KR102067848B1 - 섬유증의 치료 방법 - Google Patents

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KR102067848B1
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노그라 파마 리미티드
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Abstract

본 개시내용은, 부분적으로, 섬유증, 예를 들어, 간 섬유증 및/또는 장 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 개시된 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 섬유증, 예를 들어, 간 섬유증 및/또는 장 섬유증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

섬유증의 치료 방법 {METHODS OF TREATING FIBROSIS}
본원은 2012년 2월 9일에 출원된 EP12425027.5 및 2012년 5월 9일에 출원된 U.S.S.N. 61/644,544를 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록
본원은 텍스트 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 2013년 5월 21일에 만들어진 상기 텍스트 카피의 명칭은 PS966PCT_SL.txt이고, 크기는 3,284 바이트이다.
섬유증은 수복성 또는 반응성 과정, 예를 들어 치유에서, 통상적으로 손상 또는 장기 염증으로 인한 기관 또는 조직에서의 과도한 섬유성 결합 조직의 형성이다. 섬유증은 이환 조직을 경화 및/또는 팽윤시키는 원인이 되고, 이들 조직을 통한 체액의 흐름을 감소시킨다. 결과적으로, 섬유증을 갖는 조직은 적절하게 기능할 수 없을 것이다.
예를 들어, 간 섬유증은, 예를 들어, 알콜 및/또는 약물 남용, 바이러스 및 기생충 감염 (예를 들어, 간염, 예컨대 B형 또는 C형 간염), 비알콜성 지방간염 (NASH), 철 및 구리 과부하, 및 자가면역 질환의 결과로서의 만성 간 손상에 대한 상처-치유 반응으로서 기재될 수 있다. 모든 만성 간 질환은 주요 원인인 만성 바이러스성 B형 간염 및 알콜성 간 질환을 갖는 간 섬유증을 유발할 수 있다. 간 엔도칸나비노이드 시스템은 섬유화 세포 유형의 증식 및 사망을 차등적으로 초래하는 별개의 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 섬유화유발 및 항섬유화 효과 둘 다를 매개한다. 시간에 따라 이 과정은 간 경변증을 유발할 수 있으며, 여기서 간의 기능성 단위의 구조적 조직화가 이와 같이 파괴되어서, 간을 통한 혈액 흐름 및 간 기능이 파괴된다.
간 섬유증은 세계적으로 중요한 공통의 어려운 과제를 나타낸다. 현재, 말기 간경변증을 위한 유일한 치유적 치료는 이식이지만, 심지어 선진국에서도, 이용가능한 공여자 기관의 수 및 잠재적 수용자의 임상 조건은 이 기술의 적용가능성을 제한한다. 섬유증, 특히 간경변증의 발생은 유의한 이환율 및 사망률과 연관된다. 따라서, 간 섬유증에 적용가능한 항섬유화 전략을 개발하는 것이 상당히 시급한 것이다.
신섬유증은 투석 또는 신장 이식에 대한 필요성으로 이어지는 원발성 후천적 병변로서 유의한 이환율 및 사망률의 원인이 된다. 섬유증은 신장의 기능적 단위인 네프론의 여과 또는 재흡수 구성요소에서 발생할 수 있다. 섬유증은 또한 심장에서도 발생할 수 있고, 예를 들어, 심장 섬유증은 심장 판막의 비후로서 발생할 수 있다.
장 섬유증은 증후성이 될 수 있는 염증성 장 질환 (IBD)의 흔한 합병증이고, 협착 형성이 뒤따르면 외과적 개입을 필요로 할 수 있다. 장 섬유증의 기초가 되는 전통적 및 신규 메카니즘의 대부분은 만성 염증과 연관된다.
예를 들어, 본원에 개시된 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유증을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법에 사용하기 위한 화합물이 또한 제공된다. 예를 들어, 하기에 의해 나타내어진 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염의 치료상 및/또는 제약상 허용되는 양을 투여하는 것을 포함하는, 간 섬유증 및/또는 장 섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하거나 또는 이를 앓는 대상체 또는 환자에서 간 섬유증 및/또는 장 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.
Figure 112014084122781-pct00001
상기 식에서,
R10은 H 및 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R11은 H, C1-C6알킬 및 -C(O)-C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 C1-C6알킬이다.
적합하게는, 일부 실시양태에서, R5는 H일 수 있다.
적합하게는, R10, R11 및/또는 R5의 C1-C6알킬 관능기는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 관능기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 메틸 및 에틸 알킬 관능기가 특히 바람직하고, 여기서 메틸이 가장 바람직한 알킬 관능기이다.
적합하게는, 질소는 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 고리에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 질소는 3' 또는 4' 위치에서 부착된다. 4' 위치가 가장 바람직하다.
예시적인 고려되는 화합물은 하기 화학식 A' 및 A"를 포함할 수 있으며, 여기서 R10, R11 및 R5는 상기 및 본원에 제공된다.
<화학식 A'>
Figure 112014084122781-pct00002
<화학식 A">
Figure 112014084122781-pct00003
적합하게는, 일부 실시양태에서, R5는 H일 수 있다.
적합하게는, R10, R11 및/또는 R5의 C1-C6알킬 관능기는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 관능기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 메틸 및 에틸 알킬 관능기가 특히 바람직하고, 여기서 메틸이 가장 바람직한 알킬 관능기이다. 특정 실시양태에서, R5는 메틸, 에틸, 프로필이거나, 또는 예를 들어, 메틸이다. 특정 실시양태에서, R5는 메틸, 에틸, 프로필이거나, 또는 예를 들어, 메틸이다.
또한, 간 또는 장 섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 PPARγ 작용제, 예컨대 본원에 개시된 화합물을 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 간 또는 장 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 신섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증 및/또는 신성 전신섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 PPARγ 작용제, 예컨대 본원에 개시된 화합물을 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 신섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증 및/또는 신성 전신섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 고려된다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 환자가 인간인 방법일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 화합물은 이들 질환/상태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 이들 및 다른 측면 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 특허청구범위의 고찰에 따라 분명해질 것이다.
도 1은 CCl4, JWH-133 및 화합물 34의 투여에 따른 마우스의 체중 전개를 도시한다.
도 2 (a)는 메타비르(metavir) 점수의 설명을 도시하고, (b)는 간에 대한 CCl4, JWH-133+ CCl4 및 화합물 34+ CCl4의 효과를 도시하고, 각각의 군에 대한 메타비르 점수를 명시한다.
도 3 (a)는 CCl4, JWH-133+ CCl4 및 화합물 34+ CCl4에 적용된 마우스로부터의 간의 메타비르 점수 및 (b) 변형된 메타비르 점수를 도시한다.
도 4는 α-SMA 및 콜라겐-1에 대한 CCl4, JWH-133+ CCl4 및 화합물 34+ CCl4의 효과를 도시한다.
도 5는 장 섬유증 연구 스케줄을 도시한다.
도 6은 장 섬유증을 갖는 마우스의 결장에 대한 화합물 34의 효과를 도시한다.
도 7은 장 섬유증을 갖는 마우스의 결장에 대한 화합물 34의 항염증 효과를 도시한다.
도 8은 장 섬유증을 갖는 마우스의 결장에 대한 화합물 34의 효과를 도시한다.
도 9는 장 섬유증을 갖는 마우스의 결장에 대한 화합물 34의 효과를 섬유증의 주요 마커 (콜라겐 I-III, CTGF, SMAD 2/3, PDGF, α-SMA 및 TGF-β1)의 면역조직화학적 분석을 사용하여 도시한다.
도 10은 장 섬유증을 갖는 마우스의 결장에 대한 화합물 34의 효과를 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 도시한다.
도 11은 DSS 및 DSS+GED로 처리된 마우스에서의 체중 곡선을 나타낸다.
도 12는 DSS 및 DSS+GED로 처리된 마우스의 결장에서의 섬유증의 수준을 통상의 물을 제공받는 대조 마우스와 비교하여 보여준다.
도 13은 DSS 및 DSS + GED 마우스 만성 결장염으로부터의 결장의 현미경적 소견을 도시한다. 결장 조직을 4% PFA 중에서 고정시키고, 횡행 절편 (4μm)을 메이-그룬드발트-김자(May-Grunwald-Giemsa)(H&E) 및 마송(Masson) 트리크롬으로 염색하였다. DSS 마우스는 점막하층 및 장막 둘 다에서 대조군과 비교시 중증 염증 정도 및 섬유증을 나타내는 반면, GED 처리는 정상 장벽 구조의 복원을 결정하였다. 데이터는 평균 ± SEM; *= p< 0.05; **= p< 0.01 및 ***= p<0.005 vs H2O로 표현되었다.
도 14는 섬유증의 주요 마커의 면역조직화학 및 이뮤노블롯팅을 나타낸다. 현미경사진은 GED로 처리된 DSS 마우스에서 콜라겐 I-III (a), α-SMA (b)의 유의한 감소를 DSS-유발 만성 결장염을 갖는 마우스와 비교하여 나타낸다. 이들 마커의 단백질 수준은 또한 GED에 의해 유발된 발현 프로파일을 확인하는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정되었다. 대표적인 블롯을 나타낸다. *= p< 0.05, **= p< 0.01. N= 대조군에 대해 6마리 마우스, DSS 군에 대해 8마리 마우스, DSS + GED 군에 대해 8마리 마우스.
도 15는 DSS-유발 만성 결장염을 갖는 마우스와 비교하여 GED로 처리된 DSS 마우스에서 TGF-β1 (a), SMAD 2/3 (b), CTGF (c)의 유의한 감소를 나타내는 현미경사진을 도시한다.
도 16은 만성 DSS-처리된 마우스에서의 IL-13 단백질 수준 및 그의 하류 매개인자, TGF-β1 및 CTGF에 대한 GED 투여의 효과를 나타낸다. IL-13, TGF-β1 및 CTGF 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 대조군 값의 백분율로서 제시된다. 대표적인 블롯을 나타낸다. **= p< 0.01. N= 대조군에 대해 6마리 마우스, DSS 군에 대해 8마리 마우스, DSS + GED 군에 대해 8마리 마우스.
본 개시내용은, 부분적으로, 본원에 개시된 특정 화합물이 섬유증, 예를 들어, 간 또는 결장에서의 섬유증을 예방 또는 치료하는 능력을 갖는다는 발견을 기초로 한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 섬유증, 예를 들어 간 섬유증 및/또는 장 섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에서 간 섬유증 및/또는 장 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 개시된 방법은 본원에 개시된 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
추가 기재 이전에, 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 수집한다. 이들 정의는 본 개시내용의 나머지에 비추어 판독되어야 하고, 당업자에 의해서와 같이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 방법에 의해 치료하려는 "환자", "대상체" 또는 "숙주"는 인간, 또는 비-인간 동물, 예를 들어, 소형 포유동물, 예컨대 마우스 또는 래트, 및 예를 들어 말, 소, 개, 고양이 등을 의미할 수 있다.
용어 "치료제"는 당업계에 인식되어 있고, 대상체에서 국부로 및/또는 전신으로 작용하는 생물학적, 생리학적 또는 약리학적 활성 물질인 임의의 화학적 모이어티를 지칭한다. 또한 "약물"로 지칭되는 치료제의 예는 공지된 참조 문헌, 예컨대 머크 인덱스(Merck Index), 의사 처방 참고집, 및 치료제의 약리학 기초에 기재되어 있으며, 이들은 비제한적으로 의약; 비타민; 미네랄 보충제; 질환 또는 질병의 치료, 예방, 진단, 치유 또는 완화에 사용되는 물질; 신체의 구조 또는 기능에 영향을 미치는 물질; 또는 생물학적으로 활성이 되거나 또는 이들이 생리학적 환경에 놓인 후에 보다 활성이 되는 전구약물을 포함한다.
용어 "치료 효과"는 당업계에 인식되어 있고, 약리학적 활성 물질에 의해 발생되는 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간에서의 국부 및/또는 전신 효과를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 동물 또는 인간에서 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방, 또는 바람직한 신체적 또는 정신적 발육 및/또는 상태의 증진에서의 사용을 위한 임의의 물질을 의미한다. 어구 "치료 유효량"은 임의의 치료에 적용가능한 합리적 이익/위험 비에서 일부 목적하는 국부 또는 전신 효과를 생성하는 이러한 물질의 양을 의미한다. 이러한 물질의 치료 유효량은 치료되는 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 조성물은 충분한 양으로 투여되어 이러한 치료에 적용가능한 합리적 이익/위험 비를 생성할 수 있다.
용어 "치료하는"은 당업계에 인식되어 있고, 임의의 상태 또는 질환의 하나 이상의 증상을 치유 뿐만 아니라 완화시키는 것을 지칭한다.
용어 "알킬"은 당업계에 인식되어 있고, 포화 지방족 기, 예컨대 직쇄 알킬 기, 분지쇄 알킬 기, 시클로알킬 (지환족) 기, 알킬 치환된 시클로알킬 기 및 시클로알킬 치환된 알킬 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 약 30개 이하의 탄소 원자를 그의 백본에 갖고 (예를 들어, 직쇄의 경우에 C1-C30, 분지쇄의 경우에 C3-C30), 대안적으로, 약 20개 이하, 예를 들어 1 내지 6개의 탄소를 갖는다. 마찬가지로, 시클로알킬은 약 3 내지 약 10개의 탄소 원자를 그의 고리 구조 내에 갖고, 대안적으로 약 5, 6 또는 7개의 탄소를 고리 구조 내에 갖는다. 용어 "알킬"은 할로치환된 알킬을 포함하는 것으로도 또한 정의된다.
또한, 용어 "알킬" (또는 "저급 알킬")은 탄화수소 백본의 1개 이상의 탄소 상에 수소를 대체한 치환기를 갖는 알킬 모이어티를 지칭하는 "치환된 알킬"을 포함한다. 이러한 치환기는, 예를 들어 히드록실, 카르보닐 (예컨대 카르복실, 알콕시카르보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카르보닐 (예컨대 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 술프히드릴, 알킬티오, 술페이트, 술포네이트, 술파모일, 술폰아미도, 술포닐, 헤테로시클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 당업자들은 탄화수소 쇄 상에 치환된 모이어티가 적절한 경우에 그 자체 치환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환기는 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴 (포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 술포닐 (술페이트, 술폰아미도, 술파모일 및 술포네이트 포함) 및 실릴 기, 뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카르보닐 (케톤, 알데히드, 카르복실레이트 및 에스테르 포함), -CN 등의 치환된 및 비치환된 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 하기에 기재되어 있다. 시클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카르보닐-치환된 알킬, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
용어 오르토, 메타 및 파라는 당업계에 인식되어 있고, 각각 1,2-, 1,3- 및 1,4-이치환된 벤젠을 지칭한다. 예를 들어, 명칭 1,2-디메틸벤젠 및 오르토-디메틸벤젠은 동의어이다.
각 표현, 예를 들어, 알킬, m, n 등의 정의는, 이것이 임의의 구조에서 1회 초과로 발생하는 경우에, 동일한 구조의 다른 곳에서의 그의 정의에 독립적인 것으로 의도된다.
본 발명의 조성물에 함유된 특정 화합물은 특정한 기하 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 또한 광학 활성일 수 있다. 본 발명은 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이들의 라세미 혼합물, 및 다른 그의 혼합물을 비롯한 모든 이러한 화합물이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려한다. 추가의 비대칭 탄소 원자가 치환기, 예컨대 알킬 기에 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체, 뿐만 아니라 그의 혼합물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
"치환" 또는 "~로 치환된"은 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허용되는 원자가를 따르고, 치환이, 예를 들어 재배열, 고리화, 제거 또는 다른 반응에 의한 것과 같은 변형을 자발적으로 겪지 않는 안정한 화합물을 생성한다는 내포적인 단서를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
용어 "치환된"은 또한 유기 화합물의 모든 허용되는 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 광범위한 측면에서, 허용되는 치환기는 유기 화합물의 비-시클릭 및 시클릭, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 예시적 치환기는, 예를 들어, 본원에 상기 기재된 것들을 포함한다. 허용되는 치환기는 1개 이상이고, 적절한 유기 화합물에 대하여 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로원자, 예컨대 질소는 헤테로원자의 원자가를 충족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 수소 치환기 및/또는 임의의 허용되는 치환기를 가질 수 있다. 본 발명은 유기 화합물의 허용되는 치환기에 의해 임의의 방식으로 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 화학 원소는 원소 주기율표 (CAS 버전, 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87], 속표지)에 따라 확인된다. 또한 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "탄화수소"는 적어도 1개의 수소 및 1개의 탄소 원자를 갖는 모든 허용되는 화합물을 포함하는 것으로 고려된다. 광범위한 측면에서, 허용되는 탄화수소는 치환 또는 비치환될 수 있는 비-시클릭 및 시클릭, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 유기 화합물을 포함한다.
용어 "제약상 허용되는 염"은 당업계에 인식되어 있고, 예를 들어, 본 발명의 조성물에 함유된 것들을 포함하는, 화합물의 비교적 비-독성, 무기 및 유기 산 부가염을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 당업계에 인식되어 있고, 임의의 대상 조성물 또는 그의 구성성분을 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 기관 또는 부분으로 운반 또는 수송되는, 제약상-허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각각의 담체는, 대상 조성물 및 그의 구성성분과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 관점에서 "허용"되어야만 한다. 제약상 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는, 제약 제제에 사용되는, (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원 무함유수; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충제 용액; 및 (21) 다른 비-독성 상용성 물질을 포함한다.
화합물
개시된 방법 중 하나 이상의 사용에 고려되는 화합물은 하기 화학식 I에 의해 나타내어진 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 거울상이성질체 또는 입체이성질체를 포함한다.
<화학식 I>
Figure 112014084122781-pct00004
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성할 수 있고;
Y 및 Z는 독립적으로 H, OH, COOH, -OR3, -CH(OR3)COOH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, 페닐, 벤질, 비닐, 알릴, C1 -6 알킬, 또는 1개 이상의 할로겐으로 치환된 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합하게는, C1-C6알킬 관능기는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 관능기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 메틸 및 에틸 알킬 관능기가 특히 바람직하고, 여기서 메틸이 가장 바람직한 알킬 관능기이다.
한 실시양태에서, Y는 H 또는 COOH일 수 있다. 예를 들어, Y는 H일 수 있고, Z는 CH(OR3)COOH일 수 있거나, 또는 Y는 COOH일 수 있고, Z는 -OR3일 수 있다. 일부 실시양태에서, R3은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필일 수 있다.
다른 실시양태에서, 화학식 I의 NR1R2 모이어티는 4' 위치에 있을 수 있거나 또는 3' 위치에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, R1 및 R2는 H이다.
적합하게는, 일부 실시양태에서, R3은 H일 수 있다.
예시적인 화합물은 또한 하기 화학식 IIa 또는 IIb에 의해 나타내어진 것들 또는 그의 제약상 허용되는 염, 거울상이성질체 또는 입체이성질체를 포함한다.
<화학식 IIa>
Figure 112014084122781-pct00005
<화학식 IIb>
Figure 112014084122781-pct00006
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 5 또는 6개의 원자를 갖는 방향족 또는 지방족 고리를 형성할 수 있고;
R6은 -NR9OH, OH 및 -OR9로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R9는 C1 -6 알킬이고;
R4는 H, 할로, 페닐, 벤질, 비닐, 알릴, C1 -6 알킬, 및 1개 이상의 할로겐으로 치환된 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5 및 R7은 독립적으로 수소 또는 할로로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
R4 및 R5, 또는 R4 및 R6은 함께, 할로 또는 C1 -6 알킬로 임의로 치환된 5 또는 6개의 원자를 갖는 융합된 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
A는 융합된 헤테로시클릭 고리이다.
적합하게는, C1-C6알킬 관능기는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 관능기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 메틸 및 에틸 알킬 관능기가 특히 바람직하고, 여기서 메틸이 가장 바람직한 알킬 관능기이다.
특정 실시양태에서, 화학식 IIa의 NR1R2 모이어티는 4' 위치에 있을 수 있거나 또는 3' 위치에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, R1 및 R2는 H이다. 일부 실시양태에서의 R9는 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필일 수 있다.
일부 실시양태에서, 고려되는 화합물은 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다.
Figure 112014084122781-pct00007
상기 식에서, p는 1 또는 2이고;
R6은 OH 또는 -OR9로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R9는 상기 정의되어 있고;
R10은 독립적으로 각 경우에 H, 할로 또는 C1 -6 알킬, 예를 들어, 메틸 또는 에틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
개시내용은 또한, 적어도 부분적으로, 개시된 방법에 사용하기 위한 하기 도시된 화학식에 의해 나타내어진 화합물을 제공한다.
예를 들어, 개시된 방법에 사용하기 위해 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드가 본원에 고려된다.
<화학식 III>
Figure 112014084122781-pct00008
상기 식에서, X는 할로겐 또는 히드록실로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C3알킬렌이고;
R1은 C1-C6알킬, C3-C6시클로알킬, C2-C6알케닐 및 C2-C6알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 수소 및 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 독립적으로 각 경우에 수소, C1-C6알콕시, C1-C6알킬, 시아노, C3-C6시클로알킬, 할로겐, 히드록실 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 수소 및 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 C1-C6알킬이다.
적합하게는, 일부 실시양태에서, R5는 H일 수 있다.
적합하게는, C1-C6알킬 관능기는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬 관능기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 메틸 및 에틸 알킬 관능기가 특히 바람직하고, 여기서 메틸이 가장 바람직한 알킬 관능기이다.
한 실시양태에서, 화학식 III의 R1은 C1-C6알킬, 예컨대 메틸일 수 있다. 한 실시양태에서, R2는 수소일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, R3은 수소, C1-C6알킬, 할로겐 및 히드록실로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 실시양태에서, R3은 수소일 수 있다. 한 실시양태에서, R4 및 R5는 각각 C1-C6알킬일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, R4는 수소일 수 있고, R5는 메틸일 수 있다. 한 실시양태에서, X는 (CH2)n일 수 있고, 여기서 n은 1 또는 2, 예컨대 1이다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 III의 모이어티 -NR2-COR1은 하기 화학식 IIIa 및 IIIb에 제시된 바와 같이 X에 대해 메타 또는 파라 위치에 존재할 수 있다.
<화학식 IIIa>
Figure 112014084122781-pct00009
<화학식 IIIb>
Figure 112014084122781-pct00010
본 개시내용은 또한 개시된 방법에서 사용될 수 있는, 예를 들어 하기 도시된 바와 같은 화학식 IV에 의해 나타내어진 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드를 제공한다.
<화학식 IV>
Figure 112014084122781-pct00011
상기 식에서, R1은 C1-C6알킬, C3-C6시클로알킬, C2-C6알케닐 및 C2-C6알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 수소 및 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 독립적으로 각 경우에 수소, C1-C6알콕시, C1-C6알킬, 시아노, C3-C6시클로알킬, 할로겐, 히드록실 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 수소 또는 C1-C6알킬이다.
하기 제시된 바와 같은 화학식 V의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드가 또한 고려된다.
<화학식 V>
Figure 112014084122781-pct00012
상기 식에서, R1은 C1-C6알킬, C3-C6시클로알킬, C2-C6알케닐 및 C2-C6알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 독립적으로 각 경우에 수소, C1-C6알콕시, C1-C6알킬, 시아노, C3-C6시클로알킬, 할로겐, 히드록실 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 수소 및 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R5는 수소 또는 C1-C6알킬이고;
A는 융합된 5 또는 6원 헤테로사이클이다.
한 실시양태에서, R1은 C1-C6알킬, 예컨대 메틸일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, R1 및 R3은 각각 C1-C6알킬, 예컨대 메틸일 수 있다. 한 실시양태에서, R2는 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식에 의해 나타내어진 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드일 수 있다.
Figure 112014084122781-pct00013
상기 식에서, p는 1 또는 2이고;
R1은 C1-C6알킬, C3-C6시클로알킬, C2-C6알케닐 및 C2-C6알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R8은 각각 독립적으로 수소 및 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 개시된 방법에 사용하기 위해 고려되는 화합물은 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드를 포함한다.
<화학식 A>
Figure 112014084122781-pct00014
R10은 H 및 C1-C6알킬 (예를 들어, 메틸)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R11은 H, C1-C6알킬 및 -C(O)-C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; (예를 들어, R11은 H, 메틸, -C(O)-메틸 또는 -C(O)-에틸일 수 있음);
R5는 C1-C6알킬이다 (예를 들어, R5는 메틸, 에틸, 또는 프로필일 수 있음).
예를 들어, 개시된 방법에 사용하기 위해 하기 화학식 A' 및 A"가 본원에 고려된다.
<화학식 A'>
Figure 112014084122781-pct00015
<화학식 A">
Figure 112014084122781-pct00016
개시된 방법에 사용하기 위해 본원에 고려되는 예시적인 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
Figure 112014084122781-pct00017
일부 실시양태에서, 고려되는 화합물은 4-아미노-N-히드록시-2-메톡시벤즈아미드 (화합물 13); 6-메톡시 퀴놀린-5-카르복실산 (화합물 36); 6-메톡시-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실산 (화합물 37); 및 5-디이소프로필아미노살리실산 (화합물 38)을 포함한다.
다른 예시적인 화합물은 하기에 의해 나타내어진 것들을 포함한다.
Figure 112014084122781-pct00018
본원에 고려되는 화합물은 라세미 혼합물, 및 화합물의 거울상이성질체, 예를 들어 (±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐) 프로피온산 (화합물 20); (±)-2-메톡시-2-(4'-아미노페닐) 아세트산 (화합물 23); (±)-2-에톡시-2-(3'-아미노페닐) 아세트산 (화합물 32); (±)-2-에톡시-2-(4'-아미노페닐) 아세트산 (화합물 33); (±)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산 (화합물 34) "±34" (라세미 형태); (±)-2-에톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산 (화합물 39); (±)-2-에톡시-3-(3'-아미노페닐) 프로피온산 (화합물 40)을 포함한다.
예를 들어, 본원에 개시된 방법에 사용되는 화합물은 하기 라세미 혼합물의 거울상이성질체: (R,S)-2-히드록시-2-(3-아미노페닐)아세트산 (화합물 10); (R,S)-2-히드록시-2-(4-아미노페닐)아세트산 (화합물 11); (R,S)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 21); (R,S)-2-메톡시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 22); (R,S)-2-메톡시-3-(3'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 35); (R,S)-2-메톡시-3-(4-아미노페닐)프로피온산 (화합물 34), 뿐만 아니라 거울상이성질체, 예를 들어: (+) 2-S-메톡시-3-(4-아미노페닐)프로피온산; (-)2-R-메톡시-3-(4-아미노페닐)프로피온산일 수 있다. 일부 실시양태에서, (R,S)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐에서)프로피온산 (화합물 21) 또는 (±)-2-히드록시-3-(3'-아미노페닐) 프로피온산 (화합물 20)이 바람직하다.
고려되는 화합물의 다른 라세미 유형 혼합물은, 예를 들어 (±)-2-히드록시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 10); (±)-2-히드록시-2-(4'-아미노페닐)아세트산 (화합물 11); (±)-2-히드록시-3-(4'-아미노페닐)프로피온산 (화합물 21) 및 (±)-2-메톡시-2-(3'-아미노페닐)아세트산 (화합물 22)을 포함한다.
개시된 방법에 사용하기 위해 고려되는 추가의 화합물은 5-아미노살리시클로-히드록삼산 (화합물 5); 3-디메틸아미노살리실산 (화합물 6); 2-메톡시-4-아미노벤조산 (화합물 7); 2-메톡시-5-아미노벤조산 (화합물 8); 5-메틸아미노살리실산 (화합물 9); 4-메틸아미노살리실산 (화합물 12); 4-아세틸아미노살리실산 (화합물 16); 2-에톡시-4-아미노벤조산 (화합물 18); 2-에톡시-5-아미노벤조산 (화합물 19); 4-디메틸아미노살리실산 (화합물 24); 2-에톡시-4-아미노벤조일히드록삼산 (화합물 25); 6-히드록시퀴놀린-5-카르복실산 (화합물 27); 2-(2-프로필)옥시-4-아미노벤조산 (화합물 30); 4-(1-피페라지닐)살리실산 (화합물 41); (R,S) 5-옥사-퀴놀린-6-카르복실산 (화합물 15); 6-메톡시 퀴놀린-5-카르복실산 (화합물 36); 6-메톡시-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실산 (화합물 37); 5-디이소프로필아미노살리실산 (화합물 38); 및 4-디이소프로필아미노살리실산 (화합물 42)이다.
고려되는 화합물, 및 하나 이상의 화합물을 포함하는 제약 조성물은 N-아세틸-(R)-(-)-3-(4-아미노페닐)-2-메톡시프로피온산, N-아세틸-(S)-(-)-3-(4-아미노페닐)-2-메톡시프로피온산; 및 라세미 N-아세틸-(S)-(-)-3-(4-아미노페닐)-2-메톡시프로피온산, 또는 하기 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
Figure 112014084122781-pct00019
다른 고려되는 화합물은 화합물 20, 화합물 21, 4-아세트아미노-N-히드록시-2-메톡시벤즈아미드; 1-아세틸-6-메톡시-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실산, 5-아세트아미도-2히드록시벤조산 (예를 들어, 아세틸화 5-아미노살리실산) 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 N-옥시드를 포함한다.
또한, 화학식에 의해 나타내어진 화합물 및 예를 들어 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 개시된 방법에 사용하기 위해 본원에 고려된다.
고려되는 화합물의 제조 방법은 WO2007/010516 및 WO2007/010514의 실시예에서 발견될 수 있으며, 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
방법
섬유증, 예컨대 간 섬유증 및/또는 장 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 본 개시내용의 부분을 형성한다. 이러한 방법은 그를 필요로 하는 환자 또는 위험이 있는 환자에게 PPARy 작용제, 예컨대 본원에 개시된 화합물, 예를 들어, 화학식 I, IIa 또는 IIb, 예를 들어, 화합물 17, 29, 34 또는 39를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 간 섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 개시된 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 간 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 대안적으로, 장 섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 개시된 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 장 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.
상기 방법을 사용하여 치료된 환자는 검출가능한 섬유증을 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 개시된 화합물, 예를 들어, 화합물 17, 29, 34 또는 39의 투여 후에, 예를 들어 1일, 2일, 1주, 1개월 또는 6개월 또는 그 초과 후에 환자에 존재하는 섬유증의 양에서 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 심지어 50% 또는 그 초과의 감소를 갖는다. 이러한 화합물의 투여는, 예를 들어, 적어도 1일 기준으로 이루어질 수 있다. 화합물은 경구로 투여될 수 있다. 본원에 개시된 화합물을 투여한 결과로서 환자에서의 섬유증의 임상 징후의 지연은, 화합물, 예컨대 본원에 개시된 것을 투여하지 않은 환자와 비교시, 적어도, 예를 들어 6개월, 1년, 18개월 또는 심지어 2년 또는 그 초과일 수 있다.
치료를 필요로 하는 환자는 간경변증으로 발전되는 간 섬유증을 가질 수 있다. 간 섬유증의 위험이 있는 환자는 B형 간염, C형 간염 또는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 갖는 환자를 포함할 수 있다. NASH는 지방증 및 간경변증을 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 스펙트럼에 포함된다. NASH는 대사 증후군의 구성요소이고, 이는 비만, 제2형 당뇨병 및 이상지혈증을 특징으로 하고, 점차 간세포성 암종으로 이어질 수 있다.
간 섬유증과 연관된 장애를 치료하는 방법, 예컨대 특정의 축적 질환 및 선천성 대사 이상, 예컨대, 알파 1-항트립신 결핍, 구리 축적 질환 (예를 들어, 윌슨병), 프룩토스혈증, 갈락토스혈증, 글리코겐 축적 질환 (예를 들어, 유형 III, IV, VI, IX 및 X), 철-과부하 증후군 (예를 들어, 혈색소증), 지질 이상 (예를 들어, 고셔병), 퍼옥시좀 장애 (예를 들어, 젤웨거 증후군) 및 티로신혈증; 박테리아 감염 (예를 들어, 브루셀라증); 기생충 감염 (예를 들어, 포충증); NASH; 바이러스 감염 (예를 들어, B형 간염 또는 C형 간염, 예컨대 만성 B형 또는 C형 간염); 버드-키아리 증후군; 심부전; 간 정맥-폐쇄성 질환; 및 문맥 혈전증 중 하나 이상의 치료가 또한 제공된다. 선천성 간 섬유증을 치료하는 방법이 또한 고려된다. 조성물은 경구로 투여될 수 있다.
약물 및/또는 알콜의 남용은 간 섬유증의 사례와 연관되어 있다. 약물 및/또는 알콜 남용의 병력을 갖는 환자에서 간 섬유증을 치료하는 방법이 본원에 고려된다. 예를 들어, 알콜, 아미오다론, 클로르프로마진, 이소니아지드, 메토트렉세이트, 메틸도파, 옥시페니사틴 및 톨부타미드 중 하나 이상을 남용한 병력을 갖는 환자.
장 섬유증의 위험이 있는 환자는 궤양성 결장염, 염증성 장 질환 또는 크론병을 갖는 환자를 포함할 수 있다. 위험이 있는 환자는 또한 크론병 또는 결장염, 광범위 및/또는 중증 결장 질환의 진단시 이른 연령을 갖는 환자, 원발성 경화성 담관염의 존재를 갖는 환자 및/또는 암의 가족력을 갖는 환자를 포함할 수 있다.
장 섬유증과 연관된 장애를 치료하는 방법, 예컨대 궤양성 결장염, 염증성 장 질환 또는 크론병 중 하나 이상의 치료가 또한 제공된다.
신섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증 또는 신성 전신섬유증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 PPARy 작용제, 예컨대 본원에 개시된 화합물을 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 신섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증 또는 신성 전신섬유증을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 고려된다.
본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 서로 조합하여 사용될 수 있고, 여기서 본 발명의 적어도 2종의 화합물은 함께 단일 조성물에서 또는 치료 요법의 일부로서 사용된다. 본 발명의 화합물은 또한 약물 및/또는 알콜 남용, 신섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증 또는 신성 전신섬유증, 약물 및/또는 알콜 남용을 치료하기 위한 다른 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
일반적으로, 활성 성분의 치료 유효량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 임의로 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 임의로 약 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위에 있을 것이다. 투여된 양은 변수, 예컨대 치료하려는 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 특정한 환자의 전반적 건강 상태, 전달되는 결합 단백질의 상대적 생물학적 효능, 결합 단백질의 제제, 제제 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로에 의존할 것이다. 투여된 초기 투여량은 목적하는 혈액-수준 또는 조직 수준을 빠르게 달성하기 위해 상한 수준 초과로 증가될 수 있거나, 또는 초기 투여량은 최적보다 더 적을 수 있고, 1일 투여량은 특정한 상황에 따라 치료 과정 동안 점차 증가될 수 있다. 인간 투여량은, 예를 들어 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 수행하도록 설계된 통상의 제I상 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량 및 치료하려는 질환 상태와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 일 1회, 주 1회 및 매 2주 1회이다.
고려되는 제제 또는 조성물은 개시된 화합물을 포함하고, 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본원에 고려되는 조성물은, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 그의 의도된 용도에 따라, 다양한 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 경구로 투여되는 경우에, 이들은 정제, 캡슐, 과립, 분말 또는 시럽으로서 제제화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제제는 주사 (정맥내, 근육내 또는 피하), 점적 주입 제제 또는 좌제로서 비경구로 투여될 수 있다. 눈 점막 경로에 의한 적용에 대하여, 본 발명의 조성물은 점안액 또는 안 연고로서 제제화될 수 있다. 이들 제제는 통상의 수단에 의해 제조될 수 있고, 원하는 경우에, 상기 조성물은 임의의 통상의 첨가제, 예컨대 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 교정제, 가용화제, 현탁 보조제, 유화제 또는 코팅제와 혼합될 수 있다.
본 발명의 제제에서, 습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 술페이트 및 스테아르산마그네슘, 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제는 제제화된 작용제에 존재할 수 있다.
대상 조성물은 경구, 비내, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 에어로졸 및/또는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일 용량을 제조할 수 있는 조성물의 양은 치료받는 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 달라진다.
이들 제제를 제조하는 방법은 담체 및 임의로 하나 이상의 부속 성분을 본 발명의 조성물과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 작용제를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하고 친밀하게 회합시키는 단계, 및 이어서 필요한 경우에 제품으로 성형하는 단계에 의해 제조된다.
경구 투여에 적합한 제제는 캡슐, 카쉐, 환제, 정제, 로젠지 (향미제 기재, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 파스틸 (불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용함)로서의 형태일 수 있고, 각각은 활성 성분으로서 그의 대상 조성물의 예정량을 함유한다. 본 발명의 조성물은 또한 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태 (캡슐, 정제, 환제, 필름-코팅된 정제, 당-코팅된 정제, 분말, 과립 등)에서, 대상 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 다음 중 임의의 것과 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; (3) 함습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대, 예를 들어, 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트 및 그의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 환제의 경우에, 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 락토스 또는 유당과 같은 부형제, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
제제 및 조성물은 개시된 화합물의 마이크로화된 결정을 포함할 수 있다. 화합물의 결정 단독, 또는 결정 및 제약 부형제 또는 담체의 일부 또는 전부의 혼합물에 대해 마이크로화가 수행될 수 있다. 개시된 화합물의 마이크로화된 결정의 평균 입자 크기는 예를 들어 약 5 내지 약 200 마이크로미터, 또는 약 10 내지 약 110 마이크로미터일 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께, 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 결합제 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제 (예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제를 사용하여 보습된 대상 조성물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제, 및 다른 고체 투여 형태, 예컨대 필름 코팅된 정제 또는 당 코팅된 정제, 캡슐, 환제 및 과립은 임의로 스코어링되거나, 또는 코팅 또는 쉘, 예컨대 장용 코팅 또는 제약 제제화 분야에서 널리 공지된 다른 코팅으로 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 투여 형태는 대상 조성물 이외에도 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 예를 들어 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 시클로덱스트린 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
현탁액은 대상 조성물 이외에도 현탁화제, 예를 들어 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여를 위한 제제는 좌제로서 제공될 수 있고, 이는 대상 조성물을 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로 체강에서 용융되고 활성 작용제를 방출할 것이다. 질 투여에 적합한 제제는 또한 당업계에 공지된 바와 같은 이러한 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제를 포함한다.
대상 조성물의 경피 또는 국소 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분을 멸균 조건 하에 제약상 허용되는 담체, 및 필요할 수 있는 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 대상 조성물 이외에도 부형제, 예컨대 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화아연, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 대상 조성물에 이외에도 부형제, 예컨대 락토스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가로 통상의 추진제, 예컨대 클로로플루오로히드로카본 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예컨대 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 화합물은 대안적으로 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 이는 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성될 수 있다. 비-수성 (예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 음파 네뷸라이저는 대상 조성물에 함유된 화합물의 분해를 초래할 수 있는 전단에 작용제 노출을 최소화하기 때문에, 음파 네뷸라이저가 사용될 수 있다.
보통, 수성 에어로졸은 통상의 제약상 허용되는 담체 및 안정화제와 함께 대상 조성물의 수성 용액 또는 현탁액을 제제화함으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정한 대상 조성물의 요건에 따라 다양하지만, 전형적으로 비-이온성 계면활성제 (트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜), 혈청 알부민과 같은 무해 단백질, 소르비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 아미노산, 예컨대 글리신, 완충제, 염, 당 또는 당 알콜을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로부터 제조된다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 바로 사용 전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 대상 조성물을 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 제제를 의도되는 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 시클로덱스트린을 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 대상 조성물을 사용하는 치료 효능은 당업자에게 공지된 다수의 방식으로 결정될 수 있다.
명세서 전반에 걸쳐, 조성물이 특정한 성분을 갖거나, 비롯하거나 또는 포함하는 것으로 기재되어 있는 경우에, 조성물은 또한 언급된 성분으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 것이 고려된다. 유사하게, 방법이 특정한 가공 단계를 갖거나, 비롯하거나 또는 포함하는 것으로 기재되어 있는 경우에, 그 방법은 또한 언급된 가공 방법 단계로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다. 달리 지시되는 경우를 제외하고는 단계의 순서 또는 특정 작용을 수행하는 순서는 본 발명이 작동가능하게 남아있는 한 중요하지 않다. 더욱이, 달리 나타내지 않는 한, 둘 이상의 단계 또는 작용은 동시에 수행될 수 있다.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 하기 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공되며, 이는 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 간 섬유증 연구
간 섬유증을 사염화탄소 (CCl4)의 주사에 의해 수컷 C57bl6 마우스 (챨스 리버(Charles River), 프랑스 라브레슬)에서 유발하였다. C57bl6 마우스는 22-25 g으로 칭량되었고, 실험실 조건에서 실험 전 1주 동안 유지하였다. 동물을 먹이와 물에 자유롭게 접근하게 하면서 케이지당 5마리씩 하우징하였다.
연구는 5개 시험 군으로 구성되었다 (표 1 참조): 대조군 위관영양 (CG), 대조군 복강내 (CIP), 사염화탄소 (CCl4), 화합물 34 및 JWH-133 작용제 (문헌 [Julien et al., (2005) Gastroenterology 128: 742-755] 참조 (JWH-133에 대해, CB2-특이적 효능제 및 항섬유화제)).
<표 1>
Figure 112014084122781-pct00020
화합물 34 (PPARg의 특이적 리간드)의 효능을 JWH-133 (항섬유화제)과 비교하여 평가하였다. 화합물 34를 약 5주 동안 CCl4 주사와 조합하여 경구로 투여하였다. 화합물 34를 30 mM 용액 200 uL로 매일 투여하였다. JWH-133을 복강내 주사를 통해 3 mg/kg (용량 부피 = 100 uL)으로 매일 투여하였다. 5주 동안 CCl4의 증가된 투여량에 만성 노출시킴으로써 간 섬유증 모델을 유발하였다. 제1주에, 마우스는 올리브 오일 중 재현탁시킨 CCl4의 복강내 주사를 투여량 80μl/kg (마우스 체중)으로 주 2회 제공받았다. 제2주에, 투여량 160μl/kg의 CCl4의 3회 주사를 격일로 수행하였다. 제3주에, 투여량 240μl/kg의 CCl4의 3회 주사를 격일로 수행하였다. 제4주에, 투여량 320μl/kg의 CCl4의 3회 주사를 격일로 수행하였다. 마우스를 제5주에, 마지막 CCl4 투여 3일 후에 안락사시켰다.
체중을 실험 지속기간 동안 기록하였다. 도 1에서 보여지는 바와 같이, 체중 전개에서 다양한 군의 마우스 사이에서의 어떠한 검출된 차이도 존재하지 않았다.
간을 절제하고, 분취물을 액체 질소 중에서 스냅 동결시키고, 분석시까지 - 80℃에서 유지하였다. 각각의 간 부분의 일부를 조직학을 위해 10% 포르말린으로 고정시켰다.
실시예 2: 간 섬유증 연구의 조직학 분석
포르말린-고정된 간 조직을 가공하고, 5μm 두께의 파라핀 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 피크로시리우스 레드(Picrosirius red) 염색 (조직 절편 중 콜라겐에 대한 특이적 착색)으로 염색하여 간에서 섬유증의 정도를 평가하였다. 메타비르 점수 (메타비르 점수 차트에 대해 도 2a 참조)를 사용하여 각 간엽에 대한 섬유증 정도 (5가지)의 정량화를 위해 3명의 상이한 실험자가 각 절편을 맹검식으로 분석하였다. 도 2b에 보여진 사진은 20x 대물렌즈로 관찰하였다. 대조군은 F0 점수를 가졌고, CCl4 군은 F3 점수를 가졌으며, 이는 간의 섬유증을 나타내었다. 화합물 34 (GED)는 JWH-133 군보다 섬유증에서 더 큰 감소를 나타내었으며, 각각의 점수는 화합물 34의 경우에 F1 및 JWH-133의 경우에 F2였다.
예상대로, 2개 군의 대조 마우스 (대조군 위관영양 (CG) 및 대조군 IP (CIP))에서는 섬유증이 전혀 관찰되지 않았다. 단지 비히클만을 제공받는 섬유화 마우스의 군 (CCl4 군)에서는, 메타비르 점수에 따라 중등도 내지 중증 섬유증에 상응하는 평균 점수 2.5±0.5가 관찰되었다 (도 3a 참조). JWH-133 또는 화합물 34 (GED)를 제공받는 섬유화 마우스에 대해, 각각 2±0 및 2.1±0.2의 점수가 관찰되었다. 중증에서 중등도 섬유증으로의 섬유증 정도의 감소는 JWH-133 및 GED 둘 다에 대해 유사한 효능으로 관찰되었다.
이들 결과를 변형된 메타비르 점수를 사용하여 확인하였고 (도 3b): 메타비르 점수 (점수 (1개 절편) = Σ (PTF1 + PTF2 + PTF3 + PTF4))에 따라 F0 내지 F4로 분류되는 > 30개 문맥로의 낮은 배율 (X5)에서의 정량화를 위해 2명의 연구자가 각 간 절편을 맹검적으로 분석하였다. 이 점수를 사용하여, JWH 및 GED가 비처리 동물과 비교시 섬유화 점수를 각각 14.2% 및 12.5% 감소시키고, 2종의 시험된 분자의 치료 효과가 유사하게 보인다는 것이 입증되었다.
실시예 3: 간 섬유증 연구의 유전자 발현 분석
화합물 34 (GED) 및 특이적 CB2 효능제 (JWH-133)의 투여 효과를, 시토카인 (IL-1β, TNF-α) 및 섬유증 메카니즘에 관련된 유전자의 유전자 발현 수준에 대해 정량적 실시간 PCR에 의해 평가하였다.
총 RNA를 Rneasy 키트 (마슈레 나겔(Macherey Nagel), 프랑스 회르트)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 간으로부터 단리하였다. RNA 정량화를 분광광도측정법을 사용하여 수행하였다. 37℃에서 30분 동안 20-50 유닛의 RNase-무함유 DNase I (로슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation), 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로 처리한 후에, 올리고-dT 프라이머 (로슈 다이아그노스틱스 코포레이션, 미국 인디애나폴리스)를 사용하여 단일-가닥 cDNA를 합성하였다. SYBR 그린 마스터 믹스 (어플레라(Applera), 프랑스 코르타뵈)를 뮤린 특이적 올리고뉴클레오티드 (표 2 참조)와 함께 진앰프 아비프리즘(GeneAmp Abiprism) 7000 (어플레라, 프랑스 코르타뵈)에서 사용하여 mRNA를 정량화하였다. 각 검정에서는, 보정 및 비-주형 대조군을 포함하였다. 각 샘플을 삼중으로 실행하였다. SYBR 그린 염료 강도를 아비프리즘 7000 SDS 소프트웨어 (어플레라, 프랑스 코르타뵈)를 사용하여 분석하였다. 모든 결과는 영향받지 않은 하우스키핑 유전자 β-액틴에 대해 정규화하였다.
<표 2>
Figure 112014084122781-pct00021
상이한 군의 마우스에서 시토카인 유전자 발현의 유의한 변형이 존재하지 않았다. 섬유증의 메카니즘에 관련된 유전자에 대하여, 섬유증을 갖는 동물 (CCl4 군)에서의 a-SMA 및 콜라겐-1의 발현의 증가가 대조 동물 (CG 및 CIP 군)과 비교시 관찰되었다. 도 4 및 표 3에 보여지는 바와 같이, GED 및 JWH-133 군의 마우스에서 α-SMA 및 콜라겐-1의 수준에서의 감소가 CCl4 군 (섬유증 대조군)과 비교시 존재하였다. 콜라겐-1의 수준에 있어서, 화합물 34에 의해 처리된 마우스의 군에 대한 감소가 CCl4 마우스와 비교시 유의하였다 (각각, 42.81±14.81, p=0.03 vs. 75.15±5.23). 화합물 34로 처리된 마우스에서 관찰되는 조직학적 개선과 함께 생물학적 데이터는 화합물 34가 치유적 항섬유화 특성을 가질 수 있음을 시사한다.
<표 3>
Figure 112014084122781-pct00022
실시예 4: 간 섬유증 연구의 간 혈액 효소 분석
화합물 34 (GED) 및 특이적 CB2 효능제 (JWH-133)의 경구 투여 효과를 마우스의 혈청 중에서 다양한 간 생화학적 파라미터에 대해 평가하였다: 간 효소 (알라닌 아미노트랜스퍼라제 (AST) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (ALT)), 감마 GT 및 알칼리성 포스파타제.
예상대로, CCl4 마지막 투여 4일 후에 AST, ALT 및 Alk P의 증진이 어떠한 마우스 군에서도 관찰되지 않았다. 화합물 34는 혈액 간 효소의 임의의 증진과 연관되지 않았고, 이는 간 독성의 부재를 시사한다.
조직학 및 간 마커에 의해 평가된 바와 같이, JWH-133 및 화합물 34는 CCl4의 반복 주사에 의해 유발된 간 섬유증을 갖는 마우스에서 유사한 항섬유화 효과를 갖는다. 예상대로, JWH는 간 섬유화 병변을 14% 감소시키고, 콜라겐-1 mRNA의 간 농도를 정상화한다. 화합물 34는 간 독성 없이 유사한 효과를 갖는다. 상기 데이터는 화합물 34가 항염증 및 항섬유화 특성 둘 다를 갖는 제1 화합물일 수 있음을 시사한다.
실시예 5: 장 섬유증 연구
본 실시예는 장 섬유증에 대한 화합물 34의 효과를 평가하기 위한 실험을 기재하고 있다. 5일 동안 멸균 음용수 중에 용해시킨 2.5% DSS (40,000-50,000 MW, TdB 컨설턴시 AB(TdB consultancy AB), 스웨덴), 이어서 7일 동안 통상의 음용수의 3 사이클에 의해 C57bl6 마우스에서 만성 결장염을 유발하였다.
연구는 3개 시험 군으로 구성되었다 (표 4 참조): 대조군, DSS 대조군, GED (화합물 34) 군.
<표 4>
Figure 112014084122781-pct00023
화합물 34를 그의 최적 투여량 (30 mM)으로 사용하고, DSS의 제2 사이클 후 및 안락사까지 경구 위관영양법에 의해 매일 투여하였다. DSS를 제공받는 마우스를 체중을 모니터링함으로써 결장염의 진행에 대해 주 2회 체크하였다. 마우스의 안락사를 DSS의 제3 사이클 1주 후에 수행하였다 (도 5 참조). 결장의 크기 및 중량 평가는 사후에 평가하였다.
실시예 6: 장 섬유증 연구의 분석
A. 결장 중량/크기 비
장 섬유증은 결장의 단축 및 비후, 및 유착을 특징으로 한다. 결장의 중량/크기 비 측정치는 염증 및 섬유증 수준의 지시인자이다. 도 6a에 보여지는 바와 같이, 결장 중량/크기 비에서의 유의한 124% 증가가 비히클을 제공받는 DSS 마우스에서 단지 통상의 물을 제공받는 대조 마우스와 비교시 관찰되었다 (각각, 44.98 ±6.31 vs 20.11 ±3.91, p<0.05). 이들 결과는 DSS 마우스에서 결장의 중요한 단축에 의해 예시된다 (도 6b). 화합물 34는 결장의 중량/크기 비를 유의하게 감소시키는 DSS의 섬유화유발 효과에서 비히클을 제공받는 DSS 마우스와 비교시 34% 감소를 야기하였다 (38.13 ±7.82 vs 44.98 ±6.31 (p<0.05))(도 6a). 따라서, 이는 섬유증의 형태학적 징후, 예컨대 결장의 단축 및 비후를 감소시키고, 이는 결장에서 콜라겐 침착물을 감소시킨다 (도 6b).
B. 조직학에 의해 추정되는 염증 수준
결장의 횡행 부분의 고리를 샘플링하고 (사후), 4% 포름알데히드 중에 고정시키고, 조직학적 분석을 위해 파라핀 중에 포매시켰다. 절편 (4μm)을 메이-그룬발트-김자로 염색하였고, 2명의 연구자는 다중파라미터 조직학적 점수화 (0 내지 18)를 맹검적으로 수행하였다. 이 염색은 염증의 정량화를 허용하였다. 염증 수준을 반영하는 조직학적 등급은 점막의 세포 침윤물, 점막하 층에서의 그의 확장 및 상피 병변의 존재를 기준으로 할당하였다 (표 5 참조).
<표 5>
Figure 112014084122781-pct00024
염증성 상태를 전형적 MGG 염색을 사용하여 마우스의 각 결장에 대한 조직학적 수준에서 평가하였다. 예상대로, 유의하고 강한 염증이 DSS를 제공받는 마우스의 군에서 통상의 물을 제공받는 대조 마우스와 비교시 관찰되었다 (각각, 3.77±0.80 vs. 0.50± 0.33, p<0.05) (도 7 참조). 이 결과는 DSS의 3 사이클에 의한 염증 유발을 확인하였다. 염증 수준에서의 유의한 감소가 화합물 34를 제공받는 DSS 마우스에서 단지 비히클만을 제공받는 DSS 마우스와 비교시 관찰되었다 (각각, 2.18±0.48 vs. 3.77±0.80, p<0.05).
C. 섬유증의 수준
C1. 피크로시리우스 레드 염색에 의한 평가
수득된 결장 샘플을 PBS 중 10% 완충된 포르말린 (pH 7.4)으로 3시간 동안 즉시 고정시키고, 농도구배 에탄올 중에서 탈수시키고, 저온-융합 파라핀 중에 포매시켰다. 포르말린-고정된 결장 조직을 가공하고, 5μm 두께 파라핀 절편을 조직학적 분석을 위해 피크로시리우스 레드 염색으로 염색하였다. 사진을 x20 대물렌즈로 획득하였다. 0 내지 4의 점수를 사용하여 섬유증 정도의 정량화를 위해 3명의 상이한 실험자가 각 절편을 맹검적으로 분석하였다.
섬유증 수준의 유의한 증가는 DSS 마우스의 결장에서 대조 마우스와 비교시 관찰되었다 (각각, 2.27±0.12 vs 1.12±0.07) (도 8 참조). 이 결과는 DSS의 3 사이클에 의해 유발된 만성 염증이 장 섬유증을 유발한다는 것을 확인한다. 이것은 또한 DSS 마우스에 대한 화합물 34의 투여가 단지 비히클만 제공받는 DSS 마우스와 비교시 섬유증의 수준을 감소시킨다는 것을 확인한다 (1.625± 0.15 vs. 2.27±0.12, p<0.05).
C2. 트리크롬 마송 염색에 의한 평가
트리크롬 마송 및 콜라겐 염색을 결장 섬유증의 수준의 평가에 사용하였다. 수득된 결장의 샘플을 PBS 중 10% 완충된 포르말린 (pH 7.4)으로 3시간 동안 즉시 고정시키고, 농도구배 에탄올 중에서 탈수시키고, 저온-융합 파라핀 중에 포매시켰다. 일련의 3 μm 절편을 메탄올 및 3% 과산화수소 용액 중에 40분 동안 인큐베이션하고, 이어서 PBS 중에 헹구었다. 장 섬유증을 트리크롬-양성 결합 조직 염색의 밀도 및 확장, 및 조직 구조의 파괴에 따라 부재, 경도 또는 중증으로 점수화하였다.
C3. 콜라겐 수준의 평가
면역조직화학적 분석을 위해, 결장으로부터의 조직 시편을 새로운 4% 파라포름알데히드 (PFA)/ PBS 용액 중에서 3시간 동안 실온에서 고정시키고, 농도구배 에탄올 시리즈 중에서 탈수시키고, 저온-융합 파라핀 중에 포매시켰다. 3-μm-두께 절편을 메탄올 중에 40분 동안 및 이어서 3% 과산화수소 중에 5분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 콜라겐 유형 I-III (압캠(Abcam)), 결합 조직 성장 인자 (CTGF) (압캠), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), SMAD2/3, 섬유증의 주요 마커에 대한 특이적 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 5분 동안 세척하고, 스트렙타비딘-비오틴-퍼옥시다제 접합된 2차 항체 (다코 LSAB 코포레이션(Dako LSAB Corporation), 코드 K0675, 다코-시토메이션(Dako-Cytomation), 밀라노)와 함께 인큐베이션하였다. 10분 동안 PBS 중 세척 후에, 절편을 3,3-디아미노벤지딘-테트라히드로클로라이드와 함께 1-3분 동안 인큐베이션에 적용하였다.
면역 반응의 특이성을 1차 항체를 생략하여 수행하였다. 최종적으로 샘플을 메이어(Mayer)의 헤마톡실린으로 염색하고, 올림푸스(Olympus) BX51 광학 현미경 (올림푸스, 옵티칼 캄파니 리미티드(Olympus, Optical Co. Ltd.), 일본 도쿄) 하에 관찰하였다.
DSS 및 대조 마우스로부터의 결장에서 콜라겐 I-VII의 면역조직화학적 분석 (x 20)에서, DSS 마우스의 대장에서의 콜라겐 I-VII의 염색은 점막하의 결합 조직 및 고유근 내에 주로 국재화되고, 여기서 콜라겐의 강한 염색이 관찰되었다 (도 9 참조). 도 9에 보여지는 바와 같이, 화합물 34의 투여는 콜라겐 염색에서의 감소와 연관되며, 이는 그것이 섬유증을 개선하고 장 섬유증의 발병을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
항염증 효과 이외에도, 화합물 34의 투여는 섬유증으로 이어지는 분자 사건을 신속하게 감소시키고, 마우스에서 DSS에 의해 유발된 장 섬유화 병변을 예방한다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 0.5 cm의 동결된 결장 샘플을, 100 mM 플루오린화나트륨 (NaF), 2 mM 오르토바나듐산나트륨 (Na3VO4), 10 mM 피로인산나트륨 (NaPPi), 1 mM 페닐메탄술폰 (PMSF), 및 10 μg/mL 류펩틴 및 아프로티닌을 함유하는 전형적 프로테아제-억제제 칵테일로 보충된, 50 mM 트리스(Tris) HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 5mM EDTA, 1% 트리톤(Triton)-X 및 10% 글리세롤을 함유하는 RIPA 완충제 중에서 균질화시켰다.
각 샘플에 대해, 30 μg의 단백질을 PAGE에 의해 분리하고, 일렉트로블롯팅하였다. 니트로셀룰로스 막 (100% 순도)을, 0.1% TBS-t 중 5% 무지방 밀크 중에 희석된, CTGF, 콜라겐-I 및 GAPDH에 대한 1차 항체 (압캠 (영국 캠브리지)으로부터 구입; 1:1000, 2시간 동안, 실온에서)와 함께 인큐베이션하였다 (각 항체에 대한 특정한 프로토콜에 따름). 후속적으로, 막을 TBS-t 0.1% 중에 세척하고, 0.1% TBS-t 중 5% 무지방 밀크 중에 희석된 2차 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 항체 (항-토끼 및 항-마우스; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich); 1:20000, 1시간 동안, 실온에서)와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 면역검출을 슈퍼시그널 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 화학발광 기질 (써모 사이언티픽 피어스(Thermo Scientific Pierce), 에렘보데겜)을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 막을 자가방사법 필름 (후지 포토 필름 캄파니(Fuji Photo Film Co.), 독일 뒤셀도르프)에 노출시켰다. 표적 밴드의 광학 밀도는 컴퓨터-보조 덴시토미터 및 이미지제이(ImageJ) 공공 도메인 소프트웨어(W. S., 라스밴드(W. S., Rasband), 이미지제이, 미국 국립 보건원, 메릴랜드주 베데스다; http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2011)를 사용하여 결정하였다. 조직 수준을 총 단백질 정량당 광학 밀도 (OD)의 단위로 표현하였고, 내부 대조군 GAPDH로 정규화하였고, 그 결과를 대조군의 퍼센트로 표현하였다.
IHC 방법 및 특이적 항체를 사용하여, 섬유증의 주요 마커 (콜라겐 I-III, CTGF, SMAD 2/3, PDGF, α-SMA 및 TGF-β1)의 감소가 GED를 제공받는 DSS 마우스의 결장에서 비히클을 제공받는 결장염 마우스와 비교시 관찰되었다 (도 9a-9e 참조).
이들 결과를 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 확인하였고, 다양한 섬유증 마커의 정량화를 전체 결장 샘플에서 수행하였다 (도 10 참조). 표 6에서 보여지는 바와 같이, 콜라겐 I, CTGF 및 IL-13의 발현의 유의한 감소가 GED에 의해 처리된 결장염 마우스에서 단지 비히클만을 제공받는 결장염 마우스와 비교시 관찰되었다 (콜라겐 I에 대해 90.75±19.91 vs. 284.4±63.86, p=0.012, CTG에 대해 55.75±17.53 vs. 115.1±16.88, p=0.029, 및 IL-13에 대해 88.88±14.01 vs. 189.5±28.71, p=0.007).
<표 6>
Figure 112014084122781-pct00025
실시예 7: 장 섬유증 연구
본 실시예는 장 섬유증을 치료하는데 있어서 화합물 34 (GED)의 효과를 평가하기 위한 실험을 기재하고 있다.
물질 및 방법
시험관내 실험
장비에르(Janvier) (프랑스 르 제네-생-아일)로부터 구입한 총 60마리 야생형 C57BL/6 마우스를 연구에 포함시켰다. 모든 마우스를 릴 (프랑스)에 있는 파스퇴르 인스티튜트(Pasteur Institute)의 특이적 병원체-무함유 설비에서 유지하였다. 동물 실험을 정부 가이드라인 N° 68/609/CEE에 따라 수행하였다.
만성 결장염의 유발
만성 결장염 및 섬유증을 음용수 중 2.5% (w/v) DSS의 경구 투여에 의해, 3 사이클 (5일 DSS, 7일 물) 동안 유발하였다. 동물을 먹이와 유체 섭취에 대해 매일 모니터링하였고, 연구 시작 및 그 후 매 3일마다 정기적으로 칭량하였다.
실험 설계
마우스를 무작위로 2개의 군으로 나누었다: i. DSS 및 ii. DSS + GED. 각각의 군은 25마리 마우스로 구성하였고, 단지 물만 제공받는 10마리 대조 동물과 비교하였다. GED (30mg/kg/마우스)를 0.5% 카르복시메틸셀룰로스 나트륨 염 (CMC; MW: 90,000 Da; 시그마 알드리치) 및 1% 트윈 80을 함유한 용액 중에 용해시키고, 경구 위관영양에 의해 매일 투여하였다 (100μl/마우스). GED를 제2 사이클 시작시 투여하였다.
결장염 경과의 평가
동물을 유체 섭취, 체중 변화에 대해 매일 관찰하고, 결장염의 징후, 예컨대 체중 감소, 설사, 직장 출혈 및 탈출증, 뿐만 아니라 전신 염증의 징후, 예컨대 입모, 졸음증 및 안와주위 삼출물에 대해 검사하였다.
샘플 회수 및 제조
최종적으로, 마지막 DSS 사이클 투여 7일 후에, 각각의 군의 동물을 깊은 CO2 마취 하에 경추 탈구에 의해 희생시키고, 개복을 수행하였다. 결장이 보여지고, 신속하게 절제하였다. 전체 결장-직장의 길이 및 결장-직장의 원위 8 cm의 중량을 측정하였다.
육안적 및 현미경적 결장 병변의 평가
육안적 결장 병변, 예컨대 확장, 두께 및 협착을 마우스 처리를 알지 못하는 독립적인 관찰자에 의해 점수화하였다. 결장으로부터의 조직 시편을 절개하고, 즉시 동결시키거나 또는 새로운 4% 포름알데히드 (FA)/ PBS 용액 중에서 3시간 동안 실온에서 고정시키고, 파라핀 포매를 위한 표준 절차가 이어졌다. 3 μm에서 횡단으로 절편화된 파라핀 포매된 조직을 헤마톡실린/에오신 염색에 적용하여 염증 정도를 평가하고, 마송 트리크롬을 사용하여 조직 결합 및 섬유증을 보다 잘 평가하였다. 이어서, 조직학적 점수 평가를 수행하는 2명의 병리학자가 염색된 절편을 올림푸스 BX51 광학 현미경 (올림푸스, 옵티칼 캄파니 리미티드, 일본 도쿄) 하에서 맹검적으로 관찰하였다: i. 궤양의 존재 (0=부재, 1= 작은 궤양, 2= 큰 궤양); ii. 염증 정도 (0=부재, 1= 경도, 2= 중등도 및 3=중증); iii. 병변의 깊이 (0=부재, 1= 점막하에서 확장하는 병변, 2= 고유근에서의 병변, 및 3= 장막에서의 병변); iv. 섬유증의 정도 (0=부재, 1= 경도, 2= 중등도 및 3=중증). 장 염증의 정도를 만성 염증성 침윤물의 밀도 및 확장, 배상 세포의 손실 및 장벽 비후에 따라 평가하였다. 총 현미경적 점수는 모든 점수의 합으로서 수득될 것이다 (가능한 최대 점수 =10).
장 섬유증을 트리크롬-양성 결합 조직 염색의 밀도 및 확장, 및 조직 구조 파괴에 따라 부재, 경도 또는 중증으로 점수화하였다.
면역조직화학
결장으로부터의 조직 시편을 절개하고, 새로운 4% 포름알데히드 (FA)/ PBS 용액 중에서 3시간 동안 실온에서 고정시키고, 농도구배 에탄올 시리즈 중에서 탈수시키고, 저온-융합 파라핀 중에 포매시켰다. 3-μm-두께 절편을 메탄올 및 3% 과산화수소의 용액 중에서 45분 동안 인큐베이션하였다.
샘플을 α-평활근 액틴 (α-SMA, 압캠), 콜라겐 유형 I-III (압캠), TGF-β1 (압캠), 결합 조직 성장 인자 (CTGF) (압캠), pSmad3 및 Smad3 (셀 시그널링(Cell Signaling)), Smad7 (임제넥스(Imgenex)), PPARγ (셀 시그널링)에 대한 특이적 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 5분 세척하고, 스트렙타비딘-비오틴-퍼옥시다제 접합된 2차 항체 (다코 LSAB 코포레이션, 코드 K0675, 다코-사이토메이션, 밀라노)와 함께 배양하였다. 10분 동안 PBS 중에서 1회 세척 후에, 절편을 3,3-디아미노벤지딘-테트라히드로클로라이드와의 인큐베이션에 1-3분 동안 적용하였다. 핵의 대조염색을 헤마톡실린 에오신에 의해 수득하였다. 면역 반응의 특이성은 1차 항체를 피하여 달성되었다. 최종적으로 샘플을 메이어의 헤마톡실린으로 염색하고, 올림푸스 BX51 광학 현미경 (올림푸스, 옵티칼 캄파니 리미티드, 일본 도쿄) 하에서 관찰하였다.
웨스턴 블롯 분석
동결된 결장 샘플 0.5 cm를 자르고, 100 mM 플루오린화나트륨 (NaF), 2 mM 오르토바나듐산나트륨 (Na3VO4), 10 mM 피로인산나트륨 (NaPPi), 1 mM 페닐메탄술폰 (PMSF), 및 10 μg/mL 류펩틴 및 아프로티닌을 함유하는 전형적 프로테아제-억제제 칵테일에 의해 보충된, 50 mM 트리스 HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 5mM EDTA, 1% 트리톤-X 및 10% 글리세롤을 함유하는 RIPA 완충제 중에서 기계적으로 균질화시켰다.
각 샘플에 대해 30 μg의 단백질을 PAGE에 의해 분리하고, 일렉트로블롯팅하였다. 100% 순도의 니트로셀룰로스 막을, 0.1% TBS-t 중 5% 무지방 밀크 중에 희석된, TGF-β1, CTGF, α-SMA, 콜라겐-I 및 GAPDH에 대한 1차 항체 (압캠 (영국 캠브리지)으로부터 구입; 1:1000, 2시간 동안, 실온에서) 및 IL-13 (안티바디스(Antibodies) 온라인으로부터 구입함; 1:1000, 2시간 동안, 실온에서)와 함께 인큐베이션하였다 (각 항체에 대한 특정한 프로토콜에 따름). 후속적으로, 막을 TBS-t 0.1% 중에 세척하고, 0.1% TBS-t 중 5% 무지방 밀크 중에 희석된 2차 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 항체 (항-토끼 및 항-마우스; 시그마 알드리치; 1:20000, 1시간 동안, 실온에서)와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 면역검출을 슈퍼시그널 웨스트 피코 화학발광 기질 (써모 사이언티픽 피어스, 에렘보데겜)을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 막을 자가방사법 필름 (후지 포토 필름 캄파니, 독일 뒤셀도르프)에 노출시켰다. 표적 밴드의 광학 밀도는 컴퓨터-보조 덴시토미터 및 이미지제이 공공 도메인 소프트웨어(W. S., 라스밴드, 이미지제이, 미국 국립 보건원, 메릴랜드주 베데스다; http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2011)를 사용하여 결정하였다. 조직 수준을 총 단백질 정량당 광학 밀도 (OD)의 단위로 표현하였고, 내부 대조군 GAPDH로 정규화하였고, 그 결과를 대조군의 퍼센트로 표현하였다.
생체내 실험
세포 배양
인간 결장암 세포주 HT-29 (ATCC HTB-38) 및 결장 장 섬유모세포 (ATCC 인간 CDD-18 co)를 10% 태아 소 혈청 (FBS), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된, 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM) 및 알파-변형 이글 배지에서 각각 성장시켰다. 세포 배양을 37℃에서 95% 공기 및 5% CO2의 가습된 대기 중에서 유지하였다.
PPARγ 녹다운 세포 생성
PPARγ 녹다운 HT29를 pSUPER.레트로 시스템 (올리고유진((OligoEngine))을 사용하여 수득하였다. 인간 PPARγ mRNA의 뉴클레오티드 105-123에 상응하는 정방향 및 역방향 표적 서열 (5'-GCCCTTCACTACTGTTGAC-3' (서열 11))을 pSUPER레트로 벡터 (pRS)의 BglII/XhoI 제한 부위로 클로닝하여 ShPPAR 구축물을 제공하였다. 루시페라제 유전자에 대해 표적화된 서열 5'-ACGCTGAGTACTTCGAAAT-3' (서열 12)를 함유하는 음성 대조군 pRS 플라스미드를 생성하였다 (ShLuc 구축물). 구축물 둘 다를 아막사바이오시스템즈(AmaxaBiosystems)로부터의 뉴클레오펙터(Nucleofector) 기술을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HT-29 및 Caco-2 세포에 형질감염시켰다. 안정하게 형질감염된 클론을 퓨로마이신 (5μg/ml)으로 보충된 완전 배양 배지를 사용하여 형질감염-후 24시간에 선택하였다. PPARg 발현의 침묵화를 정량적 RT-PCR 및 웨스턴-블롯 분석에 의해 체크하였다. 확립되면, ShPPAR 및 ShLuc 세포주를 2.5μg/ml 퓨로마이신으로 보충된 완전 배지 중에 유지하였다.
실험 설계
혈청-무함유 배지 중에 용해된 TGF-β 1ng/mL 및 10 ng/mL로 4일 동안 hCCD-18 및 HT29를 각각 자극함으로써 섬유화 표현형을 유발하였다. 1mM의 GED (195.22 g/mol)를 분화 주기 동안 투여하였다. 추가로, PPARγ 활성화에 대한 잠재적 의존성을 이 수용체의 특이적 길항제인 GW9662를 사용함으로써 연구하였다. 10-5 M GW9662를 TGFβ-유발 분화 출발 4시간 전에 투여하였다.
정량적 RT-PCR
총 RNA를 뉴클레오스핀(Nucleospin) RNA 키트 (마슈레-나겔, 프랑스 회르트)를 사용하여 추출하였다. RNAse 불활성화 후에, DNAse 처리를 통해 총 RNA에서 미량 게놈 DNA를 제거하고, 이를 RNAse-무함유, DEPC-무함유수 중에 용리시켰다. RNA의 순도를 UV 분광분석법에 의해 220 내지 350 nm의 나노드롭(Nanodrop) 시스템에서 평가하고, 애질런트(Agilent) 2100 바이오분석기 상에서 프로파일링하였다. 1 μg의 총 RNA를 사용하여 로슈 다이아그노스틱스 (인디애나주 인디애나폴리스)로부터의 라이트사이클러패스트스타트 (LightCyclerFastStart) DNA 마스터 SYBR 그린 I을 제조업체 프로토콜에 따라 사용함으로써 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
결과
생체내 실험
마우스에서 만성 결장염에 대한 임상적 및 육안적 소견
DSS의 만성 경구 투여는 제1 DSS 사이클의 마지막날 (제5일)로부터 출발하여 모든 만성 마우스에서 체중 손실을 유발하였다. 제10일에 DSS를 제공받는 마우스는 대조 마우스와 비교시 보다 저체중을 나타내었다 (각각, 23.88 ± 0.31 vs. 25.27 ± 0.35 p<0.05) (도 11).
중등도 내지 중증 설사가 DSS 경구 투여 제7일에 DSS 처리된 마우스 중 70% 및 GED 마우스 중 50%에서 관찰되었다. 동일한 주기에서 전신적 증상, 예컨대 입모, 안와주위 삼출물 및/또는 기면이 DSS 마우스 중 40% 및 GED 마우스 중 30%에서 관찰되었다. 어떠한 단계에서도 명백한 직장 출혈 또는 직장 탈출증은 관찰되지 않았다. 마우스를 각각 제15일 및 제30일에 희생시키고, 결장을 결장 중량 (원위 대장의 마지막 8 cm에 적용됨) 및 결장 길이를 측정함으로써 및 부착, 협착, 확장, 두께의 존재를 관찰함으로써 육안적 평가에 적용하였고, 이는 부재한 경우에는 0; 경도 또는 중등도의 경우에는 1; 및 중증의 경우에는 2로 점수화하였다. 총 육안적 점수는 모든 이들 점수의 합계로서 계산되었다.
마우스에서 DSS-유발 만성 결장염의 경과 및 육안적 소견에 대한 GED 투여의 효과는 표 7에 요약하였고, 이는 GED가 육안적 병변 및 만성 DSS-유발 결장염을 개선하고, 섬유증의 형태학적 징후를 감소시킨다는 것을 나타내었다.
DSS 처리에서 관찰되는 모든 육안적 특징은 두 모델 모두에서 중증 조직 손상을 유발하는 DSS의 효과적인 능력을 나타내는 유의한 변화를 나타내었다. 모든 육안적 병변은 GED 처리에 의해 개선되고, 이는 DSS 및 DSS 플러스 GED 총 육안적 점수 사이의 유의한 차이를 결정하였다. 결장 중량 및 결장 중량/체중 비는 GED 처리 후에 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않았지만, 결장 길이는 유의하게 회복되는 것으로 나타났다. 결장의 직접 관찰은 실제로 DSS-처리된 샘플 대부분에서의 명백한 단축 및 확장, 및 GED 처리된 마우스에 대한 이들 특징의 감소를 나타내었다.
<표 7> 만성 결장염의 경과 및 육안적 소견에 대한 GED 투여의 효과
Figure 112014084122781-pct00026
따라서, 결장의 중량/크기 비를 염증 및 섬유증의 수준의 추가 지시인자로서 사용하였다. 상기 비에서 124%의 유의한 증가가 DSS-제공받는 마우스에서 단지 통상의 물을 제공받는 대조 마우스와 비교시 관찰되었다 (각각, 44.98 ± 6.31 vs. 20.11 ±3.91 (p< 0.05)). GED는 DSS 마우스와 비교시 결장의 중량/크기 비의 유의한 감소를 유도하였으며 (38.13 ±7.82 vs. 44.98 ±6.31 (p< 0.05)), 이는 DSS의 섬유화유발 효과에 대해 26% 감소를 유발하였다. 따라서, GED는 섬유증의 형태학적 징후, 예컨대 결장의 단축 및 비후를 감소시킬 수 있다.
만성 결장염에 대한 현미경적 소견
여러 조직학적 파라미터를 점막에서의 세포 침윤물의 밀도, 점막하 층에서의 염증 확장, 및 상피 병변 및 콜라겐 침착의 존재를 기준으로 하여 점수화하였다. 유의한 및 강한 염증이 DSS를 제공받는 마우스의 군에서 통상의 물을 제공받는 대조 마우스와 비교시 관찰되었다. 두 모델 모두에서의 조직학적 특징은 점막 궤양화 및 변성, 배상 세포의 감소, 광범위한 염증성 세포 침윤 및 점막하 부종을 나타내었다. 모든 이들 소견은 DSS-유발 만성 결장염에서 보다 강조되는 것으로 나타났고, 결장 벽의 광범위한 비후가 명백하였다. 또한, 만성 모델은 장기 처리에서 음와의 분명한 재생 및 염증 정도의 가능한 자발적 회복을 나타내었다 (도 12).
섬유증의 수준은 콜라겐 침착에 대해 특이적인 마송 트리크롬 염색에 의해 관찰되었다. 섬유증 수준의 유의한 증가가 대조 마우스와 비교시 DSS 마우스의 결장에서 뿐만 아니라 두 가지 처리 사이에서도 관찰되었다 (도 12). 이 증거는, 보다 낮은 염증 정도의 관찰과 함께, 섬유증이 염증 반응으로부터 시작하지만, 후속적으로 그와 독립적으로 진행할 수 있다는 가정과 일치하는 것으로 보인다.
총 현미경적 점수가 할당되고, DSS의 1 및 3 사이클에 의해 유발되는 높은 염증 정도 및 섬유증의 수준을 입증하고, GED의 매일 경구 투여 후에 유의하게 감소하였다 (GED에 대해 3.36 ± 0.55 vs. DSS에 대해 6.45 ± 0.82, p< 0.01) (도12).
주요 섬유증 마커의 조직 수준의 평가
DSS-유발 결장염의 만성 모델에서 섬유증의 주요 마커의 조직 수준을 면역조직화학적 분석으로 평가하고, 이뮤노블롯팅에 의해 확인하였다. 따라서, 섬유모세포 분화의 특이적 마커인 α-SMA (도 13a) 및 콜라겐 I-III (도 13b)의 뚜렷한 감소가 GED 처리의 경구 투여에 적용된 마우스의 결장에서 단지 DSS만 제공받는 마우스와 비교시 관찰되었다. 콜라겐 I-III 및 α-SMA의 발현 수준을 6마리 대조 마우스, 8마리 DSS 마우스 및 8마리 DSS + GED 마우스에서 측정하였다. 면역화학 및 웨스턴 블롯팅 둘 다는 모든 주요 섬유증 마커가 DSS를 제공받은 마우스의 군에서 통상의 물을 제공받는 대조 마우스와 비교시 유의하게 증가되었고, GED의 1일 투여가 이들의 감소된 발현과 연관됨을 나타내었다. 각 단백질의 발현 수준을 대조군 평균의 백분율로서 표현하였고, 각각의 관심 마커를 GAPDH와 같은 하우스키핑 단백질로 정규화하였다. 대조군과 비교시 DSS 마우스에서 콜라겐 I-III 발현의 뚜렷한 증가 (184%), 뿐만 아니라 α-SMA에 대한 25%의 적당한 상향조절이 관찰되었다. DSS-유발 만성 결장염을 갖는 마우스에서 GED의 경구 투여는 이들 단백질의 발현 수준에서의 감소를 야기하였고, 콜라겐 I-III에 대해 보다 유의하게 뚜렷하였다 (GED에 대해 90.75% ± 19.9% vs. DSS에 대해 284.4% ± 63.8%, p< 0.005).
GED는 TGFβ/Smad 경로 및 그의 특이적 활성화제, IL13을 제어한다.
TGFβ/Smad 경로를 다양한 수준에서 제어하는 GED의 능력은 면역조직화학적 분석에 의해 관찰되었고, 이 경로에 포함된 상이한 구성원, 예컨대 TGF-β1, Smad3, CTGF (데이터는 나타내지 않음)의 뚜렷한 감소를 입증하였다.
IL-13 발현 수준에서의 변화와 관련된 장 섬유증의 예방 또는 치료에서 GED의 이익이 관찰되었다 (도 14a). IL-13은 TGF β/Smad 경로의 특이적 활성화제였고, 이 측면은 TGF-β1 (도 14b) 및 CTGF (도 14c) 발현 수준에서의 결과적인 감소에 의해 확인되었다. DSS 마우스에서 IL-13의 증가된 발현은 GED의 경구 투여에 의해 상당히 회복되었다 (GED에 대해 88.88% ± 14.01% vs. DSS에 대해 189.5% ± 28.71%, p< 0.01). TGF-β1 및 CTGF의 발현 수준의 결과적인 감소는 이뮤노블롯팅 분석에 의해 확인되었고, CTGF에 대해 뚜렷한 유의성을 가졌다 (GED에 대해 55.57% ± 17.53% vs. DSS에 대해 115.1% ± 16.88%, p< 0.05). 발현 수준은 대조군과 비교하여 광학 밀도의 백분율로서 표현되고, GAPDH로 정규화하였다.
참고문헌 개재
본원에 언급된 각 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 내용이 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않는 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 점에서 본원에 기재된 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 여겨져야 한다. 따라서, 발명의 범위는 상기 기재내용에 의해서 보다는 첨부된 특허청구범위에 의해서 나타나고, 특허청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 그에 포괄되는 것으로 의도된다.
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Claims (22)

  1. 하기 화학식에 의해 나타내어진 2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산, 또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 입체이성질체를 포함하는, 장 섬유증 또는 특발성 폐 섬유증인 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에서 장 섬유증 또는 특발성 폐 섬유증인 섬유증을 치료하기 위한 조성물.
    Figure 112019068684668-pct00054
  2. 제1항에 있어서, 화합물이 (S)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산 또는 그의 제약상 허용되는 염인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 화합물이 (R)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산 또는 그의 제약상 허용되는 염인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 화합물이 경구로 투여가능하도록 적합화된 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 환자가 인간인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 장 섬유증인 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 특발성 폐 섬유증인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 환자가 또한 크론병, 염증성 장 질환 또는 궤양성 결장염을 앓고 있는 것인 조성물.
  9. 치료 유효량의 2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산, 또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 입체이성질체, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 장 섬유증 또는 특발성 폐 섬유증인 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에서 장 섬유증 또는 특발성 폐 섬유증인 섬유증을 치료하기 위한 제약 제제.
  10. 제9항에 있어서, 화합물이 (S)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제약 제제.
  11. 제9항에 있어서, 화합물이 (R)-2-메톡시-3-(4'-아미노페닐) 프로피온산 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제약 제제.
  12. 제9항에 있어서, 경구로 투여되는 제약 제제.
  13. 제9항에 있어서, 환자가 인간인 제약 제제.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 장 섬유증인 제약 제제.
  15. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 특발성 폐 섬유증인 제약 제제.
  16. 제14항에 있어서, 환자가 또한 크론병, 염증성 장 질환 또는 궤양성 결장염을 앓고 있는 것인 제약 제제.
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