EA030762B1 - Способы лечения фиброза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам лечения фиброза, включающим введение пациенту, страдающему фиброзом, терапевтически эффективного количества соединения формулыили его фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера, где фиброз представляет собой один из фиброза печени, фиброза кишечника или идиопатического фиброза легких. Изобретение обеспечивает противовоспалительные эффекты и уменьшает степень фиброза.

Description

Изобретение относится к способам лечения фиброза, включающим введение пациенту, страдающему фиброзом, терапевтически эффективного количества соединения формулы

nh₂

030762 B1

или его фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера, где фиброз представляет собой один из фиброза печени, фиброза кишечника или идиопатического фиброза легких. Изобретение обеспечивает противовоспалительные эффекты и уменьшает степень фиброза.

030762

Заявка на настоящий патент испрашивает приоритет заявки EP12425027.5, поданной 9 февраля 2012 г., и заявки USSN 61/644 544, поданной 9 мая 2012 г., каждая из которых включена в настоящее изобретение посредством ссылки в полном объеме.

Список последовательностей

Настоящее изобретение включает список последовательностей, который был подан в электронном виде в текстовом формате и включен в настоящее изобретение в полном объеме посредством ссылки. Указанная текстовая копия, созданная 21 мая 2013 г., озаглавлена PS966PCT SL.txt и имеет размер 3284 байта.

Предпосылки изобретения

Фиброз заключается в формировании избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в восстановительном или реактивном процессе, например, при заживлении, обычно вследствие травмы или продолжительного воспаления. Фиброз вызывает затвердевание и/или опухание пораженных тканей и уменьшает поток жидкостей через эти ткани. В результате ткани, пораженные фиброзом, могут потерять способность функционировать надлежащим образом.

Например, фиброз печени можно описать, как реакцию заживления в ответ на хроническое поражение печени, в результате, например, алкогольной или наркотической зависимости, вирусной или паразитарной инфекции (например, гепатита, такого, как гепатит В или С), неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), избытка железа или меди, а также аутоиммунных заболеваний. Все хронические заболевания печени могут приводить к фиброзу печени, причем его основными причинами являются хронический вирусный гепатит В и заболевания печени, вызванные алкоголем. Эндоканнабиоидная система печени опосредует как про-, так и антифиброгенный эффекты за счет активации различных сигнальных путей, которые по-разному влияют на пролиферацию и смерть фиброгенных типов клеток. С течением времени эти процессы могут приводить к циррозу печени, при котором структурная организация функциональных единиц печени расстраивается до такой степени, что кровь протекает через печень и деятельность печени нарушается.

Фиброз печени представляет собой распространенную и непростую проблему мирового значения. В настоящее время единственным радикальным путем лечения цирроза на конечной стадии является трансплантация, но даже в развитых странах количество донорских органов, доступных в клинических условиях для потенциальных реципиентов, ограничивает применимость данной методики. Прогрессирование фиброза и, в частности, цирроза, является причиной значительной заболеваемости и смертности. Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке стратегий борьбы с фиброзом, которые применимы при фиброзе печени.

Фиброз почек приводит к значительной заболеваемости и смертности в качестве первичной приобретенной патологии, приводя к необходимости диализа или трансплантации почек. Фиброз может возникать либо в фильтрующем, либо в реабсорбирующем компоненте нефрона, т.е. функциональной единицы почки. Кроме того, фиброз может возникать в сердце, например фиброз сердца может проявляться в виде утолщения сердечного клапана.

Фиброз кишечника является распространенным осложнением воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), которое может проявляться в виде симптомов и может потребовать хирургического вмешательства, если в результате фиброза формируется сужение просвета кишечника. Большинство традиционных и новых механизмов, лежащих в основе фиброза кишечника, связаны с хроническим воспалением.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится, например, к способам лечения фиброза, включающим введение пациенту соединений, раскрытых в тексте настоящего патента. Кроме того, в изобретении разработаны соединения для применения в указанных способах. Например, в изобретении разработан способ лечения фиброза, включающий введение пациенту, страдающему фиброзом, терапевтически эффективного количества соединения формулы

nh₂

или его фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера, где фиброз представляет собой один из фиброза печени, фиброза кишечника или идиопатического фиброза легких.

При этом фиброз может представлять собой фиброз печени, фиброз кишечника или идиопатический фиброз легких.

Далее, изобретение относится к способу лечения фиброза печени, включающему введение пациенту, страдающему фиброзом печени, фармацевтического препарата, включающего терапевтически эффективное количество 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера.

Предпочтительно фармацевтический препарат по изобретению вводят перорально.

- 1 030762

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, пациент является человеком.

В одном из вариантов осуществления изобретения, у пациента уже имеется или имелось заболевание, представляющее собой гепатит В, гепатит С, цирроз, болезнь Крона, воспалительная болезнь кишечника или язвенный колит.

Кроме того, изобретение включает способ лечения фиброза кишечника, включающий введение пациенту, страдающему фиброзом кишечника, фармацевтического препарата, включающего терапевтически эффективное количество 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера.

Предпочтительно фармацевтический препарат вводят перорально.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, пациент является человеком.

У данного пациента также может быть болезнь Крона, воспалительная болезнь кишечника или язвенный колит.

Далее, изобретение включает способ лечения идиопатического фиброза легких, включающий введение пациенту, страдающему от идиопатического фиброза легких, фармацевтического препарата, включающего терапевтически эффективное количество 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера.

Предпочтительно фармацевтический препарат вводят перорально.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения пациент является человеком.

Согласно изобретению стереоизомер 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты представляет собой (Б)-2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту или 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты представляет собой (И)-2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту.

Эти и другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут ясны из приведенного ниже иллюстративного материала, подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 изображено изменение массы тела мышей при введении CCl₄, JWH-133 и соединения 34.

На фиг. 2А приведена расшифровка баллов шкалы METAVIR и фиг. 2В отображено влияние введения CCl4, JWH-133+CCl₄ и соединения 34+CCl₄ на печень, и приведены результаты по шкале METAVIR для каждой группы.

На фиг. 3А отображены результаты по шкале METAVIR и фиг. 3В результаты по адаптированной шкале METAVIR для печени мышей, которые подвергались действию CCl₄, JWH-133+CCl₄ и соединения 34+CCl4.

На фиг. 4 отображено действие CCl₄, JWH-133+CCl₄ и соединения 34+CCl₄ на уровни α-SMA и коллагена-1.

На фиг. 5 приведено расписание исследования кишечного фиброза.

На фиг. 6 отображено действие соединения 34 на ободочную кишку мышей с фиброзом кишечника.

На фиг. 7 приведено противовоспалительное действие соединения 34 на ободочную кишку мышей с фиброзом кишечника.

На фиг. 8 отображено действие соединения 34 на ободочную кишку мышей с фиброзом кишечника.

На фиг. 9 отображено действие соединения 34 на ободочную кишку мышей с фиброзом кишечника, определенное по результатам иммуногистохимического анализа основных маркеров фиброза (коллагена I-III, CTGF, SMAD 2/3, PDGF, α-SMA и TGF-β 1).

На фиг. 10 показано действие соединения 34 на ободочную кишку мышей с фиброзом кишечника, определенное с помощью вестерн-блоттинга.

На фиг. 11 показана кривая массы тела мышей, которым вводили DSS и DSS+GED.

На фиг. 12 показан уровень развития фиброза в ободочной кишке мышей, получавших DSS и DSS+GED по сравнению с контрольными мышами, получавшими обычную воду.

На фиг. 13 показаны результаты микроскопического исследования ободочной кишки мышей с хроническим колитом, получавших DSS и DSS+GED. Ткани ободочной кишки фиксировали в 4% PFA и поперечные срезы (4 мкм) окрашивали красителем Мэя-Грюнвальда-Гимза (Н&Е) и трихромом по Массону. Мыши DSS демонстрировали сильную степень воспаления и фиброза, как в подслизистом слое, так и в серозной оболочке по сравнению с контрольными животными, в то время как введение GED обеспечивало восстановление нормальной структуры кишечной стенки. Данные приведены в виде среднее значение ±SEM (стандартная ошибка среднего значения); *=p<0,05; **=p<0,01 и ***p<0,005 относительно Н₂О.

На фиг. 14 показаны результаты иммуногистохимии и иммуноблоттинга основных маркеров фиброза. Микрофотографии демонстрируют значительное уменьшение уровней коллагена I-III (а), α-SMA (b) у DSS мышей, которым вводили GED, по сравнению с мышами с DSS-индуцированным хроническим колитом. Уровни этих маркеров измеряли также с помощью Вестерн-блоттинга, подтверждая профиль экспрессии, индуцированный GED. Показаны характерные результаты блоттинга. *=p<0,05; **=p<0,01. N=6 мышей в контрольной группе, 8 мышей в группе DSS, 8 мышей в группе DSS+GED.

На фиг. 15 приведены микрофотографии, демонстрирующие значительное уменьшение уровней

- 2 030762

TGF-βΙ (a), SMAD ИЗ (b) , CTGF (с) у DSS мышей, которым вводили GED, по сравнению с мышами с хроническим колитом, вызванным DSS.

На фиг. 16 показано влияние введения GED на уровни белка IL-13 у мышей, постоянно получавших DSS, а также производных медиаторов, а именно TGF-β 1 и CTGF. Уровни IL-13, TGF-β 1 и CTGF определяли с помощью вестерн-блоттинга. Данные выражены в процентах от средних значений для контрольных животных. Показаны репрезентативные результаты блоттинга. **=p<0,01. N=6 мышей в контрольной группе, 8 мышей в группе DSS, 8 мышей в группе DSS+GED.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение частично основано на данных о том, что некоторые соединения, раскрытые в настоящем изобретении, обладают способностью предотвращать или лечить фиброз, например, печени или ободочной кишки. В одном из аспектов, изобретение направлено на способы профилактики или лечения фиброза, например фиброза печени и/или фиброза кишечника, у пациентов, которым это необходимо. Способы по настоящему изобретению включают введение соединений, раскрытых в настоящем изобретении.

Перед дальнейшим описанием изобретения ниже по тексту собраны определения некоторых терминов, используемых в описании, примерах и приложенной формуле изобретения. Эти определения следует воспринимать в свете оставшейся части описания и понимать так же, как их понимают специалисты в данной области техники. Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют те же значения, которые традиционно понимаются под ними рядовыми специалистами в данной области техники.

"Пациент", "субъект" или "хозяин", которого предполагается лечить способом по настоящему изобретению может означать как человека, так и животного, не являющегося человеком, например, мелкое млекопитающее, такое как крыса или мышь, а также лошадь, корову, собаку, кошку и т.д.

Термин "терапевтический агент" известен в технике и относится к любой химической частице, которая является биологически, физиологически или фармакологически активным веществом, которое местно и/или системно действует в организме субъекта. Примеры терапевтических агентов, именуемых также "лекарственными средствами", описаны в хорошо известных литературных источниках, таких как Merck Index, the Physicians Desk Reference и The Pharmacological Basis of Therapeutics, и такие средства включают, не ограничиваясь указанными, медикаменты; витамины; минеральные добавки; вещества, применяемые для лечения, профилактики, диагностики, устранения или ослабления болезни или заболевания; вещества, которые воздействуют на строение или функции организма; или пролекарства, которые приобретают биологическую активность или становятся более активными после того, как их помещают в физиологическую среду.

Термин "терапевтический эффект" известен в технике и относится к местному и/или системному действию у животных, в том числе млекопитающих, и более конкретно людей, вызванному фармакологически активным веществом. Таким образом, указанный термин относится к любому веществу, которое предназначено для применения в диагностике, лечении, ослаблении, устранении или предупреждении заболевания или в улучшении желаемого физического или умственного развития и/или состояния у животного или человека. Фраза "терапевтически эффективное количество" означает такое количество данного вещества, которое вызывает желаемое местное или системное действие при разумном соотношении польза/риск, применимое к любому лечению. Терапевтически эффективное количество данного вещества будет меняться в зависимости от субъекта и подвергаемого лечению болезненного состояния, массы и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, пути введения и подобных факторов, которые может легко определить рядовой специалист в данной области техники. Например, некоторые композиции по настоящему изобретению можно вводить в количестве, достаточном для получения эффекта при разумном соотношении польза/риск, применимом к такому лечению.

Термин "лечение" известен в технике и относится к устранению заболевания, а также к ослаблению по крайней мере одного из симптомов любого состояния или заболевания.

Термин "алкил" известен в технике и охватывает насыщенные алифатические группы, в том числе алкильные группы с линейной цепью, алкильные группы с разветвленной цепью, циклоалкильные (алициклические) группы, циклоалкильные группы с алкильными заместителями и алкильные группы с циклоалкильными заместителями. В некоторых вариантах осуществления скелет алкильных групп с линейной или разветвленной цепью включает примерно 30 или менее атомов углерода (например, Cj-C₃₀ для линейной цепи, C₃-C₃₀ для разветвленной цепи) и, в качестве альтернативы, примерно 20 или менее, например, от 1 до 6 атомов углерода. Аналогично, циклическая структура циклоалкилов включает от примерно 3 до примерно 10 атомов углерода и, в качестве альтернативы, примерно 5, 6 или 7 атомов углерода. Кроме того, термин "алкил" определяется таким образом, что он охватывает галогензамещенные алкилы.

Кроме того, термин "алкил" (или "низший алкил") включает "замещенные алкилы", которые представляют собой алкильные фрагменты, включающие заместители, замещающие атомы водорода у одного или нескольких атомов углерода углеводородного скелета. Упомянутые заместители могут включать,

- 3 030762

например, гидроксил, карбонил (например, карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (например, тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, амино, амидо, амидин, имин, циано, нитро, азидо, сульфгидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил, или ароматический или гетероароматический фрагмент. Специалист в данной области поймет, что фрагменты, являющиеся заместителями углеводородной цепи, сами по себе могут быть замещенными, если имеется соответствующая возможность. Например, заместители замещенного алкила могут включать замещенные и незамещенные формы амино, азидо, имино, амидо, фосфорила (в том числе фосфонатов и фосфинатов), сульфонила (в том числе сульфата, сульфонамидо, сульфамоила и сульфоната) и силильной группы, а также простых эфиров, алкилтио, карбонильных соединений (в том числе кетонов, альдегидов, карбоксилатов и сложных эфиров), -CN и т.п. Типовые замещенные алкилы описаны ниже. Циклоалкилы могут быть дополнительно замещены алкилами, алкенилами, алкокси, алкилтио, аминоалкилами, карбонилзамещенными алкилами, -CN и т.п.

Термины "орто-", "мета-" и "пара-" известны в технике и относятся к 1,2-, 1,3- и 1,4-дизамещенным бензолам соответственно. Например, названия 1,2-диметилбензол и ортодиметилбензол являются синонимичными.

Имеется в виду, что определения для каждого фрагмента или переменной величины, например, алкила, m, n и т.п., если в какой-либо структуре они встречаются более одного раза, являются независимыми от любых других определений этой переменной в той же самой структуре.

Некоторые соединения, входящие в композиции по настоящему изобретению, могут существовать в конкретных геометрических или стереоизомерных формах. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут также являться оптически активными. Настоящее изобретение охватывает все такие соединения, в том числе цис- и транс-изомеры, R- и S-энантиомеры, диастереомеры, (Э)-изомеры. (L)изомеры их рацемические смеси и другие смеси, которые попадают в объем настоящего изобретения. Дополнительные асимметрические атомы углерода могут присутствовать в заместителе, например, алкильной группе. Имеется в виду, что все такие изомеры, а также их смеси включены в настоящее изобретение.

Имеется в виду, что термины "замещение" или "замещенный чем-либо" включают потенциально возможные молекулы, при условии, что такие замещения соответствуют возможным валентностям замещенного атома и заместителя, и что замещение приводит к устойчивому соединению, которое, например, не претерпевает самопроизвольного превращения, например, в результате перегруппировки, циклизации, элиминирования или других реакций.

Предполагается также, что термин "замещенный" включает все допустимые заместители органических соединений. В широком аспекте, допустимые заместители включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Иллюстративные примеры заместителей включают, например, заместители, перечисленные выше по тексту. Подходящие органические соединения могут включать один или несколько заместителей, и эти заместители могут быть одинаковыми или различными. Для целей настоящего изобретения, гетероатомы, например, азот, могут быть замещены водородом и/или любыми допустимыми заместителями органических соединений, описанными в тексте заявки, которые насыщают валентность указанных гетероатомов. Имеется в виду, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо образом допустимыми заместителями органических соединений.

Для целей настоящего изобретения, химические элементы идентифицируются в соответствии с Периодической таблицей элементов, версия CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67^th Ed., 1986-87, на развороте обложки. Также для целей настоящего изобретения считается, что термин "углеводород" включает все возможные соединения, содержащие по крайней мере один атом водорода и один атом углерода. В широком аспекте, возможные углеводороды включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические органические соединения, которые могут быть замещенными или незамещенными.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" известен в технике и относится к относительно нетоксичным неорганическим и органическим кислотно-аддитивным солям соединений, в том числе, например, входящих в композиции по настоящему изобретению.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" известен в технике и относится к фармацевтически приемлемым материалам, композициям или носителям, например, жидким или твердым наполнителям, разбавителям, эксципиентам, растворителям или инкапсулирующим материалам, принимающим участие в переносе или транспортировке любой композиции по настоящему изобретению или ее компонента из одного органа или части организма в другой орган или часть организма. Каждый из носителей должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с композицией по настоящему изобретению и ее компонентами, и отсутствия вредоносности для пациента. Некоторые примеры материалов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают (1) сахара, например лактозу, глюкозу и сахарозу; (2) крахмалы, например кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, например натрий карбоксиметил целлюлозу, этилцеллюлозу и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) такие экципиенты, как масло какао

- 4 030762

и воски для суппозиториев; (9) масла, например арахисовое масло, масло семян хлопчатника, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, например пропиленгликоль; (11) полиолы, например глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, например этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, например гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатный буферный солевой раствор и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах.

Соединения.

Соединения, предназначенные для применения в одном или нескольких способах по настоящему изобретению, включают соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, энантиомеры или стереоизомеры

где каждый из заместителей R¹ и R² независимо выбран из группы, состоящей из H и Cl_-6алкила; или R¹ и R² совместно с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать ароматический или алифатический цикл, состоящий из 5 или 6 атомов;

заместители Y и Z независимо выбраны из группы, состоящей из H, OH, COOH, -OR³, -CH(OR₃)COOH; и

заместитель R³ выбран из группы, состоящей из H, фенила, бензила, винила, аллила, ^^алкила или ^^алкила, замещенного одним или несколькими атомами галогена;

или его фармацевтически приемлемую соль.

Подходящие Cl_-6алкильные фрагменты могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из метила, этила, пропила, пентила и гексила. Алкильный фрагмент может быть линейным или разветвленным. Особенно предпочтительными алкильными группами являются метил и этил, и наиболее предпочтительной алкильной группой является метил.

В одном из вариантов осуществления Y может означать H или COOH. Например, Y может означать H, и Z может означать CH(OR³)COOH, или Y может означать COOH, и Z может означать -OR³. В некоторых вариантах осуществления R³ может представлять метил, этил, н-пропил или изопропил.

В других вариантах осуществления фрагмент NR¹R² формулы (I) может находиться в положении 4' или в положении 3'. В некоторых вариантах осуществления R¹ и R² представляют собой атомы Н.

В некоторых вариантах осуществления подходящим заместителем R₃ может являться Н.

Типовые примеры соединений включают также соединения формул (IIa) или (IIb) или их фармацевтически приемлемые соли, энантиомеры или стереоизомеры

где заместители R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из H и Cl_-6алкила; или R¹ и R² совместно с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать ароматический или алифатический цикл, состоящий из 5 или 6 атомов;

заместитель R⁶ выбран из группы, состоящей из -NR⁹OH, ОН и -OR⁹;

R⁹ означает ^^алкил;

заместитель R⁴ выбран из группы, состоящей из H, галогена, фенила, бензила, винила, аллила, C_1-6алкила и C_1-6алкила, замещенного одним или несколькими атомами галогена;

заместители R⁵ и R⁷ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода или галогена, или R⁴ и R⁵, или R⁴ и R⁶ совместно образуют конденсированный гетероцикл, состоящий из 5 или 6 атомов, необязательно замещенный галогеном или ('ндгакилом; и

А представляет собой конденсированный гетероцикл; или его фармацевтически приемлемую соль.

Подходящие C_1-6алкильные фрагменты могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из метила, этила, пропила, пентила и гексила. Алкильный фрагмент может быть линейным или разветвленным. Особенно предпочтительными алкильными группами являются метил и этил, и наиболее предпочтительной алкильной группой является метил.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент NR¹R² соединения (IIa) может находиться в положении 4' или в положении 3'. В некоторых вариантах осуществления заместители R¹ и R² представляют собой атомы H. В некоторых вариантах осуществления R⁹ может представлять собой метил, этил, нпропил или изопропил.

В некоторых вариантах осуществления соединение по настоящему изобретению может быть пред- 5 030762

ставлено формулами

где p означает 1 или 2;

заместитель R⁶ выбран из группы, состоящей из ОН или -OR⁹, где R⁹ соответствует данному выше определению; и

заместитель R¹⁰ в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из H, галогена или О_1-6алкила, например метила или этила.

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет, по меньшей мере частично, соединения приведенных ниже формул, для применения в раскрытых способах.

Например, изобретение относится к применению в раскрытых способах соединений формулы (III)

где X означает О₁-О₃-алкилен, необязательно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из галогена или гидроксила;

заместитель R₁ выбран из группы, состоящей из О₁-О₆-алкила, О₃-О₆-циклоалкила, О₂-О₆-алкенила и О₂-О₆-алкинила;

заместитель R₂ выбран из группы, состоящей из водорода и О₁-О₆-алкила;

заместитель R₃ в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₆алкокси, ^-^-алкила, циано, ^-^-циклоалкила, галогена, гидроксила и нитро;

заместитель R₄ выбран из группы, состоящей из водорода и ^-^-алкила;

заместитель R₅ представляет собой Ci-Ce-алкил;

или из их фармацевтически приемлемых солей или N-оксидов.

В некоторых вариантах осуществления подходящий заместитель R₅ может представлять собой атом H.

Подходящие ^^алкильные фрагменты могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из: метила, этила, пропила, пентила и гексила. Алкильный фрагмент может быть линейным или разветвленным. Особенно предпочтительными алкильными группами являются метил и этил, и наиболее предпочтительной алкильной группой является метил.

В одном из вариантов осуществления заместитель R₁ в формуле (III) может представлять собой ^^алкил, например метил. В одном из вариантов осуществления R₂ может быть водородом. В другом варианте осуществления заместитель R3 может быть выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C6алкила, галогена и гидроксила. В другом варианте осуществления R₃ может являться водородом. В одном из вариантов осуществления каждый из заместителей R₄ и R₅ может представлять собой ^-^-алкил. В другом варианте осуществления R₄ может являться водородом и R₅ может быть метилом. В одном из вариантов осуществления фрагмент X может представлять собой группу (CH₂)_n, где n означает 1 или 2, например 1.

В другом варианте осуществления фрагмент -NR₂-COR₁ формулы (III) может находиться в метаили пара-положении относительно группы X, что представлено формулами (IIIa) и (IIIb)

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет соединения приведенной ниже формулы (IV), которые могут применяться в раскрытых в патенте способах, например

- 6 030762

где заместитель Ri выбран из группы, состоящей из Ci-Сб-алкила, С₃-С₆-циклоалкила, C₂-C₆алкенила и ^-^-алкинила;

заместитель R₂ выбран из группы, состоящей из водорода и ^-^-алкила;

заместитель R₃ в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₆алкокси, ^-^-алкила, циано, ^-^-циклоалкила, галогена, гидроксила и нитро;

заместитель R₅ представляет собой водород или CrQ-алкил; а также их фармацевтически приемлемые соли или N-оксиды.

Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям приведенной ниже формулы (V)

где заместитель R₁ выбран из группы, состоящей из G-Cs-алкила, ^-^-циклоалкила, C₂-C₆алкенила и ^-^-алкинила;

заместитель R₃ в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₆алкокси, ^-^-алкила, циано, ^-^-циклоалкила, галогена, гидроксила и нитро;

заместитель R4 выбран из группы, состоящей из водорода и ^-^-алкила; заместитель R₅ представляет собой водород или Q-Q-алкил; и

фрагмент А представляет собой конденсированный пяти или шестичленный гетероцикл; а также к их фармацевтически приемлемым солям или N-оксидам указанных соединений.

В одном из вариантов осуществления R₁ может представлять собой CrQ-алкил, например метил. В

другом варианте осуществления каждый из заместителей R₁ и R₃ может представлять собой Q-Q-алкил, например метил. В одном из вариантов осуществления R₂ может являться водородом.

В некоторых вариантах осуществления соединение по настоящему изобретению может быть представлено формулами

где p означает 1 или 2;

заместитель R₁ выбран из группы, состоящей из CrGs-алкила, C₃-C₆-циклоалкила, ^-^-алкенила и ^-^-алкинила;

каждый из заместителей R₄ и R₈ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C₁-C₆алкила;

или соединение по настоящему изобретению представляет собой фармацевтически приемлемую соль или N-оксид указанного соединения.

Например, в одном из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, подходящие для применения в раскрытых способах, включают соединения формулы А

где заместитель R₁₀ выбран из группы, состоящей из H и ^-^-алкила (например, метила); заместитель R₁₁ выбран из группы, состоящей из H, Q-Cs-алкила и группы -C(O)-C₁-C₆-алкил (на- 7 030762

пример, R₁₁ может представлять собой H, метил, -С(О)-метил или -С(О)-этил);

заместитель R₅ представляет собой Cl-C6-алкил (например, R₅ может являться метилом, этилом или

пропилом);

или их фармацевтически приемлемые соли или N-оксиды.

Например, предусмотрено применение в способах по настоящему изобретению соединений формул А' и А":

Типовые примеры соединений, предусмотренных в настоящем изобретении для применения в раскрытых способах, включают:

или их фармацевтически приемлемые соли.

В некоторых вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению включают:

4- амино-^гидрокси-2-метоксибензамид (соединение 13);

6-метокси хинолин-5-карбоновую кислоту (соединение 36);

6-метокси-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-5-карбоновую кислоту (соединение 37) и

5- диизопропиламиносалициловую кислоту (соединение 38).

Другие типовые примеры соединений включают следующие вещества:

Соединения по настоящему изобретению включают рацемические смеси и энантиомеры соединений, например:

(±)-2-гидрокси-3-(3'-аминофенил)пропионовую кислоту (соединение 20); (±)-2-метокси-2-(4'-аминофенил)уксусную кислоту (соединение 23); (±)-2-этокси-2-(3'-аминофенил)уксусную кислоту (соединение 32); (±)-2-этокси-2-(4'-аминофенил)уксусную кислоту (соединение 33); (±)-2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту (соединение 34);

- 8 030762

±соединение 34 (рацемическую форму);

(±)-2-этокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту (соединение 39);

(±)-2-этокси-3-(3'-аминофенил)пропионовую кислоту (соединение 40).

Например, соединения, применяемые в способах по настоящему изобретению, могут представлять собой энантиомеры следующих рацемических смесей:

(И,Б)-2-гидрокси-2-(3-аминофенил)уксусной кислоты (соединения 10);

(И,Б)-2-гидрокси-2-(4-аминофенил)уксусной кислоты (соединения 11);

(И,Б)-2-гидрокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты (соединения 21);

(И,Б)-2-метокси-2-(3'-аминофенил)уксусной кислоты (соединения 22);

(И,Б)-2-метокси-3-(3'-аминофенил)пропионовой кислоты (соединения 35);

(И,Б)-2-метокси-3-(4-аминофенил)пропионовой кислоты (соединения 34), а также энантиомеры, например,

(+)2-Б-метокси-3-(4-аминофенил)пропионовой кислоты;

(-)2-И-метокси-3 -(4-аминофенил)пропионовой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления предпочтительными соединениями являются (R,S)-2гидрокси-3-(4'-аминофенил)пропионовая кислота (соединение 21) или (±)-2-гидрокси-3-(3'аминофенил)пропионовая кислота (соединение 20).

Другие типы рацемических смесей соединений по настоящему изобретению включают, например:

(±)-2-гидрокси-2-(3'-аминофенил)уксусную кислоту (соединение 10);

(±)-2-гидрокси-2-(4'-аминофенил)уксусную кислоту (соединение 11);

(±)-2-гидрокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту (соединение 21) и

(±)-2-метокси-2-(3'-аминофенил)уксусную кислоту (соединение 22).

Другие соединения, применение которых предусмотрено в способах по настоящему изобретению, включают

5-аминосалицил-гидроксамовую кислоту (соединение 5);

3- диметиламиносалициловую кислоту (соединение 6);

2-метокси-4-аминобензойную кислоту (соединение 7);

2-метокси-5-аминобензойную кислоту (соединение 8);

5- метиламиносалициловую кислоту (соединение 9);

4- метиламиносалициловую кислоту (соединение 12);

4-ацетиламиносалициловую кислоту (соединение 16);

2-этокси-4-аминобензойную кислоту (соединение 18);

2-этокси-5-аминобензойную кислоту (соединение 19);

4-диметиламиносалициловую кислоту (соединение 24);

2-этокси-4-аминобензоилгидроксамовую кислоту (соединение 25);

6- гидроксихинолин-5-карбоновую кислоту (соединение 27);

2-(2-пропил)окси-4-аминобензойную кислоту (соединение 30);

4- (1-пиперазинил)салициловую кислоту (соединение 41);

ЩЛ)-5-оксахинолин-6-карбоновую кислоту (соединение 15);

6-метоксихинолин-5-карбоновую кислоту (соединение 36);

6-метокси-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-5-карбоновую кислоту (соединение 37);

5- диизопропиламиносалициловую кислоту (соединение 38); и

4-диизопропиламиносалициловую кислоту (соединение 42).

Соединения по настоящему изобретению и фармацевтические композиции, включающие как минимум одно соединение, могут быть выбраны из группы, состоящей из

Ы-ацетил-Щ)-(-)-3-(4-аминофенил)-2-метоксипропионовой кислоты,

Ы-ацетил-^)-(-)-3-(4-аминофенил)-2-метоксипропионовой кислоты и рацемической Ы-ацетил-^)-(-)-3-(4-аминофенил)-2-метоксипропионовой кислоты или соединения, выбранного из:

- 9 030762

или их фармацевтически приемлемых солей или N-оксидов.

Другие соединения по настоящему изобретению включают соединение 20, соединение 21, 4ацетамидо-^гидрокси-2-метоксибензамид; 1-ацетил-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-5карбоновую кислоту, 5-ацетамидо-2-гидроксибензойную кислоту (например, ацеталированную 5аминосалициловую кислоту) или их фармацевтически приемлемые соли или N-оксиды.

Кроме того, для применения в способах по настоящему изобретению предусматривается применение композиций, которые включают соединения, представленные приведенными формулами, и, например, фармацевтически приемлемый носитель.

Способы получения соединений по настоящему изобретению можно найти, например, в заявках WO 2007/010516 и WO 2007/010514, каждая из которых включена в настоящее изобретение в полном объеме посредством ссылки.

Способы

Частью настоящего описания являются способы профилактики или лечения фиброза, например, фиброза печени и/или фиброза кишечника. Эти способы могут включать введение пациенту, которому это необходимо, или для которого существует риск заболевания, фармацевтических препаратов, включающих PPARy-агент, например, соединение, раскрытое в настоящем изобретении, например, соединение формулы I, IIa или IIb, например, соединения 17, 29, 34 или 39. Например, в изобретении предложен способ профилактики или лечения фиброза печени, включающий введение пациенту, которому это необходимо, соединения по настоящему изобретению. В качестве альтернативы, в изобретении предложен способ профилактики или лечения фиброза кишечника, включающий введение пациенту, которому это необходимо, соединения по настоящему изобретению.

Пациенты, которых лечат с применением указанного выше способа, могут иметь или не иметь обнаруживаемого фиброза. В некоторых вариантах осуществления у пациента наблюдается уменьшение уровня имеющегося фиброза, как минимум, примерно на 5, 10, 20, 30, 40 или даже на 50% или более после введения соединений по настоящему изобретению, например, соединений 17, 29, 34 или 39, через, например, 1, 2 дня, 1 неделю, 1 месяц или 6 месяцев или более. Введение упомянутого соединения может осуществляться, например, по меньшей мере, на ежедневной основе. Соединения могут вводиться перорально. Отсрочка клинических проявлений фиброза у пациента вследствие введения соединений по настоящему изобретению может составлять как минимум, например, 6 месяцев, 1 год, 18 месяцев или даже 2 года или более, по сравнению с пациентом, которому не вводили упомянутое соединение, например, соединение по настоящему изобретению.

У пациента, которому необходимо лечение, может иметься фиброз печени, который перешел в цирроз. Пациенты, у которых имеется риск возникновения фиброза печени, могут включать пациентов с гепатитом В, гепатитом С или неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ). НАСГ входит в круг заболеваний, связанных с неалкогольным жировым перерождением печени, включающий стеатоз и цирроз. НАСГ яв- 10 030762

ляется составной частью метаболического синдрома, который характеризуется ожирением, сахарным диабетом II типа и дислипидимией, и может постепенно приводить к гепатоклеточной карциноме.

В настоящем изобретении предложены также способы лечения расстройств, связанных с фиброзом печени, например, лечения по меньшей мере одного заболевания из числа некоторых болезней накопления и врожденных нарушений метаболизма, например, дефицита альфа 1-антитрипсина, болезней накопления меди (например, болезни Вильсона), фруктоземии, галактоземии, болезней накопления гликогена (например, III, IV, VI и X типов), синдромов перенасыщения железом (например, гемохроматоза), липидных аномалий (например, болезни Гоше), пероксисомных расстройств (например, синдрома Цельвегера) и тирозинемии; бактериальных инфекций (например, бруцеллеза); паразитарных инфекций (например, эхинококкоза); НАСГ; вирусных инфекций (например, гепатита В или гепатита С, включая хронический гепатит В или С); синдрома Бадда-Киари; сердечной недостаточности; заболеваний, связанных с окклюзией печеночных вен; и тромбоза воротной вены. Помимо этого, изобретение относится к способам лечения врожденного фиброза печени. Композиции, применяемые в этих способах, можно вводить перорально.

Изобретение охватывает также способы лечения наркотической и/или алкогольной зависимости, в случае, если эта зависимость приводит к фиброзу печени. В изобретении предусмотрены способы лечения фиброза печени у пациента с историей наркотической и/или алкогольной зависимости. Например, пациента с историей зависимости по крайней мере от одного из следующих веществ: спирта, амиодарона, хлорпромазина, изониазида, метотрексата, метилдопы, оксифенизатина и толбутамида.

Пациенты с риском фиброза кишечника могут включать пациентов с язвенным колитом, воспалительной болезнью кишечника или болезнью Крона. Пациенты с риском фиброза кишечника могут также включать пациентов раннего возраста, у которых диагностирована болезнь Крона или колит, обширное и/или тяжелое заболевание ободочной кишки, пациентов с первичным склерозирующим холангитом и/или пациентов со случаями заболевания раком в семье.

В изобретении предложены также способы лечения расстройств, связанных с фиброзом кишечника, например, лечения как минимум одного заболевания из числа язвенного колита, воспалительной болезни кишечника или болезни Крона.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам профилактики или лечения фиброза почек, фиброза сердца, эндомиокардиального фиброза, идиопатического фиброза легких, миелофиброза, забрюшинного фиброза или нефрогенного системного фиброза, включающим введение пациенту, которому это необходимо, фармацевтического препарата, включающего PPARy агент, например, соединение, раскрытое в настоящем изобретении.

Соединения по настоящему изобретению могут применяться индивидуально или в комбинации друг с другом, когда как минимум два соединения по настоящему изобретению применяются совместно в одной композиции или в качестве составных частей схемы лечения. Соединения по настоящему изобретению могут также применяться в комбинации с другими лекарственными средствами для лечения наркотической и/или алкогольной зависимости, фиброза почек, фиброза сердца, эндомиокардиального фиброза, идиопатического фиброза легких, миелофиброза, забрюшинного фиброза или нефрогенного системного фиброза.

Как правило, терапевтически эффективное количество действующего компонента будет находиться в диапазоне от примерно 0,1 мг/кг до примерно 100 мг/кг, необязательно от примерно 1 мг/кг до примерно 100 мг/кг, необязательно от примерно 1 мг/кг до 10 мг/кг. Вводимое количество будет зависеть от таких параметров, как тип и степень заболевания или симптома, который предполагается лечить, общее состояние здоровья конкретного пациента, относительной биологической эффективности доставленного связывающего белка, состава связывающего белка, наличия и типов эксципиентов, входящих в состав, а также пути введения. Первоначально введенная доза может превышать верхние указанные уровни для быстрого достижения желаемых уровней действующего вещества в крови или ткани, или же первоначальная дозировка может быть меньше оптимальной, причем дневную дозировку можно последовательно увеличивать во время курса лечения, в зависимости от конкретной ситуации. Дозировку препарата для людей можно оптимизировать, например, путем стандартного повышения дозировок во время фазы 1 клинического исследования с охватом дозировок от 0,5 мг/кг до 20 мг/кг. Частоту введения препарата можно менять в зависимости от таких факторов как путь введения, вводимое количество и состояние или заболевание, подвергаемое лечению. Типовой частотой введения является введение один раз в день, один раз в неделю и один раз каждые две недели.

Составы или композиции по настоящему изобретению включают раскрытые в заявке соединения, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от намеченной цели их применения, что хорошо известно в технике. Например, если композицию по настоящему изобретению предполагается вводить перорально, ей можно придать форму таблеток, капсул, гранул, порошков или сиропов. В качестве альтернативы, составы по настоящему изобретению можно вводить парентерально в форме инъекций (внутривенных, внутримышечных или подкожных), препаратов для капельных инфузий или суппозиториев. Для введения через слизистую оболочку глаза, композициям

- 11 030762

по настоящему изобретению можно придать форму глазных капель или глазных мазей. Эти составы можно получать с применением стандартных средств и, если это желательно, композиции можно смешивать с любыми традиционными добавками, например, эксципиентами, связующими веществами, дезинтегрирующими агентами, смазывающими веществами, корригирующими веществами, солюбилизирующими агентами, суспендирующими средствами, эмульгирующими агентами или покрывающими агентами.

В составах по настоящему изобретению могут присутствовать такие вспомогательные агенты, как смачивающие агенты, эмульгаторы и смазывающие вещества, например, лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, агенты, способствующие высвобождению, покрывающие агенты, подсластители, вкусовые и ароматические агенты, консерванты и антиоксиданты.

Композиции по настоящему изобретению могут быть предназначены для перорального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), ректального, вагинального, аэрозольного и/или парентерального введения. Удобно получать составы в виде дозированных лекарственных форм, и эти формы можно получать любыми способами, хорошо известными в фармацевтической области техники. Количество композиции, которую можно смешать с носителем для получения одной единицы дозированной формы, меняется в зависимости от подвергаемого лечению субъекта и конкретного пути введения.

Способы получения этих составов включают стадию смешивания композиции по настоящему изобретению с носителем и, необязательно, одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Как правило, составы получают путем однородного и тщательного смешивания агентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или носителями обоих типов, с последующим приданием продукту соответствующей формы, если это необходимо.

Составы, подходящие для перорального введения, могут иметь форму капсул, крахмальных капсул, пилюль, таблеток, леденцов (в которых используется вкусоароматическая основа, обычно сахароза и гуммиарабик или трагакант), порошков, гранул, или растворов или суспензий в водных или неводных жидкостях, или жидких эмульсий масло-в-воде или вода-в-масле, или эликсира или сиропа, или пастилок (в которых применяется инертная основа, такая как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик), каждая единица которых содержит заранее установленное количество соединения по настоящему изобретению в качестве действующего ингредиента. Композиции по настоящему изобретению можно также вводить в форме болюсов, электуария или пасты.

В твердых дозированных формах для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, таблеток с пленочным покрытием, таблетках с сахарным покрытием, порошках, гранулах и т.п.), композиции по настоящему изобретению смешаны с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, например, цитратом натрия или дикальций фосфатом и/или любым из следующих компонентов: (1) наполнителями или увеличителями объема, например, крахмалами, лактозой, сахарозой, глюкозой, маннитом и/или кремниевой кислотой; (2) связующими веществами, например, карбоксиметилцеллюлозой, альгинатами, желатином, поливинилпирролидоном, сахарозой и/или гуммиарабиком; (3) увлажнителями, например, глицерином; (4) дезинтегрирующими агентами, например, агар-агаром, карбонатом кальция, крахмалом картофеля или маниока, альгиновой кислотой, некоторыми силикатами и карбонатом натрия; (5) агентами, замедляющими растворение, например, парафином; (6) ускорителями абсорбции, например, соединениями четвертичного аммония; (7) смачивающими агентами, например, этиловым спиртом и моностеаратом глицерина; (8) абсорбентами, например, каолином и бентонитовой глиной; (9) смазывающими средствами, например, тальком, стеаратом кальция, стеаратом магния, твердыми полиэтиленгликолями, лаурилсульфатом натрия и их смесями; и (10) красящими агентами. В случае капсул, таблеток и пилюль композиции могут включать также буферные агенты. Твердые композиции аналогичного типа могут также применяться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с применением таких эксципиентов, как лактоза или молочные сахара, а также полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы и т.п.

Составы и композиции могут включать тонкоизмельченные кристаллы соединений по настоящему изобретению. Можно осуществлять измельчение кристаллов индивидуальных соединений или смеси кристаллов соединения по настоящему изобретению с фармацевтическими эксципиентами или носителями, или их частью. Средний размер частиц тонкоизмельченных кристаллов по настоящему изобретению может составлять, например, от примерно 5 до примерно 200 мкм или от примерно 10 до примерно 110 мкм.

Таблетки можно получать прессованием или формованием, необязательно с применением одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Прессованные таблетки можно получать с применением связующих веществ (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), смазывающих веществ, инертных разбавителей, консервантов, дезинтегрирующих веществ (например, натрий крахмал гликолята или поперечно-сшитой натрий карбоксиметилцеллюлозы), поверхностно-активных или диспергирующих агентов. Формованные таблетки можно получать формованием в подходящем агрегате смеси соединения по настоящему изобретению, смоченной инертным жидким разбавителем. Таблетки и другие твердые дозированные формы, например, таблетки с пленочным покрытием или таблетки с сахарным покрытием, капсулы, пилюли и гранулы могут необязательно иметь насечки или снабжены покрытиями и оболочка- 12 030762

ми, например, кишечнорастворимыми покрытиями и другими покрытиями, хорошо известными в технике получения фармацевтических составов.

Жидкие дозированные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Помимо соединения по настоящему изобретению, жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, традиционно применяемые в технике, как, например, воду или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, например, этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, циклодекстрины и их смеси.

Суспензии, помимо композиции по настоящему изобретению, могут содержать суспендирующие агенты, например, этоксилированные изостеариловые спирты, эфиры полиоксиэтилена и сорбита и сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также их смеси.

Составы для ректального или вагинального введения могут иметь форму суппозиториев, которые можно получать смешиванием соединения по настоящему изобретению с одним или несколькими подходящими не раздражающими эксципиентами или носителями, в том числе, например, маслом какао, полиэтиленгликолем, воском или салицилатом для суппозиториев, которые являются твердыми при комнатной температуре, но жидкими при температуре тела и, следовательно, будут плавиться в полостях организма и высвобождать действующий агент. Составы, которые подходят для вагинального введения, включают также пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи, содержащие носители, которые считаются подходящими в фармацевтической технике.

Дозированные формы для трансдермального или местного введения соединения по настоящему изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и составы для ингаляции. Действующий компонент можно смешать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем, а также с любыми необходимыми консервантами, буферами или пропеллентами.

Помимо соединения по настоящему изобретению, мази, пасты, кремы и гели могут содержать такие эксципиенты, как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и оксид цинка, или их смеси.

Порошки и спреи могут содержать, в дополнение к соединению по настоящему изобретению, такие эксципиенты, как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок, или смеси этих веществ. Спреи могут дополнительно содержать стандартные пропелленты, например, хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, например, бутан и пропан.

В качестве альтернативы, композиции и соединения по настоящему изобретению можно вводить в форме аэрозолей. Такое введение осуществляется путем получения аэрозолей на водной основе, липосомальных препаратов или твердых частиц, содержащих соединение по настоящему изобретению. Можно применять не водные суспензии (например, включающие фторуглеродный пропеллент). Можно применять ультразвуковые ингаляторы, поскольку в них осуществляется минимальное механическое воздействие на лекарственный агент, которое может приводить в разрушению соединений, содержащихся в композициях по настоящему изобретению.

Как правило, водные аэрозоли получают путем формирования водного раствора или суспензии композиции по настоящему изобретению в комбинации с традиционными фармацевтически приемлемыми носителями и стабилизаторами. Можно менять носители и стабилизаторы в соответствии с требованиями к конкретной композиции по настоящему изобретению, но, как правило, эти компоненты включают неионные ПАВ (Tweens, Pluronics или полиэтиленгликоль), нетоксичные белки, например, альбумин сыворотки, сложные эфиры сорбитана, олеиновую кислоту, лецитин, аминокислоты, например, глицин, буферы, соли, сахара или сахарные спирты. Как правило, аэрозоли получают из изотонических растворов.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые подходят для парентерального введения, включают собственно композицию в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильные порошки, которые можно восстановить до стерильных растворов или дисперсий для инъекции непосредственно перед применением, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства, растворенные компоненты, которые делают состав изотоничным крови намеченного реципиента, или суспендирующие или загущающие агенты.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, например, оливковое масло, и подходящие для инъекций органические сложные эфиры, например, этилолеат и

- 13 030762

циклодекстрины. Необходимую текучесть состава можно поддерживать, например, применением покрывающих материалов, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий, а также применением ПАВ. Эффективность лечения композициями по настоящему изобретению можно определить рядом способов, известных специалисту в данной области техники.

В тексте настоящего описания, если указано, что композиция имеет, включает или содержит определенные компоненты, имеется в виду, что композиция также состоит в основном из или состоит из упомянутых компонентов. Аналогично, если указано, что способ имеет, включает или содержит определенные стадии, этот способ также состоит в основном из, или состоит из упомянутых стадий. За исключением случаев, когда указано иное, порядок стадий или порядок осуществления определенных действий является несущественным, если изобретение остается работоспособным. Кроме того, если не указано иное, две или несколько стадий или операций могут осуществляться одновременно.

Примеры

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Эти примеры приведены только с иллюстративными целями, и не следует считать, что они каким-либо образом ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1: исследование фиброза печени.

Фиброз печени вызывали у самцов мышей С57Ы6 (Charles River, l'Arbresle, France) инъекцией четыреххлористого углерода (CCl₄). Перед экспериментом мышей С57Ы6 массой 22-25 содержали в лабораторных условиях в течение 1 недели. Животных расселяли по 5 особей в клетке, причем пища и вода были доступны без ограничений.

В исследовании было задействовано 5 тестовых групп (см. табл. 1): контрольная группа с принудительным пероральным введением (CG), контрольная группа с интраперитонеальным введением (CIP), группа, получавшая четыреххлористый углерод (CCl₄), группы, получавшие соединение 34 и JWH-133 (см. Julien et al. (2005), Gastroenterology 128: 742-755 (для ознакомления с JWH-133, CB2-специфичным агонистом и антифиброгенным агентом)).

Таблица 1

Тестовая	группа	Вводимые препараты	Схема введения
Контроль,		Раствор	Ежедневно	в
принудительное	карбоксиметилцеллюлозы	течение	>5
пероральное		(носитель для	недель
введение (5	мышей)	принудительного
		перорального введения) и
		оливковое масло
		(носитель для СС14)
Контроль,		ДМСО/Tween (носитель для	Ежедневно	в
интраперитонеальное	JWH-133) и оливковое	течение	>5
введение (5	мышей)	масло (носитель для	недель
		СС14)
Четыреххлористый	СС14 в оливковом масле	3 раза	в
углерод (10	мышей)	вводили	неделю (каждые
		интраперитонеальным	два дня)	в
		путем (200 мкл)	течение	>5
			недель
Соединение	34 (10	30 мМ раствор соединения	34: Ежедневно
мышей)		34 в 0,5% СМС вводили	в течение	>5
		путем перорального	недель;
		принудительного	СС14: 3 раза	в
		кормления (2 00 мкл) , и	неделю	в
		СС14 в оливковом масле	течение	>5

- 14 030762

	вводили интраперитонеальным путем (200 мкл)	недель
Агент	JWH-133	(10	3 мг/кг JWH-133 в	JWH: Ежедневно
мышей)			ДМСО/Tween вводили	в течение	>5
			интраперитонеальным	недель;
			путем (100 мкл), и CCL4	СС14: 3 раза	в
			в оливковом масле	неделю	в
			вводили	течение	>5
			интраперитонеальным	недель
			путем (200 мкл)

Оценивали эффективность соединения 34 (специфичный лиганд PPARg) по сравнению с JWH-133 (антифиброгенным агентом). Соединение 34 вводили перорально в комбинации с инъекциями CCl₄ в течение примерно 5 недель. Соединение 34 вводили ежедневно в количестве 200 мкл 30 мМ раствора. JWH-133 вводили ежедневно путем интраперитонеальной инъекции в количестве 3 мг/кг (объем инъекции=100 мкл). Модельный фиброз печени вызывали постоянным действием возрастающих доз CCl₄ в течение 5 недель. На первой неделе мыши получали интраперитонеальную инъекцию CCl₄, суспендированного в оливковом масле в дозировке 80 мкл/кг массы животного два раза в неделю. В течение 2-й недели осуществляли 3 инъекции CCl₄ в дозировке 160 мкл/кг один раз в два дня. В течение 3-й недели осуществляли 3 инъекции CCl4 в дозировке 240 мкл/кг один раз в два дня. В течение 4-й недели осуществляли 3 интраперитонеальные инъекции CCl₄ в дозировке 320 мкл/кг один раз в два дня. На 5-й неделе через 3 дня после последнего введения CCl4 мышей подвергали эвтаназии.

Во время проведения эксперимента регистрировали массу тела животных. Как видно на фиг. 1, не существует заметной разницы между изменением массы тела в разных группах мышей.

Извлекали печень животных, осуществляли быструю заморозку аликвот ткани печени в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализа. Часть печени каждого животного фиксировали в 10% формалине для гистологического исследования.

Пример 2: гистологический анализ в исследовании фиброза печени.

Фиксированную в формалине ткань печени подвергали необходимой обработке и парафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е), а также обрабатывали красителем пикросириус красный (специфическое окрашивание для выявления коллагена на срезах тканей) для оценки степени фиброза в печени. Каждый препарат оценивали три различных исследователя, не имевших сведений о его происхождении, для количественного определения степени фиброза в каждой доле печени (5), используя шкалу Metavir (см. фиг. 2А, на которой приведен график результатов по шкале Metavir). Фотографические изображения, показанные на фиг. 2В, получали с помощью 20х объектива. Контрольная группа имела результат F0, и группа, получавшая CCl₄, продемонстрировала результат F3, который указывает на наличие фиброза печени. Соединение 34 (GED) продемонстрировало более сильное уменьшение фиброза, по сравнению с группой JWH-133, с результатами соответственно F1 для соединения 34 и F2 для JWH-133.

Как и ожидалось, фиброз не наблюдался в двух группах контрольных мышей (контрольное принудительное пероральное введение носителей (CG) и контрольное IP введение носителей (CIP)). В группе мышей с фиброзом (группа CCl₄), получавших только носитель, был зарегистрирован средний результат 2,5±0,5, соответствующий фиброзу в степени от умеренной до тяжелой согласно шкале Metavir (см. фиг. 3А). Для мышей с фиброзом, получавших JWH-133 или соединение 34 (GED), были зафиксированы результаты 2±0 и 2,1±0,2 соответственно. Для обоих препаратов, т.е. JWH-133 и GED, наблюдалось уменьшение степени фиброза с тяжелой до умеренной с примерно аналогичной эффективностью.

Эти результаты подтверждали с использованием адаптированной шкалы Metavir (фиг. 3В); каждый срез печени анализировали 2 исследователя, не имевших сведений о его происхождении, с целью количественной оценки при низком увеличении (х5) более 30 препаратов портальных трактов, классифицированных по шкале Metavir от F0 до F4 (результат (для 1 среза) X(PTF1 + PTF2 + PTF3 + PTF4)). С использованием полученных результатов было продемонстрировано, что JWH и GED понижали степень фиброза на 14,2% и 12,5% соответственно, по сравнению с животными, не получавшими препаратов, и что терапевтическое действие двух протестированных веществ было приблизительно одинаковым.

Пример 3: анализ экспрессии генов в исследовании фиброза печени.

Определяли влияние введения соединения 34 (GED) и специфичного агониста СВ2 (JWH-133) на уровень экспрессии генов цитокинов (IL-1 β, TNF-α) и генов, вовлеченных в механизм развития фиброза, с помощью реакции PCR в режиме реального времени.

РНК полностью изолировали из печени, используя набор Rneasy (Macherey Nagel, Hoerdt, France) согласно инструкции производителя. Количественное определение РНК осуществляли с использованием

- 15 030762

спектрофотометрии. После обработки при 37°C в течение 30 мин 20-50 единицами DNase 1 (дезоксирибонуклеазы 1), не содержащей RNase (рибонуклеазы) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA), использовали олиго-dT праймеры (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) для синтеза одноцепочечной кДНК. Количественное определение мРНК осуществляли с использованием смеси SYBR green Master Mix (Applera, Courtaboeuf, France) со специфичными для мышей олигонуклеотидами (см. табл. 2) в термоциклере GeneAmp Abiprism 7000 (Applera, Courtaboeuf, France). В каждый анализ включали калиброванные и не содержащие матрицы контрольные образы. Для каждого образца проводили три параллельных анализа. Интенсивность красителя SYBR green определяли с помощью программного обеспечения Abiprism 7000 SDS (Applera, Courtaboeuf, France). Все результаты нормализовали по конститутивному гену β-актина, не вовлеченному в аналитические реакции.

Таблица 2

Мышиные гены	Последовательности праймеров (5' -У ')
β-актин	F:5’-gggTCAgAAggATTCCTATg-3’ (SEQ ID NO: 1) R: 5’-ggTCTCAAACATgATCTggg-3’ (SEQ ID NO: 2)
TNF-a	F:5’-TgggAgTAgACAAggTACAACCC-3’ (SEQ ID NO: 3) R:5’ CATCTTTCTCAAAATTCgAgTgACAA-3’ (SEQ ID NO: 4)
IL-Ιβ	F:5’-gATCCACACTCTCCAgCTgCA-3’ (SEQ ID NO: 5) R:5’-CAACCAACAAgTgATATTCTCCATg-3’ (SEQ ID NO: 6)
коллаген-1	F: 5’- GAG TAC TGG АТС GAC CCT AAC CAA -3’ (SEQ ID NO: 7) R: 5’- АСА CAG GTC TGA CCT GTC TCC AT -3’ (SEQ id no: 8)
a-SMA	F: 5’- CCT GAC GGG CAG GTG АТС -3’ (SEQ ID NO: 9) R: 5’- ATG AAA GAT GGC TGG AAG AGA GTC T -3’ (seq id no: ю)

В разных группах мышей не наблюдалось значительных изменений экспрессии генов цитокинов. Что касается генов, вовлеченных в механизм развития фиброза, имело место заметное увеличение экспрессии SMA и коллагена-1 у животных с фиброзом (CCl₄ группа) по сравнению с контрольными животными (CG и CIP группы). Как можно видеть на фиг. 4 и в табл. 3, в группах мышей, получавших GED и JWH-133, имело место понижение уровней α-SMA и коллагена-1 по сравнению с CCl₄ группой (контрольной группой с фиброзом). Что касается уровня коллагена-1, снижение было статистически значимым для группы мышей, получавших соединение 34, по сравнению с мышами, получавшими CCl₄, с результатами, соответственно 42,8±14,81, р=0,03 против 75,15±5,23. Эти биологические данные, наряду с улучшением результатов гистологии у мышей, получавших соединение 34, дают основание предположить, что соединение 34 может иметь терапевтические антифибротические свойства.

Таблица 3

Группа	Коллаген-1	a-SMA
CC14	138,12+34,68	65,51+22,24
JWH-133+CC14	87,59+16,97	30,07+4,7
соединение 34+CCl4	75,15+5,23, p=0,03	42,81+14,81

Пример 4: определение ферментов печени в крови в исследовании фиброза печени.

Оценивали влияние перорального введения соединения 34 (GED) и специфичного агониста СВ2 (JWH-133) на различные биохимические параметры сыворотки мышей, связанные с печенью, а именно: уровни печеночных ферментов (аланинаминотрансферазы (AST) и аспартатаминотрансферазы (ALT)), гамма GT и щелочной фосфатазы.

Как и ожидалось, через 4 дня после последнего введения CCl4, во всех группах мышей не наблюдалось увеличения уровней AST, ALT и Alk P. Соединение 34 не вызывало какого-либо повышения уровней печеночных ферментов в крови, что указывает на отсутствие токсичности для печени.

Согласно данным гистологии и исследования печеночных маркеров, JWH-133 и соединение 34 имеют сходное антифибротическое действие у мышей с фиброзом печени, вызванным многократными инъекциями CCl₄. Как и ожидалось, JWH понижал поражение печени фиброзом на 14% и нормализовал концентрацию мРНК коллагена-1 в печени. Соединение 34 оказывало аналогичное действие, не проявляя токсичности в отношении печени. Эти данные позволяют предположить, что соединение 34 может являться первым соединением, проявляющим как противовоспалительные, так и антифибротические свойства.

Пример 5: исследование фиброза кишечника.

В этом примере описан эксперимент для оценки влияния соединения 34 на фиброз кишечника. Хронический колит вызывали у мышей С57Ы6, осуществляя 3 цикла введения 2,5% DSS (декстран сульфата натрия) (М.масса 40000-50000, TdB consultancy AB, Sweden), растворенного в стерильной питьевой воде в течение 5 дней, с последующим приемом обычной питьевой воды в течение 7 дней.

- 16 030762

В исследовании были задействованы 3 тестовые группы (см. табл. 4): контрольная группа, контрольная группа, получавшая DSS, группа получавшая GED (соединение 34).

Таблица 4

Тестовая группа	Вводимое вещество	Расписание	введения
контрольная	Н2О	Ежедневно	в течение
группа (10		36 дней
мышей)
DSS контрольная	2,5% DSS в питьевой Н2О	5 дней	введение
группа (25		DSS, 7	дней
мышей)		отсутствие	DSS в
		течение 36	дней
соединение 34	осуществляли	соед. 34:	ежедневно
(25 мышей)	пероральное введение 30	в дни 13-36;
	мМ раствора соединения	DSS: 5	дней
	34 в 0,5% СМС с помощью	введение	DSS, 7
	принудительного	дней отсутствие DSS
	кормления (200 мкл) и	в течение	36 дней
	2,5% DSS в питьевой Н2О

Соединение 34 использовали в оптимальной дозировке (30 мМ) и осуществляли пероральное введение путем принудительного кормления ежедневно после второго цикла введения DSS и до момента осуществления эвтаназии. Мышей, получавших DSS, обследовали дважды в неделю, выявляя развитие колита путем наблюдения за массой тела. Эвтаназию мышей осуществляли через одну неделю после третьего цикла введения DSS (см. фиг. 5). Осуществляли посмертное определение размера и массы ободочной кишки мышей.

Пример 6: анализ результатов исследования фиброза кишечника.

A. Соотношение масса/размер ободочной кишки.

Фиброз кишечника характеризуется уменьшением длины и утолщением ободочной кишки, а также образованием спаек. Величина соотношения масса/размер ободочной кишки является индикатором уровня воспаления и фиброза. Как видно на фиг. 6А, статистически значимое увеличение на 124% соотношения масса/размер ободочной кишки наблюдалось у мышей DSS, получавших носитель, по сравнению с контрольными мышами, получавшими только обычную воду, при значениях указанного соотношения соответственно 44,98±6,31 и 20,11±3,91, p<0,05. Эти результаты иллюстрируются существенным сокращением длины ободочной кишки у DSS мышей (фиг. 6В). Соединение 34 вызывает 34% уменьшение профибротического действия DSS, приводя к значительному уменьшению соотношения масса/размер ободочной кишки, при значениях указанного соотношения 38,13±7,82 против 44,98±6,31 (p<0,05), по сравнению с DSS мышами, получавшими только носитель (фиг. 6А). Соответственно, соединение 34 уменьшает морфологические признаки фиброза, такие как уменьшение длины и утолщение ободочной кишки, а также уменьшает отложение коллагена в ободочной кишке (фиг. 6В).

B. Уровень воспаления по данным гистологических исследований.

Отбирали кольцевые образцы поперечного участка ободочной кишки (посмертно), фиксировали в 4% формальдегиде и заливали парафином для гистологического анализа. Срезы (толщиной 4 мкм) окрашивали красителем Мэя-Грюнвальда-Гимзы и проводили мультипараметрическую гистологическую оценку (результат от 0 до 18) с привлечением двух исследователей, которые не были осведомлены о происхождении препаратов. Проведенное окрашивание давало возможность количественной оценки воспаления.

Гистологические баллы, отражающие уровень воспаления, присваивали, исходя из интенсивности клеточного инфильтрата в слизистой оболочке, его распространения в слои подслизистой оболочки и наличия поражений эпителия (см. табл. 5).

- 17 030762

Таблица 5

Сегмент	Балл	Описание
тяжесть	0	нет
	1	легкая степень
	2	умеренная степень
	3	тяжелая степень
распространение	0	нет
	1	слизистая оболочка
	2	слизистая и подслизистая оболочки
	3	сквозное
регенерация	4	нет восстановления тканей
	3	поврежден поверхностный эпителий
	2	регенерация с истощением кишечных крипт
	1	практически полная регенерация
	0	полная регенерация или нормальная ткань
поражение крипт	0	отсутствует
	1	поражена нижняя 1/3
	2	поражены нижние 2/3 не затронут только поверхностный
	3	эпителий
	4	полная утрата крипт и эпителия
процентная доля	1	1-25%
пораженных	2	26-50%
тканей	3	51-75%
	4	76-100%

Степень воспаления оценивали на гистологическом уровне для каждого образца ободочной кишки мыши, используя классическое окрашивание MGG. Как и ожидалось, значительное и сильное воспаление наблюдалось в группе мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольными мышами, получавшими обычную воду, при значениях 3,77±0,80 против 0,50±0,33, p<0,05 (см. фиг. 7). Этот результат подтверждает, что 3 цикла введения DSS вызывают воспаление. Статистически значимое снижение уровня воспаления наблюдалось у DSS мышей, получавших соединение 34, по сравнению с мышами DSS, получавшими только носитель, при значениях соответственно 2,18±0,48 против 3,77±0,80, p<0,05.

С. Уровень фиброза.

С1. Оценка при окрашивании красителем пикросириус красный.

Полученные образцы тканей кишечника быстро фиксировали 10% буферированным формалином в PBS (pH 7,4) в течение 3 ч, дегидратировали в очищенном этаноле и заливали парафином с низкой температурой плавления. Фиксированные формалином ткани ободочной кишки подвергали необходимой обработке и парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали красителем пикросириус красный для гистологического анализа. Изображения препаратов получали с использованием объектива х20. Каждый срез был исследован 3 различными экспериментаторами, которые не имели информации о его происхождении, для количественной оценки степени фиброза с использованием баллов от 0 до 4.

Статистически значимое увеличение уровня фиброза наблюдалось в ободочной кишке DSS мышей по сравнению с контрольными мышами при сумме баллов соответственно 2,27±0,12 против 1,12±0,07 (см. фиг. 8). Этот результат подтверждает, что хроническое воспаление, вызванное 3 циклами введения DSS, приводит к фиброзу кишечника. Данные экспериментов подтверждают также, что введение соединения 34 мышам DSS понижает уровень фиброза по сравнению с мышами DSS, получавшими только носитель (1,625±0,15 против 2,27±0,12, p<0,05).

С2. Исследование с применением окрашивания трихромом по Массону.

В данной оценке уровня фиброза ободочной кишки применяли окрашивание трихромом по Массону и окрашивание коллагена. Полученные образцы ободочной кишки быстро фиксировали 10% буферированным формалином в PBS (pH 7,4) в течение 3 ч, дегидратировали в очищенном этаноле и заливали парафином с низкой температурой плавления. Последовательно полученные 3 мкм срезы инкубировали в течение 40 мин в метаноле и 3% растворе пероксида водорода, после чего промывали PBS. Фиброз кишечника оценивали в терминах "отсутствие", "умеренный" или "тяжелый" в зависимости от плотности и распространенности окрашивания трихром-позитивной соединительной ткани, а также нарушения структуры ткани.

- 18 030762

С3. Определение уровней коллагена.

Для осуществления иммуногистохимического анализа, образцы тканей из ободочной кишки фиксировали в свежем 4% растворе параформальдегида (PFA) в PBS в течение 3 ч при комнатной температуре, дегидратировали в нескольких порциях очищенного этанола и заливали парафином с низкой температурой плавления. Срезы толщиной 3 мкм инкубировали в метаноле в течение 40 мин и затем в 3% пероксиде водорода в течение 5 мин. Образцы инкубировали в течение ночи со специфичными антителами против коллагена типов I-III (Abcam), фактора роста соединительной ткани (CTGF) (Abcam), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), SMAD2/3, т.е. основных маркеров фиброза. Образцы промывали PBS в течение 5 мин и инкубировали со стрептавидин-биотин-пероксидаза конъюгированным вторичным антителом (Dako LSAB Corporation, код К0675, Dako-Cytomation, Milano). После промывания PBS в течение 10 мин, срезы подвергали инкубированию с 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлоридом в течение 1-3 мин.

Специфичность иммунной реакции определяли, пропуская обработку первичными антителами. В заключении образцы окрашивали гематоксилином Майера и исследовали с помощью светового микроскопа Olympus BX51 Light Microscope (Olympus, Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan).

В иммуногистохимическом анализе (x20) коллагенов I-VII в образцах ободочной кишки DSS и контрольных мышей, окрашивание коллагенов I-VII в толстом кишечнике DSS мышей было локализовано главным образом в соединительной ткани подслизистого слоя и мышечной оболочки, где наблюдалось сильное окрашивание коллагена (см. фиг. 9). Как показано на фиг. 9, введение соединения 34 связано с уменьшением окрашивания коллагена, что указывает на уменьшение фиброза и ослабление распространения фиброза кишечника.

В дополнение к противовоспалительному действию, введение соединения 34 быстро ослабляет явления, ведущие к фиброзу, на молекулярном уровне и предупреждает фибротическое поражение кишечника у мышей, вызванные DSS.

Для проведения Вестерн-блоттинга, 0,5 см замороженных образцов ободочной кишки гомогенизировали в буфере RIPA, содержащем 50 мМ Tris HCl pH 7,6, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂, 5 мМ EDTA, 1% Triton-X и 10% глицерина с добавкой 100 мМ фторида натрия (NaF), 2 мМ ортованадата натрия (Na₃VO₄), 10 мМ пирофосфата натрия (NaPPi), 1 мМ фенилметансульфона (PMSF) и классической смеси ингибиторов протеазы, содержащей 10 мкг/мл леупептина и апротинина.

Для каждого образца 30 мг белка выделяли с помощью PAGE и разделяли электрофорезом. Мембраны из нитроцеллюлозы (с чистотой 100%) инкубировали (согласно отдельному протоколу для каждого антитела) с первичными антителами, направленными против CTGF, коллагена-I и GAPDH (приобретенными у Abcam, Cambridge, UK; 1: 1000 в течение 2 ч при кт), разбавленными 5% обезжиренным молоком в 0,1% TBS-t. Затем мембраны промывали 0,1% TBS-t и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (антикроличьим и антимышиным; Sigma Aldrich; 1:20000 в течение 1 ч при кт), разбавленными 5% обезжиренным молоком в 0,1% TBS-t. В заключении осуществляли иммунологический анализ с хемолюминисцентным субстратом SuperSignal West Pico (Thermo Scientific Pierce, Erembodegem) в соответствии с протоколом производителя. Мембраны регистрировали на ауторадиографическую пленку (Fuji Photo Film Co., Dusseldorf, Germany). Оптическую плотность целевых полос определяли с помощью денситометра с компьютерным управлением и общедоступной программы ImageJ (W.S., Rasband, ImageJ, U.S.National Institutes of Health, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2011). Уровни интересующих молекул в тканях выражали в единицах оптической плотности (OD) относительно общего количества белка, нормализованного по внутреннему контролю GAPDH, и результаты выражали в процентных долях относительно контрольной группы.

Используя ИГХ (иммуногистохимические) методики и специфичные антитела, наблюдали уменьшение уровней основных маркеров фиброза (коллагена I-III, CTGF, SMAD 2/3, PDGF, α-SMA и TGF-β 1) в ободочной кишке DSS мышей, получавших GED, по сравнению с мышами с колитом, получавших носитель (см. фиг. 9А-9Е).

Эти результаты подтверждали с использованием методики Вестерн-блоттинга, и количественное определение различных маркеров фиброза проводили на целостных образцах ободочной кишки (см. фиг. 10). Как можно видеть из данных таблицы б, значимое ослабление экспрессии коллагена I, CTGF и IL-13 наблюдалось у мышей с колитом, получавших GED, по сравнению с мышами, получавшими только носитель (коллаген I 90,75±19,91 против 284,4±63,86, р=0,012; для CTG 55,75+17,53 против 115,1±16,88, р=0,029; и для IL-13 88,88±14,0 против 189,5±28,71, р=0,007).

- 19 030762

Таблица 6

	DSS	DSS+GED	Р
OC-SMA	125,4+19, 45	97,88+15,66	0,282
коллаген I	284,4+63,86	90,75+19,91	0, 012
CTGF	115,1+16,88	55,75+17,53	0, 029
IL-13	189,5+28,71	88,88+14,01	0, 007
TGF-βΙ	153,6+26,25	130,5+28,02	0,5

Пример 7: исследование фиброза кишечника.

В этом примере описан эксперимент по оценке эффекта соединения 34 (GED) при лечении фиброза кишечника.

Материалы и методики.

Эксперименты in vivo.

В исследовании использовали в общей сложности 60 мышей C57BL/6 дикого типа, приобретенных у фирмы Janvier (Le Genest-St-Isle, France). Всех мышей содержали на специальном корме, свободном от патогенов, института Пастера в Лилле (Франция). Эксперименты над животными проводили согласно правительственным директивам No 68/609/CEE.

Провоцирование хронического колита.

Хронический колит и фиброз у мышей вызывали путем перорального введения 2,5% (мас./об.) DSS в питьевой воде в течение трех циклов (5 дней DSS, 7 дней вода). Ежедневно следили за потреблением пищи и жидкости животными, и взвешивали их в начале исследования и затем регулярно каждые три дня.

План эксперимента.

Мышей случайным образом делили на две группы: i) группу, получавшую DSS, и ii) группу, получавшую DSS+GED. Каждая группа состояла из 25 мышей и результаты этих групп сравнивали с результатами для 10 контрольных животных, которые получали только воду. GED (30 мг/кг/мышь) растворяли в растворе, содержащем 0,5% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (CMC; мол.масса: 90000 Да; Sigma Aldrich) и 1% Tween 80, и ежедневно вводили с помощью принудительного кормления через рот (100 мкл/мышь). GED вводили в начале второго цикла.

Оценка течения колита.

Осуществляли ежедневное наблюдение за животными, определяя потребление жидкости, изменение массы и выявляя признаки колита, в том числе потерю массы, диарею, кровотечение из прямой кишки и выпадение прямой кишки, а также симптомы системного воспаления, например, пилоэрекцию, вялость и образование окологлазничных экссудатов.

Отбор и приготовление препаратов.

В заключении эксперимента, через семь дней после последнего цикла введения DSS, животных всех групп умерщвляли смещением шейных позвонков под глубокой анестезией СО₂ и осуществляли вскрытие брюшной полости. Находили прямую кишку и быстро иссекали ее. Определяли суммарную длину ободочной и прямой кишки и измеряли массу дистального отрезка ободочной и прямой кишки длиной 8 см.

Исследование макроскопических и микроскопических поражений ободочной кишки.

Макроскопические поражения ободочной кишки, включая дилатацию (расширение), утолщение и стеноз, оценивались независимыми наблюдателями, которые не имели информации о препаратах, введенных мышам. Образцы тканей из ободочной кишки иссекали, немедленно замораживали или фиксировали в свежеприготовленном 4% растворе формальдегида (FA) в PBS в течение 3 ч при комнатной температуре и затем заливали парафином по стандартной методике. Залитые парафином ткани, разделенные на поперечные срезы толщиной 3 мкм, подвергали окрашиванию гематоксилином/эозином для оценки степени воспаления и осуществляли окрашивание трихромом по Массону для более точной оценки наличия соединительной ткани и фиброза. Затем окрашенные срезы наблюдались двумя патоморфологами, не осведомленными об их происхождении, с использованием светового микроскопа Olympus BX51 (Olympus, Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan), которые осуществляли гистологическую оценку в баллах по следующей шкале: i) наличие язв (0=отсутствие, 1=небольшие язвы, 2=большие язвы); ii) степень воспаления (0=отсутствие, 1= небольшое, 2=умеренное и 3=тяжелое); iii) глубина поражения (0=отсутствие поражений, 1=поражения распространяются в подслизистую оболочку, 2=поражения в мышечной оболочке и 3=поражения в серозной оболочке); iv) степень развития фиброза (0=отсутствие, 1=легкий, 2=умеренный и 3=тяжелый). Степень воспаления кишечника оценивали по плотности и величине хронического воспалительного инфильтрата, утрате бокаловидных клеток и утолщению стенки кишечника. Общую сумму баллов при микроскопическом исследовании получали в виде суммы баллов по отдельным позициям (максимально возможная сумма=10).

Фиброз кишечника оценивали, как отсутствующий, легкий или тяжелый в зависимости от плотно- 20 030762

сти и площади окрашивания трихром-положительной соединительной ткани и разрушения структуры ткани.

Иммуногистохимические исследования.

Образцы ткани ободочной кишки, иссеченные и зафиксированные в свежем 4% растворе формальдегида (FA) в PBS в течение 3 ч при комнатной температуре, дегидратировали в нескольких порциях очищенного этанола и заливали парафином с низкой температурой плавления. Срезы толщиной 3 мкм инкубировали в растворе метанола и 3% пероксида водорода в течение 45 мин.

Образцы инкубировали в течение ночи со специфичными антителами против альфа-актина гладких мышц (α-SMA, Abcam), коллагена типов I-III (Abcam), TGF-β 1 (Abcam), фактора роста соединительной ткани (CTGF) (Abcam), pSmad3 и Smad3 (Cell Signaling), Smad7 (Imgenex), PPARy (Cell Signaling). Образцы промывали PBS в течение 5 мин и инкубировали со стрептавидин-биотин-пероксидаза конъюгированным вторичным антителом (Dako LSAB Corporation, код К0675, Dako-Cytomation, Milano). После одного промывания PBS в течение 10 мин, срезы инкубировали с 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлоридом в течение 1-3 мин.

Контрастное окрашивание ядер осуществляли с помощью гематоксилин эозина. Специфичности иммунной реакции добивались, устраняя первичные антитела. В заключении образцы окрашивали гематоксилином Майера и наблюдали с использованием светового микроскопа Olympus BX51 (Olympus, Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan).

Вестерн-блоттинг.

Отрезали 0,5 см образцы замороженной ободочной кишки и механическим путем гомогенизировали в буфере RIPA, содержащем 50 мМ Tris HCl pH 7,6, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂, 5 мМ EDTA, 1% TritonX и 10% глицерина с добавкой 100 мМ фторида натрия (NaF), 2 мМ ортованадата натрия (Na₃VO₄), 10 мМ пирофосфата натрия (NaPPi), 1 мМ фенилметансульфона (PMSF) и классической смеси ингибиторов протеазы, содержащей 10 мкг/мл леупептина и апротинина.

Из каждого образца выделяли 30 мг белка с помощью PAGE и разделяли электрофорезом. Мембраны из нитроцеллюлозы 100% чистоты инкубировали (согласно отдельному протоколу для каждого антитела) с первичными антителами, направленными против TGF-β 1, CTGF, α-SMA, коллагена-I и GAPDH (приобретенными у Abcam, Cambridge, UK; 1:1000 в течение 2 ч при кт) и IL-13 (приобретенного у Antibodies online; 1:1000 в течение 2 ч при кт), разбавленными 5% обезжиренным молоком в 0,1% TBS-t. Затем мембраны промывали 0,1% TBS-t и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (антикроличьим и антимышиным; Sigma Aldrich; 1:20000 в течение 1 ч при кт), разбавленными 5% обезжиренным молоком в 0,1% TBS-t. В заключении осуществляли иммунологический анализ с хемолюминисцентным субстратом SuperSignal West Pico (Thermo Scientific Pierce, Erembodegem) в соответствии с протоколом производителя. Мембраны регистрировали на ауторадиографическую пленку (Fuji Photo Film Co., Dusseldorf, Germany). Оптическую плотность целевых полос определяли с помощью денситометра с компьютерным управлением и общедоступной программы ImageJ (W.S., Rasband, ImageJ, U.S.National Institutes of Health, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/, 19972011). Уровни интересующих молекул в тканях выражали в единицах оптической плотности (OD) относительно общего количества белка, нормализованного по внутреннему контролю GAPDH, и результаты выражали в процентных долях относительно контрольной группы.

Эксперименты in vivo.

Клеточные культуры.

Клетки линии рака ободочной кишки человека НТ-29 (АТСС НТВ-38) и фибробласты ободочной кишки человека (АТСС human CBB-18 со) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) и альфа-модифицированной среде Игла, соответственно, включавших 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят (FBS). Клеточные культуры содержали во влажной атмосфере, состоявшей из 95% воздуха и 5% CO₂, при 37°C.

Получение клеток с подавленной экспрессией PPARy.

Клетки НТ29 с подавленной экспрессией PPARy получали с использованием системы pSUPER.retro (OligoEngine). Прямые и обратные целевые последовательности, соответствующие нуклеотидам 105-123 мРНК PPARy человека (5'-GCCCTTCACTACTGTTGAC-3') (SEQ ID NO: 11)), клонировали в сайты рестрикции BgIII/Xhol вектора pSUPERretro (pRS), получая генетическую конструкцию ShPPAR. Также в качестве отрицательного контроля получали плазмиду pRS, включающую последовательность 5'ACGCTGAGTACTTCGAAAT-3' (SEQ ID NO: 12), нацеленную против гена люциферазы (генетическую конструкцию ShLuc). Обе конструкции трансфецировали в клетки НТ-29 и Caco-2 с использованием технологии Nucleofector фирмы AmaxaBiosystems в соответствии с протоколом производителя. Устойчиво трансфецированные клоны отбирали через 24 ч после трансфекции с использованием полной культуральной среды с добавлением пуромицина (5 мкг/мл). Подавление экспрессии PPARy проверяли с помощью количественной RT-PCR и вестерн-блоттинга. Полученные клеточные линии ShPPAR и ShLuc содержали в полной среде с добавкой 2,5 мкг/мл пуромицина.

- 21 030762

План эксперимента.

Появление фибротического фенотипа вызывали путем стимулирования hCCD-18 и НТ29 действием, соответственно, 1 нг/мл и 10 нг/мл TGF-β в течение 4 дней, растворенного в среде, не содержащей сыворотки. Во время периода дифференцировки, вводили 1 мМ GED (195,22 г/моль). Кроме того, потенциальная зависимость от активации PPARy исследовали с использованием GW9662, т.е. специфичного антагониста этого рецептора. 10^-5 М GW9662 вводили за 4 ч до начала дифференцировки, вызванной TGF-β.

Количественная RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией).

Всю массу РНК извлекали с использованием набора Nucleospin RNA kit (Macherey-Nagel, Hoerdt, France). После инактивации РНКазы, всю массу РНК очищали от следов геномной ДНК обработкой ДНКазой и промывали в воде, не содержащей РНКазы и DEPC. Чистоту РНК определяли с помощью УФ-спектроскопии на системе Nanodrip в диапазоне 220-350 нм и анализируя профиль на биоанализаторе Agilent 2100. Для проведения количественной реакции RT-PCR использовали 1 мкг общей массы РНК и реакцию проводили с помощью реакционной смеси LightCyclerFastStart DNA Master SYBR Green I производства Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) согласно протоколу производителя.

Результаты.

Эксперименты in vivo.

Клинические и макроскопические данные по хроническому колиту у мышей.

Продолжительное пероральное введение DSS вызывало потерю массы тела у всех мышей, начиная с последнего дня первого цикла введения DSS (дня 5). На 10 день мыши, получавшие DSS, продемонстрировали более низкую массу тела по сравнению с контрольными мышами, со значениями массы тела соответственно 23,88±0,31 против 25,27±0,35, p<0,05 (фиг. 11).

Диарея в степени от умеренной до тяжелой наблюдалась у 70% мышей, получавших DSS, и 50% мышей, получавших GED, на седьмой день перорального введения DSS. В тот же период времени, системные симптомы, например, пилоэрекция, окологлазничный экссудат и/или вялость, наблюдались у 40% мышей DSS и 30% GED мышей. Ни на одной из стадий не наблюдалось явного кровотечения из прямой кишки или выпадения прямой кишки. Мышей умерщвляли на 15 и 30 день соответственно, и производили макроскопическое обследование ободочной кишки, измеряя ее массу (массу последних 8 см дистальной части толстого кишечника), длину и определяя наличие спаек, сужений, расширений, утолщений, которые оценивали по следующей шкале: 0 - в случае отсутствия признака; 1 - при наличии легкой или умеренной выраженности признака; 2 -при наличии явно выраженного признака. Общий результат макроскопического обследования вычисляли как сумму баллов по отдельным позициям.

Влияние введения GED на течение и макроскопические признаки DSS-индуцированного хронического колита представлено в таблице 7, и эти данные показывают, что введение GED облегчает макроскопическое поражение при хроническом колите, вызванном DSS, и уменьшает морфологические признаки фиброза.

Все макроскопические признаки, наблюдаемые при введении DSS, демонстрировали значительные вариации в обеих моделях, что указывает на эффективность DSS при необходимости вызвать тяжелое поражение тканей. Все макроскопические признаки облегчались при введении GED, определяя статистически значимые различия суммы баллов макроскопических признаков для групп DSS и DSS+GED. Такие параметры, как масса ободочной кишки и соотношение масса ободочной кишки/масса тела не продемонстрировали значимых изменений в результате введения GED, тогда как длина ободочной кишки, повидимому, статистически значимо возвращалась к нормальным значениям. Действительно, непосредственное обследование ободочных кишок показало явное сокращение и расширение для большинства образцов, обработанных DSS, а также ослабление этих изменений у мышей, получавших GED.

- 22 030762

Таблица 7

Влияние введения GED на течение и макроскопические признаки хронического колита

Параметр	Долговременное введение
	н2о	DSS	DSS+GED
Продолжительность введения DSS	30 дней	30 дней	15 дней
Смертность (кол-во мышей)	0	2	0
Масса тела	28,95±0,331	25,93±0,223**	25,132±0,458**
Масса ободочной кишки	0,171±0,005	0,283±0,006***	0,269±0,007***
Отношение масса ободочной кишки/масса тела	0,29±0,0051	0,2б±0,007**	0,27±0,012**/γγ
Длина ободочной кишки	8,52±0,093	6,304±0,009**	7,092±0,16**/
Расширение	отсутствует	1,35±0,165**	1,12±0,185**/γγ
Утолщение	отсутствует	1±0,154**	0,48±0,108**/γ
Стеноз	отсутствует	0,364±0,151**	0,32±0,114**/γ
Спайки	отсутствуют	0,348±0,135**	0,12±0,1^
Общий результат макроскопического обследования	отсутствует	3,112±0,31**	2,02±0,26**/γγ

Данные представлены в виде среднее значение ± стандартная ошибка; пр=отсутствует; *=p<0,05 относительно H₂O; **=р<0,01 относительно Н₂0; ***=р<0,005 относительно H₂O; ^Y=p<0,05 относительно DSS; ^YY=p<0,01 относительно DSS; ^YYY=p<0,005 относительно DSS.

Так, например, соотношение масса/размер ободочной кишки использовали в качестве дополнительного индикатора уровня воспаления и фиброза. Статистически значимое увеличение этого соотношения на 124% наблюдалось у мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольными мышами, получавшими только обычную воду при значениях указанного соотношения 44,98±6,31 против 20,11±3,91 (p<0,05). Введение GED приводило к статистически значимому уменьшению соотношения масса/размер ободочной кишки по сравнению с мышами DSS (38,13±7,82 против 44,98±6,31 (p<0,05)), вызывая 26% уменьшение этого соотношения по сравнению с профибротическим эффектом DSS. Соответственно, GED способен ослаблять морфологические признаки фиброза, такие как уменьшение длины и утолщение ободочной кишки.

Микроскопические данные по хроническому колиту.

Проводили оценку ряда гистологических параметров, определяя интенсивность клеточного инфильтрата в слизистую оболочку, распространение воспаления в слои подслизистой оболочки, а также наличие поражений эпителия и отложения коллагена. Статистически значимое и сильное воспаление наблюдалось в группе мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольными мышами, получавшими обычную воду. Гистологические характеристики для обеих моделей включали изъязвление и дегенерацию слизистой оболочки, уменьшение числа бокаловидных клеток, значительную воспалительную инфильтрацию клеток и отек подслизистой оболочки. Все эти признаки были более выраженными при хроническом колите, вызванном DSS, и значительное утолщение стенки ободочной кишки было очевидным. Кроме того, хроническая модель продемонстрировала явную регенерацию крипт и возможное самопроизвольное восстановление степени воспаления при долговременном введении (фиг. 12).

Уровень фиброза определяли с использованием окрашивания трихромом по Массону, которое избирательно выявляет отложения коллагена. Статистически значимое увеличение уровня фиброза наблюдалось не только в ободочной кишке DSS мышей по сравнению с контрольными мышами, но также между двумя группами, получавшими DSS (фиг. 12). Это обстоятельство, а также обнаружение более низкой степени воспаления, по-видимому, согласуется с предположением о том, что фиброз начинается с воспалительной реакции, но затем может развиваться независимо от нее.

Результаты микроскопических исследований выражали в виде суммы баллов и полученные результаты показали, что высокая степень воспаления и уровни фиброза, вызванные 1 и 3 циклами введения DSS, статистически значимо понижались в результате ежедневного перорального введения GED (3,36±0,55 для GED против 6,45±0,82 для DSS, p<0,01) (фиг. 12).

Определение уровней основных маркеров фиброза в тканях.

Уровни основных маркеров фиброза в тканях в хронической модели DSS-индуцированного колита

- 23 030762

определяли с помощью иммуногистохимического анализа и подтверждали иммуноблоттингом. Так, например, наблюдалось заметное уменьшение уровней коллагена I-III (фиг. 13а) и α-SMA (фиг. 13b), т.е. специфичных маркеров дифференцировки фибробластов, в ободочной кишке мышей, которым осуществляли пероральное введение GED, по сравнению с мышами, получавшими только DSS. Уровни экспрессии коллагена I-III и α-SMA измеряли у 6 контрольных мышей, 8 мышей DSS и 8 мышей DSS+GED. Как иммуногистохимия, так и вестерн-блоттинг показали, что уровни всех основных маркеров фиброза значимо повышались в группе мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольными мышами, получавшими обычную воду, и что ежедневное введение GED сопровождалось уменьшением их экспрессии. Уровни экспрессии каждого из белков выражали в процентных долях относительно среднего значения для контрольной группы, и данные для каждого интересующего маркера нормализовали относительно конститутивного белка, например, GAPDH. Наблюдалось заметное увеличение экспрессии коллагена IIII (184%) у мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольной группой, а также умеренное повышение экспрессии для α-SMA, равное 25%. Пероральное введение GED у мышей с хроническим колитом, вызванным DSS, приводило к уменьшению уровней экспрессии указанных белков, которое было более значимым в случае коллагенов I-III (90,75%±19,9% для GED против 284.4%±63,8% для DSS, p<0,005).

GED регулирует сигнальный путь TGF3/Smad и его специфический активатор, а именно IL-13.

Способность GED регулировать сигнальный путь TGFp/Smad при различных уровнях наблюдали с использованием иммуногистохимического анализа, при этом было продемонстрировано заметное уменьшение уровней различных молекул, вовлеченных в этот сигнальный путь, например, TGF-β! Smad3, CTGF (данные не показаны).

Наблюдался положительный результат от применения GED при профилактике или лечении фиброза кишечника, относящийся изменению уровней экспрессии IL-13 (фиг. 14а). IL-13 является специфическим активатором сигнального пути TGFp/Smad и это обстоятельство подтверждается последующим понижением уровней экспрессии TGF-β 1 (фиг. 14b) и CTGF (фиг. 14с). Повышенная экспрессия IL-13 у мышей, получавших DSS, статистически значимо возвращалась в исходное состояние при пероральном введении GED при значениях 88,88%±14,1% для GED против 189,5%±28,71% для DSS, p<0,01. Последующее уменьшение уровней экспрессии TGF-β 1 и CTGF подтверждалось иммуноблоттингом с достаточной статистической значимостью для CTGF (55,57%±17,53% для GED против 115,1%±16,88% для DSS, p<0,05). Уровни экспрессии выражали в процентных долях оптической плотности относительно контрольной группы и нормализовали относительно GAPDH.

Включение посредством ссылки.

Содержание каждого из патентных документов и научных статей, упомянутых в тексте настоящей заявки, полностью включено в заявку во всех смыслах посредством ссылки.

Эквиваленты.

Настоящее изобретение можно воплотить в других конкретных формах, не отступая от его сути или основных характеристик. Таким образом, описанные выше варианты осуществления следует считать во всех отношениях иллюстративными, а не ограничивающими описанное изобретение. Поэтому объем изобретения ограничен приложенной формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и имеется в виду, что все изменения, которые по смыслу и пределам применимости являются эквивалентами формулы изобретения, охвачены настоящим изобретением.

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения фиброза, включающий введение пациенту, страдающему фиброзом, терапевтически эффективного количества соединения формулы ОМе

   NH₂

   или его фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера, где фиброз представляет собой один из фиброза печени, фиброза кишечника или идиопатического фиброза легких.
2. 2. Способ по п.1, где фиброз представляет собой фиброз печени.
3. 3. Способ по п.1, где фиброз представляет собой фиброз кишечника.
4. 4. Способ по п.1, где фиброз представляет собой идиопатический фиброз легких.
5. 5. Способ лечения фиброза печени, включающий введение пациенту, страдающему фиброзом печени, фармацевтического препарата, включающего терапевтически эффективное количество 2-метокси-3(4'-аминофенил)пропионовой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера.
6. 6. Способ по п.5, где фармацевтический препарат вводят перорально.

   - 24 030762
7. 7. Способ по п.5 или 6, где пациент является человеком.
8. 8. Способ по любому из пп.5-7, где у пациента уже имеется или имелся гепатит В или гепатит С.
9. 9. Способ по любому из пп.5-8, где у пациента имеется цирроз.
10. 10. Способ по любому из пп.5-9, где у пациента имеется также болезнь Крона, воспалительная болезнь кишечника или язвенный колит.
11. 11. Способ лечения фиброза кишечника, включающий введение пациенту, страдающему фиброзом кишечника, фармацевтического препарата, включающего терапевтически эффективное количество 2метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера.
12. 12. Способ по п.11, где фармацевтический препарат вводят перорально.
13. 13. Способ по п.11 или 12, где пациент является человеком.
14. 14. Способ по любому из пп.11-13, где у пациента имеется также болезнь Крона, воспалительная болезнь кишечника или язвенный колит.
15. 15. Способ лечения идиопатического фиброза легких, включающий введение пациенту, страдающему от идиопатического фиброза легких, фармацевтического препарата, включающего терапевтически эффективное количество 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли и/или стереоизомера.
16. 16. Способ по п.15, где фармацевтический препарат вводят перорально.
17. 17. Способ по п.15 или 16, где пациент является человеком.
18. 18. Способ по любому из пп.1-17, где стереоизомер 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты представляет собой ^)-2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту.
19. 19. Способ по любому из пп.1-17, где стереоизомер 2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовой кислоты представляет собой да-2-метокси-3-(4'-аминофенил)пропионовую кислоту.