-유도성 R0S 생성올 억제한다는 점을 감안한다면， C-펩타이드가 세포내 R0S 생성을 방지함에 의하여 VEGF-유도성 스트레스 섬유 형성을 억제함을 알 수 있었다. 실시예 5: 접착연접부의 분해에 미치는 C-펩타이드의 효과 확인
(1) HUVECs에서의 접착연접부의 분해에 미치는 C-펩타이드의 효과
당뇨병—유도성 혈관 누출에 대한 C-펩타이드 관련 메커니즘을 밝히기 위해， 누출인자로서 접착연접부 단백질인 VE-cadherin의 VEGF-유도성 변화에 대한 C-펩타이드의 효과를 HUVECs에서 확인하고자 하였다. 구체적으로， 6웰 플레이트에서 포화배양된 세포층 (HUVECs)에 C-펩타이드 또는 R0S 제거제를 처리하여 30분 동안 반웅시키고， 370C에서 90분 동안 VEGF를 처리하였다. 상기 처리된 세포를 PBS로 세척하고， 3.7% 포름알데히드를 포함하는 PBS를 사용하여 30분동안 고정시켰다. 세포를 0.2% Triton X-100을 포함하는 PBS로 30분 동안 처리하고,단클론 VE-cadher in항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA)를 포함하는 PBS를 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 염색하였다. 그런 다음， 염소의 항-마우스 FITC(f luorescein isothiocyanate; Sigma, St. Louis, M0)로 반웅시키고， 공초점현미경을 이용하여 VE-cadherin를 관찰하였다. 실험 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4a와 도 4b는 C-펩타이드가 VEGF-유도성 유출을 억제함을 나타내는데, HUVECs에 10 ng/ml VEGF 또는 0.5 nM C-펩타이드를 단독으로 처리하거나, 또는 0.5 nM C-펩타이드， 1 mM NAC또는 0.5 mM Trolox의 존재하에서 10 ng/ml VEGF를 처리하고 90분 동안 배양한 후 (n=3), VE-cadher in을 염색하고 공초점현미경으로 가시화한 결과이며 (n=3), 스케일 바는 를 나타낸다.
도 4a를 참고하면， VEGF는 VE-cadher in의 분해를 자극하고， 이러한 분해는 C-펩타이드에 의해 억제되며， 이러한 VE-cadher in의 VEGF-유도성 분해는 NAC 및 Trolox에 의해서도 저해되었는데， 이로부터 세포내 R0S가 VE-cadherin의 VEGF-유도성 붕괴를 매개함을 알 수 있었다.
또한， 상기 VE-cadher in의 분해에 의해 발생하는 누출수준의 변화를 상대적인 형광강도 (relative fluorescence intensity, RFI)를 나타내는 히스토그램으로 표시한 도 4b를 참고하면， 상기 접착연접부 형광강도에서 VEGF-유도성 감소는 Cᅳ펩타이드와 R0S 제거제의 처리에 의해 회복됨을 확인할 수 있다. 따라서， C-펩타이드는 내피세포에서 세포내 R0S의 생성을 억제하여 세포 연접부에서의 VEGF에 의하여 자극된 VE-cadher in의 분해를 억제함을 알 수 있었다 .
(2) 망막에서의 접착연접부의 분해에 미치는 C-펩타이드의 효과 당뇨성 마우스의 한쪽 눈에 2 ^의 C-펩타이드를 안구주사 (intravitreal inject ion)하였고 (Diabetic + C-Pep), 동일한 용량의 PBS를 반대쪽 눈에 주사하였다 (Diabetic, n=3) . 정상 마우스 (비—당뇨성 마우스) 역시 2 ^의 PBS를 안구주사 (intravitreal inject ion)하였다 (Normal, n=3). 상기 마우스 각각의 망막의 VE-cadherin 을 염색하고, 다음과 같이 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
마우스의 망막 내의 전체 양에서의 미세혈관을 염색하였다. 구체적으로， 마우스로부터 분리된 망막을 100% 에탄을에서 30 분 동안 고정하고， 100% ice-cold 아세톤에서 10 분 동안 지방을 제거한 후， 0.3% Triton X-100으로 1시간 동안 투명화하였다. 상기 망막은 항 -VE-cadher in항체 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)와 함께 4°C에서 24시간 동안 배양하였고， 염소의 항-마우스 FITC
(Sigma)로 4°C에서 24시간 동안 탐침한 후， 공초점현미경을 이용하여
VE-cadher in를 관찰하였다 (FV-300, Olympus) .
실험결과를 도 4c에 나타내었다. 도 4c를 참고하면， HUVECs에서의
Cᅳ펩타이드의 VEGF에 의하여 자극된 VE-cadherin의 분해 억제 효과와 대웅되게， Cᅳ펩타이드의 안구주사 (intravitreal injection)는， 당뇨성 마우스의 망막의 미세혈관에서의 당뇨성 접착연접부의 분해를 억제함을 확인할 수 있었다. 따라서， C-펩타이드는 내피 세포에서의 세포 내 R0S 생성을 억제함으로, 세포 연접부에서 VEGF에 의하여 자극된 VE-cadherin의 분해를 억제함을 알 수 있었다. 실시예 6: C-펩타이드의 당뇨성 마우스의 망막에서의 미세혈관 누출 억제 효과 확인 상기의 실험결과로부터 배양된 내피세포에서의 in vitro 실험결과는
C-펩타이드는 세포내 스트레스 섬유의 형성뿐 아니라 세포내 R0S의 생성을 억제함으로 VEGF에 의해 유도된 접착연접부의 분해가 억제됨을 확인하였다. 이에 더더하하여여，， 당당뇨뇨성성 동동물물 및및 당당뇨뇨성성 환환자자의의 망망막막에에서서 VVEEGGFF 수수준준이이 증증가가하하며며，， 이이러러한한 iinn vviittrroo 수수준준의의 실실험험결결과과를를 더더욱욱 확확실실히히 하하기기 위위해해，， 항항 --VVEEGGFF 항항체체 및및 RR00SS 저저해해제제가가 스스트트템템토토조조신신에에 의의해해 유유발발된된 당당뇨뇨성성 마마우우스스의의 망망막막 혈혈관관 누누출출에에 미미치치는는 효효과과를를 실실험험하하였였다다.. 구구체체적적으으로로，， 당당뇨뇨성성 마마우우스스의의 한한쪽쪽 눈눈에에 모모노노클클로로날날 VVEEGGFF항항체체 ((110000 //gg//mmll)),, NN--aacceettyyll--ccyysstteeiinnee ((8811..55 mmgg//mmll )) ,, 및및 TTrroollooxx ((112255 ////gg//mmll ))를를
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injection)하였고，동일한 부피의 PBS를 반대쪽 눈에 주사하였다 (n = 6 per group) . 주사ᅳ후 24시간 후에 형광안저조영술 (fluorescein angiography)을 망막누출의 수준을 정량분석하였다. 망막누출의 수준을 정량분석하기 위하여， 마우스의 좌심실에 1.25 mg의 500-kDa FITC-dextran (Sigma) 을 주사하고， 5분동안 혈액순환시켜서 염색시켰으며， 안구를 적출하고 즉시 4% 파라포름알데히드를 사용하여 45분동안 고정시켰다.상기 고정된 안구로부터 망막을 절개하고，몰타십자 형상에서 절단하였으며， 절단된 망막을 슬라이드 글라스에 안치시킨 다음， 공초점현미경을 사용하여 관찰하였다. 공초점현미경 (FV-300, Olympus, Tokyo , Japan)을 사용하여, 전체 망막조직 (그룹당 6개)에서 스며나오는 FITC-dextran의 강도를 측정하고， 이를 FV-300 software에 적용하여 정량적으로 분석함으로써， 망막누출의 수준을 정량 분석하였다. 실험결과를 도 5에 나타내었다. 도 5a를 참조하면， 모노클로날 항 -VEGF 항체의 안구주사 (intravitreal injection)는 당뇨성 마우스의 망막에서 미세 혈관누출을 유의하게 억제하였으며， 이는 VEGF 당뇨성 마우스에서의 망막성 혈관 누출과 관련이 있음을 확인할 수 있다. R0S 저해제인 NAC 및 Trolox의 안구주사 (intravitreal injection) 역시 당뇨성 마우스에서의 망막 혈관 누출을 억제하였다. 또한, 예상한 바와 같이， 당뇨성 마우스의 망막에서의 FITC-dextran의 유출 역시 Cᅳ펩타이드 주사에 의해 억제되었다. 당뇨성 마우스에서의 망막 혈관 누출에 대한 C-펩타이드 억제를 망막 조직 전체에서 FITOdextran 형광강도를 측정함에 의해 정량화하여 도 5b에 나타내었다 (/尸6， 0.01; 도 5b).
따라서, C-펩타이드는 망막 내피 세포에서의 세포내 R0S 생성 억제에 VEGF-유도된 망막 혈관 누출을 막는다. 실시예 7: C-펩타이드의 투여 방법에 따른 효과
(1) 삼투압 펌프 (osmotic pump)를 이용한 피하주사법에 의한 투여
C-펩타이드를 사용한 miniosmotic pump의 주입 후， 혈청의 C-펩타이드의 농도를 측정하였다. 당뇨성 마우스의 그룹 (n=7)에 PBS 내에 C-펩타이드를 함유하는 Alzet mini-osmotic pump 2004 (DIRECT, Cupertino, CA)를 35 pmol/kg/min의 투여 속도로 피하 이식하였다. 또 다른 당뇨성 마우스 그룹 (n=7) 및 정상 마우스 그룹 (n=7)에 sham operations을 수행하였다.상기의 연속적인 피하 C-펩타이드 주입 동안， 혈청 C-펩타이드 수준을 C-peptide Enzyme Immunoassay Kit (RayBiotech, Norcross, GA) 을 사용하여 측정하였다. 실험 결과를 도 6a에 나타내었다. 도 6a는 삼투압 펌프 (osmotic pump)의 방법으로 마우스에게 C-펩타이드를 투여한 후 C-펩타이드의 잔존량을 평가한 결과이다. 도 6a를 참고하면， miniosmotic pump를 이용했을 경우 C-펩타이드의 농도가 정상치로 돌아오는 것을 확인할 수 있다. 따라서， miniosmotic pump를 이용한 피하주사법의 경우 1.45 pmol/kg/min 내지 36.5 pmol/kg/min로 투여 가능하다. (2) 피내주사 (intradermal injection)에 의한 투여
C-펩타이드의 미세혈관 누출에 대한 억제 효과는 스트랩토조신에 의해 유발된 당뇨성 마우스의 피부에서의 in vivo Miles vascular permeability assay에 의해 확인되었다.
다음과 같이 마우스에 대하여 Miles vascular permeability assay을 수행하였다. 마우스를 제모한 후 2~3일 후에， 마우스를 마취 시키고， 1%의 Evans blue solution 150 을 정맥 ( intraveneously)주사하였다.15분 후， 15ngO펩타이드 또는 0, 7.5， 및 15 ng의 C—펩타이드를 함유하는 VEGF (10 ng) 15 ng 를 피내 (intradermal ly)로 주사하였다 0?=12 per group). PBS는 컨트를로 주사되었다
(/尸12). 포름아미드 (formai de)를 560C에서 2일간 사용하여, 절개된 피부로부터 염료 (dye)를 분리하였고， 염료 (dye)의 양을 620 nm에서 분광광도법 (spectrophotometry)을 사용하여 정량분석하였다. 실험 결과를 도 6b 및 도 6c에 나타내었다. 도 6b는 각 처리 그룹의 이미지를 나타낸다. 도 6c는 절개된 피부로부터 분리된 염료 (Evans blue dye를 정량분석하여 컨트를을 기준으로 나타낸 결과이다 ( =12). *^0.01. 도 6b를 참조하면， VEGF의 피내주사 (intradermal inject ion)는 당뇨성 마우스에서 혈관 투과도를 유의하게 유도하였으며， 이는 C-펩타이드에 의해 용량 -의존적으로 억제되었다. 그러나， C-펩타이드 단독은 혈관 투과의 유의한 변화를 유발하지 않았다. 이와 같이 VEGF-유도된 Evans blue dye 의 혈장으로부터 세포 사이 공간으로의 혈관 누출은 dye extraction 및 spectrophotometr ic abs이 "bance측정에 의해 skin-core biopsies으로 정량화 되었다 τ=12, ρ<0.01; 도 6c). 이러한 결과는， C-펩타이드가 스트렙토조신으로 유발된 당뇨성 마우스의 국지적 혈관에서의 미세혈관의 누출을 억제함을 나타낸다.이러한 모든 결과를 종합하면， C-펩타이드는， 스트레스 섬유 형성 및 접착연접부의 분해를 촉진하여 미세혈관의 누출을 초래하는 VEGF-유도된 세포내 R0S 생성올 억제함으로, 당뇨성 마우스의 망막에서의 미세혈관 누출을 억제함을 알 수 있다.
(3) 안구주사 (intravitreal inject ion)에 의한 투여
안구주사 (intravitreal injection) 후 시간 경과에 따른， 유리체체액 (vitreous fluid) 내의 C-펩타이드 농도의 변화를 측정하였다. 구체적으로， 7.5 ng 의 C-펩타이드를 안구주사하고， Human C-peptide EL ISA kit (Millipore Co. Billerica, MA)를 사용하여 유리체방 (vitreous chambers) 내의 c_펩타이드 농도를 측정하였다 (n = 4).
실험결과를 도 6d에 나타내었다. 도 6d에서 제시한 것과 같이 안구주사 (intravitreal injection)를 이용했을 경우 약 24시간 후에 혈관누출이 억제됨을 이미 확인하였고， 도 6d를 통해 실제로 안구내 C-펩타이드의 농도를 측정한 결과 약 12시간까지 정상치의 C-펩타이드가 남아있음을 확인하였다. 즉， 상기 도 6d의 결과로부터，안구주사 (intravitreal injection)이용하여 C-펩타이드를 투여하는 경우， C-펩타이드가 정상수치로 안구에 잔존하게 되며， 이에 따라 VEGF에 의한 모세혈관의 누출을 억제함을 확인하였다.
상술한 데이터를 종합하면， 본 발명자들은 C-펩타이드가， 혈관누출의 결과로서 스트레스 섬유 형성과 접착연접부의 분해를 자극하는 VEGF-유도성 세포내 R0S 생성을 억제하여， 당뇨병 모델 마우스의 망막에서 혈관누출을 저해함을 알 수 있었다ᅳ 산업상 이용가능성
본 발명에서 제공하는 C-펩타이드를 포함하는 약학조성물은 VEGF-유도성 VE-cadherin 분해를 억제하여 혈관외 누출을 억제할 수 있으므로， 혈관누출을 수반하는 다양한 당뇨성 합병증의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있다.

Claims

청구의 범위
【청구항 1】
C-펩타이드 (C-peptide)를 포함하는 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서，
상기 C-펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서ᅳ
상기 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병의 예방 또는 치료는, C-펩타이드 (C-peptide)의 세포내 R0S 생성 억제작용， C-펩타이드 (C-pept ide)의 세포내 칼슴이온 (ca 2+) 수준에 영향을 미치지 않음， C-펩타이드 (C-peptide)의 스트레스 섬유 (stress-fiber) 형성 억제 작용， 및 C—펩타이드 (C-peptide)의 접착연접 (adherens junction) 단백질 분해 억제 작용 중 하나 이상에 의한 것인 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서，
상기 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)에 의한 질병은， 당뇨성 망막병증, 당뇨성 신경장애증, 당뇨성 신장병， 당뇨성 혈관기능장애, 및 당뇨성 염증 중 하나 이상인 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서，
상기 당뇨성 혈관누출 (vascular leakage)은， 망막 혈관누출인 조성물.
【청구항 6]
제 1항에 있어서，
상기 조성물은 삼투압 펌프 (osmotic pump)를 이용한 피하주사 (subcutaneous injection), 피내주사 ( intradermal injection), 정맥주사 ( intravein injection) , 복강주사 또는 안구주사 (intravitreal injection)에 의해 투여되는 것인 조성물.
【청구항 7】 계 1항에 있어서，
상기 조성물은 인간의 치료를 위한 것인 조성물.
【청구항 8]
C-펩타이드 (C-peptide)를 포함하는 당뇨성 망막병증 (diabet ic
retinopathy)의 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 9】
제 8항에 있어서，
상기 C-펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10】
제 8항에 있어서，
상기 당뇨성 망막병증 (diabetic retinopathy) 예방 또는 치료는， C-펩타이드 (C-peptide)의 세포내 R0S 생성 억제작용， C-펩타이드 (C-peptide)의 세포내 칼슘이온 (Ca2+) 수준에 영향올 미치지 않음, C-펩타이드 (C-peptide)의 스트레스 섬유 (stress-fiber) 형성 억제 작용, 및 C-펩타이드 (C-peptide)의 접착연접 (adherens junction) 단백질 분해 억제 작용 중 하나 이상에 의한 것인 조성물.
【청구항 111
게 8항에 있어서，
상기 조성물은 삼투압 펌프 (osmotic pump)를 이용한 피하주사 (subcutaneous injection) , 피내주사 ( intradermal inject ion) , 정맥주사 ( intravein injection) , 복강주사 또는 안구주사 (intravitreal injection)에 의해 투여되는 것인 조성물. 【청구항 12]
제 8항에 있어서，
상기 조성물은 인간의 치료를 위한 것인 조성물.
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