KR20200115547A - 섬유성 병리를 치료하는 방법 - Google Patents

섬유성 병리를 치료하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200115547A
KR20200115547A KR1020207024004A KR20207024004A KR20200115547A KR 20200115547 A KR20200115547 A KR 20200115547A KR 1020207024004 A KR1020207024004 A KR 1020207024004A KR 20207024004 A KR20207024004 A KR 20207024004A KR 20200115547 A KR20200115547 A KR 20200115547A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
alkyl
yap
cell
taz
Prior art date
Application number
KR1020207024004A
Other languages
English (en)
Inventor
다니엘 제이. 춤퍼린
앤드류 제이. 핵
Original Assignee
메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 filed Critical 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Publication of KR20200115547A publication Critical patent/KR20200115547A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/438—The ring being spiro-condensed with carbocyclic or heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/473—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. acridines, phenanthridines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/4045—Indole-alkylamines; Amides thereof, e.g. serotonin, melatonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/48—Ergoline derivatives, e.g. lysergic acid, ergotamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/485—Morphinan derivatives, e.g. morphine, codeine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 출원은 조직 섬유증과 관련된 질환 및 병태를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.

Description

섬유성 병리를 치료하는 방법
우선권 주장
본 출원은 2018년 1월 31일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제62/624,535호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은, 예를 들어, 섬유아세포에서 YAP/TAZ를 억제하는 화합물을 사용함으로써 조직 섬유증과 관련된 질환 및 병태를 치료하는 것에 관한 것이다.
모든 장기에 걸친 조직 섬유증은 많은 사람들 집단에 영향을 미친다. 미국에서만 50만명이 넘는 사람들이 간 (>400k)과 폐 (>100k) 섬유증에 의해 영향을 받는다. 이들 질환은 임상적으로 치료하기 매우 어려운 것으로 남아 있다. 특발성 폐 섬유증 (IPF) 및 경피증과 같은 예에서, 치료 옵션은 매우 제한적이다. 사실, 이 질환 군의 경우, 5년 생존율은 많은 후기 단계 공격성 암만큼이나 비관적일 수 있다.
조직 섬유증은 섬유 결합 조직 단백질의 제어되지 않은 침착 및 감소된 소거율을 특징으로 하고, 궁극적으로 치명적인 말기 기관 반흔을 유도한다. Yes-관련된 단백질 1 (YAP), 및 PDZ-결합 모티프를 갖는 전사 보조 활성인자 (TAZ)는 조직 섬유증을 촉진하는 중간엽 세포 활성화에 역할을 한다1-4. YAP 및 TAZ는 중간엽 세포에서 다발성 전구섬유화 (pro-fibrotic) 자극의 다운스트림 전사 이펙터이고5, 다른 세포 및 조직에서의 이들의 발현은 재생 및 항상성에 필수적이고6, 이들을 치료학적으로 표적화하려는 노력을 복잡하게 한다7.
하나의 일반적인 양상에서, 본 출원은 중간엽 세포에서 GPCR 효능작용을 통해 YAP 및 TAZ를 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 제시된 데이터는 폐 및 간 섬유증의 뮤린 모델에서 이러한 접근법의 효능을 입증한다. GαS-커플링된 도파민 수용체 D1은 이들 기관의 다른 주요 상주 세포 (resident cell)에 비해 폐 및 간 중간엽세포에서 우선적으로 발현된다. D1 수용체의 효능작용은 중간엽 세포에서 YAP/TAZ 기능을 선택적으로 억제하고, YAP/TAZ 의존성 방식으로 이들의 표현형을 전구섬유화로부터 섬유증-해소로 전환시켜 시험관내 세포외 매트릭스 축적 및 경직 (stiffening), 및 생체내 조직 섬유증을 효과적으로 역전시킨다. 이 발견은 조직 섬유증을 촉진하는 표적을 억제하는 세포-선택적 접근법을 입증하고, 섬유증-해소 중간엽 표현형을 생성하기 위한 전략으로서 GαS 효능작용을 확립한다.
하나의 일반적인 양상에서, 본 출원은 섬유성 병리를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료학적 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, GαS 단백질 커플링된 수용체는 상피 또는 내피 세포와 비교하여 중간엽 세포에서 우선적으로 발현된다. 이들 구현예의 일부 양상에서, 효능제는 중간엽 세포에서 우선적으로 발현되는 GαS 수용체에 특이적이다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에서 GαS 단백질 커플링된 수용체를 효능화시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에서 YAP/TAZ 인산화를 촉진시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에서 YAP/TAZ 기능을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에서 전구섬유화 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에서 YAP/TAZ의 핵 국소화를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에서 α-평활근 액틴 (αSMA)의 발현을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에 의한 세포외 매트릭스 생성 및 침착을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 세포에 의한 세포외 매트릭스 분해를 증진시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양상에서, 본 출원은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 본원에 기재된 바와 같다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 출원에 사용하기 위한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있고; 당업계에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 예시일뿐이고 제한하려는 의도는 아니다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 다른 참조문헌은 그들의 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 제어될 것이다.
본 출원의 다른 특성 및 이점은 하기의 상세한 설명과 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1 Gα S -커플링된 도파민 수용체 D1은 폐 섬유아세포에서 선택적으로 발현된다. a. GPCR 신호전달에 의한 YAP/TAZ 전사 보조인자 활성의 조절. GαS에 커플링되는 수용체는 cAMP를 상승시키고 핵 국소화를 차단하는 YAP/TAZ의 인산화를 유도한다. Galphαi/q/12에 커플링되는 수용체는 Rho-키나제 (ROCK)를 통해 가능한 YAP/TAZ의 핵 국소화 및 활성을 촉진시킨다. b. 배양된 인간 폐포 상피 세포 및 정상 인간 폐 섬유아세포의 GPCR 발현 프로파일링. 도파민 수용체 D1 (DRD1) 전사체는 섬유아세포에서 고도로 발현되고 상피 세포에서는 검출되지 않는다. 적색 점은 GαS에 선택적으로 커플링되는 GPCR을 나타낸다. 오렌지색 대각선은 10배 우선적 발현을 나타내고, 청색 선은 100배 우선적 발현을 나타낸다. c. 배양된 비-IPF 관련 섬유아세포, IPF 환자-유래된 섬유아세포, 정상 인간 폐포 상피 세포 (NHAEpC), 및 정상 인간 미세혈관 내피 세포 (NHMVEC)에서의 DRD1 발현, 6회 이하 계대. NHAEpC 및 NHMVEC, n=2. 비-IPF FB 및 IPF FB, n=6. d. 새롭게 단리된 마우스 폐 섬유아세포 (FB), 상피 (EpC), 내피 세포 (EC), 및 백혈구 (Leuk)에서 DRD1의 발현. 건강한 COL1A1-GFP 발현 마우스로부터의 폐를 효소적으로 분해하고, 이어서 섬유아세포 (GFP+, CD140a+), 상피 세포 (CD326+), 내피 세포 (CD31+) 및 백혈구 (CD45+)의 마커에 대해 분류하고, 이어서 RNA를 단리하여 선택적 집단 및 Drd1의 발현을 입증한다.
도 2 도파민 수용체 D1 효능작용은 YAP/TAZ 핵 국소화를 차단한다. a. 다양한 효능을 갖는 도파민 수용체 D1의 선택적 효능제는 YAP/TAZ 핵 국소화를 억제하고; 이 효과는 DRD1 수용체 길항제 (SCH 39166, 3 μM), (디하이드렉시딘, 10 μM)로 처리하여 극복될 수 있다. IMR-90 세포는 고정화 2시간 전에 처리하였다. N=4 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001). 스케일 막대는 100 μm를 나타낸다. b. DRD1 발현과 일관되게, DHX는 섬유아세포 (IPF-FB)에서만 YAP/TAZ를 억제하지만 상피 (NHEpC) 또는 내피 (NHMVEC) 세포에서는 그렇지 않다. N=4 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001) c. YAP/TAZ 국소화는 Galphαi/q/12, 엔도텔린 1 (ET-1: 100 nM), 리소포스파티드산 (LPA: 10 μM), 및 세로토닌 (5-HT: 1 μM)에 커플링된 수용체를 자극하는 다중 리간드를 통해 유도된다. 각각의 경우에, DHX 처리 (10 μM)는 YAP/TAZ에 대한 이 효과를 역전시킬 수 있다. IMR-90 세포는 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 24시간 동안 플라스틱 세포 배양 플레이트 상에 고밀도로 분주하고, 고정화 전 2시간 동안 처리하였다. N=4 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001), (각각의 자극된 효능제 ET-1, LPA, 또는 5-HT 대비 ++++ p < 0.0001). 스케일 막대는 100 μm를 나타낸다. d. DHX (10 μM) +/- SCH 39166 (3 μM)을 사용하여 20분 동안 처리된 IPF 환자-유래된 섬유아세포에서 측정된 cAMP. N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 ** p < 0.01). e. Rho-키나제 억제제 Y27632 (20 μM), 직접적인 cAMP 자극인자 포르스콜린 (Forskolin) (10 μM), 또는 DHX (10 μM)에 의한 YAP의 인산화. IMR-90 세포는 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 24시간 동안 배양하고, 고정화 전 2시간 동안 처리하였다. N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 *** p < 0.001).
도 3 DHX는 섬유아세포 매트릭스 침착, 수축 및 경직을 역전시킨다. a. DHX는 IPF 환자-유래된 섬유아세포에서 전구섬유화 유전자 발현을 차단한다. 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 콜라겐 I (COL1A1), αSMA (ACTA2), 및 피브로넥틴 (FN1)을 암호화하는 유전자는 DHX (10 μM), +/- SCH 39166 (3 μM)을 사용한 24시간 처리에 의해 감소된다. N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, * p < 0.05) b. DHX는 TGFβ-유도된 αSMA+ 스트레스 섬유 형성을 역전시킨다. IMR-90 세포는 48시간 동안 2 ng/mL TGFβ로 사전 자극하고, 이어서 고정화 전 추가 24시간 동안 DHX (10 μM) + 2 ng/mL TGFβ로 처리하였다. αSMA에 대해 양성인 세포는 맹검 연구자에 의해 정량화하고 우측 하단 모서리에 나타내고, 각각의 실험에서 최소 300개 세포를 정량화하였다. N=3. c. DHX는 TGFβ-유도된 세포외 매트릭스 축적을 역전시킨다. 컨플루언스에서 성장한 IPF 환자-유래된 섬유아세포는 48시간 동안 2 ng/mL TGFβ로 사전 자극하고, 이어서 고정화 전 추가 24시간 동안 DHX (10 μM) + 2 ng/mL TGFβ로 처리하였다. 세포 유래된 매트릭스는 콜라겐 I 및 피브로넥틴에 대한 항체를 사용하여 측정한다. N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, ** p < 0.01) d. DHX는 견인력 현미경 (traction force microscopy)으로 측정된 IPF 환자-유래된 섬유아세포 수축성을 약화시킨다. 대표적인 견인 맵은 지정된 농도의 DHX로 처리된 6.4 kPa 매트릭스 상에 분주된 세포로부터 나타난다. RMS 견인은 2개의 독립적인 실험에서 결정되었고; 박스 및 위스커 플롯 (box and whisker plot)은 하나의 대표적인 실험으로부터 최소에서 최대, 사분위 및 평균을 보여준다 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001, * p < 0.05). e. DHX는 세포외 매트릭스 경직을 역전시킨다. 젤라틴-코팅된 조직 배양 플레이트 상에 분주된 NIH-3T3 세포는 강성도 (탄성률)를 측정하기 위해 AFM 마이크로압입 (microindentation) 분석 전 72시간 동안 2 ng/mL TGFβ 및 20 μM 아스코르브산을 갖는 매트릭스에 침착하도록 자극하였다. 이어서, 동일한 디쉬를 추가 72시간 동안 동일한 배지에서 +/- 10 μM DHX를 처리하고, AFM 분석하였다. 매트릭스를 탈세포화시키고 계대 3회 NHLF를 매트릭스 상에 분주하고; 24시간 후, RNA를 수거하고 전구섬유화 유전자의 발현을 분석하였다. AFM 분석 N=2. 각각의 플레이트에 대해 75회 압입 측정을 수행하였다. 박스 및 위스커 플롯은 하나의 대표적인 실험으로부터 최소에서 최대, 사분위 및 평균을 보여준다 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001) (첫 72시간 항온처리 후 동일한 배양 플레이트 대비 ++ p < 0.01, + p < 0.05). 탈세포화된 매트릭스 상에 분주된 세포로부터 RNA의 측정 N=3. (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 * p < 0.05). f. DHX는 매트릭스 분해 유전자 프로그램 대비 매트릭스 침착을 조절한다. 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 배양된 IPF 환자-유래된 섬유아세포는 RNA 단리 전 2 ng/mL TGFβ 및 10 μM DHX로 24시간 동안 자극하였다. ECM 가교결합을 위해 트랜스글루타미나제 2 (TGM2), 리실 옥시다제 및 리실 옥시다제-유사 효소 (LOX 및 LOXL1-4)를 암호화하고, ECM 분해를 위해 uPA (PLAU), tPa (PLAT), 카뎁신 K (CTSK), 및 매트릭스 메탈로프로테아제-14 (MMP14) 및 ECM 프로테아제 억제제를 암호화하고: 메탈로프로테아제 억제제 3 (TIMP3), 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 (SERPINE1)을 암호화하는 유전자를 측정하였다. N=3. (0.1% DMSO 비히클 대조군 비-TGFβ 처리 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05), (0.1% DMSO 비히클 대조군 TGFβ 처리 대비 ++++ p < 0.0001, ++ p < 0.01, + p < 0.05).
도 4 DHX는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증을 치료학적으로 역전시킨다. a. 블레오마이신 유도된 폐 손상 및 DHX 치료학적 이득의 결과로서 체중 변화. 암컷 마우스에 0일에 블레오마이신을 기관내 투여하였고; 치료는 10일에 개시하였고 (5 mg/kg DHX i.n., 매일) 24일 까지 계속하였다. b. 콜라겐 및 구조 변화를 시각화하기 위한 H&E 염색. 파라핀 포매된 폐 절편을 염색하고 폐 병리학자에 의한 맹검 방식으로 분석하고 애쉬크로프트 방법 (Ashcroft method)을 사용하여 점수를 매겼다. c. 폐에서 콜라겐 침착을 측정하기 위한 하이드록시프롤린 검정. 급속 (snap) 동결된 폐 조직은 하이드록시프롤린 검정을 사용하여 콜라겐 풍부함에 대해 생화학적으로 분석하였다. d. αSMA 및 Yap/Taz에 대한 폐 절편의 면역형광 이미지화. 폐 절편은 αSMA 및 Yap/Taz에 대해 면역 탐지하여 염색하였다. αSMA와 Yap/Taz 둘 다에 대해 이중 양성인 세포는 자동화 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. e. 전구섬유화 유전자 발현에서의 변화, 전체 폐 균질물 중 Yap 및 Taz (Wwtr1). 샴 (Sham) 대조군 N=15, 블레오 (Bleo) 대조군 N=17, 및 블레오 DHX N=17. (샴 대조군 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05) (각각의 블레오 대조군 대비 ++ p < 0.01, + p < 0.05).
도 5 기관내 투여된 YAP/TAZ siRNA는 블레오마이신 유도된 폐 손상 및 섬유증을 악화시킨다. 마우스에 0일에 블레오마이신을 투여하고, 이어서 14일에 Yap 및 Taz에 대해 siRNA를 기관내 투여하였다. 21일에 BAL 유체를 수거하고 분석을 위해 폐를 수거하였다. Yap/Taz siRNA는 콜라겐 침착 (a), 혈관 누출 및 폐 손상 (b-d)을 증진시켰다. 샴 처리된 마우스 N=4, 블레오 처리된 마우스 N=6 (샴 NT-siRNA 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05).
도 6 DHX는 다중 조직으로부터의 섬유아세포에서 YAP/TAZ 국소화를 억제한다. a. 폐 (IMR-90 및 IPF-FB) 간성상 세포 (HSC), 인간 성인 심장 섬유아세포, (HACF) 및 인간 피부 섬유아세포 (HDF)로부터 유래된 중간엽 세포를 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 24시간 동안 플라스틱 세포 배양 플레이트 상에 고밀도로 (컨플루언트) 또는 희박하게 (대조군 및 모든 나머지 조건) 분주하고, Rho 키나제 억제제 Y27632, 아데닐레이트 사이클라제 활성화제 포르스콜린 및 DHX로 2시간 동안 처리하였다. N=4, 핵 YAP/TAZ에 대해 양성인 세포는 자동화된 이미지 분석에 의해 정량화하였다. b. YAP/TAZ 핵 국소화의 DHX 억제를 위한 시간 과정. IMR-90 세포, N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 *** p < 0.001). c. DHX는 PGE2와 달리, IPF 유래된 섬유아세포에서 효능을 상실하지 않는다. N=3.
도 7 DHX는 DRD1 효능작용을 통한 전구섬유화 유전자 발현을 억제한다. a. DRD1을 녹다운시키기 위한 siRNA 처리. b/c. DRD1-siRNA 처리된 세포에서 YAP/TAZ 핵 국소화 및 전구섬유화 유전자 발현의 감소된 DHX-매개된 억제. DHX로 2시간 (b) 또는 24시간 (c) 처리 전에 72시간 동안 DRD1 또는 NTsiRNA를 표적화하는 siRNA로 형질감염된 IMR-90 세포. 모두에 대해 N=2 (NTsiRNA 대비 **** p < 0.0001, ** p < 0.01, * p < 0.05).
도 8 전구섬유화 유전자 발현 및 매트릭스 침착의 DHX 억제는 YAP/TAZ의 억제를 요구한다. DHX는 섬유아세포가 항상성 활성 돌연변이체 TAZ (TAZ4SA)를 발현하는 경우 전구섬유화 유전자 발현 (a) 및 ECM 침착 (b)을 억제하지 않는다. TAZ4SA 발현은 10 μM 또는 지시된 농도의 디하이드렉시딘으로의 처리 전 72시간 동안 100 ng/mL의 독시사이클린으로 유도하였다. 유전자 발현 실험의 경우, NIH-3T3 세포 내 DHX의 효능은 TGFβ (24시간, 2 ng/mL) 유도된 유전자 발현에 대한 DHX (10 μM) 효과에 의해 입증되었다. 모두에 대해 N=2.
도 9 DHX 단독은 폐 매트릭스 함량 또는 전구섬유화 유전자 발현에 영향을 미치지 않는다. 정상의 건강한 마우스에서, DHX는 체중 (a), 폐 조직학 (b), 폐 콜라겐 침착 (c), 또는 Ctgf, Col1a1, Acta2, 및 Fn1의 발현 (d)을 변화시키지 않았다. 그룹 당 n = 6마리 마우스.
도 10 DHX는 간성상 세포 활성화 및 생체내 간 섬유증을 역전시킨다. a. DRD1은 배양된 인간 간성상 세포 (HSC)에서 우선적으로 발현된다: ACTA2, PDGFRA 양성, 배양된 인간 간세포 (Hep)에 상대적인: ALB 양성. N=1. b. DHX는 시험관내 TGFβ-매개된 간성상 세포 활성화를 억제한다. HSC는 αSMA 및 피브로넥틴의 총 단백질 단리 및 웨스턴 블롯 분석 전에, 48시간 동안 TGFβ +/- DHX (10 μM)로 자극하였다. N=3 (대조군 + TGFβ 대비 *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05). c. DHX는 트리크롬 염색에 의해 측정된 생체내 담관 결찰 (BDL) 매개된 섬유증을 역전시키고, d. 하이드록시프롤린. 샴 대조군 N=5, BDL 대조군 N=7, 및 BDL DHX N=8 (BDL 대조군 대비 ** p < 0.01).
도 11은 선택된 D1 수용체 효능제의 물리적 성질을 보여준다.
도 12는 A-68930의 선택된 유사체의 물리적 성질을 보여준다.
도 13은 YAP 인산화가 pYAP의 핵 국소화를 차단함을 보여준다.
도 14는 동일한 수용체를 표적화하고 다양한 구조를 갖는 D1 수용체 효능제가 유사한 효과를 생성함을 보여준다.
도 15는 DHX에 의한 YAP 불활성화가 D1 수용체 활성에 기초함을 보여준다.
도 17은 D1 수용체 효능제가 IPF를 갖는 환자 기원의 섬유아세포에서 다중 전구섬유화 유전자의 발현을 감소시킴을 보여준다.
도 18은 D1 수용체 효능제가 IPF 섬유아세포에서 증식을 선택적으로 느리게 함을 보여준다. IPF 섬유아세포 및 정상 폐 섬유아세포 공동-배양 증식. 세포는 형광 염료 (적색 및 녹색)로 사전 표지화시키고, 이어서 96 웰 플레이트에서 1:1의 비율로 공동 배양하였다. 세포 계수는 24시간 마다 결정하고 IPF/HLF 세포의 비율로서 플롯팅한다. 대조군 웰에서, IPF 세포는 과성장하고 웰을 넘쳐난다. N=2.
도 19는 YAP/TAZ가 매트릭스 강성도-의존성 섬유아세포 활성화에 필요함을 보여준다.
도 21은 돌연변이체 YAP/TAZ가 NIH 3T3 섬유아세포에서 연질의 매트릭스 상에서 활성임을 보여준다.
도 22는 YAP/TAZ가 생체내 섬유조직발생 잠재력을 부여함을 보여준다.
도 23은 글로벌 YAP/TAZ 표적화가 가능하지 않음을 보여준다.
도 24는 화합물 X (DHX)가 생체내 항섬유화성임을 보여준다.
도 25는 IPF 환자 유래된 섬유아세포, 정상 인간 폐포 상피 세포 (NHAEpC) 및 정상 인간 미세혈관계 내피 세포로부터의 D1 도파민 수용체의 웨스턴 블롯 단백질 발현을 보여준다. NHAEpC 및 NHMVEC, N=2. 비-IPF FB 및 IPF FB, N=3 상이한 공여자 라인.
도 26은 1차 배양된 인간 폐 미세혈관 내피 세포 및 정상 인간 폐 섬유아세포의 GPCR 발현 프로파일링을 보여준다. 적색 점은 GαS에 선택적으로 커플링되는 GPCR을 나타낸다. 청색 선은 100배 우선적 발현을 나타낸다. 프로스타글란딘 수용체 PTGER2 및 PTGDR (DRD1 바로 위의 적색 점)은 또한 섬유아세포 대 내피 세포에서 선택적으로 발현되었지만, 이들 수용체 둘 다는 상피 세포에서 고도로 발현되었다.
도 27 도파민 수용체 D1 효능작용은 YAP/TAZ 핵 국소화를 차단한다. A. D1 수용체 선택적 효능제는 YAP/TAZ 핵 국소화를 억제한다. IPF 환자-유래된 폐 섬유아세포는 다양한 도파민성 효능제 (10 μM)로 고정화 2시간 전에 처리하였다. N=4 상이한 환자 샘플. YAP/TAZ의 % 핵 국소화는 자동화된 이미지화 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 스케일 막대는 100 μm를 나타낸다. C. cAMP는 DHX로 20분 동안 처리된 IPF 환자-유래된 섬유아세포에서 측정하였다. N=3. E. DHX는 다중 기관으로부터의 섬유아세포: 간성상 세포 (HSC), 인간 성인 심장 섬유아세포 (HACF), 및 인간 피부 섬유아세포 (HDF)에서 YAP/TAZ 핵 국소화를 억제하지만, 폐 폐포 상피 (NHAEp) 또는 내피 (NHMVE) 세포에서는 그렇지 않다. N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001).
도 28 DHX는 섬유아세포 매트릭스 침착, 수축 및 경직을 역전시킨다. A. D1 수용체 선택적 효능제는 섬유아세포 활성화를 억제한다 (대표적인 이미지: 1 μM 디하이드렉시딘 (DHX)). IPF 환자-유래된 폐 섬유아세포는 다양한 혼합 선택성 도파민성 효능제 (1 μM) + TGFβ의 라이브러리로 고정화 전 72시간 동안 처리하였다. N=4 상이한 환자 샘플. αSMA 강도는 자동화된 이미지화 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 스케일 막대는 100 μm를 나타낸다. B. DHX는 견인력 현미경으로 측정된 IPF 섬유아세포 수축성을 약화시킨다. (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001, * p < 0.05). C. DHX는 세포외 매트릭스 축적을 역전시킨다. IPF 환자-유래된 섬유아세포는 48시간 동안 2 ng/mL TGFβ로 사전 자극하고, 이어서 추가 24시간 동안 DHX + 2 ng/mL TGFβ로 처리하였다. N=3 (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, ** p < 0.01) D. DHX 및 YAP/TAZ siRNA는 매트릭스 가교결합 및 분해 유전자 프로그램을 조절한다. IPF 섬유아세포는 2 ng/mL TGFβ +/- 10 μM DHX 또는 YAP 및 TAZ siRNA (>90% 녹다운)로 24시간 처리하였다. N=3. 히트 맵은 비자극된 대조군에 상대적인 % 변화를 나타낸다. E. DHX는 세포외 매트릭스 경직을 역전시킨다. IPF 환자 유래된 섬유아세포 및 이들의 세포-유래된 매트릭스는 72시간 후 구형 팁을 사용하여 AFM 마이크로압입에 의해 특징 분석하고, 이어서 추가 72시간 동안 매트릭스 침착 배지에서 +/- 10 μM DHX로 처리하고, 다시 특징 분석하였다. N=5 상이한 환자 샘플. (0.1% DMSO 비히클 대조군 대비 * p < 0.05).
도 29 DHX는 생체내 폐 섬유아세포에서 YAP/TAZ 표적 유전자의 발현을 선택적으로 차단한다. A. 2개 그룹의 마우스는 0일에 블레오마이신으로 기관내 손상시키고, 10일에 하나의 그룹에는 2회 용량의 DHX (폐 수거 전 2시간 및 24시간)를 투여하고, 나머지 그룹에는 비히클 대조군을 투여하였다. 11일에 폐를 수거하여 섬유아세포, 상피 및 내피 세포를 유동 분류하였다. B. 새롭게 단리된 세포로부터의 YAP/TAZ 표적 유전자의 RNA 발현에서의 변화.
도 30 DRD1 효능작용은 폐 섬유아세포에서 YAP/TAZ의 국소화 및 활성을 선택적으로 차단한다. A 및 C. IPF 유래된 폐 섬유아세포, 폐 폐포 상피 (NHAEp) 및 내피 (NHMVE) 세포는 DRD1 선택적 효능제 (DHX, A) 또는 부타프로스트 (EP2 수용체 효능제, C)로 2시간 동안 처리하였다. DRD1 수용체는 섬유아세포에서만 발현되는 반면, cAMP를 또한 상승시키는 EP2 수용체는 3개 세포 유형 모두에서 발현된다. B 및 D. IPF 유래된 폐 섬유아세포, 폐 폐포 상피 (NHAEp) 및 내피 (NHMVE) 세포는 RNA 단리 및 YAP/TAZ 표적 유전자의 측정 전에 DRD1 선택적 효능제 (DHX, B) 또는 부타프로스트 (EP2 수용체 효능제, D)로 24시간 동안 처리하였다. N=2 기술적 리플리케이트.
도 31 DHX 활성은 DRD1 수용체에 의존한다. A-E. DRD1 siRNA 처리는 cAMP의 DHX의 상승 (C), YAP/TAZ 핵 국소화의 억제 (D), 및 YAP/TAZ 표적 유전자의 억제 (E)를 차단한다. F-H. 도파민 수용체 D1 길항제 SCH-39166 및 LE-300은 cAMP의 DHX의 상승 (F), YAP/TAZ 핵 국소화의 억제 (G), 및 YAP/TAZ 표적 유전자의 억제 (H)를 차단한다. F-H. N=3, IMR-90 폐 섬유아세포.
도 32 DHX는 증식을 차단하고 아폽토시스를 위해 폐 섬유아세포를 프라이밍한다. 폐 섬유아세포 (IMR-90 세포 및 IPF 환자-유래된 폐 섬유아세포)의 증식은 GPCR 효능제 ET-1 (100 nM) 및 LPA (10 μM) (A,B) 또는 성장 인자 TGFβ (2 ng/mL) 및 CTGF (100 ng/mL) (C,D) +/- 10 μM DHX의 존재하에 4일 동안 측정하였다. 세포를 고정화시키고 각각의 날의 말기에 DAPI로 계수하였다. N=3 기술적 트리플리케이트. 아폽토시스 촉진 인자 BIM (E,F) 및 항-아폽토시스 인자 BCL2 (G,H)의 RNA 발현은 DHX (10 μM)로 24회 처리 후 평가하였다. N=4.
도 33 DOPA 데카복실라제는 IPF에서 감소하고 악화된 질환 중증도와 상호관련된다. A. DDC 및 DRD1에 대한 발현 수준은 IPF (n=134) 및 대조군 (n=108) 폐의 마이크로어레이 분석으로부터 조사하였다. 각각의 데이터 포인트는 개체로부터의 발현 수준을 나타낸다. 막대는 평균 및 표준 편차를 나타낸다. B. 웨스턴 블롯팅을 사용하여 IPF (n=10) 및 대조군 (n=11) 폐로부터의 전체 폐 균질물에서 DDC 단백질 발현을 검출하였다. 막대는 평균 및 표준 편차를 나타낸다. C. 강제 폐활량 (FVC: forced vital capacity) 및 일산화탄소에 대한 폐의 확산능 (DLCO)과 DDC 발현의 상호관계의 단변량 분석은 피어슨 (Pearson) 상관 계수 (r)를 사용하여 수행하였다. 각각의 데이터 포인트는 개체로부터의 발현 수준 및 폐 기능 (연령, 성별 및 이상적인 체중을 기준으로 예측된 퍼센트로 나타냄)을 나타낸다. P 값은 각각의 도면 패널에 대해 나타낸 바와 같다.
도 34 도파민은 항-섬유화 효과를 촉진시킨다. A. 도파민은 조직 배양 플라스틱 상에 분주된 저밀도 IPF-환자 유래된 섬유아세포에서 YAP/TAZ 핵 국소화를 억제한다. N=2. B. 도파민은 αSMA+ 스트레스 섬유 형성을 역전시킨다. IPF-환자 유래된 섬유아세포는 48시간 동안 2 ng/mL TGFβ로 사전 자극하고, 이어서 추가 24시간 동안 도파민 (1 μM)+ 2 ng/mL TGFβ로 처리하였다. N=4. 스케일 막대는 500 μm를 나타낸다. C. 도파민은 견인력 현미경으로 측정된 IPF 섬유아세포 수축성을 약화시킨다. (나타낸 그룹 대비 **** p < 0.0001, *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05).
도 35 DRD1 효능작용은 인간 피부 섬유아세포에서 전구섬유화 유전자 발현을 차단한다. 인간 피부 섬유아세포는 24시간 동안 +/- 2 ng/mL TGFβ 및 D1 효능제: RNA 단리 전 DHX 및 A68930으로 처리하였다. N=2.
도 36은 cAMP 조절제 및 YAP/TAZ 핵 국소화에 대한 이들의 효과를 보여준다. IMR-90 세포는 96-웰 세포 배양 플레이트에 희박하게 분주하고 나타낸 화합물로 2시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 고정화시키고 YAP/TAZ에 대해 염색하였다. 핵 국소화는 자동화된 이미지화 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. Y27632는 YAP/TAZ 핵 국소화를 감소시키기 위해 양성 대조군으로서 사용된다. 나머지 화합물은 다른 세포 유형에서 cAMP를 상승시키는데 이들의 공지된 개선을 기반으로 무작위로 선택되었다. N=3.
도 37은 디하이드렉시딘 (DHX) 효능이 도파민 수용체 (DRD1, DRD5)와 같이 D1의 발현에 의존함을 보여준다. IMR-90 폐 섬유아세포는 자궁 섬유종 (A)으로부터 유래된 중간엽 세포 보다 더 높은 수준의 DRD1 및 DRD5를 발현하며, 이는 이들 세포 (B)에서 DHX에 의한 YAP/TAZ 핵 국소화의 주변부 억제를 초래한다. ND는 검출되지 않는 유전자를 지칭한다.
조직 섬유증은 심장, 폐, 간 및 신장을 포함한 다중 중요 기관에서 일어날 수 있다. 섬유증은 다중 기전을 통해 정상의 건강한 기관을 구조적으로 그리고 기능적으로 손상된 조직으로 변형시키는 진행성 과정이다. 임상적 관점으로부터, 이들은 치료 옵션이 최소로 유지되고 예후가 일반적으로 매우 불량하기 때문에 심각한 문제를 나타낸다. 중추 신경계의 일부로서 거의 독점적으로 연구되는 도파민 수용체는 실제로 신체의 선택된 조직 및 세포에서 뿐만 아니라 말초에서 고도로 발현된다. 이들 수용체는 조직 섬유증에서 주요한 역할을 수행하는 다운스트림 경로를 통해 신호전달한다. 본 연구는 GαS-커플링된 수용체, 예컨데 도파민 수용체 D1 (DRD1)이 다중 기관에서 조직 섬유증의 치료 또는 예방을 위한 생존 가능한 치료학적 표적으로서 사용됨을 보여준다.
YAP 및 TAZ는 Hippo 경로의 전사 공동-활성인자 및 중추 이펙터이다8. 조직 형태형성 동안에 기관 성장 및 크기 조절에서 이들의 역할을 기반으로 본래 확인된, Hippo 경로 및 성인 조직 내 YAP/TAZ는 상피 및 내피 항상성9-13, 줄기 세포 기능14-16 및 조직 재생9,17,18을 조절한다. 폐 및 간2을 포함한 다중 기관19-22에서 중간엽 세포 활성화 및 섬유증에서 YAP 및 TAZ에 대한 역할을 나타냈다. 일련의 기계적 및 생화학적 신호는 YAP 및 TAZ의 업스트림 조절인자로서 매트릭스 강성도를 포함한 다중 전구섬유화 자극, 잠재적으로 모두 신호전달에 관여하는 TGFβ/SMAD, MRTF/SRF, 및 WNT5 , 23 , 24와 연루되어 있다.
G 단백질 커플링된 수용체는 4개 주요 부류의 G-단백질 (예를 들어, Gα12/13, Gαq/11, Gαi/o 또는 GαS)로부터의 이펙터 단백질에 연결된다. 일부 경우에, G 단백질 커플링된 수용체는 YAP/TAZ 핵 전좌 및 전사 활성을 자극한다. 다른 경우에, G 단백질 커플링된 수용체는 cAMP의 상승을 통해 YAP/TAZ 핵 국소화 및 활성을 억제한다 (예를 들어, 도 1a를 참조).
일부 구현예에서, G 단백질 커플링된 수용체의 활성화 (효능작용)는 생리학적 조건하에서 YAP/TAZ 과인산화 및 불활성화를 초래한다 (예를 들어, 수용체의 효능작용은 YAP/TAZ 핵 국소화를 예방한다). 이것은 YAP/TAZ 핵 전좌 및 전사 활성을 자극하는 G 단백질 커플링된 수용체의 불활성화 (길항작용)와 대조적이며, 이는 Acta2 (αSMA), Ctgf (결합 조직 성장 인자), Fn1 (피브로넥틴), Col1a1 (콜라겐 I), 및 Col1a2 (콜라겐 II)와 같은 전구섬유화 유전자의 발현을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 세포에서 G 단백질 커플링된 수용체를 효능화시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 본원에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 세포에서 TAZ 인산화를 촉진시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 본원에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, G 단백질 커플링된 수용체의 효능작용은 YAP/TAZ 인산화 및 후속적 분해를 초래한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 세포에서 YAP/TAZ 기능을 억제하는 (예를 들어, 세포에서 전구섬유화 유전자의 발현을 억제하는) 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포와 본원에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, G 단백질 커플링된 수용체의 효능작용은 세포에서 YAP/TAZ 기능의 억제 및 세포에서 전구섬유화 유전자의 발현의 후속 억제를 초래한다. 일부 구현예에서, 세포에서 YAP/TAZ 기능의 억제는 조직 내 세포외 매트릭스의 축적을 예방한다. 일부 구현예에서, G 단백질 커플링된 수용체의 효능작용은 섬유 형성 및 세포외 매트릭스 축적을 역전시킨다. 일부 구현예에서, 섬유 형성은 외상 또는 조직 손상에 의해 유도된다. 정상적으로 세포는 단지 적절한 양의 조직을 생성하여 오래된 조직을 대체하거나 손상을 복구한다. 과도한 결합 조직 생성 (예를 들어, 외상 또는 손상에 응답하여)은 기관 또는 조직 비후 및 반흔을 유도하는 섬유성 조직 (예를 들어, 세포외 매트릭스 단백질)의 병리학적 축적을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에서 섬유성 병리를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 섬유성 병리의 치료를 필요로 하는 대상체는 치료 담당의에 의해 섬유성 병리로 진단된다.
일부 구현예에서, 섬유성 병리는 간질성 폐 질환 (ILD)이다. 일부 구현예에서, 섬유성 병리는 폐 조직 섬유증, 예를 들어, 폐 섬유증 (PF) 또는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 거론되었음에도 불구하고, 낭포성 섬유증은 간질성 폐 질환 또는 주요 섬유성 병리로 간주되지 않는다. 낭포성 섬유증은 손상된 이온 수송, 점액 기능부전, 및 기도로부터 효과적으로 병원체를 제거하지 못하여 초래되며, 결국 기도와 폐의 반흔을 초래한다.
일부 구현예에서, 섬유성 병리는 간 조직 섬유증, 예를 들어, 간경변 또는 담도 폐쇄증이다. 일부 구현예에서, 섬유성 병리는 심장 조직 섬유증 (심장 섬유증), 예를 들어, 동맥 섬유증, 심근내막 섬유증 또는 심근경색 후 반흔이다. 일부 구현예에서, 섬유성 병리는 뇌 조직 섬유증, 예를 들어, 신경교 반흔이다. 일부 구현예에서, 섬유성 병리는 동맥 강성, 관절섬유증 (무릎, 어깨, 팔꿈치 또는 기타 관절), 만성 신장 질환 및 섬유증, 간 섬유증, 비알콜성 지방간, 비알콜성 지방간염, 크론 질환 (장 반흔), 듀피이트렌 구축 (Dupuytren’s contracture) (손 또는 손가락의 반흔 조직), 피부 조직 섬유증, 예를 들어, 켈로이드 (피부 상에 반흔), 종격섬유증 (종격의 연질 조직), 페이로니 질환 (Peyronie's disease) (음경 조직 내 반흔), 신성 전신 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 복막후 섬유증 (복막후의 연질 조직 상에 반흔) 또는 유착관절낭염이다.
일부 구현예에서, 섬유성 병리의 예방을 필요로 하는 대상체는 치료 담당의에 의해 조직 외상 또는 손상으로 진단된다. 조직 손상의 적합한 예는 흡입된 물질 (예를 들어, 실리카 또는 석면)에 의해 유발된 손상, 약물-유도된 손상 (항생제 또는 항암 약물에 의해 유발된 손상), 자가면역 질환에 의해 유발된 조직 손상 (예를 들어, 류마티스 관절염, 경화증, 예컨대 전신 경화증, 루푸스), 감염에 의해 유발된 손상 (예를 들어, 결핵, 폐렴, 호흡기 바이러스) 또는 사르코이드증을 포함한다.
예시적인 치료 화합물
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 하나의 방법에 사용될 수 있는 화합물은 G 단백질 커플링된 수용체의 효능제이다. 그러한 구현예에서, 화합물은 GαS 수용체의 선택적 효능제이다 (예를 들어, 화합물은 Gα12/13, Gαq/11 또는 Gαi/o 단백질 커플링된 수용체 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합과 비교하여 GαS 단백질 커플링된 수용체에 대해 100배, 50배 또는 10배 선택적이다).
일부 구현예에서, G 단백질 커플링된 수용체는 중간엽 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 중간엽 세포는 섬유아세포 (예를 들어, 폐, 심장, 간, 신장 또는 피부 섬유아세포) 또는 성상 세포 (예를 들어, 췌장 성상 세포, 간 성상 세포, 족세포 또는 골세포)이다. 일부 구현예에서, G 단백질 커플링된 수용체는 조직의 상피 또는 내피 세포와 비교하여 중간엽 세포에서 우선적으로 발현된다. 하나의 예에서, G 단백질 커플링된 수용체는 폐포 상피 세포 보다 폐 섬유아세포에서 우선적으로 발현된다. 또 다른 예에서, G 단백질 커플링된 수용체는 간세포 보다 간 성상 세포에서 우선적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 효능제는 중간엽 세포에서 우선적으로 발현되는 GαS 수용체에 특이적이다. 예를 들어, 도파민 D1 수용체 및 도파민 D5 수용체는 GαS 단백질 커플링된 수용체 둘 다이다. 따라서, GαS 단백질 커플링된 수용체의 효능제는 D1 및 D5 수용체 둘 다에 대해 효능작용할 수 있다. 이러한 예에서, 도파민 D1 수용체 및 도파민 D5는 둘 다 조직의 중간엽 세포 및 또한 상피 또는 내피 세포에서 발현될 수 있지만, 도파민 D1 수용체는 중간엽 세포에서 우선적으로 발현되지만 D5는 두 세포 유형 사이에 동일하게 분포된다. 이러한 예에서, GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제는 D5 수용체 보다 D1 수용체에 특이적이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 친수성이다. 그러한 구현예에서, 수용체 효능제 화합물의 구조는 G 단백질 커플링된 수용체의 활성 부위 내 물 분자 및 아미노산과 수소 결합을 형성할 수 있는 수소 결합 공여자 (HBD) 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제의 분자는 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HBD 원자(예를 들어, 헤테로원자, 예컨대 O, N 또는 S)를 함유한다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제의 분자는 적어도 하나의 하이드록실기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 하이드록실기)를 함유한다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제의 분자는 아미노기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노기)를 함유한다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 혈뇌 장벽을 관통하지 못하거나, 단지 유의적이지 ?鳧? 양의 수용체 효능제는 수용체 효능제가 대상체에게 투여된 후 혈뇌 장벽을 관통한다 (예를 들어, 대상체에게 투여되는 화합물 양의 약 0.1 wt.%, 약 1 wt.%, 약 5 wt.%, 약 10 wt.%, 또는 약 20 wt.% 이하가 혈뇌 장벽을 관통한다).
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 소분자, 예를 들어, 약 2000 달톤 이하 (예를 들어, 약 300 내지 약 1200, 약 300 내지 약 1000, 약 300 내지 약 800 및/또는 약 300 내지 약 600 달톤)이다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제는 생분자이다. 전형적으로, 생분자는 대형 중합체 분자, 예컨대 폴리펩타이드, 단백질, 당단백질, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오타이드 및 핵산을 포함하는, 생존 유기체 또는 세포에 의해 생성되는 200 달톤 이상의 분자량을 갖는 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제는 항체, 호르몬, 막관통 단백질, 성장 인자 또는 효소이다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제는 G 단백질 커플링된 수용체에 특이적인 항체이다. 그러한 구현예에서, 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날이다.
일부 구현예에서, GαS 단백질 커플링된 수용체는 도파민 수용체 (예를 들어, D1, D2, D3, D4, 또는 D5 도파민 수용체)이다. 즉, G 단백질 커플링된 수용체 효능제는 도파민 수용체 효능제 (예를 들어, D1, D2, D3, D4, 또는 D5 도파민 수용체 또는 이의 임의의 조합의 효능제)이다. 일부 구현예에서, 도파민 수용체는 도파민 수용체 D1 (DRD1)이다. 일부 구현예에서, 효능제는 도파민 수용체와 관련하여 선택적이다. 일부 구현예에서, 화합물은 도파민 수용체 D1의 선택적 효능제이다 (예를 들어, 화합물은 D2, D3, D4, 또는 D5 수용체 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합과 비교하여 D1 도파민 수용체에 대해 100배, 50배 또는 10배 선택적이다). 일부 구현예에서, D1 수용체 효능제는 중추신경계 (CNS) 장애를 치료하는데 효과가 없거나 단지 약하게 효과적이다. 일부 구현예에서, 수용체 효능제는 도파민 수용체 D1에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체이다.
일부 구현예에서, 도파민 수용체 D1 효능제는 A-86929, 디하이드렉시딘 (DHX), 디나프솔린, 디녹실린, 독산트린, SKF-81297, SKF-82958, SKF-38393, 페놀도팜, 6-Br-APB, 스테폴리딘, A-68930, A-77636, CY-208,243, SKF-89145, SKF-89626, 7,8-디하이드록시-5-페닐-옥타하이드로벤조[h]이소퀴놀린, 카버골린 및 페르골리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제는 ABT-413, A-86929, 디하이드렉시딘 (DHX), 디나프솔린, 디녹실린, 독산트린, SKF-81297, SKF-82958, SKF-38393, 페놀도팜, 6-Br-APB, 스테폴리딘, A-68930, A-77636, CY-208-243, SKF-89145, SKF-89626, 7,8-디하이드록시-5-페닐-옥타하이드로벤조[h]이소퀴놀린, 카버골린, 페르골리드, R(-)-2,10,11-트리하이드록시아포르핀, (R)-(-)-아포모르핀, R(-)-프로필노라포모르핀, R(+)-6-브로모-APB, R(-)-2,10,11-트리하이드록시-N-프로필-노라포르핀, 6,7-ADTN, 메술레르긴, N-메틸도파민, 4-하이드록시펜에틸아민, 카버골린, 3-하이드록시펜에틸아민, 프라미펙솔, PD-168077, 페놀도팜, (±)-PD 128-907, (±)-2-(N-페닐에틸-N-프로필)아미노-5-하이드록시테트랄린, 브로모크립틴, 로피니롤, LY-163-502, 디프로필도파민, B-HT 920, 피리베딜, (+)-UH 232, 페르골리드, (-)-퀸피롤, 및 R(-)-2,11-디하이드록시-10-메톡시아포모르핀 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제는 디하이드렉시딘 (DHX), SKF-82958, A-68930 및 CY-208-243 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 디하이드렉시딘:
Figure pct00002
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 A-68930:
Figure pct00003
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 SKF-82958:
Figure pct00004
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 CY 208-243:
Figure pct00005
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 SKF-38393:
Figure pct00006
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 A-77636:
Figure pct00007
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 A-86929:
Figure pct00008
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 ABT-431:
Figure pct00009
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는, 이의 개시내용이 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 (Martin et al., International Journal of Medicinal Chemistry, 2011, Article ID 424535)에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물이다.
일부 구현예에서, 수용체 효능제는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 I
Figure pct00010
상기 식에서:
각각의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, OH, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, HO-C1-3 알킬, NH2-C1-3 알킬, HS-C1-3 알킬, SH, NH2, C1-6 알킬아미노 및 디(C1-6 알킬)아미노로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물이 아니다:
Figure pct00011
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은, 본원에 참조로 포함된 문헌 (J. Med. Chem., 1991, 34 (8), 2561-2569)에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물이 아니다.
일부 구현예에서, R1은 H이다. 일부 구현예에서, R1은 OH이다. 일부 구현예에서, R1은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 또는 트리플루오로메톡시이다. 일부 구현예에서, R1은 NH2이다. 일부 구현예에서, R1은 SH이다. 일부 구현예에서, R1은 메틸아미노, 디메틸아미노, 또는 메틸에틸아미노이다.
일부 구현예에서, R2는 H이다. 일부 구현예에서, R2는 OH이다. 일부 구현예에서, R2는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 또는 트리플루오로메톡시이다. 일부 구현예에서, R2는 NH2이다. 일부 구현예에서, R2는 SH이다. 일부 구현예에서, R2는 메틸아미노, 디메틸아미노, 또는 메틸에틸아미노이다.
일부 구현예에서, R3은 H이다. 일부 구현예에서, R3은 OH이다. 일부 구현예에서, R3은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 또는 트리플루오로메톡시이다. 일부 구현예에서, R3은 NH2이다. 일부 구현예에서, R3은 SH이다. 일부 구현예에서, R3은 메틸아미노, 디메틸아미노, 또는 메틸에틸아미노이다.
일부 구현예에서, R4는 H이다. 일부 구현예에서, R4는 OH이다. 일부 구현예에서, R4는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 또는 트리플루오로메톡시이다. 일부 구현예에서, R4는 NH2이다. 일부 구현예에서, R4는 SH이다. 일부 구현예에서, R4는 메틸아미노, 디메틸아미노, 또는 메틸에틸아미노이다.
일부 구현예에서, R5는 H이다. 일부 구현예에서, R5는 OH이다. 일부 구현예에서, R5는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 또는 트리플루오로메톡시이다. 일부 구현예에서, R5는 NH2이다. 일부 구현예에서, R5는 SH이다. 일부 구현예에서, R5는 메틸아미노, 디메틸아미노, 또는 메틸에틸아미노이다.
일부 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 OH이다. 일부 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 2개는 OH이다. 일부 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 3개는 OH이고, 나머지 기는 H이다. 일부 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 NH2이다. 일부 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 2개는 NH2이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물:
Figure pct00012
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은, 본원에 참조로 포함된 문헌 (J. Med. Chem., 1991, 34 (8), 2561-2569)에 기재된 화합물 중 임의의 하나의 화합물이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물:
Figure pct00013
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물:
Figure pct00014
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
약제학적 조성물 및 제형
본 출원은 또한 유효량의 본원 개시내용의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 또한 기재된 임의의 하나의 추가 치료제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 출원은 또한 본원에 기재된 임의의 하나의 추가 치료제 (예를 들어, 키트 내)를 포함하는 약제학적 조성물 및 투여 형태를 제공한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분들과 상용성이라는 의미에서 "허용되는" 것이고, 약제학적으로 허용되는 담체의 경우, 약제에 사용되는 양으로 이의 수용자에게 해롭지 않다.
본 출원의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클은 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 (wool fat)를 포함한다.
조성물 또는 투여 형태는 0.005% 내지 100%의 범위로 본원에 기재된 임의의 하나의 화합물 및 치료제를 함유할 수 있고 잔량은 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제로 구성된다. 고려되는 조성물은 본원에 제공된 임의의 하나의 화합물 및 치료제를 0.001% 내지 100%, 하나의 구현예에서, 0.1 내지 95%, 또 다른 구현예에서 75 내지 85%, 추가의 구현예에서, 20 내지 80% 함유할 수 있고, 여기서, 잔량은 본원에 기재된 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 이들 부형제의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
투여 경로 및 투여 형태
본 출원의 약제학적 조성물은 임의의 허용되는 투여 경로를 위해 적합한 것들을 포함한다. 허용되는 투여 경로는 협측, 피부, 자궁경내, 내시경술, 기관내, 장, 경막외, 간질 (interstitial), 복부내, 동맥내, 기관지내, 활액낭내 (intrabursal), 뇌내, 수조내 (intracisternal), 관상동맥내, 피내 (intradermal), 관내, 십이지장내, 경막내, 상피내, 식도내, 위내, 질내, 회장내, 림프관내, 척수내, 뇌막내, 근육내, 비강내, 난소내, 복막내, 전립선내, 폐내, 부비강내, 척수내, 윤활액내, 고환내, 수막공간내, 관내 (intratubular), 종양내, 자궁내, 혈관내, 정맥내, 비강, 비위, 경구, 비경구, 경피적, 경막주위, 직장, 호흡 (흡입), 피하, 설하, 점막하, 국소, 경피, 경점막, 기관경유 (transtracheal), 요관, 요도 및 질을 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 제형은 편리하게는 단위 투여 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐 (예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐), 서방성 캡슐, 및 리포좀으로 제공될 수 있고, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (20th ed. 2000))을 참조한다. 그러한 제조 방법은 투여될 분자와 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 같은 성분들을 회합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체, 리포좀 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하고 친밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 하나의 화합물 및 치료제는 경구로 투여된다. 경구 투여에 적합한 본 출원의 조성물은 각각 소정량 (예를 들어, 유효량)의 활성 성분을 함유하는 개별 단위, 예컨대 캡슐, 사쉐제, 과립 또는 정제; 분말 과립; 수용액 또는 비수용액 중의 용제 또는 현탁액; 수중유 액체 에멀젼; 유중수 액체 에멀젼; 리포좀으로 포장; 또는 볼러스 등으로서 제공될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 화합물 흡수율을 유리하게 증가시킬 수 있는 그러한 현탁액을 함유하는데 유용할 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨, 및 규산 및 전분을 포함한다. 다른 허용되는 부형제는 a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산, b) 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스 및 아카시아, c) 보습제, 예컨대 글리세롤, d) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨, e) 용액 지연제, 예컨대 파라핀, f) 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물, g) 습윤제, 예컨대 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토 및 i) 윤활제, 예컨대 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴황산나트륨 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 캡슐 형태로 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구로 투여되는 경우, 활성 성분은 유화제 및 현탁제와 조합된다. 원하는 경우, 특정 감미제 및/또는 향제 및/또는 착색제는 첨가될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물은 향 첨가 기반의 성분, 일반적으로 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 포함하는 로젠지; 및 불활성 기반의 활성 성분, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아를 포함하는 향정 (pastille)을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 항산화제, 완충제, 정균제 및 해당 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 주사액 또는 주입액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단일 용량 또는 다회 용량 컨테이너, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용수, 식염수 (예를 들어, 0.9% 식염수 용액) 또는 5% 덱스트로스 용액의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조 (freeze dried) (동결 건조 (lyophilized)) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 주사 용액은, 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 주사 가능한 멸균 제제는 또한, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액으로서 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 주사 가능한 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클과 용매 중에는, 만니톨, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 블랜드 (bland) 고정유가 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 이의 글리세리드 유도체는 천연 약제학적으로 허용되는 오일, 예컨대 올리브유 또는 피마자유로서, 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 버젼으로 주사제의 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
본 출원의 약제학적 조성물은 직장 투여용 좌제 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 출원의 화합물을, 실온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체여서 직장에서 용해되어 활성 성분을 방출할 적합한 비자극성 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 그러한 재료는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 출원의 약제학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 조성물은 약제 제형 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조되고, 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 생체유용성을 증진시키기 위한 흡착 촉진제, 플루오로카본 및/또는 당업계에 알려진 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중 용액으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,803,031호를 참조한다. 비강내 투여를 위한 추가 제형 및 방법은 문헌 (Ilium, L., J Pharm Pharmacol, 56:3-17, 2004 and Ilium, L., Eur J Pharm Sci 11:1-18, 2000)에 발견된다.
본원 개시내용의 국소 조성물은 에어로졸 분무제, 크림, 에멀젼, 고체, 액체, 분산제, 발포제, 오일, 겔, 하이드로겔, 로션, 무스, 연고, 분말, 패치제, 포마드, 용제, 펌프 분무제, 스틱, 타월렛 (towelette), 비누, 또는 국소 투여 분야에서 통상적으로 사용되는 기타 형태 및/또는 화장품 및 피부 케어 제형 형태로 제조되고 사용될 수 있다. 국소 조성물은 에멀젼 형태일 수 있다. 본 출원의 약제학적 조성물의 국소 투여는 원하는 치료가 국소 적용에 의해 용이하게 접근 가능한 영역 또는 기관을 포함하는 경우 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 국소 조성물은 본원에 개시된 임의의 하나의 화합물 및 치료제와, 하나 이상의 추가 성분, 담체, 부형제, 또는 흡착제를 포함한 희석제, 항-자극제, 항-여드름제, 보존제, 항산화제, 착색제/안료, 연화제 (보습제), 유화제, 필름-형성/유지제 (holding agent), 향제, 리브-온 각질 제거제 (leave-on exfoliant), 처방 약물, 보존제, 스크럽제, 실리콘, 피부-동일/복구제 (skin-identical/repairing agent), 슬립제, 선스크린 활성제, 계면활성제/세제 세정제, 침투 향상제, 및 증점제의 조합을 포함한다.
본 출원의 화합물 및 치료제는 이식 가능한 의료 장치, 예컨대 보철물, 인공 판막, 혈관 이식편, 스텐트 또는 카테터를 코팅하기 위한 조성물에 혼입될 수 있다. 적합한 코팅 및 코팅된 이식 가능한 장치의 일반적인 제조는 당업계에 알려져 있고, 미국 특허 제6,099,562호; 제5,886,026호; 및 제5,304,121호에 예시되어 있다. 코팅은 전형적으로 생체적합성 중합체 재료, 예컨대 하이드로겔 중합체, 폴리메틸디실록산, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락트산, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 이들의 혼합물이다. 코팅은 임의로 플루오로실리콘, 폴리사카라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 인지질 또는 이들의 조합의 적합한 탑코트에 의해 추가로 덮혀 조성물에서 제어 방출 특징을 부여할 수 있다. 침습성 장치를 위한 코팅은 이들 용어들이 본원에 사용된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클의 정의 내에 포함되어야 한다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 출원은 화합물 또는 치료제가 함침되어 있거나 이를 함유하는 이식 가능한 약물 방출 장치, 또는 본 출원의 화합물 또는 치료제를 포함하는 조성물을 제공하여 상기 화합물 또는 치료제가 상기 장치로부터 방출되어 치료적으로 활성이도록 한다.
용량 및 용법
본원의 약제학적 조성물에서, 치료 화합물은 유효량 (예를 들어, 치료학적 유효량)으로 존재한다.
유효량은 치료되는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 대상체의 성별, 연령 및 일반적인 건강 상태, 부형제 사용, 다른 제제의 사용과 같은 다른 치료 처치제와의 동시 사용 가능성 및 치료 담당의의 판단에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 화합물의 유효량은, 예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 500 mg/kg (예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 200 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 200 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 150 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 150 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg; 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg; 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg)의 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 화합물의 유효량은 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg이다.
이전의 용량은 매일 기준으로 (예를 들어, 단일 용량으로 또는 2회 이상의 분할된 용량으로, 예를 들어, 매일 1회, 매일 2회 및 매일 3회) 또는 비-매일 기준으로 (예를 들어, 격일, 2일 마다, 3일 마다, 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 1개월에 1회) 투여될 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 임의의 순서로 대상체에게 투여될 수 있다. 본원 개시내용의 화합물과 같은 제1 치료제는, 치료를 필요로 하는 대상체에게 제2 치료제, 예를 들어, 본원에 기재된 항암 치료요법의 투여 전에 또는 후에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전 또는 후) 또는 이와 동시에 투여될 수 있다. 따라서, 본원 개시내용의 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 조성물은 제2 치료제, 예컨대 본원에 기재된 화학요법제와 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 본원 개시내용의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 제2 또는 제3 치료제가 대상체에게 동시에 투여되는 경우, 치료제는 단일 투여 형태 (예를 들어, 정제, 캡슐, 또는 주사 또는 주입 용제)로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 섬유성 병리를 치료하거나 예방하는데 유용한 약물이다. 그러한 약물의 적합한 예는 닌테다닙, 피르페니돈, 또는 프레드니손, 또는 면역억제제, 예컨대 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 페니실라민 및 사이클로스포린을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 도파민 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
키트
본 발명은 또한, 예를 들어, 본원에 언급된 장애, 질환 및 병태의 치료에서 유용한 약제학적 키트를 포함하고, 이는 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 함유하는 하나 이상의 컨테이너를 포함한다. 그러한 키트는, 원하는 경우, 하나 이상의 다양한 통상적인 약제학적 키트 성분, 예컨대 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 갖는 컨테이너, 추가 컨테이너 등을 추가로 포함할 수 있다. 삽입물 또는 라벨로서 투여될 성분들의 양을 나타내는 지침서, 투여용 가이드라인 및/또는 성분들을 혼합하기 위한 가이드라인이 또한 키트에 포함될 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 "대략" (예를 들어, 나타낸 값의 + 또는 - 대략 10%)을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "화합물"은 명명되거나 도시된 구조의 모든 입체이성체, 기하학적 이성체, 토토머 및 동위원소를 포함하는 것으로 의미된다. 하나의 특정 토토머 형태로 명칭 또는 구조로 확인된 본원의 화합물은 달리 명시되지 않는 한, 다른 토토머 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적" 및 "약제학적으로 허용되는"이란, 건전한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합한, 인간 및 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 시험관내, 생체외 또는 생체내인 세포를 지칭하기 위해 의미된다. 일부 구현예에서, 생체외 세포는 유기체, 예컨대 포유동물로부터 절단된 조직 샘플의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관내 세포는 세포 배양물에서의 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 생체내 세포는 유기체, 예컨대 포유동물에서 생존하는 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 중간엽 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 섬유아세포 (예를 들어, 심장, 피부 또는 폐 섬유아세포)이다. 일부 구현예에서, 세포는 간성상 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 1) 질환을 억제하는 것; 예를 들어, 질환, 병태 또는 장애의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 억제하는 것 (즉, 병리 및/또는 증상의 추가 발병을 저지함)을 지칭하거나, 2) 질환을 개선하 것; 예를 들어, 질환, 병태 또는 장애의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 개선하 것 (즉, 병리 및/또는 증상을 역전시키는 것)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환, 병태 또는 장애를 "예방하는" 또는 "예방"이라는 용어는, 대상체 또는 대상체 그룹 (예를 들어, 질환, 병태 또는 장애에 대한 성향이 있거나 이에 감수성인 대상체 또는 대상체 그룹)에서 질환, 병태 또는 장애의 발병 위험을 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 질환, 병태 또는 장애를 예방하는 것은, 질환, 병태 또는 장애 및/또는 이와 관련된 증상을 획득할 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 질환, 병태 또는 장애를 예방하는 것은, 질환, 병태 또는 장애가 발병하는 것을 완전히 또는 거의 완전히 중지시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 화합물의 산 성 또는 염기성 기, 예컨대 화합물의 아미노 기능성 기, 염기 및 산성 기, 예컨대 카복실 기능성 기 사이에 형성되는 염을 지칭한다. 일부 구현예에서, 화합물은 약제학적으로 허용되는 산 부가염이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 형성하기 위해 통상적으로 사용되는 산은 무기산, 예컨대 이황화수소, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산 및 인산, 및 유기산, 예컨대 파라-톨루엔설폰산, 살리실산, 타르타르산, 바이타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 베실산, 푸마르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 포름산, 글루탐산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 락트산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 카본산, 석신산, 시트르산, 벤조산 및 아세트산, 및 관련 무기 및 유기산을 포함한다. 따라서, 그러한 약제학적으로 허용되는 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설피트, 바이설피트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 설포네이트, 크실렌 설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 및 기타 염을 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 무기산, 예컨대 염산 및 브롬화수소산으로 형성된 것들 및 특히 유기산, 예컨대 말레산으로 형성된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 형성하기 위해 통상적으로 사용되는 염기는 나트륨, 칼륨, 및 리튬을 포함한 알칼리 금속의 수산화물; 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘 및 마그네슘의 수산화물; 다른 금속, 예컨대 알루미늄 및 아연의 수산화물; 암모니아, 유기 아민, 예컨대 비치환되거나 하이드록실-치환된 모노-, 디- 또는 트리-알킬아민, 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-OH-(C1-C6)-알킬아민), 예컨대 N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 모르폴린; 티오모르폴린; 피페리딘; 피롤리딘; 및 아미노산, 예컨대 아르기닌, 라이신 등을 포함한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 사용되는 "Cn-m 알콕시"라는 용어는 화학식 -O-Cn-m 알킬기를 지칭하고, 본 출원에서 알킬기는 n 내지 m개의 탄소 원자를 함유한다. 적합한 예시적 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 (예를 들어, n-프로폭시 및 이소프로폭시), 부톡시 (예를 들어, n-부톡시 및 tert-부톡시) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 알콕시기는 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다.
본 출원에 사용된 바와 같이, "Cn-m 할로알콕시"는 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 화학식 -O-할로알킬기를 지칭한다. 예시적인 할로알콕시기는 OCF3이다. 일부 구현예에서, 할로알콕시기는 단지 불소화된다. 일부 구현예에서, 알킬기는 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Cn-m 알킬아미노"는 화학식 -NH(알킬) 기를 지칭하고, 여기서, 알킬기는 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 알킬기는 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 알킬아미노기의 적합한 예는 N-메틸아미노, N-에틸아미노, N-프로필아미노 (예를 들어, N-(n-프로필)아미노 및 N-이소프로필아미노), N-부틸아미노 (예를 들어, N-(n-부틸)아미노 및 N-(tert-부틸)아미노) 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디 Cn-m 알킬아미노"는 화학식 -N(알킬)2 기를 지칭하고, 여기서, 각각의 알킬기는 독립적으로 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 알킬기는 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 디알킬아미노기의 적합한 예는 N,N-메틸에틸아미노, N,N-디에틸아미노, N,N-프로필에틸아미노, N,N-부틸이소프로필아미노 등을 포함한다.
실시예
재료 및 방법
세포 배양: 세포는 달리 언급되지 않는 한, 10% FBS를 함유하는 DMEM (ATCC)에서 모두 유지하였다. IMR-90 배아 폐 섬유아세포 및 NIH-3T3 마우스 섬유아세포는 ATCC로부터 구입하였다. TAZ4SA를 발현하는 독시사이클린-유도성 Tet-On NIH3T3 또는 대조군 공 벡터는 이전에 기재되었다. 정상 인간 폐포 상피 세포 (NHAEpC), 정상 인간 미세혈관 내피 세포 (NHMVEC), 정상 인간 폐 섬유아세포 (NHLF), 및 인간 피부 섬유아세포 (HDF)는 제조원 (Lonza)으로부터 구입하였고, 제조원 (Lonza)의 추천에 따라 상표 등록된 배지에서 배양하였다. 인간 성인 심장 섬유아세포 (HACF) 및 간성상 세포 (HSC)는 제조원 (ScienCell)으로부터 구입하였고, 제조원 (ScienCell)의 추천에 따라 상표 등록된 배지에서 배양하였다. 간세포는 제조원 (Samsara)으로부터 구입하였고, 제조원 (Samsara)의 추천에 따라 상표 등록된 배지에서 배양하였다. 폐 섬유아세포를 사용한 모든 추가 실험은 폐 이식을 받은 IPF로 진단된 대상체 또는 기관 (University of Minnesota Institutional Review Board)에 의해 승인된 프로토콜 하에 미네소타 대학교 (University of Minnesota)에 피터 비트맨 (Peter Bitteman) 및 크레이그 헨케 (Craig Henke)에 의해 관대하게 제공된, 기관 이식이 거부된 공여자 (비-IPF)의 폐로부터의 외이식 배양에 의해 단리된 1차 인간 폐 섬유아세포를 사용하였다. 모든 1차 세포 배양 실험은 6회 이하로 계대된 세포를 사용하여 수행하였다.
화학물질 및 시약: 디메틸 설폭사이드 (DMSO), Y-27632, 엔도텔린 1 (ET-1), 및 아스코르브산은 제조원 (Sigma-Aldrich)으로부터 구입하였다. 디하이드렉시딘, SKF-81297, 페놀도팜, 포르스콜린 및 프로스타글란딘 E2는 제조원 (Tocris Bioscience)으로부터 구입하였다. 리소포스파티드산 (LPA) 및 세로토닌 (5-Ht)은 제조원 (Cayman Chemical)으로부터 구입하였다. SCH 39166은 제조원 (Santa Cruz Biotechnology)으로부터 구입하였다. TGFβ1은 제조원 (eBioscience)으로부터 구입하였다.
GPCRome 프로파일링 및 qPCR: GPCRome 프로파일링은 제조업자의 제안 (Qiagen)에 따라 수행되었다. 세포는 제조업자의 지침에 따라 Rneasy 플러스 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 RNA 단리 전 24시간 동안 이들의 추천된 성장 배지에서 성장시켰다. 이어서, 단리된 RNA (1000 ng)를 사용하여 RT2 제1 가닥 키트 (Qiagen)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, G 단백질 커플링된 수용체 384HT PCR 어레이는 LightCycler 480 (Roche)을 사용하여 분석하였다. 데이터는 1/Ct (도 1b)로서 나타내고, 섬유아세포 및 상피 세포 데이터세트에 대한 GAPDH는 거의 동일하였다 (각각 17.39 및 17.41). 모든 수용체에 대한 원시 Ct 값은 가용하다 (표 1).
[표 1]
(*)로 표시된 수용체는 Gαs에 독점적으로 커플링되는 것으로 확인되었다21.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
모든 다른 시험관내 실험의 경우, 세포는 제조업자의 지침에 따라 RNeasy 플러스 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 RNA 단리 전 나타낸 바와 같이 처리하였다. 이어서, 단리된 RNA (250 ng)는 SuperScript VILO (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하기 위해 사용하였다. 정량적 PCR은 FastStart 필수 DNA 그린 마스터 (Roche)를 사용하여 수행하였고, LightCycler 96 (Roche)을 사용하여 분석하였다. 데이터는 GAPDH에 상대적인 ΔΔCt에 의한 배수 변화로서 표현한다. 생체내 실험의 경우, 조직은 즉시 동결되었고, -80℃에서 보관하였다. RNA 단리, cDNA 합성 및 qPCR 분석은 상기와 같이 수행하였다. qPCR을 위해 사용되는 프라이머는 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00030
Figure pct00031
세포 분류: FACS: PBS 관류된 마우스 폐는 0.2 mg ml-1 Liberase DL (Roche) 및 100 U ml-1 DNase I (Roche)를 함유하는 1 mL의 냉 DMEM 배지 중 100 mm 페트리 디쉬에서 면도날로 미세하게 다졌다. 혼합물은 15 ml의 튜브로 옮기고 수 욕조에서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 효소 분해는 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지를 첨가함으로써 불활성화시켰다. 세포 현탁액은 40 μm 세포 스트레이너 (Fisher)에 1회 통과시켜 다세포 잔해를 제거하였다. 이어서, 세포는 4℃에서 10분 동안 1,300 r.p.m에서 원심분리하고, PBS 중에서 1회 세척하고, 0.2 ml의 FACS 완충액 (PBS 중 1% BSA, 0.5 μM EDTA pH 7.4)에 재현탁시켰다. 이어서, 단일 세포 현탁액은 얼음에서 20분 동안 항-CD45-PerCp-Cy5.5, 항-CD31-PE, 항-PDGFRα-APC 및 항-EpCAM-BV421 항체 (1:200) (Biolegend)와 함께 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포는 빙냉 FACS 완충액으로 세척하고, 1 ml의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. FACS 분류는 BD FACS Aria II (BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. FACS-분류된 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포는 RLT 용해 완충액 (Qiagen)을 함유하는 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 수거하고, 이는 mRNA 추출, 상보적 DNA 합성 및 RT-PCR 분석에 적용하였다. MACS:PBS 관류된 마우스 폐는 MACS 마우스 폐 분해 키트에 기재된 1 ml의 MAC 분해 용액 중에 100 mm 페트리 디쉬에서 면도날로 미세하게 다졌다. 혼합물은 15 ml의 튜브로 옮기고, 수 욕조에서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 효소 분해는 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지를 첨가함으로써 불활성화시켰다. 세포 현탁액은 40 μm 세포 스트레이너 (Fisher)에 1회 통과시켜 다세포 잔해를 제거하였다. 이어서, 세포는 4℃에서 10분 동안 1,350 r.p.m에서 원심분리하고, 상등액을 흡인하였다. 샘플은 0.1 ml 15% BSA-autoMACS 세정 용액에 재현탁시켰다. 이어서, 단일 세포 현탁액은 4-8℃에서 15분 동안 마우스 항-CD45 MicroBead (1:10)와 함께 항온처리하였다. 이어서, 세포는 LS 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 자기적으로 여과하였다. 양성으로 선택된 세포는 4℃에서 1350 r.p.m에서 펠렛화하고, RLT 용해 완충액 (Qiagen)에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플은 mRNA 추출, 상보성 DNA 합성 및 RT-PCR 분석에 적용하였다.
면역형광 현미경: 세포를 이들의 특정 성장 배지에서 96웰 플레이트 (Corning 3603)에 분주하고 부착 (8시간)되도록 한다. 이어서, 배지는 각각의 실험에 대해 나타낸 조건으로 교환하였다. 세포는 3.7% 포르말린 (Sigma-Aldrich)에 고정화시키고, 0.25% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)에 투과시킨 다음, 1시간 동안 1% BSA로 차단하였다. 세포 또는 조직 절편은 PBS 중에서 1% BSA로 1:200 희석된, αSMA에 대한 마우스 모노클로날 항체 (Sigma-Aldrich F3777) 및/또는 YAP/TAZ에 대한 토끼 모노클로날 항체 (Cell Signaling D24E4)로 밤새 항온처리하였다. 이어서, 세포는 세척하고, 1:1000으로 희석된 형광-접합된 2차 항체 (Invitrogen) 및 DAPI (Thermo Fisher Scientific)에 노출시켰다. 이미지는 Cytation5 (BioTek) 현미경으로 촬영하였다. αSMA 양성 세포 (도 3b)를 점수 매기기 위해, 처리 조건에 맹검인 관찰자는 밝은 섬유성 염색을 위한 가시적 역치를 사용하여 αSMA-양성 세포를 계수하였고; 최소 200개 세포는 각각의 조건에 대해 계수하였다. YAP/TAZ 국소화는 Gen 5 (Biotek) 소프트웨어를 사용하여 정량하였다 (도 2, 6, 8). 이미지는 DAPI 및 YAP/TAZ 염색 둘 다의 4X 배율로 촬영하였다. 대상은 DAPI 채널을 사용하여 동정되었고 YAP/TAZ 핵 양성 세포의 서브집단은 YAP/TAZ 채널의 평균 픽셀 강도가 대조군 처리된 세포에서 모든 핵의 평균 픽셀 강도의 85% 초과인 핵을 기준으로 계수하였다. 폐 조직 절편으로부터의 이중 양성 (YAP/TAZ 및 αSMA) 세포의 정량화 (도 4d)는 유사하게 수행하였지만; 별도의 역치는 YAP/TAZ 및 αSMA 둘 다에 대해 확립하였다. 최소 4000개 세포를 각각의 마우스에 대해 정량화하였다.
견인력 현미경: 견인 분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 6.4 kPa의 전단 탄성률을 갖는 폴리아크릴아미드 기질을 제조하고, 형광 설페이트-변형된 라텍스 미소구 (0.2 μm, 505/515 ex/em) (FluoSpheres, Life Technologies)를 50 mM HEPES 용액 (pH 8.5) 중에서 1 mg ml-1의 도파민 하이드로클로라이드 (Sigma-Aldrich)로 처리한 후 겔 표면에 접합시켰다. IPF 환자 유래된 섬유아세포는 밤새 겔 상에 분주하고, 견인력 측정 전에 나타낸 바와 같이 처리하였다. 표면-접합된 형광 비드의 이미지는 x 10 배율로 Nikon ECLIPSE Ti 현미경을 사용하여 트립신 처리 전후에 각각의 세포에 대해 획득하였다. 견인력은 비드 변위 필드 (bead displacement field)를 측정하고, TractionsForAll (이의 기질 상에 접착 세포에 의해 나타나는 2-D 견인을 계산하는 자유롭게 분포된 프로그램)을 사용하여 상응하는 견인 필드를 계산함으로써 평가하였다.
cAMP 검정: IPF 환자 유래된 섬유아세포는 10% FBS를 함유하는 EMEM에 밤새 분주하였다. 배지는 0.1% FBS를 함유하는 EMEM으로 24시간 동안 교환하였다. cAMP는 제조업자의 제안에 따라 cAMP-GloTM 검정 (Promega)을 사용하여 측정하였다. 세포 용해 20분 전에, 배지를 제거하고 세포는 비선택적 포스포디에스테라제 억제제 및 나타낸 농도의 화합물(들)을 함유하는 "유도 완충액"으로 처리하였다. 발광은 Flexstation 3 (Molecular Devices) 플레이트 판독기에서 측정하였다.
웨스턴 블롯팅: 세포는 10% FBS를 함유하는 EMEM에 밤새 분주하였다. 배지는0.1% FBS를 함유하는 EMEM으로 24시간 동안 교환하였다. 단백질 분리 전, 세포는 나타낸 시간 동안 나타낸 농도의 화합물들로 처리하였다. 총 단백질은 피어스 (Pierce) 포스파타제 억제제 (Thermo) 및 핼트 (Halt) 프로테아제 억제제 칵테일 (Thermo)을 함유하는 RIPA 완충액 (pH 8.0)을 사용하여 단리하였다. 용해물 총 단백질 농도는 피어스 BCA 단백질 검정 키트 (Thermo)를 사용하여 결정하고, 샘플은 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 실행하였다. 블롯은 Li-Cor 오딧세이 차단 완충액 중에서 1:1000으로 희석된 1차 항체: pYAP (Ser 127, 세포 신호전달 D9W21), YAP/TAZ (세포 신호전달 D24E4), GAPDH (세포 신호전달 14C10), HSC70 (Santa Cruz sc-7298), αSMA (Abcam ab5694), 및 피브로넥틴 (Santa Cruz sc-9068)으로 밤새 항온처리하였다. 블롯은 1:10,000으로 희석된 IR-염료-접합된 2차 항체 (Li-Cor)로 60분 항온처리 전에 TBS-Tween으로 세척하였다. 플레이트는 밀도측정기를 통해 정량화를 수행한 Li-Cor 오딧세이XL 시스템을 통해 이미지화하였다.
면역-ECM: 이전에 공개된 방법으로부터 적응하여, IPF 환자-유래된 섬유아세포를 분주하여 투명-바닥 96-웰 플레이트에서 컨플루언스되도록 하였다. 세포가 부착된 후, 배지는 0.1% FBS ± 2 ng/mL TGF-β를 함유하는 EMEM으로 교체하였다. 48시간 후 나타낸 농도의 DHX 또는 DMSO 대조군을 각각의 웰에 첨가하고 24시간 동안 항온처리하였다. WST-1 생존능 시약은 각각의 웰 (Sigma-Aldrich)에 첨가하고 Flexstation 3 (Molecular Devices) 플레이트 판독기에서 측정하였다. 이어서, 세포는 3.7% 포르말린 (Sigma-Aldrich)에 고정화시키고, 0.25% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)에 투과시켰다. 웰은 tris-완충 식염수 (TBS)로 세척하고 차단 완충액 중에서 1:200으로 희석된 피브로넥틴 (Sigma sc-9068) 또는 콜라겐 I (Novus Nb600-408)에 대한 폴리클로날 토끼 항체 중에서 밤새 항온처리하기 전에 60분 동안 Li-Cor 오딧세이 차단 완충액으로 차단하였다. 웰은 1:400으로 희석된 IR-염료-접합된 2차 항체 (Li-Cor #926-32211)와 함께 항온처리 45분 전에 TBS-Tween으로 세척하였다. 플레이트는 밀도측정기를 통해 정량화를 수행한 Li-Cor 오딧세이XL 시스템을 통해 이미지화하였다. 데이터는 임의의 잠재적인 화합물 독성을 설명하기 위해 WST-1 신호 흡광도에 상대적인 IR 강도로서 표현된다.
원자간력 현미경에 의해 측정된 매트릭스 리모델링: NIH-3T3 세포를 분주하여 10% FBS를 함유하는 DMEM 중에서 겔라틴 코팅된 (Cell Biologics) AFM 상용성 조직 배양 디쉬 (Willco) 상으로 컨플루언스되도록 하였다. 세포를 밤새 부착시킨 후, 배지는 2% FBS, 2 ng/mL TGFβ, 및 20 μg/mL 아스코르브산을 함유하는 DMEM으로 대체하여 매트릭스 침착을 촉진시켰다. 72시간 후, BioScope 촉매 AFM (Bruker, MA, USA)을 사용하여 측정하였다. 마이크로압입은 용추철 상수가 열 변동 방법에 의해 ~100 pN nm-1에서 결정된 2.5 μm 반경 구형-팁 프로브 (Novascan, IA, USA)를 사용하여 수행하였다. 각각의 디쉬에 대해, 3개의 상이한 영역을 분석하였다. 힘 곡선은 상이한 지점에서 20 μm s-1의 압입 속도와 10 μm의 램프 크기에서 MIRO 2.0 (NanoScope 9.1; Bruker)을 사용하여 획득하였다. 75 힘 곡선은 세포 디쉬 당 (면적당 25개) 수행하였다. 영 탄성률 (Young's modulus) E는 NanoScope 분석 소프트웨어 (Bruker)를 사용하고 0.5의 피어슨 비율을 고려하는 헤르쯔 모델에 의한 힘 곡선의 피팅에 의해 결정하였다. 배지는 나타낸 농도의 DHX 또는 0.1%의 DMSO (비히클 대조군)와 함께 2% FBS, 2 ng/mL TGFβ, 및 20 μg/mL 아스코르브산을 함유하는 새로운 DMEM으로 교환하였다. 또 다른 72시간 후, 이전과 같이 AFM을 측정하였다. 이어서, 생성된 세포-유래된 매트릭스는 0.5% (v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 및 20 mM NH4OH (LabChem Inc.)를 함유하는 포스페이트-완충 식염수 (Gibco)로 탈세포화하였다. 매트릭스는 PBS로 3회 세척한 다음, RNA 단리 전 24시간 동안 낮은 계대 (P3)의 NHLF와 함께 분주하였다.
RNA 간섭: 세포는 25 nM siGENOME siRNA SMARTpool (Dharmacon) 표적화 DRD1 (L-005477-00-0005) 또는 비표적화 SMARTpool (D-001810-10-05)과 함께 리포펙타민 RNAiMAX (Life Technologies)를 사용하여 형질감염시켰다. 세포는 RNA를 수거하기 전에 72시간 동안 배양하였다. YAP/TAZ 국소화 실험을 위해, 세포는 면역형광 검정을 위해 96-웰 플레이트에 재-분주하기 전에 이들의 6-웰 플레이트에서 48시간 동안 형질감염시켰다. 생체내 siRNA 방법에 대해 아래를 참조한다.
블레오마이신 마우스 연구: 초기 생체내 siRNA 연구 (도 5)에서, 6 내지 8주령의 성체 수컷 연령-일치된 C57BL/6N 마우스는 기관 (National Cancer Institute (NCI)-Frederick Mouse Repository (Frederick, MD, USA))으로부터 구입하였다. 모든 실험은 국립 보건원 지침 및 연구 동물 관리에 관한 매사추세츠 종합 병원 소위원회 (Massachusetts General Hospital Subcommittee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였고, 모든 마우스는 기관 (AAALAC: merican Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)에 의해 승인된 특정 병원균-부재 (SPF) 환경에서 유지하였다. 6 내지 8주령 마우스는 기관에 노출되기 전에 케타민 및 크실라진으로 마취하였다. 폐 섬유증은 0일에 블레오마이신 (1.2 U/kg으로 50 μl) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS; 대조군으로서)의 기관내 주사에 의해 유도하였다. 14일 후 마우스 Yap (L-046247-01-0005) 또는 Taz (L-058248-01-0005) mRNA (Dharmacon)를 표적화하거나 대조군 siRNA를 표적화하지 않는 소형 간섭 RNA (siRNA) 듀플렉스는 마우스 당 25 μg (각각 siRNA)의 단일 용량으로 기관내 점적에 의해 생체내 투여하였다. 21일에, 마우스를 희생시키고 콜라겐 결정 및 생화학적 분석을 위해 폐를 수거하였다. 총 단백질 농도 결정을 위한 BAL 샘플을 수득하기 위해, 폐는 6개 0.5 mL 분취량의 PBS로 세척하였다. BAL 샘플은 4℃에서 20분 동안 3,000 g에서 원심분리하고, 후속 분석을 위해 상등액을 실리콘화된 저-결합 에펜도르프 튜브 (PGC Scientifics)로 옮겼다. BAL 유체의 총 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce)에 의해 결정하였다. 디하이드렉시딘 처리 연구 (도 4)에서, 8주령의 암컷 C57/BL6 마우스를 제조원 (Charles River Laboratories)으로부터 구입하였다. 마우스 폐 섬유증은 MicroSprayer® 분무기 (Aerosolizer) (Penn-Century)를 사용하여 폐로 기관내 (3 U/kg)로 전달된 블레오마이신 (BLEO; Fresenius Kabi)으로 유도하였다. 샴 마우스에 동일한 방법을 사용하는 대신에 멸균 0.9% 식염수를 투여하였다. 마우스를 24시간 마다 체중을 칭량하고, 이어서 그룹 둘 다를 10일에 체중 변화 정도가 일치하는 DHX 및 대조군 처리 그룹으로 무작위화하였다. DHX (5 mg/kg)는 14일 동안 폐포로의 확산을 돕는 것으로 이전에 나타난 계면활성제 (infasuf)에 용해된 비강내 (i.n.)로 매일 투여하였다. 마우스의 대조군 그룹에 균등한 비히클 용량의 계면활성제를 투여하였다. 최종 DHX 처리 후, 마우스를 희생시키고, 우측 폐는 4% 파라포름알데하이드 (PFA)로 부풀리고, 파라핀 포매를 위한 처리 전에 24시간 동안 4% PFA에서 추가로 항온처리하였다. 폐의 좌엽은 RNA 단리 및 하이드록시프롤린 검정을 위해 액체 질소에 급속 동결시켰다. 실험 과정은 기관 (Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었고, 동물은 이들의 지침에 따라 취급하였다.
담관 결찰: BDL은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 8 내지 10주 노령 암컷 C57BL/6N은 BDL 또는 샴 수술을 진행하였다. 마우스는 IACUC 프로토콜에 따라 0일에 마취시키고, 담관은 멸균 3/0 실크 결찰사를 사용하여 결찰하였다. 샴 수술은 실크 결찰사를 담관 아래로 통과시켜 수행하였다. 7일째부터 시작하여, DHX (5 mg/kg) 또는 비히클 대조군은 14일 동안 매일 복막내 (i.p.)로 투여하였다. 최종 DHX 처리 후, 마우스를 희생시키고, 간은 섬유증 분석을 위해 수거하였다.
조직학적 점수 매김: 5 μm의 두께의 절편을 파라핀 포매된 폐 조직으로부터 절단하고, 상기 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 또는 매이슨의 트리크롬 염색 키트 (Masson's Trichrome stain kit) (Abcam)로 염색하였다. 모든 H&E-염색된 슬라이드 및 트리크롬-염색된 슬라이드는 흉부 병리학자에 의해 맹검 방식으로 검토하였다. 간질성 및 세기관지주위 폐 미성숙 및 성숙 섬유증의 중증도는 Ashcroft 등에 따라 수치 척도로 추정하였다. 점수 매김 목적을 위해, 모든 H&E 염색된 슬라이드는 100x 배율로 전신 스캐닝하였고, 연속 100x 필드를 점수 매겼다. 점수 매김은 하기 척도를 기반으로 하였다: 0 (섬유증 없음), 1 (섬유증으로 인한 최소 간질성 및/또는 세기관지주위 비후), 3 (명백한 구조적 염좌 없이 중간 정도의 비후), 5 (섬유성 띠 및/또는 작은 매쓰의 형성과 함께 증가된 섬유증), 7 (큰 면적의 섬유증 및 벌집모양 변화 면적과 함께 중증의 구조적 염좌) 및 8 (필드의 총 섬유성 소멸). 각각의 필드에 대한 우세한 점수를 기록하였다. 모든 점수의 평균은 각각의 경우에 대해 계산하였다. 간 트리크롬 염색된 절편은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 계산적으로 측정하였다. RGB 스택에서 각각의 이미지를 전환시킨 후, 역치를 조정하고 모든 이미지에 대해 동일한 수준으로 유지하였다.
하이드록시프롤린: 하이드록시프롤린 함량은 제조 지침에 따라 약간의 수정을 가하여 하이드록시프롤린 검정 키트 (Biovision)를 사용하여 측정하였다. 폐 조직을 칭량하고, 멸균수 (100 μl H2O 당 10 mg의 조직)에서 균질화시키고 3시간 동안 120℃에서 압밀된 테플론 캡핑된 바이알에서 12 N HCl에서 가수분해시킨 다음, 45 μm Spin-X® 원심분리 튜브 필터 (Corning)를 통해 여과하였다. 10 μl의 가수분해된 샘플은 2시간 동안 스피트-백 (Speed-Vac)에서 건조시킨 다음, 실온에서 5분 동안 100 μl의 클로라민 T 시약 및 60℃에서 90분 동안 100 μl의 4-(디메틸아미노) 벤즈알데하이드 (DMAB)와 함께 항온처리하였다. 산화된 하이드록시프롤린의 흡광도는 560 nm에서 결정하였다. 하이드록시프롤린 농도는 알려진 농도의 트랜스-4-하이드록실-L-프롤린을 사용하여 생성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. 칭량된 조직으로부터 단리된 단백질의 총량은 단백질 검정 키트 (Bio-Rad, 595 nm에서 흡광도)를 사용하여 결정하였다. 콜라겐의 양은 μg/mg 총 단백질로 나타낸다.
통계: 그룹은 일원분석 ANOVA에 의해 터키 (Tukey) 다중 비교 시험과 비교하였다. 모든 통계 시험은 통계적 유의성이 p<0.05로 정의된 GraphPad Prism 6을 사용하여 수행하였다. 결과는 본원 전반에 걸쳐 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로 나타낸다.
실시예 1 - Gα S 수용체를 효능화시킴으로써 선택적 YAP 및 TAZ 표적화
비선택적 YAP 및 TAZ 표적화가 폐 섬유증 모델에서 효과적인지 여부를 시험하기 위해, YAP 및 TAZ siRNA는 폐 섬유증의 표준 모델인 블레오마이신 손상 후 마우스에 기관내 투여하였다 (도 5). 이와 관련하여 YAP/TAZ의 비-선택적 표적화는 섬유증 (하이드록시프롤린 검정에 의해 측정됨)을 증폭시켰으며 또한 폐 손상 및 혈관 누출을 증가시켰다. 대조적으로, YAP 및 TAZ의 섬유아세포 선택적 유전적 결실은 신장 섬유증 모델에서 가능성을 나타냈다25.
G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR)는 인간 게놈에서 최대 계열의 막 수용체를 구성하고, 다산 (prolific)의 치료 표적이 되었고, 이들의 리간드는 모든 임상적으로 승인된 약물의 >30%를 차지한다26. GPCR은 4개 주요 부류의 G-단백질 기원의 이펙터 단백질에 연결된다. Gα12/13, Gαq/11 및 Gαi/o에 커플링되는 수용체의 활성화는 YAP/TAZ 핵 전좌 및 전사 활성을 자극한다. 대조적으로, GαS에 커플링되는 수용체는 YAP/TAZ 핵 국소화, 및 cAMP의 상승을 통한 활성을 억제한다27-30 (도 1a).
GPCR 발현은 기관에 걸쳐 그리고 심지어 동일한 조직에서 인접한 세포 유형 내에서 다양하다31. 따라서, GPCRome의 RNA 발현은 1차 성인 인간 폐 섬유아세포 및 폐포 상피 세포 둘 다에서 프로파일링되었고 (도 1b), 독점적으로 GαS 32에 커플링되고 (적색으로 강조됨, 도 1b) 섬유아세포에서 선택적으로 발현되는 수용체를 모색한다. 28개 GαS 커플링된 수용체 중에서, 도파민 수용체 D1 (DRD1)의 발현은 폐포 상피 세포와 비교하여 상대적으로 고발현 및 현저한 풍부함을 나타냈다 (도 1b). 배양된 정상 인간 폐 섬유아세포 및 특발성 폐 섬유증을 갖는 환자로부터 유래된 섬유아세포에서 DRD1에 대해 풍부한 전사체는 qPCR에 의해 결정하였고, 1차 인간 폐포 상피 세포와 미세혈관 내피 세포 둘 다에서 DRD1의 전사체 수준은 검출가능하지 않았다 (도 1c). 새롭게 단리된 폐 세포 집단에서 본 발명의 발견을 추가로 입증하기 위해, 본원 발명자들은 마우스 폐 조직을 중간엽, 상피, 내피 및 백혈구 집적된 분획으로 분류하였다 (도 1d). 배양된 인간 세포에서와 같이, 본원 발명자들은 새롭게 단리된 중간엽 세포에서 DRD1의 강력한 발현을 관찰하였지만, 다른 폐 세포 집단에서는 검출 가능하지 않은 수준이었다.
실시예 2 - DRD1 효능제는 중간엽 세포에서 YAP 및 TAZ 국소화를 선택적으로 억제한다
3개의 선택적 DRD1 효능제 (디하이드렉시딘, SKF-81297, 페놀도팜)는 YAP/TAZ 핵 국소화를 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다 (도 2a, 6). 섬유아세포는 단단한 매트릭스 (플라스틱)에 분주하고 세포 접촉 억제의 부재는 YAP/TAZ의 풍부한 핵 국소화를 갖는다2. 3개의 화합물 모두는 YAP/TAZ의 핵 국소화를 감소시켰고, 이들의 효능은 이전에 기재된 이들 리간드의 고유 활성과 일치하였다33.
디하이드렉시딘 (DHX)에 의한 YAP/TAZ 핵 국소화의 억제는 DRD1 선택적 길항제를 사용하여 (도 2a) 또는 세포를 DRD1-siRNA로 처리하여 (도 7) 약화될 수 있고, 이로 DHX의 수용체-특이적 효과를 확인한다. 이전에 정의된 기전과 일치하여, YAP/TAZ 핵 국소화는 세린 잔기의 cAMP-의존성 인산화에 의해 제어되고, 이는 세포질 체류 또는 분해를 촉진하고, DHX는 cAMP를 상승시키고 YAP 세린 127 인산화를 촉진시킨다27-30 (도 2d, e). DHX는 심장 및 피부 섬유아세포 및 간성상 세포를 포함한 중간엽 세포 유형의 패널에 걸쳐 YAP/TAZ 핵 국소화를 억제하는데 효과적이었고 (도 6), 이는 YAP 및 TAZ의 중간엽 세포 표적화에 대한 이 리간드의 잠재적으로 광범위한 관련성을 시사한다. YAP/TAZ 핵 국소화의 DHX-매개된 억제는 상대적으로 지속적이었고, 폐에서 알려된 항-섬유화 효과를 갖는 또 다른 GPCR 리간드 (PGE2)의 감소된 효능과 달리, 정상 폐 섬유아세포 및 IPF를 갖는 환자로부터 유래된 것들에서도 균등하게 강력하였다 (도 6)34. 이러한 관찰과 대조적으로, DHX는 폐 상피 및 내피 세포에서 YAP/TAZ 국소화에 영향을 미치지 않았고 (도 2b), 이러한 세포 유형에서 DRD1에 대한 검출 가능한 전사체의 부재와 일치한다. 섬유증을 촉진시키는 것으로 알려진 다중 GPCR 리간드는 Gαi, Gαq, 및 Gα12에 커플링하고, 이는 이어서 섬유아세포에서 YAP/TAZ 핵 국소화를 증진시키는 것으로 예상된다28 , 33. 이것은 달리 YAP/TAZ의 감소된 핵 국소화를 나타내는 컨플루언트 섬유아세포에서 확인되었고, 이는 엔도텔린-1, 리소포스파티드산 및 세로토닌, 섬유증의 촉진에 관여하는 모든 GPCR 리간드35가 YAP/TAZ 핵 국소화를 증진시킴을 보여준다. DHX는 이들 리간드 3가지 모두에 응답하여 YAP/TAZ의 핵 국소화를 차단하였고, 이는 섬유아세포에서 YAP/TAZ에 대한 GPCR 리간드의 광범위한 효과를 입증하고, YAP/TAZ 핵 국소화의 기계적 (단단한 매트릭스) 및 생화학적 조절 둘 다를 억제하기 위한 효과적인 전략으로서 DHX, 및 GαS/cAMP의 자극을 동정한다 (도 2c). YAP/TAZ 핵 국소화를 억제하는 선택된 도파민 수용체 효능제의 능력은 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00032
αSMA의 발현을 억제하는 선택된 도파민 수용체 효능제의 능력은 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00033
실시예 3 - DHX는 섬유아세포 활성화 및 매트릭스 침착을 감소시킨다
YAP/TAZ 핵 국소화의 DHX-매개된 억제가 변화된 중간엽 세포 활성화로 해독되는지 여부를 시험하기 위해, 본원 발명자들은 먼저, 특징적인 전구섬유화 유전자 CTGF, COL1A1, ACTA2, 및 FN1의 발현이 DHX 처리에 의한 IPF 환자-유래된 폐 섬유아세포에서 감소되었음을 입증하였고, 이는 YAP/TAZ 녹다운의 효과를 개괄하였다1-4 (도 3a). 이러한 효과는 DRD1-siRNA (도 7) 뿐만 아니라 DRD1 길항제 (도 3a)로 차단될 수 있다. TGFβ로 72시간 동안 단단한 조직 배양 플라스틱 상에서 배양된 섬유아세포의 자극은 αSMA+ 스트레스 섬유에 의해 검출된 바와 같이 이들의 근섬유아세포 전이를 증진시키고; TGFβ의 존재하에 48 내지 72시간 동안 DHX로 섬유아세포의 처리는 이 전이를 역전시킨다 (도 3b). 유사하게, DHX는 용량-의존적으로 콜라겐 I 및 피브로넥틴의 섬유아세포-매개된 TGFβ-자극된 축적을 역전시켰다 (도 3c). 이 효과가 YAP/TAZ의 억제에 의존하는지를 검증하기 위해, 독시사이클린-유도성, 항상성 활성, 돌연변이체 TAZ (TAZ4SA)를 안정적으로 발현하는 NIH-3T3 세포를 사용하였다2, 36. 이들 세포에서, DHX는 전구섬유화 유전자 발현 또는 특정 매트릭스 축적에 영향을 미치지 않았다 (도 8). 최종적으로, 견인력 현미경 (TFM)은 DHX가 유의적으로 및 용량 으존적으로 섬유아세포에 의해 생성된 수축력을 감소시켰음을 입증하였다 (도 3d).
실시예 4 - DHX에 의한 세포외 매트릭스 리모델링
상기 결과는 섬유아세포 전구섬유화 활성화의 주요 양상을 약화시킬 뿐만 아니라 잠재적으로 이들의 표현형을 섬유증 제거 및 해소를 촉진시키는 쪽으로 전환시키는 DHX와 일치하였다. 이 개념을 직접적으로 시험하기 위해, 시험관내 매트릭스 리모델링 검정을 개발하였다. 섬유아세포 (NIH-3T3 세포)는 먼저 세포-유래된 매트릭스를 연구하기 위해 개발된 접근법에 따라 컨플루언스에서 분주하였다 (도 3에서 A 및 B). 두 플레이트 상의 세포를 TGFβ 및 아스코르브산으로 항온처리하여 매트릭스 합성 및 침착을 촉진시켰다. 72시간 후, 세포 및 이들의 세포-유래된 매트릭스의 강성도는 원자간력 현미경 (AFM)을 사용하여 측정하였다. 세포-매개된 매트릭스 리모델링을 유도하는 DHX의 능력을 시험하기 위해, TGFβ 및 아스코르브산을 유지하였지만 또한 DHX를 AFM으로 매트릭스를 다시 탐지하기 전에 추가 72시간 동안 B (비히클 대조군을 A에 첨가하였다)에 첨가하였다. 대조군 플레이트 A 내 세포 및 매트릭스는 시간 경과에 따라 계속 강화되었지만, DHX 처리는 이러한 경향을 효과적으로 역전시키고 관찰된 강성도를 유의적으로 감소시켰다. DHX가 매트릭스 리모델링 효과를 도입했는지를 확인하기 위해, 매트릭스를 탈세포화하고 24시간 동안 낮은 계대의 1차 인간 성인 폐 섬유아세포를 탈세포화된 매트릭스 상으로 분주한 다음, RNA를 단리하여 전구섬유화 유전자 발현에서의 변화를 측정하였다. CTGF, COL1A1, ACTA2 및 FN1 발현은 이전에 DHX로 처리된 매트릭스 상에 분주된 세포에서 모두 감소하였고, 세포 리모델링에 의한 세포외 매트릭스에 남겨진 약물-풋프린트 (pharmaco-footprint)를 동정하였다.
DHX의 이들 매트릭스 리모델링 효과에 기반하여, 이 경로의 효능이 단순히 이의 진행을 늦추기 (섬유아세포의 중요한 유용성) 보다는 질환을 역전시킬 수 있는 섬유아세포에서 매트릭스 분해/리모델링 작용을 유도하는 것으로 확장되는지를 결정하였다. 먼저, DHX의 효과는 매트릭스 리모델링과 관련된 유전자의 발현에 대해 조사하였다 (도 3f). TGFβ로 처리된 IPF 환자 유래된 섬유아세포는 매트릭스 가교결합 유전자 및 매트릭스 프로테아제 효소 억제제의 증진된 발현을 보여주었지만, 또한 매트릭스 제거와 관련된 여러 유전자의 감소된 발현을 보여주었다 (도 3f). 각각의 경우에, DHX 처리는 TGFβ의 효과를 역전시켜 가교결합 및 프로테아제 억제제의 발현을 감소시키지만 매트릭스 분해 관련된 효소의 발현을 증진시켰다. DHX가 매트릭스 리모델링에 영향을 미치는 단일 드라이버 유전자가 존재하는 것으로 보이지 않고, 이는 관찰된 효과가 보다 광범위한 섬유아세포 프로그램 전환임을 시사한다.
실시예 5 - 생체내 DHX 효능
폐 섬유증의 블레오마이신 모델을 사용하여 실험 섬유증에서 생체내 DHX의 효능을 시험하였다. 마우스는 0일에 블레오마이신을 기관내 투여하였다. 10일에, 손상 및 염증은 전형적으로 진정되고 섬유증은 계속된다. 10일에, 마우스는 2개의 그룹으로 무작위화하고, 하나에 DHX (하루 1회 5 mg/kg i.n)를 투여하고, 다른 하나에 비히클 대조군이었다. 블레오 DHX 그룹은 블레오 대조군 그룹 보다 훨씬 적게 감량되었다 (도 4a). 24일에, 마우스를 희생시키고 조직학, 하이드록시프롤린 및 qPCR을 사용하여 비교하였다. 조직학적으로, 블레오 DHX 그룹은 맹검 병리학자에 의해 평가된 바와 같이, 블레오 대조군 그룹 및 샴 비손상 마우스와 비교하여 폐 리모델링으로부터 완전히 보호하였다 (도 4b). 블레오 DHX 마우스의 폐에서 총 콜라겐은 샴 처리된 마우스와 거의 동일하였고 블레오 대조군 마우스와 비교하여 유의적으로 감소하였다 (도 4c). 블레오마이신은 폐에서 YAP 및 TAZ에 대한 염색을 증가시켰고 이것은 DHX 처리에 의해 약화되었다 (도 4d). 블레오 대조군 그룹은 또한 Yap 및 Taz 자체 뿐만 아니라 전구섬유화 유전자 Acta2, Ctgf, Fn1, Col1a1, 및 Col1a2에 대한 증진된 전사체 수준을 보여주었고 이들 모두는 블레오 DHX 그룹에서 유의적으로 약화되었다 (도 4e). DHX가 섬유증의 부재하에 폐 리모델링에 악영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 본원 발명자들은 또한 동일한 시간 과정 및 노출 경로에 따라 대조군 마우스를 DHX에 노출시켰다. 샴 DHX 마우스의 폐는 임의의 이러한 측정을 사용한 대조군 마우스의 폐와 상이하지 않았다 (도 9).
실시예 6 - 간성상 세포에 대한 DHX의 효과
일련의 중간엽 세포에 걸쳐 YAP/TAZ 핵 국소화를 약화시키는데 있어서 DHX의 효능을 기반으로, 본원 발명자는 우리의 발견을 간성상 세포와 간 섬유증까지 확장하려고 노력하였다. 간세포와 비교하여 간성상 세포 (HSC)에서 DRD1의 우선적 발현 (도 10)이 확인되었고, 결과는 이전 실시예에서 폐 조직에 대해 얻은 결과와 유사하였다. 이어서, SMA 및 FN 단백질의 TGFβ-매개된 HSC 발현을 감소시키는 DHX의 능력은 웨스턴 블로팅에 의해 시험하였고 둘 다의 간찰된 유의한 역전을 관찰하였다. 이어서, 담즙정체 손상 및 간 섬유증의 담관 결찰 모델에서 DHX의 효능을 시험하였다. 담관 결찰은 0일에 수행하였고 DHX 또는 비히클을 사용한 처리는 7일에 개시하고 14일 동안 계속하였다. DHX는 BDL에 의해 유발된 조직학적 섬유증을 유의적으로 개선시켰고 감소된 콜라겐 침착 경향을 나타내었다 (도 10).
이전 연구는 TAZ가 비-알콜성 지방간염의 모델에서 간 세포에서 섬유성 효과를 매개하고37, 버테포르핀 (YAP/TAZ-TEAD 상호작용의 억제제)이 간 섬유증 모델에서 제한된 이로운 효과를 갖고19, YAP/TAZ가 간 재생 (간에서 비특이적 YAP 분해는 간세포 괴사를 촉진시킨다38)에서 필수적임을 입증하였다. 본원의 결과는 실험 간 섬유증에서 YAP/TAZ의 선택적 억제에 대한 GPCR-기반 접근법의 효능을 처음으로 입증하였다.
실시예 7 - DOPA 데카복실라제는 IPF에서 감소하였고 악화되는 질환 중증도와 상호관련이 있다
IIPF 환자 폐는 비-IPF 폐 보다 적게 dopa 데카복실라제 (DDC) (도파민 합성에 관여하는 효소)를 발현하고 보다 낮은 수준의 DDC 발현이 폐 섬유증에서 상실된 도파민 신호전달에 대한 내인성 보호성 역할과 일치하는, 감소된 폐 기능과 상호관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 33). 이를 뒷받침하기 위해, 또한 도파민은 섬유아세포 활성의 시험관내 평가에서 항섬유성인 것으로 나타났다 (도 34).
종합하면, 본원에 제시된 실험 결과 및 데이터는 GPCR 효능작용이 조직 섬유증에 대한 이로운 효과를 발휘하기 위한 선택적 세포 집단에서 YAP 및 TAZ를 약리학적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다. Gas 효능작용 및 YAP/TAZ 억제는 매트릭스 침착 및 활성화된 섬유아세포의 강화 표현형을 섬유증 해결을 촉진시키는 매트릭스 리모델링 표현형으로 역전시키고, 이는 Gas 효능작용 및 YAP/TAZ 억제가 섬유성 질환을 갖는 환자를 치료하기 위한 가치 있는 접근법임을 보여준다.
참조문헌
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
기타 구현예
본 출원은 이의 상세한 설명과 함께 기재되지만 이전의 개시내용은 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정되는, 본 출원의 범위를 예시하고자 하는 것이지 이를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 양상, 이점 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Mayo Foundation for Medical Education and Research <120> Methods of Treating Fibrotic Pathologies <130> 07039-1754WO1 <150> US 62/624,535 <151> 2018-01-31 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 1 cccagcccta tcagtcatat tg 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 2 aggattcatc tgcgagttca g 21 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 3 gtccagcacg aggctca 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 4 tcgccttcgt ggtcctc 17 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 5 aagggacaca gaggtttcag tgg 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 6 cagcaccagt agcaccatca tttc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 7 gtgaagaaga ggacagcact g 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 8 cccattccca ccatcacc 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 9 tgtcagtcaa agcaagcccg 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 10 ttaggacgct cataagtgtc accc 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 11 tcagctacaa tgggatcttg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 12 aaggcagtca cggtatttct c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 13 acattcgcta cacaggacat c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 14 ttcccacttc agaacaccag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 15 tgccagtgga tcgacataac 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 16 gaaacgtagc gacctgtgta g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 17 gtgcagcgac aaaaggattc 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 18 gcggtaggtt gagaggatg 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 19 agcgaaaaga gggtcaacg 19 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 20 tgtcattggc acgatagaac tc 22 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 21 gtggcagagt cagatttctc c 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 22 ttgttcctga gacgctgttc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 23 gggagatgaa gtttgaggtg g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 24 agatggtctg tatagtccgg g 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 25 aaacccagat cgagactcaa ag 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 26 acccattccc aaagtagcag 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 27 ctccttccag ttttacagca aag 23 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 28 tttccccagt tttctcccc 19 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 29 tgcctaccga caagattgat g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 30 atcccttccc agactttgat g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 31 cccgtagcca ttatgatcgt c 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 32 agagcattcg acagggtttc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 33 tccttctacc acctcagcga g 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 34 ccggatggtc actctttagg aag 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 35 ttgctccaaa ctggcgtcta 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 36 acgtgatctc cgtgtccttg t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 37 ctgccagtcc gaaaatggaa c 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 38 cttcatccac tggggctatc 20 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 39 gacagagtta gtgaatggag acc 23 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 40 aaaagttcgg agagtgtagg c 21 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 41 gagaagccca gccagtcg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 42 ctcttgctct gggcttca 18 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 43 cctgcgaccc acacaag 17 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 44 gacccaccga agacacag 18 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 45 ccagcagcat gatcaaaaca c 21 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 46 ggtggctaca tgttagagtg tc 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 47 atcatagcca taggacatct gg 22 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 48 ctggacagcc tggacttc 18 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 49 ctctgagtga tcctctggtt c 21 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 50 ccataagaac aagaccacat cct 23 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 51 cttgctggtg ttggtgattc 20 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 52 atcagcctct gaatcatgtg aa 22 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 53 tgctttttcc aggggtgtgt t 21 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated oligonucleotide <400> 54 ttacttcctg cactaatttg gca 23

Claims (35)

  1. 섬유성 병리를 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    여기서, GαS 단백질 커플링된 수용체는 상피 또는 내피 세포와 비교하여 중간엽 세포에서 우선적으로 발현되는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 효능제는 중간엽 세포에서 우선적으로 발현되는 GαS 수용체에 특이적인, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 중간엽 세포는 섬유아세포 또는 성상 세포인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GαS 단백질 커플링된 수용체는 도파민 수용체인, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 도파민 수용체는 도파민 수용체 D1 (DRD1)인, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 도파민 수용체 효능제는 D2, D3, D4, 또는 D5 도파민 수용체 또는 이의 임의의 조합과 비교하여 D1 도파민 수용체에 선택적인, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GαS 단백질 커플링된 수용체 효능제는 ABT-413, A-86929, 디하이드렉시딘 (DHX), 디나프설린, 디녹실린, 독산트린, SKF-81297, SKF-82958, SKF-38393, 페놀도팜, 6-Br-APB, 스테폴리딘, A-68930, A-77636, CY-208-243, SKF-89145, SKF-89626, 7,8-디하이드록시-5-페닐-옥타하이드로벤조[h]이소퀴놀린, 카버골린, 페르골리드, R(-)-2,10,11-트리하이드록시아포르핀, (R)-(-)-아포모르핀, R(-)-프로필노라포모르핀, R(+)-6-브로모-APB, R(-)-2,10,11-트리하이드록시-N-프로필-노라포르핀, 6,7-ADTN, 메술레르긴, N-메틸도파민, 4-하이드록시펜에틸아민, 카버골린, 3-하이드록시펜에틸아민, 프라미펙솔, PD-168077, 페놀도팜, (±)-PD 128-907, (±)-2-(N-페닐에틸-N-프로필)아미노-5-하이드록시테트랄린, 브로모크립틴, 로피니롤, LY-163-502, 디프로필도파민, B-HT 920, 피리베딜, (+)-UH 232, 페르골리드, (-)-퀸피롤, 및 R(-)-2,11-디하이드록시-10-메톡시아포모르핀 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체 효능제는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    화학식 I
    Figure pct00038

    상기 식에서,
    각각의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, OH, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, HO-C1-3 알킬, NH2-C1-3 알킬, HS-C1-3 알킬, SH, NH2, C1-6 알킬아미노 및 디(C1-6 알킬)아미노로부터 선택된다.
  9. 청구항 8항에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5중 적어도 하나는 OH, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, HO-C1-3 알킬, NH2-C1-3 알킬, HS-C1-3 알킬, SH, NH2, C1-6 알킬아미노 및 디(C1-6 알킬)아미노로부터 선택되는, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5중 적어도 2개는 독립적으로, OH, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, HO-C1-3 알킬, NH2-C1-3 알킬, HS-C1-3 알킬, SH, NH2, C1-6 알킬아미노 및 디(C1-6 알킬)아미노로부터 선택되는, 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, R1, R2 및 R5 중 적어도 하나는 OH인, 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 2개는 OH인, 방법.
  13. 청구항 8에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 NH2인, 방법.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00039
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유성 병리는 간질성 폐 질환 (ILD)인, 방법.
  16. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유성 병리는 폐 섬유증 (PF) 및 특발성 폐 섬유증 (IPF)으로부터 선택되는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유성 병리는 간 조직 섬유증, 심장 섬유증, 신장 섬유증 및 피부 조직 섬유증으로부터 선택되는, 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 섬유성 병리를 치료하는데 유용한 치료학적 유효량의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 추가 치료제는 도파민 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법.
  20. ㆍ 세포에서 GαS 단백질 커플링된 수용체를 효능화시키고/시키거나;
    ㆍ 세포에서 YAP/TAZ 인산화를 촉진시키고/시키거나;
    ㆍ 세포에서 YAP/TAZ 기능을 억제하고/하거나;
    ㆍ 세포에서 전구섬유화 유전자의 발현을 억제하고/하거나;
    ㆍ 세포에서 YAP/TAZ의 핵 국소화를 감소시키고/시키거나;
    ㆍ 세포에서 α-평활근 액틴 (αSMA)의 발현을 억제하고/하거나;
    ㆍ 세포에 의한 세포외 매트릭스 생성 및 침착을 억제하고/하거나;
    ㆍ 세포에 의한 세포외 매트릭스 분해를 증진시키는 방법으로서,
    상기 방법은 세포와 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법:
    화학식 I
    Figure pct00040

    상기 식에서,
    각각의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, OH, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, HO-C1-3 알킬, NH2-C1-3 알킬, HS-C1-3 알킬, SH, NH2, C1-6 알킬아미노 및 디(C1-6 알킬)아미노로부터 선택되고,
    단, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물이 아니다:
    Figure pct00041
    .
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 방법은 세포에서 GαS 단백질 커플링된 수용체를 효능화시키고/시키거나, 세포에서 YAP/YAZ 인산화를 촉진시키고/시키거나; 세포에서 YAP/TAZ 기능을 억제하고/하거나; 세포에서 전구섬유화 유전자의 발현을 억제하는, 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 전구섬유화 유전자는 CTGF, COL1A1, ACTA2, 및 FN으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 2개는 OH인, 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 NH2인, 방법.
  25. 청구항 20에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00042
    .
  26. 청구항 20 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GαS 단백질 커플링된 수용체는 도파민 수용체인, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 도파민 수용체는 도파민 수용체 D1 (DRD1)인, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 도파민 수용체 효능제는 D2, D3, D4, 또는 D5 도파민 수용체 또는 이의 임의의 조합과 비교하여 D1 도파민 수용체에 선택적인, 방법.
  29. 청구항 20 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 중간엽 세포인, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 중간엽 세포는 섬유아세포 및 성상 세포로부터 선택되는, 방법.
  31. 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 이의 염:
    화학식 I
    Figure pct00043

    상기 식에서:
    각각의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, OH, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, HO-C1-3 알킬, NH2-C1-3 알킬, HS-C1-3 알킬, SH, NH2, C1-6 알킬아미노 및 디(C1-6 알킬)아미노로부터 선택되고,
    단, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물이 아니다:
    Figure pct00044
  32. 청구항 31에 있어서, R3은 OH인, 화합물.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 2개는 OH인, 화합물.
  34. 청구항 31에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 NH2인, 방법.
  35. 청구항 31에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00045
    .
KR1020207024004A 2018-01-31 2019-01-31 섬유성 병리를 치료하는 방법 KR20200115547A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862624535P 2018-01-31 2018-01-31
US62/624,535 2018-01-31
PCT/US2019/016178 WO2019152733A1 (en) 2018-01-31 2019-01-31 Methods of treating fibrotic pathologies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200115547A true KR20200115547A (ko) 2020-10-07

Family

ID=67478910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207024004A KR20200115547A (ko) 2018-01-31 2019-01-31 섬유성 병리를 치료하는 방법

Country Status (5)

Country Link
US (3) US20210038561A1 (ko)
EP (1) EP3745862B1 (ko)
KR (1) KR20200115547A (ko)
CA (1) CA3089864A1 (ko)
WO (1) WO2019152733A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023080628A1 (ko) * 2021-11-02 2023-05-11 연세대학교 산학협력단 세포예정괴사 관련 질병 치료제로서의 아포모르핀의 용도

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111956643B (zh) * 2020-09-15 2024-06-25 西安交通大学 维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用
WO2022155471A1 (en) * 2021-01-15 2022-07-21 Thomas Jefferson University Compounds, compositions, and methods for treating or ameliorating nonalcoholic fatty liver disease and related diseases or disorders
WO2023220332A1 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 Children's Hospital Medical Center Methods and compositions for treatment of idiopathic pulmonary fibrosis
WO2024157207A1 (en) * 2023-01-25 2024-08-02 Gpcr Therapeutics, Inc. Gpcr inhibitors and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5304121A (en) 1990-12-28 1994-04-19 Boston Scientific Corporation Drug delivery system making use of a hydrogel polymer coating
US5994341A (en) 1993-07-19 1999-11-30 Angiogenesis Technologies, Inc. Anti-angiogenic Compositions and methods for the treatment of arthritis
US6099562A (en) 1996-06-13 2000-08-08 Schneider (Usa) Inc. Drug coating with topcoat
WO1996038435A1 (en) 1995-05-30 1996-12-05 Abbott Laboratories Dopamine agonists
CA2446904A1 (en) 2001-05-24 2003-04-03 Alexza Molecular Delivery Corporation Delivery of drug esters through an inhalation route
US8859001B2 (en) * 2007-10-18 2014-10-14 Mia Levite Fenoldopam formulations and pro-drug derivatives
EP2968989B1 (en) * 2013-03-12 2020-12-02 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Use of shroom3 as marker for chronic allograft nephropathy
KR20180125460A (ko) 2016-01-29 2018-11-23 온코슈틱스 인코포레이티드 이미프리돈에 의한 g 단백질-커플링된 수용체 (gpcr) 조절

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023080628A1 (ko) * 2021-11-02 2023-05-11 연세대학교 산학협력단 세포예정괴사 관련 질병 치료제로서의 아포모르핀의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US20210038561A1 (en) 2021-02-11
CA3089864A1 (en) 2019-08-08
WO2019152733A1 (en) 2019-08-08
EP3745862A4 (en) 2021-04-07
US20240252463A1 (en) 2024-08-01
US20230346740A1 (en) 2023-11-02
EP3745862B1 (en) 2024-06-26
EP3745862A1 (en) 2020-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200115547A (ko) 섬유성 병리를 치료하는 방법
JP6944377B2 (ja) グルタミナーゼの阻害剤を用いる肺がんの処置
US10500249B2 (en) Compositions and methods for preventing or treating diseases, conditions, or processes characterized by aberrant fibroblast proliferation and extracellular matrix deposition
EP1885356A2 (en) Phosphoinositide 3-kinase inhibitors for inhibiting leukocyte accumulation
JP2021500362A (ja) 進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ｐｆ−ｉｌｄ）の処置のための活性剤の新規組み合わせ
US10124006B2 (en) Use of Sigma-1 receptor agonist compounds
WO2019033122A1 (en) TREATMENT OF PULMONARY DISEASES USING PHARMACEUTICAL AGENTS THAT ELIMINATE SENESCENT CELLS
JP2019026649A (ja) 結腸直腸癌を処置する方法
KR20170141757A (ko) 테트라하이드로나프티리디닐 프로피온산 유도체 및 이의 용도
EA030762B1 (ru) Способы лечения фиброза
US20220193053A1 (en) Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators for treating autosomal dominant polycystic kidney disease
KR20180004816A (ko) Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 gata-3 저해제
JP2023540393A (ja) カテプシンｃ阻害剤により転移を治療するための方法
JP2021528392A (ja) 老化細胞によって引き起こされるかまたは媒介される状態の臨床管理における使用のためおよびがんを治療するための、Ｂｃｌファミリーアンタゴニストであるアシルスルホンアミド
JP2018537404A (ja) 腫瘍細胞を非腫瘍細胞に変換するための医薬的連合体及びその使用
CN106243096B (zh) 三环类药物的新用途
US20210379078A1 (en) Killing Senescent Cells And Treating Senescence-Associated Conditions Using A Bcl Inhibitor And An Mcl-1 Inhibitor
KR20220041847A (ko) 섬유성 병리를 치료하기 위한 화합물 및 방법
JP2019511541A (ja) 結腸直腸癌の処置における使用のためのラムシルマブとメレスチニブとの組み合わせ
JP2008543807A (ja) Ｐｄｅ１ｃ及びそのインヒビターの使用
TW202227065A (zh) 硫代咪唑烷酮藥物在治療ｃｏｖｉｄ－１９疾病中的用途
KR102057441B1 (ko) 벤조[d]싸이아졸 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
Ha et al. Puromycin aminonucleoside modulates p130Cas of podocytes
WO2023199010A1 (en) Treatment of muscle fibrosis
JP7493460B2 (ja) 有機化合物

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal