TWI594764B - 治療用途 - Google Patents
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Description
本發明係有關於藉由VAP-1抑制劑預防、治療及/或減緩一種纖維變性病況之一種方法。
纖維變性病況之發生,通常係因創傷或慢性發炎之後的傷口癒合過程受到干擾之故。在經常暴露於化學與生物傷害的器官如肝臟、肺臟、皮膚及腎臟中,纖維化病變特別地普遍。不論該疾患係急性或慢性,其等的一個共同特徵為異常的纖維母細胞活化作用及細胞外基質(ECM)的累積作用,因正常組織被瘢痕組織置換而導致器官功能喪失。該病況係進行性及通常為不可逆的,及其預後與存活率不佳。
不論受傷原因為何,纖維變性瘢痕的組成皆相當類似。自預後的觀點而言,診斷與檢定纖維變性的嚴重程度係最重要。治療的決策過程係高度地依纖維變性、其進程及併發症的初發之評估而定。在肝臟纖維變性中,經皮的肝臟活體組織檢驗係用於肝臟疾病分級與分期之黃金本位。然而,其係一種侵入性醫療程序,及具有不可避免的一定風險及通常與疼痛及不舒適相關聯的併發症。歸因於該程序的併發症之死亡率,係介於1:1000至1:10000之範圍(Crockett等人於2006年乙文)。
已在罹患與纖維變性相關聯的肝硬化、慢性肝炎及肝癌之病患中發現血清單胺氧化酶的活性水平上升,但在罹患炎性結締組織疾患諸如類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡之病患中發現該水平正常(McEwen與Castell於1967年期刊“J Lab Clin Med”第70期第36-47頁乙文;Ito等人於1971年期刊“Digestion”第4期第49-58頁乙文;MaLin等人於1976年期刊“Proc Soc Exp Biol Med”第151期第40-3頁乙文)。然而,上升的血清單胺氧化酶活性僅被視為一標記或視為對於組織受傷之一反應,及尚未知其在纖維變性的致病機轉中扮演一角色。
習用的治療方法大部分標定朝向纖維變性的發炎過程,及使用皮質類固醇類與免疫抑制藥物。然而,不幸地該等藥劑具有極微或全無臨床效應,因而清楚地需要用於治療纖維變性病況的新藥物。
本發明的一些目標係有關於作為抗纖維變性劑之一種VAP-1抑制劑、VAP-1抑制劑用於製造供治療一種纖維變性病況用的一藥劑之用途及在需要的一人類個體中用於預防、治療或減緩纖維變性病況之一種方法,該方法包括對於該名病患投予一有效量的一種VAP-1抑制劑。在一些實施例中,VAP-1抑制劑係選自由單株抗VAP-1抗體與SSAO抑制劑所組成之群組。
在其他實施例中,纖維變性病況係選自由肝臟纖維變性與其素因性的炎性病況亦即急性與慢性肝炎、膽疾病與毒性肝臟損傷、肺纖維變性、腎臟纖維變性及包括自糖尿病性腎病變所產生者、骨髓纖維變性、胰臟纖維變性、硬皮症、結締組織疾病、瘢痕形成、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄化、動脈纖維變性、關節纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜後纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性及COPD所組成之群組,COPD係其中呼吸道壁纖維變性而具有肌纖維母細胞與膠原蛋白的累積及如同所有纖維變性組織收縮之一疾病。
本發明的另一目標係提供在一個體中診斷COPD之一種方法。該方法包括a)提供來自該個體的一體液試樣,b)分析該試樣中之可溶性VAP-1(sVAP-1)的量或SSAO活性,c)以該sVAP-1量或SSAO活性為基礎而診斷纖維變性。
本發明的又一目標係提供用於如上所界定的COPD診斷方法中之一套組。
本發明的其他特定實施例係說明於所附的申請專利範圍中。
自下列圖式、詳細說明及實例,將瞭解本發明的其他目標、細節與優點。
如下將藉由較佳實施例及參照所附圖式,更詳細地說明本發明,其中第1圖VAP-1抗體BTT-1029的投藥作用產生近乎完全的保護作用而免於四氯化碳所引發的肝臟纖維變性。在來自注射礦物油(MO,對照組)、四氯化碳或同時注射四氯化碳與VAP-1抗體之WT與VAP-1剔除型小鼠的肝臟,進行錫利(Sirius)紅染色作用。使用Image J閾值分析,進行纖維變性瘢痕形成作用的定量測量。顯示來自三組的平均值±SEM。放大倍數為10倍。
第2圖儘管四氯化碳的纖維變性誘發作用,經VAP-1抗體治療的肝臟及VAP-1剔除型肝臟顯示顯著地缺少肝炎與壞死區域。放大20倍之蘇木色素與伊紅(eosin)染色作用係突顯壞死的肝細胞(箭頭)與進行中的肝炎(箭號)。
第3圖藉由VAP-1抗體預防纖維變性組織中的膠原蛋白IV與彈性蛋白表現作用之增加。使用Image J閾值分析,進行膠原蛋白IV、彈性蛋白及層黏連蛋白染色作用之定量測量。顯示來自三組的平均值±SEM。
第4圖mRNA水平顯示VAP-1對於肝臟的星形細胞與纖維母細胞之一調節效應。進行彈性蛋白、aSMA、VAP-1及TIMP1之定量RT-PCR分析。數據係以來自各測量三次的三隻小鼠之平均值±SEM形式呈現。*p<0.05,**<0.01,***<0.001(ANOVA)。
第5圖血清中的可溶性VAP-1與SSAO活性增加,以回應四氯化碳所引發的肝臟纖維變性。A.以一種時差螢光DELFIA分析法,分析四氯化碳所引發的肝臟纖維變性對於血清中的可溶性VAP-1水平之效應。B.使用一種放射化學分析,在來自四氯化碳所引發之WT肝臟的血清中發現SSAO活性水平之增加。
第6圖藉由四氯化碳所引發的腎小球損傷,在VAP-1剔除型小鼠與經VAP-1抗體治療的C57BL/6小鼠中獲得救護。放大40倍之蘇木色素與伊紅(eosin)染色作用係突顯腎小球。
第7圖在VAP-1剔除型小鼠與經VAP-1抗體治療的小鼠中,顯著地降低由於四氯化碳所引發的腎小球纖維變性之膠原蛋白累積作用。來自注射礦物油(MO,對照組)、四氯化碳或同時注射四氯化碳與VAP-1抗體的WT與VAP-1剔除型小鼠之腎臟,係進行錫利(Sirius)紅染色作用。使用Image J閾值分析,進行纖維變性瘢痕形成作用的定量測量。顯示來自三組的平均值±SEM。放大倍數為40倍。
第8圖相較於經載劑治療的小鼠,來自經VAP-1抗體(BTT-1029)治療之暴露於菸草煙霧的小鼠之支氣管肺泡灌洗液中的總細胞計數減少。
第9圖相較於經載劑治療的小鼠,來自暴露於菸草煙霧之經羅氟司特(roflumilast)治療的對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中之總細胞計數減少。
第10圖相較於經0.9%氯化鈉治療的對照組,在地塞米松治療組與二個SSAO抑制劑(BTT-2089)治療組中之中層生成作用顯著降低。
第11圖相較於經0.9%氯化鈉治療的對照組,在地塞米松治療組與二個SSAO抑制劑(BTT-2089)治療組中之新生內膜生成作用顯著降低。
第12圖經HPS(蘇木色素根皮紅番紅花)染色的血管片段之實例。當相較於對照組A時,在SSAO抑制劑治療組C與D中之管腔尺寸增加。A:0.9%氯化鈉組;B:地塞米松;C:10毫克/公斤的BTT2089;D:30毫克/公斤的BTT2089。
本發明係以亦稱作半卡肼敏感型胺氧化酶(SSAO)及由人類基因AOC3所界定之血管附著蛋白-1(VAP-1)在纖維變性組織形成作用中扮演一直接角色之意外發現為基礎。迄今,已顯示VAP-1藉由中介白血球遷移進入組織中而涉及數種炎性疾病,但尚未顯示其直接涉及纖維變性本身的致病機轉。
“纖維變性”一詞係指在一器官或組織中形成或存在過量的結締組織。其可能以對於一刺激諸如組織受傷或發炎之修復或置換反應的形式發生。
本發明的一目標係研究VAP-1抑制劑在保護各種器官免於纖維變性損傷之角色。如在小鼠中因四氯化碳所引起的慢性纖維變性肝臟損傷中,在菸草煙霧所引發之一種慢性阻塞性肺病(COPD)的小鼠模式中及在一種血管重塑、血管狹窄及新生內膜增厚(纖維變性)的小鼠模式中,已獲得極佳的結果。因此,VAP-1抑制劑可確實被視為抗纖維變性劑。
就一方面而言,本發明的實施例因此提供藉由對於需要該治療的一人類病患投予一有效水平的一種VAP-1抑制劑而在活體內即在人類體內減少或治療纖維變性之一種方法。“治療作用”或“治療”一詞係意欲包括為了可包括預防、改善、阻止或治癒涉及纖維變性的疾患之目的而對於一個體投予VAP-1抑制劑之投藥作用,該等疾患諸如肝臟纖維變性及為其素因性的炎性病況亦即急性與慢性肝炎、膽疾病與毒性肝臟損傷、肺纖維變性、腎臟纖維變性及包括自糖尿病性腎病變所產生者、骨髓纖維變性、胰臟纖維變性、硬皮症、結締組織疾病、瘢痕形成、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄化、動脈纖維變性、關節纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜後纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性及COPD,而COPD係其中呼吸道壁纖維變性而具有肌纖維母細胞與膠原蛋白的累積及如同所有纖維變性組織收縮之一疾病。
一“有效水平”的一種VAP-1抑制劑,係指其中纖維變性的有害效應至少獲得改善之一水平。用於VAP-1抑制劑投藥作用的量與方法,係該等具有治療纖維變性相關疾患的一般臨床技藝者即可判定。身為單株抗VAP-1抗體的VAP-1抑制劑較佳係以每星期一次至每三個月一次的間隔,以0.01至20毫克/公斤的範圍,更佳以0.1至15毫克/公斤的範圍,最佳1.0至10毫克/公斤之劑量而以血管內方式提供。任擇地,VAP-1抑制劑係以每星期一次至每三個月一次的間隔,以0.1至20毫克/公斤的範圍,更佳以0.2至10毫克/公斤的範圍,最佳0.5至5毫克/公斤之劑量,以皮下方式提供。
身為SSAO抑制劑之本發明的化合物可以在約0.1微克/公斤至約300毫克/公斤的劑量範圍內之一有效量投藥,及較佳介於1.0微克/公斤與10毫克/公斤之間。本發明的化合物可以一個單一的每日劑量投藥,或每日總劑量可依體重的公斤數而以每日二、三或四次的分開劑量投藥。
上述方面可依一任擇方式配製,亦即藉此本發明的一些實施例提供VAP-1抑制劑作為預防、治療及/或減緩一種纖維變性病況之抗纖維變性劑,諸如肝臟纖維變性及為其素因的炎性病況亦即急性與慢性肝炎、膽疾病與毒性肝臟損傷、肺纖維變性、腎臟纖維變性及包括自糖尿病性腎病變所產生者、骨髓纖維變性、胰臟纖維變性、硬皮症、結締組織疾病、瘢痕形成、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄化、動脈纖維變性、關節纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜後纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性及COPD,而COPD係其中呼吸道壁纖維變性而具有肌纖維母細胞與膠原蛋白的累積及如同所有纖維變性組織收縮之一疾病。因此,VAP-1抑制劑可用於製造供該等纖維變性病況用之一藥劑。
“VAP-1抑制劑”一詞係指具有阻斷VAP-1功能或其SSAO活性的能力之任一化合物。VAP-1抑制劑可分成二個主要類型,阻斷性抗體與SSAO抑制劑。
如用於此之“抗VAP-1抗體”(Ab)或“單株抗VAP-1抗體”(MAb)一詞,係意欲包括完整的抗體以及可與VAP-1蛋白特異性結合的抗體片段,諸如Fab與F(ab’)2片段。
適用於本發明的各方面之抗VAP-1抗體係技藝中可取得者,及其他抗體可藉由嫻熟技藝者所知方法製造。例如,第5,580,780號美國專利述及一種單株抗體(mAb) 1B2,其識別人類VAP-1及其可在一冷凍切片分析中阻斷淋巴球與扁桃體HEV的結合作用。MAb 1B2係一種鼠類IgM-抗體及具有對於人類VAP-1的特異性。國際專利公開案WO 03/093319揭露一種嵌合型抗VAP-1單株抗體BTT-1002,相較於對應的鼠類抗體而言,其具有較低的免疫原性。然而,一種嵌合抗體在人類療法的適用性,係由於其免疫原性及所產生之對抗其的抗體製造作用而受到影響。
在此併入本案以為參考資料之國際專利公開案WO 2008/129124,揭露具有較低的免疫原性與細胞激素釋出作用之完全人類抗VAP-1抗體。完全人類單株抗VAP-1抗體的較佳實例,係包括所具有的一種重鏈多肽包含選自由序列辨識編號1至3所組成之群組的1至3個CDR共有序列及/或所具有的一種輕鏈多肽包含選自由序列辨識編號24至26所組成之群組的1至3個CDR共有序列之該等者。其他較佳的抗VAP-1抗體係包括所具有的一種重鏈多肽包含一個選自序列辨識編號4至8的第一CDR序列、一個選自序列辨識編號9至13的第二CDR序列及一個選自序列辨識編號14至18的第三CDR序列及/或所具有的一種輕鏈多肽包含一個選自序列辨識編號27至31的第一CDR序列、一個選自序列辨識編號32至36的第二CDR序列及一個選自序列辨識編號37至41的第三CDR序列之該等者。
在本發明的其他實施例中,該完全人類抗VAP-1抗體係示為8C10者,及包含序列辨識編號19中所述的一個重鏈變異區及序列辨識編號42中所述的一個輕鏈變異區。在另一其他實施例中,該抗VAP-1抗體係示為8A4者,及其包含序列辨識編號20中所述的一個重鏈變異區及序列辨識編號43中所述的一個輕鏈變異區。在其他實施例中,該抗VAP-1抗體係示為3F10者,及包含序列辨識編號21中所述的一個重鏈變異區及序列辨識編號44中所述的一個輕鏈變異區。在又一其他實施例中,該抗VAP-1抗體係示為5F12者,及包含序列辨識編號22中所述的一個重鏈變異區及序列辨識編號45中所述的一個輕鏈變異區。在再一其他實施例中,該抗VAP-1抗體係示為4B3者,及包含序列辨識編號23中所述的一個重鏈變異區及序列辨識編號46中所述的一個輕鏈變異區。該等抗體亦可以重組抗體的形式提供,諸如包含序列辨識編號47中所述的一種重鏈多肽與序列辨識編號48中所述的一種輕鏈多肽之重組型r8C10(BTT-1023)。
適用於本實施例中的SSAO抑制劑實例係包括但不限於肼衍生物,諸如烯丙基肼類及特別是苯基烯丙基肼類;及胲(亦即胺氧基)衍生物。苯基烯丙基肼類的更詳細實例係包括但不限於2-(苯基-烯丙基)-肼、N-[2-(4’-氟苯基)-烯丙基]-肼及(E)-1-氟-2-苯基-3-肼基丙烯,而胺衍生物的更詳細實例係包括但不限於2-胺氧基-1-苯基-乙醇與2-胺氧基-1-(3’,4’-二甲氧基-苯基)-乙醇。該等SSAO抑制劑係述於WO 2006/094201與WO 2005/014530,其等在此併入本案以為參考資料。其他適宜的肼衍生物係包括乙醯肼類,諸如但不限於在此併入本案以為參考資料的WO 2009/145360所述之2-(4-{2-[5-(4-乙醯基哌-1-基)吡啶-2-基]乙基}苯基)乙醯肼類;及肼醇類諸如但不限於在此併入本案以為參考資料的WO 02/02090所述之(1R,2S)-2-(1-甲基肼基)-1-苯基-1-丙醇、(1R,2S)-2-(1-甲基肼基)-1,2-二苯基乙醇、1-(1’-甲基肼基)-3-(間-甲氧基苯氧基)-2-丙醇及(1S,2R)-2-(1-甲基肼基)-1,2-二苯基乙醇(BTT-2079);及在此併入本案以為參考資料的WO 03/006003與WO 2005/080319所述之肼茚烷類,諸如但不限於(1S,2S)-2-(1-甲基肼基)-1-茚醇。
適用於本實施例中的SSAO抑制劑之其他實例係包括但不限於丙烯基-與炔丙基胺類、4-取代-2-丁炔基胺類、鹵代烯丙基胺類(特別地2-與3-鹵代烯丙基胺類)、二氫吡咯衍生物、炔丙基二胺類、烯丙基胺類及二胺類。上述SSAO抑制劑的更詳細實例係包括但不限於5-苯氧基戊-2,3-二烯基胺、4-(4-甲氧基苯基)丁-3-炔基胺、4-苯基丁-3-炔基胺、2-苯基-3-氟烯丙基胺、S-(E)-4-(4-胺基-2-氟丁-2-烯基氧)-N-(1-苯基乙基)苯甲醯胺、(E)-3-氟-4-(4-(甲基磺醯基)苯氧基)丁-2-烯-1-胺、(E)-3-氟-4-(2-甲基苯并[d]噻唑-5-基氧)丁-2-烯-1-胺、(E)-4-(4-胺基-2-氟丁-2-烯基氧)-N-(1-苯基乙基)苯磺醯胺及(E)-2-(4-氟苯乙基)-3-氟烯丙基胺(BTT-2089,莫非吉蘭(mofegeline))。該等化合物係述於WO 2007/005737、WO 2005/082343、WO 2009/066152、WO 2009/055002及Palfreyman等人於期刊“J Neural Transm.”(1994年)第41期第407-414頁乙文),其等皆在此併入本案以為參考資料。
適用於本實施例之SSAO抑制劑的又一實例,係包括但不限於4,5,6,7-四氫咪唑并[4,5-c]吡啶衍生物(述於在此併入本案以為參考資料之WO 02/38153)、甲醯胺類諸如N-羥基-2-(2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙醯胺基)乙醯胺與5-胺基-2-羥基-N-(2-羥基苄基)苯甲醯胺及磺醯胺類諸如N2-{[4-(1,1-二甲基丙基)苯基]磺醯基}-N1-羥基絲胺醯胺,其係述於在此併入本案以為參考資料的WO2006/013209與US 2007/066646。
而且,噻唑及/或胍衍生物及尤其2-醯基胺基三唑衍生物係適用於本發明的各實施例中。該等SSAO抑制劑的更詳細實例係包括但不限於N-{4-[2-(4-{[胺基(亞胺基)甲基]胺基}苯基)乙基]-1,3-噻唑-2-基}乙醯胺、N-{4-[2-(4-{[胺基(亞胺基)甲基]胺基}苯基)乙基]-5-[4-(甲基磺醯基)苄基]-1,3-噻唑-2-基}乙醯胺、N-{4-[2-(4-{[2-胺基-1H-咪唑并1-4-基)甲基]苯基}乙基)噻唑-2-基]-乙醯胺、2-(4-{2-[2-(乙醯基胺基)-1,3-噻唑-4-基]乙基}苯基)-N-[胺基(亞胺基)甲基]乙醯胺。該等化合物係述於WO 2004/087138、WO 2004/067521、WO 2006/028269、WO 2006/011631及WO 2005/089755,其等皆在此併入本案以為參考資料。
此外,各種肟衍生物係SSAO抑制劑,及因此可用於本發明的各實施例中。該等肟衍生物係包括但不限於在此併入本案以為參考資料的WO 2010/029379中所述之5-溴-1,3-苯并二唑-4-甲醛肟、6-乙氧基-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲醛肟、1,3-二甲基-6-(甲基甲硫基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四-氫嘧啶-5-甲醛肟。
皆在此併入本案以為參考資料之WO 2010/015870、WO 2005/072738、Lyles G. A.於期刊“Int. J. Biochem. Cell Biol.”第28期第259-276頁(1996年)乙文及McDonald等人於期刊“Annual reports in Med. Chem.”第42期第229-243頁(2007年)乙文中所揭露之二肼、芳基烷基胺類、唑烷酮、鹵代烷基胺類及苯磷硫胺(維生素B1),亦可在本發明的各實施例中作為SSAO抑制劑。
而且,適用於本發明的各實施例中之SSAO抑制劑,係包括具有抑制或阻斷VAP-1的SSAO活性之一能力之任一立體異構物、立體異構物的混合物、E或Z型、E與Z型的混合物、前驅藥、代謝物、結晶形式、非結晶形式、水合物、溶劑化物或其鹽類。
可藉由技藝中所知的SSAO分析,篩選與辨識其他適宜的SSAO抑制劑。該種分析可包括VAP-1 SSAO活性分析,其係使用實質上如所述用於單胺氧化酶與相關酵素的一種偶合比色方法(Holt,A.等人於期刊“Anal. Biochem.”第244期第384-392頁(1997年)乙文)。亦可使用一種用於過氧化氫之高度靈敏與安定的探針安普思(Amplex)紅試劑(10-乙醯基-3,7-二羥基啡),而獨立地測量內皮細胞的SSAO活性(Zhou M、Panchuk-Voloshina N.於期刊“Anal Biochem.”第253(2)期第169-74頁(1997年)乙文)。此外,可使用[7-14C]-苄基胺鹽酸鹽作為一受質,以放射化學方式分析胺氧化酶活性(Jaakkola等人於期刊“Am J Pathol”第155(6)期第1953-65頁(1999年)乙文)。可使用在諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的細胞株中表現之重組型人類VAP-1 SSAO(Smith,D. J.,等人於期刊“J. Exp. Med.”第188期第17-27頁(1998年)乙文),作為VAP-1 SSAO酵素的一來源。其他適宜的SSAO VAP-1酵素來源可為來自不同物種諸如靈長類動物與囓齒動物的血清與組織試樣。
就如本實施例的用途而言,VAP-1抑制劑可以一藥學組成物的形式提供,其包含一種藥學上可接受的載劑或稀釋劑及作為有效成分的一種VAP-1抑制劑。該組成物所含有的VAP-1抑制劑的量,係足以在需要該拮抗作用的病患中拮抗(完全地或部分地)病患的SSAO活性或VAP-1與VAP-1的生物配位體之固有的結合作用。
用於VAP-1抑制劑投藥作用的量與方法,係該等具有治療纖維變性相關疾患的一般臨床技藝者即可判定。一般而言,VAP-1抑制劑治療的劑量將依數項考量而異諸如:待治療病患的年齡、性別及一般健康狀況;如有同時的治療作用之類型;治療頻率及所欲效應的性質;組織損傷程度;症狀持續時間;及待個別醫師調整的其他變異數。所欲的一劑量可分一或多次投藥,以獲致所欲的結果。如本實施例的藥學組成物可以單位劑型提供。
藥學組成物可在用於投藥之任一適當的藥用載劑中投予。其等能以達成預防、舒減、防止或治癒人類或動物病患中的纖維變性病況之任一形式投藥。
用於非經腸與局部投藥之藥學組成物,係包括無菌的含水或非水溶劑、懸浮液及乳化液。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油及可注射性有機酯類。含水的載劑係包括水、水-醇溶液,包括食鹽水與經緩衝的一般非經腸載劑及其包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer)葡萄糖溶液、葡萄糖加上氯化鈉溶液、含有乳糖的林格氏(Ringer)溶液或非揮發性油。供靜脈內用的載劑包括流質與營養素補充液、電解質補充液,諸如該等以林格氏(Ringer)葡萄糖等為基礎者。如實施例之含水組成物可包含適宜的緩衝劑,諸如鈉與鉀的磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽或依目標pH值範圍而定之甘胺酸緩衝劑。使用氯化鈉作為一種滲透壓調整劑亦為有效的。組成物可包括其他賦形劑,諸如安定劑或防腐劑。適用的安定性賦形劑包括表面活性劑(聚山梨糖醇酯20與80、泊洛沙姆(poloxamer)407)、聚合物(聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮(povidone))、碳水化合物(蔗糖、甘露糖醇、葡萄糖、乳糖)、醇類(山梨糖醇、甘油丙二醇、乙二醇)、適宜的蛋白質(白蛋白)、適宜的胺基酸(甘胺酸、麩胺酸)、脂肪酸(乙醇胺)、抗氧化劑(抗壞血酸、半胱胺酸等)、螯合劑(EDTA鹽類、組胺酸、天冬胺酸)或金屬離子(鈣、鎳、鎂、錳)。適用的防腐劑係苄基醇、氯丁醇、氯化烷基二甲基苄基銨及可能為對羥苯甲酸酯。
該藥學組成物可以濃縮形式或在需要時復原的一粉末形式提供。在用於注射/灌注用溶液的粉末配方之該等情況下,可使用上述的賦形劑。在冷凍乾燥的情況下,較佳的一些低溫保護劑係包括聚合物(聚乙烯基吡咯烷酮(povidone)、聚乙二醇、聚葡萄糖)、糖類(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、胺基酸(甘胺酸、精胺酸、麩胺酸)及白蛋白。若在包裝中添加復原用溶液,其可由如注射用的純水或氯化鈉溶液或右旋糖或葡萄糖溶液所組成。
治療上有效的抗VAP-1抗體可以化學方式或藉由基因工程而與其他作用劑接合,其使得抗體標定朝向一所欲的作用位址。任擇地,其他化合物可以化學方式或藉由基因工程而與該抗體接合,藉此增強抗體或提供附加的性質,特別是增強抗體促進減緩由VAP-1結合作用所媒介的有害效應之能力之性質。
可以化學方式或藉由基因工程標記抗VAP-1抗體,以提供可檢測的抗體。該等標記抗體將為用於人類的纖維變性位址成像作用之有用工具,特別是用於纖維變性位址之活體內免疫閃爍顯像術的成像作用。就成像目的而言,在抗纖維變性療法中使用抗體片段可能優於使用全抗體之方式,及衍生自完全人類抗體的片段之安全性仍應高於其等的嵌合或小鼠同等物。
本發明的一些方面係有關於纖維變性病況之診斷。關於本發明而言,已發現可溶性VAP-1(sVAP-1)的血清水平之上升及因此SSAO活性之上升係與纖維變性程度相關。本發明的一些實施例因此提供用於診斷COPD的方式與方法,而COPD係其中呼吸道壁纖維變性而具有肌纖維母細胞與膠原蛋白的累積及如同所有纖維變性組織收縮之一疾病。
在一些實施例中,以體液中之上升的sVAP-1水平及/或SSAO活性為基礎之COPD診斷作用,可與現行用於纖維變性病況的一組預測性生物標記之分析組合。其可增進現行生物標記的診斷能力。換言之,可單獨使用sVAP-1水平/SSAO活性或與其他臨床與生化標記組合,以作為預測呼吸道壁纖維變性是否存在之一種新穎的非侵入性試驗。
例如可藉由下列方法,測定一體液試樣諸如血清中之sVAP-1水平:用於量化可溶性VAP-1之時差式單一步驟免疫螢光分析(TR-IFMA)(DELFIA),可使用在經鏈黴卵白素塗覆的微量滴定盤上作為一捕獲劑之生物素接合型小鼠抗人類VAP-1抗體TK8-14(拜奧諦治療(Biotie Therapies)公司)。可使用作為一示蹤劑之銪接合型小鼠抗人類VAP-1抗體TK8-18(拜奧諦治療(Biotie Therapies)公司),進行結合的可溶性VAP-1之檢測作用。可藉由在615奈米測量時差式螢光(Victor3多重標記計數器)而檢測標記。螢光計數係與試樣中存在多少可溶性VAP-1直接相關。然後可藉由與一參考物的標準曲線相比較而分析試樣數據。
在本發明的一些實施例中,以自需要該診斷及/或疑似罹患COPD的一個體所得之一體液中的SSAO活性為基礎,而診斷COPD。Li等人於期刊“J. Chromatogr.”B第810期(2004年)第277-282頁乙文中,已揭露用於該目的之一種適宜方法。測定SSAO活性的其他方式與方法係技藝中所知。
而且,本發明的一些方面提供用於診斷COPD之一套組。在一些實施例中,該套組係包含用於評估sVAP-1量之一或多種試劑,諸如一種特異性抗VAP-1抗體,如上述抗VAP-1抗體中之一者。在其他實施例中,該套組係包含用於評估一體液諸如血清或血漿中的SSAO活性之一或多種試劑。例如,該套組可包含VAP-1 SSAO之一受質諸如苄基胺、甲基胺、胺丙酮或其他脂族或芳族單胺類,連同一種適宜的SSAO酵素活性分析緩衝劑及用於檢測SSAO活性的一組試劑與方法。可使用一種偶合分析檢測SSAO活性,其中係測量自SSAO活性在單胺受質上的作用所產生之過氧化氫;或可使用一種14C標記的胺受質諸如苄基胺及藉由監測一種水溶性胺轉換為一種可溶於有機溶劑的醛之轉換作用,而直接地測量。
嫻熟技藝者將明白,隨著技術的進步,本發明的概念能以各種方式施行。本發明與其實施例並非受限於下列所述的實例,及可在申請專利範圍的範疇內變化。
研究之目的係評估VAP-1抑制劑對於小鼠中的纖維變性肝臟損傷之效應。
依據總公司規定,所有的小鼠係在伯明翰(Birmingham)大學的生物醫學事務單位依習用條件供養與安置。每籠安置4隻小鼠,及在實驗前讓其等習慣安置場所一星期。在研究中使用年齡為8至10個星期的雌性C57BL/6與VAP-1-/-小鼠(缺少VAP-1的AOC3基因剔除型小鼠)。C57BL/6小鼠係自伯明翰(Birmingham)大學的生物醫學事務單位之一配種族群取得,而VAP-1-/-(AOC3基因剔除型)小鼠係自承包育種業者丹麥的泰科尼克(Taconic)公司取得。
藉由每二個星期一次在腹膜內投予投予溶於礦物油中之1毫升/公斤的四氯化碳(四氯化碳來自艾爾迪希化學(Aldrich)公司)劑量達8個星期,建立慢性肝臟纖維變性之一種小鼠模式,而對照組僅領受礦物油。在四氯化碳投藥作用之前與期間,經一種小鼠抗小鼠VAP-1抗體BTT-1029治療的小鼠係每星期一次以靜脈注射方式領受達二個星期。在最後的四氯化碳劑量之96小時後,終結動物的生命。在異氟烷麻醉期間藉由心臟穿刺抽取血液試樣,之後藉由頸椎脫位而犧牲小鼠。將肝臟解剖與分割成4塊,以供不同處理之用。
使用供視窗(Windows)用的第11.0版SPSS進行統計ANOVA。依序使用單因子ANOVA與費雪(Fisher)最小顯著差異事後檢定,以分析具有二個以上的變異數組別之試樣顯著性。
肝臟試樣係在4%聚甲醛中固定,包埋於石蠟中及切成4微米的切片。用於組織病理分析之切片,係依據標準程序以錫利(Sirius)紅或H&E染色。就免疫螢光染色作用而言,藉由浸沒在30%蔗糖中而低溫保護固定後的小鼠肝臟,快速冷凍及在低溫恆溫器中切成7微米。簡言之,以含有0.1%曲拉通(Triton) X-100之經磷酸鹽緩衝的食鹽水(PBST)清洗切片10分鐘,及在室溫與位於0.1% PBST中的10%山羊血清培養1小時。與在血清-PBST中所稀釋之用於彈性蛋白、膠原蛋白IV及層黏連蛋白的初級抗體(愛碧康(Abcam)公司)培養之後,切片在PBST中清洗三次及在室溫中與二級抗體(英杰(Invitrogene)公司)培養1小時。
如所預期,四氯化碳在C57BL/6小鼠中引發嚴重的纖維變性傷害。在8個星期時,顯示野生型小鼠肝臟的錫利(Sirius)紅原纖維含量增加八倍,及具有肝細胞壞死與進行中的肝炎。有意思之處係VAP-1缺陷小鼠與經BTT-1029治療的野生型小鼠二者中之纖維變性損傷均顯著地降低。該等小鼠僅呈現低量的錫利(Sirius)紅原纖維,及肝臟組織結構顯得近乎正常及完全不存在壞死區域及僅具有輕微的肝炎(第1與2圖)。而且,所存在的成熟巨噬細胞之數目顯著較低,其再次表明損傷的嚴重性係遠低於野生型(數據未顯示)。
藉由qRT-PCR評估肝臟中與肝臟星形細胞活化作用相關之基因的mRNA水平。為此,使用凱傑(Qiagen)公司的RNAeasy迷你套組(#74104),自小鼠肝臟萃取總RNA。使用隨機引子(普洛麥格(Promega)公司)及來自英杰(Invitrogene)公司的Superscript III,將RNA逆轉錄為cDNA模板。用於qRT-PCR的參數如下:變性作用係於95℃達10分鐘,擴增反應係於95℃達10秒,於55℃達30秒,於72℃達1秒,55個循環。以使用參考基因GAPDH之羅奇(Roche) LightCycler 480系統及來自羅奇(Roche)公司的探針,測量定量式即時PCR。使用‘E-方法’(羅奇(Roche)公司)量化表現水平。
數據顯示VAP-1藉由調節肝臟星形細胞(HSC)而在肝臟纖維變性的發展中扮演一角色。活化型HSC被認為是用於合成纖維變性肝臟中包括彈性蛋白在內的ECM組分之主要來源。經投予四氯化碳的野生型肝臟顯示αSMA與彈性蛋白mRNA水平之大幅增加,顯示表現αSMA的HSC之累積作用及彈性蛋白的澱積作用(第4圖)。在經BTT-1029治療的野生型與VAP-1-/-肝臟中之αSMA與彈性蛋白二者的mRNA水平,係顯著低於野生型肝臟。藉由共焦顯微鏡檢法,亦進一步證實彈性蛋白與膠原蛋白IV的表現作用之差異,而層黏連蛋白水平維持不變(第3圖)。
總而言之,BTT-1029之治療係藉由降低肝臟星形細胞的活化作用而引發對於確定的肝臟纖維變性之幾乎完全的保護作用,因此限制在纖維變性病灶中之纖維母細胞的發育。亦在VAP-1-/-小鼠中確證該相同效應,顯示對抗四氯化碳所引發的傷害之一種近乎完全的保護作用。該等結果表明VAP-1係經由對於肝臟星形細胞的調節性效應而成為肝臟纖維變性的發展中之一關鍵角色。VAP-1 SSAO係一種銅胺氧化酶,及因此與負責ECM蛋白諸如彈性蛋白與膠原蛋白的交聯作用之另一種銅胺氧化酶酵素即離胺醯基氧化酶類似。VAP-1的SSAO活性仍可能對於ECM蛋白中的交聯形成作用亦具有一直接效應。
而且,使用[7-14C]-苄基胺鹽酸鹽(放射比活度57毫居里/毫莫耳)作為一受質,以放射化學方式分析血清與肝臟組織試樣中的SSAO活性(第5圖)。血清(40毫克/毫升的蛋白)或組織配製品(2毫克/毫升的蛋白)係在37℃與5μM的氯吉林(clorgyline)與巴吉林(pargyline)及在亦具有1 mM半卡肼的非特異性結合管中預培養30分鐘。在37℃,該分析在最終體積為200微升之含有[7-14C]-苄基胺作為一受質的0.2 mM磷酸鈉緩衝劑(pH 7.4)中進行1小時。該催化性酵素活性反應分析之終止與處理,係如先前Jaakkola等人於1999年所述者(於期刊“American Journal of Pathology”第155期第6頁乙文)。依據Bradford等人(Bradford,M. M.於1976年期刊“Anal. Biochem.”第72期第248頁乙文),使用牛血清白蛋白作為一標準,分析蛋白濃度。
結果證實除了預防四氯化碳所引發的肝臟纖維變性之外,BTT-1029治療顯著地降低該肝臟試樣中的SSAO活性。
大量暴露於四氯化碳造成肝臟與腎臟之損傷。因此,收集來自第1例所述經四氯化碳處理之動物的腎臟,及分析VAP-1抑制劑對於腎病變之效應。
腎臟係在4%聚甲醛中固定,包埋於石蠟中及切成4微米的切片。在經錫利(Sirius)紅與H&E染色的切片上進行組織病理分析。依據標準程序進行染色。藉由使用Image J軟體之閾值分析,量化錫利(Sirius)紅原纖維的量。
使用供視窗(Windows)用的第11.0版SPSS,進行統計ANOVA。依序使用單因子ANOVA與塔基(Tukey) HSD之最小顯著差異事後檢定,以分析具有二個以上的變異數組別之試樣顯著性。
經投予四氯化碳的小鼠呈現同時具有節段性與整體性變化之病灶腎小球改變。H&E染色作用證實各種損傷,如膜細胞過多、頂端區的附著與硬化。然而,大部分觀察到腎小球叢的整體崩壞而僅剩餘片段的腎小球(數據未顯示)。有意思地,VAP-1剔除型小鼠與經BTT-1029治療的小鼠係受到完全保護而免於腎小球損傷(第6圖)。
顯示纖維變性之腎小球周圍的膠原蛋白累積作用,係藉由錫利(Sirius)紅染色作用評估。在C57BL/6小鼠中所投予的四氯化碳,引發腎小球叢周圍的膠原蛋白累積作用增加幾乎二倍。有意思地,缺少VAP-1或經投予VAP-1抑制劑的小鼠顯示膠原蛋白澱積物顯著減少而與對照組相近(第7圖)。結果清楚地證實VAP-1在四氯化碳所引發的腎病變中之保護性角色。
採用菸草煙霧所引發的COPD小鼠模式,以評估VAP-1抑制劑在COPD治療上之效應。
C57BL/6J小鼠連續11天每天暴露於菸草煙霧(TS)一次,在最後TS暴露之後的24小時引起肺部發炎。在11天後的反應係包括巨噬細胞、上皮細胞、嗜伊紅白血球、嗜中性白血球及淋巴球之顯著增加。
將小鼠隨機分入研究組別(n=10),及在第-1、3、6及9天的TS暴露之4小時後,以靜脈內方式以一載劑(pH 7.4之5毫升/公斤的PBS+0.1%聚山梨糖醇酯80)或以小鼠單株抗VAP-1抗體(位於載劑中之3毫克/公斤或9毫克/公斤的BTT-1029)治療。另一組(n=10)係以靜脈內方式領受載劑及暴露於空氣一段相等的時間長度。另外二組小鼠(n=10)係連續11天每天在各次TS暴露之1小時前,以口服方式領受另一載劑(位於無菌水中的0.5%羧甲基纖維素鈉鹽(CMC))或一參考化合物(位於0.5%CMC中的5毫克/公斤的羅氟司特(roflumilast))一次。最後一組(n=10)領受口服載劑(0.5% CMC)及暴露於空氣一段相等的時間長度。
所有結果係以各動物的個別數據點之方式呈現,及計算各組的平均數值。當常態性檢定為正數時,數據最初進行變異數檢定的一種單因子分析(ANOVA),接著進行用於多重比較之邦弗洛尼(Bonferroni)校正,以檢定治療組之間的顯著性。“p”值0.05係視為統計上顯著。
所有數據亦進行用於等變異數之拔雷特氏(Bartlett)檢定,及就大部分的研究而言變異數通常為等變異數,然而如該研究中所發生者,一些治療組偶爾得到正的結果。因此亦使用非參數分析。當數據呈現常態分布時,則引用參數分析(ANOVA)。
使用下列公式,在用於方格數據的Excel試算表內自動計算抑制百分比:
在研究第-1、3、6及9天的TS暴露之4小時後,當以靜脈內方式投予9與3毫克/公斤的BTT-1029時,顯著地降低TS所引發之BAL中的細胞增加(抑制百分比分別為38%與33%及二者p<0.001)(第8圖)。其係由巨噬細胞(抑制百分比為29%與22%及分別為p<0.01與p<0.05)、嗜中性白血球(抑制百分比為66%與59%及二者p<0.001)、淋巴球(抑制百分比為69%與54%及二者p<0.001)及嗜伊紅白血球(抑制百分比為93%與65%及分別為p<0.001與p<0.01)之顯著減少所組成。
每日在TS暴露之1小時前,當以口服方式投予參考化合物羅氟司特(roflumilast)一次時,亦顯著地減少細胞總數(41%及p<0.001)(第9圖)。該抑制作用係由嗜中性白血球(63%及p<0.001)、上皮細胞(51%及p<0.01)及淋巴球(65%及p<0.001)之減少所組成。在該研究中,羅氟司特(roflumilast)並未顯著地降低在BAL中所發現的巨噬細胞與嗜伊紅白血球數目。
新生內膜與中層之增厚,係動脈粥樣硬化損傷的發展之一早期與必要階段及為再狹窄化的一必要部分。其伴隨著在血管壁的新生內膜與中層之纖維變性改變。該研究評估阻斷SSAO在纖維變性疾病中所扮演之角色,其係藉由評估全身性輸送(藉由每日腹膜內注射)一種小分子SSAO抑制劑(莫非吉蘭(mofegiline),BTT-2089)對於領受一種普通的西方式飲食之ApoE3萊登(Leiden)小鼠的股動脈中之套箍所引發的新生內膜增厚(套箍引發型狹窄)之效應。
方法:在手術放置套箍之前,40隻雄性ApoE3*萊登(Leiden)小鼠(年齡為12個星期)餵食一種輕微的高膽固醇血症飲食達3個星期。治療係每日腹膜內注射1)載劑;2)位於飲水中之9毫克/公升的地塞米松;3)每日腹膜內注射10毫克/公斤的BTT-2089;4)30毫克/公斤的BTT-2089,所有皆在手術前一天開始及在實驗期間繼續。在第0天進行手術,亦即將一種非收縮性套箍(長度為2至3毫米)放置在小鼠的二條股動脈周圍。在2個星期後犧牲各組的10隻小鼠,進行組織形態學分析而量化對於加速的動脈粥樣硬化損傷與新生內膜生成之抑制作用。相較於經0.9%氯化鈉治療的對照組,在經地塞米松治療的正對照組及二個BTT-2089治療組中觀察到中層與新生內膜生成作用顯著降低(第10與11圖)。相較於一對照組而言,其係反映在SSAO抑制劑治療組中經HPS染色的血管片段之實例的管腔尺寸增加(第12圖)。
在相同模式中,以來自不同於BTT-2089的化學類型之另一種SSAO抑制劑進行第二研究。該肼式抑制劑(BTT-2079)係每日藉由腹膜內注射而以10毫克/公斤的水平給藥,及與30毫克/公斤的BTT-2089相比較。以相同方式進行該研究的所有其他方面係,除了略去地塞米松對照組之外。每日以腹膜內方式投予30毫克/公斤的莫非吉蘭(mofegiline)(BTT-2089)之SSAO抑制作用,再度具有一有益效應,及顯示在SSAO抑制作用後之新生內膜生成作用與管腔狹窄百分比顯著降低。在經每日以腹膜內方式投予10毫克/公斤的SSAO抑制劑治療之組別中,亦造成新生內膜生成作用顯著降低。在所有組別之間未觀察到血管壁直徑、中層與管腔區域之顯著改變。10毫克/公斤的BTT-2079與30毫克/公斤的BTT-2089之內膜中層比例係顯著低於對照組,但僅30毫克/公斤的BTT-2089組之管腔狹窄百分比係顯著低於對照組。血管完整性不受影響。
該等研究顯示當相較於一個對照治療組時,SSAO抑制劑的全身性給藥作用在ApoE3萊登(Leiden)小鼠套箍模式中產生較少的新生內膜增厚作用(新生內膜纖維變性)。
博萊黴素(Bleomycin)所引發的肺臟纖維變性,係用於研究肺纖維變性之一種確立與可再現的小鼠模式。
藉由愛澤特(Alzet)公司滲透壓型迷你幫浦,以博萊黴素(Bleomycin)(100毫克/公斤)全身性處理年齡為8個星期的雄性C57BL/6J小鼠達7天,以引發肺損傷。在植入幫浦後之7至21天觀察到非肺毒性。如組織病理方式所評估,在第21天肺臟中有12至15%纖維變性。之後出現可藉由呼吸速率增加與體重大幅下降觀察到之臨床肺臟損傷,及最後在42天內導致死亡(若未在之前終止研究)。
將小鼠隨機地分入研究組別,及自第0天至第28天期間,每三天藉由靜脈注射而以一載劑、VAP-1抑制劑或參考化合物治療。各研究組的一半小鼠在第21天犧牲,而另外一半在第28天犧牲。
在屍體解剖時,將肺臟固定(10%中性經緩衝的福馬林),及進行組織病理處理以將纖維變性損傷分級。組織切片係以H&E與馬森(Masson)三色染劑進行染色,以識別纖維變性。藉由電腦輔助式影像分析,將各小鼠的纖維變性肺臟面積相對於總肺臟面積之比例量化。
依序使用單因子ANOVA與適宜的事後檢定,以分析具有二個以上的變異數組別之試樣顯著性。
可顯示肺纖維變性減少,如藉由相較於對照組之統計上顯著的評分降低所證明。
糖尿病可引起與進行性腎臟纖維變性相關聯的糖尿病性腎病變(DN),最後減少具功能性的腎臟組織。為評估抗VAP-1抗體與SSAO抑制劑對於腎臟纖維變性之效應,採用一些用於糖尿病腎臟疾病之完善的小鼠模式:1)Db/db糖尿病小鼠模式;2)鏈佐黴素誘發型糖尿病的小鼠模式;及3)單側輸尿管阻塞之腎臟纖維變性模式。
該等實驗的所有方面(安置、實驗及動物之處理)一般係依據“實驗動物管理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)”(美國華盛頓特區的國家學院出版社(National Academy Press)於1996年出版)進行。
1)Db/db糖尿病小鼠模式。使用體重為50±10克及年齡約15個星期的雄性非胰島素依賴型糖尿病小鼠。所有小鼠係每日以腹膜內方式投予一載劑(水)或各種劑量的試驗物質一次,及連續給藥6個星期。讓所有動物自由取用平常的實驗室飼料與水。
在第1與第6星期取得的血液試樣中,藉由酵素方法(變旋酶-GOD)測定血清化學水平。在6個星期的給藥期間之開始與結束時,測定尿液中的蛋白含量與腎小球濾過率。在研究完成時,犧牲動物及保存右腎以供進行組織病理學分析,及急速冷凍左腎以供進行膠原蛋白分析。
2)鏈佐黴素誘發型糖尿病小鼠模式。年齡為6至7個星期(體重為20至25克)的雄性小鼠在注射鏈佐黴素(STZ)之前禁食6小時。為誘發糖尿病,現混合的STZ(在檸檬酸鈉緩衝劑中為7毫克/毫升)係以腹膜內方式注射55毫克/公斤至事先禁食的各隻小鼠中。為完成該疾病的誘發作用,重複該程序,藉此各隻小鼠連續5天各領受一次的STZ注射作用。在最後的STZ注射作用後之一個星期,將非空腹血液葡萄糖低於280毫克/分升之小鼠從實驗中排除,因該等小鼠所發生之糖尿病通常不足以造成顯著的腎損傷。
連續三個星期,每二天以腹膜內方式投予所有小鼠適當體積的一載劑或試驗物質。給予所有動物可任意取用之平常的實驗室飼料與水。
藉由酵素方法(變旋酶-GOD),測定血液試樣之血清化學水平。藉由測量尿液白蛋白排出量與肌酸酐廓清率而以生化方式評估腎臟損傷,及進一步藉由馬森(Masson)三色染劑與過碘酸希夫(Schiff)染色作用而以組織學方式評估。
3)單側輸尿管阻塞-腎臟纖維變性模式。所有小鼠係在手術前的5天與手術後的7天期間以腹膜內方式投予一載劑或試驗物質。每二天注射適於抑制SSAO之一量的抑制劑與載劑。給予所有動物可任意取用之平常的實驗室飼料與水。
藉由異氟烷(2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟-乙烷)吸入作用,麻醉年齡為6至7個星期(體重為20至25克)的雄性小鼠,及在手術前皮下注射0,05至0,1毫克/公斤的丁基原啡因(Buprenorphine)。小鼠係進行單側輸尿管阻塞(UUO)或一假手術。在經UUO手術的小鼠中,左側輸尿管係以4-0絲質縫合線在二個點結紮,及在二個結紮之間切斷以預防逆行性泌尿道感染。小鼠係在手術後的第7天犧牲。
藉由測量尿液白蛋白排出量與肌酸酐廓清率而以生化方式評估腎臟損傷,及進一步藉由馬森(Masson)三色染劑與過碘酸希夫(Schiff)染色作用而以組織學方式評估。
在所有研究中使用單因子ANOVA與唐奈特氏(Dunnett)檢定,以確定經治療組與載劑組之間的顯著差異。當*P<0.05時,則認為差異顯著。
可顯示腎臟纖維變性減少,如藉由相較於對照組之統計上顯著的評分降低所證明。
糖尿病性腎病變係末期腎臟疾病之常見原因,而纖維變性及尤其間質纖維變性係糖尿病性腎臟之一個關鍵病理學特徵。臨床研究可測定VAP-1抑制劑是否可減少糖尿病病患的腎病變及藉此延長腎臟功能。
在一研究中納入患有第1或2型糖尿病及腎小球濾過率(GFR)介於20至75毫升/分鐘/1.73平方公尺之間、蛋白尿高於300毫克/日及在一種血管收縮素轉化酵素(ACE)抑制劑或一種血管收縮素受體拮抗劑(ARA)作用下之血壓低於或等於140/90之成年病患。病患係藉由可每日一次或較不頻繁之一種適宜的給藥方法,領受一有效水平之一種VAP-1抑制劑或一安慰劑達1年。將病患隨機分派至安慰劑或VAP-1抑制劑組。在研究期間,定期監測病患的參數,諸如空腹血液與尿液的葡萄糖水平、血壓及臨床化學參數。可抽取附加的血液試樣以測量血清中的VAP-1 SSAO水平,該水平在糖尿病中可能上升及與該疾病的進程相關。另外可評估血清試樣中的甲基胺水平。甲基胺的升高係VAP-1 SSAO活性的抑制作用之一種生物標記。要求病患居家定期測量其等的血壓與血液葡萄糖及記錄所得的數值,以監測其等的糖尿病狀態。經由投予適當量的胰島素,可依該方式持續良好地控制病患的糖尿病。
依目前的糖尿病性腎病變照護標準照顧病患,其可包括一種ACE抑制劑及/或ARA之治療、血壓目標低於130/80之抗高血壓療法及具有適當設定的HbA1C目標之嚴格的血糖控制。
藉由GFR評估腎功能,及該研究的主要終點可為自基線至研究期間結束時之腎功能變化。次要終點可包括在研究期間之尿液白蛋白排出量的變化百分比。
例如可藉由下列方法,測定一體液試樣諸如血清中之sVAP-1水平:用於量化可溶性VAP-1之時差式單一步驟免疫螢光分析(TR-IFMA)(DELFIA),可使用在經鏈黴卵白素塗覆的微量滴定盤上作為一捕獲劑之生物素接合型小鼠抗人類VAP-1抗體TK8-14(拜奧諦治療(Biotie Therapies)公司)。可使用作為一示蹤劑之銪接合型小鼠抗人類VAP-1抗體TK8-18(拜奧諦治療(Biotie Therapies)公司),進行結合的可溶性VAP-1之檢測作用。可藉由在615奈米測量時差式螢光(Victor3多重標記計數器)而檢測標記。螢光計數係與試樣中存在多少可溶性VAP-1直接相關。然後可藉由與一參考物的標準曲線相比較而分析試樣數據。
<110> 生化治療(Biotie Therapies)公司
<120> 治療方法
<130> 2091339TW
<160> 48
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
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<221> 其他_特徵
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第1圖VAP-1抗體BTT-1029的投藥作用產生近乎完全的保護作用而免於四氯化碳所引發的肝臟纖維變性。在來自注射礦物油(MO,對照組)、四氯化碳或同時注射四氯化碳與VAP-1抗體之WT與VAP-1剔除型小鼠的肝臟,進行錫利(Sirius)紅染色作用。使用Image J閾值分析,進行纖維變性瘢痕形成作用的定量測量。顯示來自三組的平均值±SEM。放大倍數為10倍。
第2圖儘管四氯化碳的纖維變性誘發作用,經VAP-1抗體治療的肝臟及VAP-1剔除型肝臟顯示顯著地缺少肝炎與壞死區域。放大20倍之蘇木色素與伊紅(eosin)染色作用係突顯壞死的肝細胞(箭頭)與進行中的肝炎(箭號)。
第3圖藉由VAP-1抗體預防纖維變性組織中的膠原蛋白IV與彈性蛋白表現作用之增加。使用Image J閾值分析,進行膠原蛋白IV、彈性蛋白及層黏連蛋白染色作用之定量測量。顯示來自三組的平均值±SEM。
第4圖mRNA水平顯示VAP-1對於肝臟的星形細胞與纖維母細胞之一調節效應。進行彈性蛋白、aSMA、VAP-1及TIMP1之定量RT-PCR分析。數據係以來自各測量三次的三隻小鼠之平均值±SEM形式呈現。*p<0.05,**<0.01,***<0.001(ANOVA)。
第5圖血清中的可溶性VAP-1與SSAO活性增加,以回應四氯化碳所引發的肝臟纖維變性。A.以一種時差螢光DELFIA分析法,分析四氯化碳所引發的肝臟纖維變性對於血清中的可溶性VAP-1水平之效應。B.使用一種放射化學分析,在來自四氯化碳所引發之WT肝臟的血清中發現SSAO活性水平之增加。
第6圖藉由四氯化碳所引發的腎小球損傷,在VAP-1剔除型小鼠與經VAP-1抗體治療的C57BL/6小鼠中獲得救護。放大40倍之蘇木色素與伊紅(eosin)染色作用係突顯腎小球。
第7圖在VAP-1剔除型小鼠與經VAP-1抗體治療的小鼠中,顯著地降低由於四氯化碳所引發的腎小球纖維變性之膠原蛋白累積作用。來自注射礦物油(MO,對照組)、四氯化碳或同時注射四氯化碳與VAP-1抗體的WT與VAP-1剔除型小鼠之腎臟,係進行錫利(Sirius)紅染色作用。使用Image J閾值分析,進行纖維變性瘢痕形成作用的定量測量。顯示來自三組的平均值±SEM。放大倍數為40倍。
第8圖相較於經載劑治療的小鼠,來自經VAP-1抗體(BTT-1029)治療之暴露於菸草煙霧的小鼠之支氣管肺泡灌洗液中的總細胞計數減少。
第9圖相較於經載劑治療的小鼠,來自暴露於菸草煙霧之經羅氟司特(roflumilast)治療的對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中之總細胞計數減少。
第10圖相較於經0.9%氯化鈉治療的對照組,在地塞米松治療組與二個SSAO抑制劑(BTT-2089)治療組中之中層生成作用顯著降低。
第11圖相較於經0.9%氯化鈉治療的對照組,在地塞米松治療組與二個SSAO抑制劑(BTT-2089)治療組中之新生內膜生成作用顯著降低。
第12圖經HPS(蘇木色素根皮紅番紅花)染色的血管片段之實例。當相較於對照組A時,在SSAO抑制劑治療組C與D中之管腔尺寸增加。A:0.9%氯化鈉組;B:地塞米松;C:10毫克/公斤的BTT2089;D:30毫克/公斤的BTT2089。
Claims (10)
- 一種血管附著蛋白-1(VAP-1)抑制劑的用途,該VAP-1抑制劑為一抗VAP-1抗體,用於製造供治療或減緩一種纖維變性病況用的一藥劑,該纖維變性病況係選自由肺纖維變性、腎臟纖維變性、骨髓纖維變性、胰臟纖維變性、硬皮症、結締組織疾病、瘢痕形成、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、動脈纖維變性、關節纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜後纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性及慢性阻塞性肺病(COPD)所組成之群組,而COPD係其中呼吸道壁纖維變性而具有肌纖維母細胞與膠原蛋白的累積及如同所有纖維變性組織收縮之一疾病,其中該抗體係一種完全人類抗VAP-1抗體,包含一重鏈多肽及一輕鏈多肽,該重鏈多肽包含分別於序列辨識編號1、2和3中所述之3個互補決定區(CDR)序列,該輕鏈多肽包含分別於序列辨識編號24、25和26中所述之3個CDR序列。
- 如申請專利範圍第1項之用途,其中腎臟纖維變性係自糖尿病性腎病變所產生。
- 如申請專利範圍第1項之用途,其中該抗體具有一種重鏈多肽,其包含分別於序列辨識編號4、9和14中所述的三個CDR序列;及具有一種輕鏈多肽,其包含分別於序列辨識編號27、32和37中所述的三個CDR序列。
- 如申請專利範圍第1項之用途,其中該抗體所具有的一 個重鏈變異區係包含選自由序列辨識編號19至23所組成之群組的一胺基酸序列,及所具有的一個個別輕鏈變異區係包含選自由序列辨識編號42至46所組成之群組的一胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之用途,其中該抗體係一種完全人類重組抗體,其包含序列辨識編號47中所述的一種重鏈多肽及序列辨識編號48中所述的一種輕鏈多肽。
- 一種體外診斷一個體之COPD之方法,該方法包括:a)提供來自該個體的一體液試樣,b)分析該試樣中之可溶性VAP-1(sVAP-1)的量,c)以該sVAP-1量為基礎而診斷纖維變性。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該sVAP-1量係與一參考體液中的sVAP-1量比較。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該sVAP-1量係使用一種VAP-1特異性抗體測定。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該體液係血清或血漿。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該診斷係包括測定纖維變性程度。
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