ES2252874T3 - Utilizacion de acido linoleico conjugado para tratamiento de la diabetes mellitus tipo ii. - Google Patents

Utilizacion de acido linoleico conjugado para tratamiento de la diabetes mellitus tipo ii.

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ES2252874T3 ES98963884T ES98963884T ES2252874T3 ES 2252874 T3 ES2252874 T3 ES 2252874T3 ES 98963884 T ES98963884 T ES 98963884T ES 98963884 T ES98963884 T ES 98963884T ES 2252874 T3 ES2252874 T3 ES 2252874T3
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Abstract

La utilización de ácido linoleico conjugado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.

Description

Utilización de ácido linoleico conjugado para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.
Antecedentes de la invención
La presente invención trata sobre el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.
La diabetes es una de las enfermedades metabólicas más comunes y afecta a cientos de millones de individuos en todo el mundo. Existen dos formas de la diabetes mellitus: Tipo 1 (insulino-dependiente) y Tipo II (no insulino-dependiente). La enfermedad puede conducir a complicaciones serias, incluyendo hiperglicemia, macroangiopatía, microangiopatía, neuropatía, nefropatía y retinopatía. Los métodos para el tratamiento de la diabetes han incluido la administración de insulina en el caso de la diabetes tipo I y la administración de diversos agentes hipoglicémicos en el caso de la diabetes tipo II.
Muchos de los agentes hipoglucémicos conocidos muestran efectos secundarios no deseables, y en ciertos casos son tóxicos.
ZA-A-9-603 360 trata sobre un amplio rango de usos terapéuticos para mono- o diésteres de 1,3-propanodiol, en los cuales el/los residuos ácidos tienen 12-30 átomos de carbono. La especificación ZA revela (entre otras muchas posibilidades) la utilización de diésteres de 1,3-propanodiol en los cuales uno de los ácidos esterificantes es GLA o DGLA y el otro es GLA, DGLA, SA, EPA, DAJ, CLA o CA para el tratamiento de "complicaciones en la diabetes" y la "mejora de las respuestas de la insulina en la diabetes y en la pre-diabetes".
US-A-5 518 751 (equivalente a EP-A-624 317) revela la producción de leche y leche en polvo que incorporan una fracción grasa que contiene ácidos grasos libres insaturados (por ejemplo ácido oleico, ácido linoleico (que puede o no estar conjugado), ácido \alpha-linoleico y ácidos grasos C_{20} y C_{22} insaturados). Los ácidos grasos se incluyen con el propósito de prevenir o reducir las enfermedades cardiovasculares, atropías, desórdenes reumáticos o la diabe-
tes.
US-A-5 208 356 revela sales y ésteres de ácido linoleico conjugado (CLA) sustancialmente puras y no tóxicas que son útiles como antioxidantes y como inhibidores del crecimiento del moho. También se revelan métodos para la fabricación del isómero cis-9, trans-11 del ácido linoleico.
US-A-5 585 400 revela el tratamiento de animales frente a los efectos adversos de la hipersensibilidad mediada por tipo I o I_{R}E en el animal mediante la adminsitración de CLA (o de una sustancia que se convierte en CLA en el animal).
Journal of Nutrition, vol. 124, No. 5, 1994, páginas 694-701 revela que el CLA es producido en ratas convencionales pero no libres de microbios a las que se alimenta con ácido linoleico.
Por consiguiente, existe la necesidad de usos de composiciones adicionales para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II. La presente invención se halla dirigida a esta necesidad.
Estos y otros objetos y ventajas de la presente invención serán obvios a partir de las descripciones que se incluyen aquí.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra el mecanismo de acción de los proliferadores de peroxisoma.
La Fig. 2 muestra gráficos de la cantidad de cloramfenicol acetiltranferasa producida como porcentaje del control frente a la concentración de CLA y de WY 14,643 100 \muM con distintos subtipos de PPAR. Panel izquierdo, PPAR\alpha; Panel central, PPAR\beta; Panel derecho, PPAR\gamma.
La Fig. 3 muestra los efectos biológicos de la activación del receptor activado por proliferador de peroxisoma (PPAR) por CLA.
La Fig. 4 representa un gráfico de barras que muestra la extensión en la cual diversos isómeros de CLA activan los 3 distintos subtipos de PPAR. Todos los compuestos químicos se dieron a 100 \muM en dimetilsulfóxido (DMSC). Se muestran los controles positivos para PPAR\alpha (Wy 14,643), PPAR\beta (Bezafibrato; ácido 2-[4-[2-[(4-clorobenzoíl) amino]-etil]fenoxi]-2-metilpropanoico]) y PPAR\gamma (Troglitazona) para propósitos de comparación. El furano utilizado fue el ácido 8-(5-hexil-2-furil)-octanoico, que es un producto de oxidación del CLA.
Los datos muestran el promedio de dos experimentos.
La Fig. 5 representa gráficos de barras que muestran la extensión en la cual el CLA y diversos isómeros del CLA activan el PPAR\alpha completo. Panel A: muestra la activación del PPAR\alpha completo de ratón. Las células transfectadas se trataron durante seis horas con concentraciones crecientes de una mezcla de CLA (0 \muM, 5 \muM, 10 \muM, 50 \muM, 100 \muM, 150 \muM o 200 \muM).
Los asteriscos denotan valores que son significativamente distintos de las células tratadas con DMSO (p < 0.05, n = 3); Panel B: muestra la activación del PPAR\alpha completo por los diversos isómeros geométricos de CLA. Las células transfectadas se trataron durante seis horas con 100 \muM de cada uno de los activadores mostrados. Las distintas letras denotan diferencias significativas (p < 0.05, n=3).
La Fig. 6 representa un gráfico de barras mostrando la extensión en la cual el CLA y diversos isómeros de CLA activan el PPAR\beta completo de ratón. Las células transfectadas se trataron con 100 \muM de los compuestos indicados. Los asteriscos denotan diferencias significativas (p < 0.01, n=3).
La Fig. 7 representa un gráfico de barras mostrando la extensión en la cual el CLA y diversos isómeros de CLA activan el PPAR\gamma completo de ratón. Las células transfectadas se trataron durante seis horas con 100 \muM de los compuestos indicados. Los asteriscos denotan diferencias significativas (p < 0.05, n=3).
La Fig. 8 presenta un gráfico de barras que muestra los efectos del CLA sobre los marcadores de diferenciación en preadipocitos 3T3-L1. Las células de preadipocito de ratón se trataron a confluencia durante 48 horas con un medio de inducción que contiene la concentración indicada de CLA, Wy 14,643 (Wy) 100 \muM o un vehículo (DMSO). Posteriormente se añadió medio de inducción con insulina a las células.
Se llevó a cabo un ensayo de RT-PCR cuantitativo utilizando estándares internos específicos para cada gen. Los datos se expresan como el promedio de tres muestras como el porcentaje de células tratadas con DMSO que corrigen la expresión de \beta-actina.
La Fig. 9 presenta un gráfico de barras que muestra los efectos del CLA y de la troglitazona (TZD) sobre la expresión génica específica para un tejido. ACO y mAP2 se cuantificaron mediante RT-PCR.
Los asteriscos denotan una diferencia estadísticamente significativa respecto a las ratas alimentadas con la dieta de control (P < 0.05).
La Fig. 10 representa un gráfico que muestra el efecto del CLA en la dieta sobre la tolerancia a la glucosa. Se alimentaron ratas Zucker delgadas (Panel A) o fa/fa (obesas, Panel B) con dietas experimentales durante 14 días y se midió la tolerancia a la glucosa.
Los valores representan la glucosa promedio (mg/dl) \pm S. D. (n = 4 ratas delgadas u 8 ratas fa/fa).
Descripción de los ejemplos de realización preferidos
Con el propósito de facilitar la comprensión de los principios de la invención, se hará referencia a continuación a los ejemplos de realización preferidos y al lenguaje específico que se utilizará para describirlos.
La presente invención trata sobre el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II mediante la administración de una cantidad con eficacia terapéutica de CLA. La administración de CLA presenta la ventaja de normalizar la tolerancia a la glucosa en animales mientras que también reduce los niveles de insulina, triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma. La invención puede implicar la utilización de isómeros de CLA purificados o de mezclas purificadas de isómeros de CLA, por ejemplo una cantidad con eficacia terapéutica de ácido cis,cis-9,11-octadecadienoico purificado, ácido trans,cis-10,12-octadecadienoico purificado, una mezcla de ácido cis,trans-9,11-octadecadienoico y ácido trans,cis-9,11-octadecadienoico, u otro isómero purificado de CLA.
La invención abarca la utilización para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II en un animal de una cantidad con eficacia terapéutica de CLA, incluyendo sus sales, sus ésteres (incluyendo, por ejemplo, monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos), sus isómeros activos y sus mezclas. El término CLA hace referencia a un grupo de isómeros posicionales y geométricos del ácido linoleico (ácido cis,cis-9,12-octadecadienoico). Los isómeros posicionales incluyen los isómeros que tienen enlaces dobles bien en los átomos de carbono 9 y 11 o en los átomos de carbono 10 y 12, mientras que los isómeros geométricos incluyen los isómeros que tiene las configuraciones cis y/o trans. Así pues, existen diversos posibles isómeros del CLA, que incluyen, pero sin estar limitados a: ácido cis,cis-9,11-octadecadienoico; ácido cis,trans-9,11-octadecadienoico; ácido trans,cis-9,11-octadecadienoico; ácido trans,trans-9,11-octadecadienoico; ácido cis,cis-10,12-octadecadienoico; ácido cis,trans-10,12-octadecadienoico; ácido trans,cis-10,12-octadecadienoico; y ácido trans,trans-10,12-octadecadienoico. Los isómeros ácido cis,trans-9,11 y ácido trans,cis-9,11 todavía no han sido aislados independientemente el uno del otro y en la literatura se utiliza el término aproximado ácido cis,trans-9,11-octadecadienoico para hacer referencia a los isómeros cis,trans-9,11 y trans,cis-9,11.
El CLA utilizado en la presente invención puede prepararse utilizando las técnicas conocidas en el campo de la técnica y en la literatura, o puede obtenerse como un producto comercial.
El CLA se puede obtener comercialmente de compañías como, por ejemplo, Pharmanutrients, Inc., Lake Bluff, IL; NuChek Prep, Elysian MN; y Peak Nutrition, Syracuse, NE. Sin embargo, se prefiere el CLA vendido por
NuCheck Prep. Las proporciones relativas de los isómeros pueden variar en los CLA adquiridos comercialmente. La composición comercial también puede incluir otros ácidos grasos como ácido linoleico así como otros lípidos como hidrocarburos de cadena lineal con grupos terminales polares. Por ejemplo, la mezcla de CLA puede incluir otros ácidos grasos conocidos en el campo de la técnica, saturados o insaturados, o productos de degradación del CLA. La composición comercial puede incluir también antioxidantes como vitamina E, hidroxianisol butilado (BHA) o hidroxitolueno butilado (BHT). El CLA también puede sintetizarse mediante métodos conocidos en el campo de la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar CLA a partir de la isomerización del ácido linoleico utilizando, por ejemplo, una especie generadora de radicales y una proteína rica en residuos de azufre como las que se conocen en el campo de la técnica y tal como se describe en Dormandy TL, Wickens DG, Chem.Phys. Lipids 45: 353-64 (1987). Como otro ejemplo adicional, el CLA se puede sintetizar a partir de ácido linoleico o bien de aceite de cártamo bajo atmósfera inerte, con unos pasos posteriores de acidificación y extracción tal como se describe en la U. S. Patent No. 5,670,082 a Cook y col.. Además, algunos isómeros específicos de CLA, como el isómero trans,trans 9-11, el isómero cis,cis-9,11, el isómero cis,trans-9,11 (en combinación con el isómero trans,cis-9,11) y el isómero cis,trans-10,12 se pueden sintetizar, de hecho, en forma pura utilizando los métodos conocidos en el campo de la técnica. Las sales de CLA son aquellas conocidas en el campo de la técnica, incluyendo las sales de sodio y potasio.
El ácido linoleico utilizado para sintetizar el CLA, u otros ácidos grasos incluídos en la mezcla, puede obtenerse a partir de plantas, incluyendo aceites de soja, semilla de algodón, maíz, girasol, cártamo, colza y plama.
Los aceites de soja, maíz, girasol y cártamo son particularmente ricos en ácido linoleico. El ácido linoleico también se puede obtener a partir de la hidrólisis de triglicéridos aislados a partir de plantas mediante la extracción con un disolvente de la biomasa de la planta utilizando disolventes alifáticos. Las purificaciones adicionales posteriores pueden consistir en destilación, cristalización fraccional, descrudado, decoloración y extracción con vapor. Los triglicéridos pueden hidrogenarse como se considere necesario. Así pues, los triglicéridos pueden hidrolizarse mediante métodos enzimáticos (por ejemplo, mediante la utilización de lipasa) o químicos (por ejemplo, mediante hidrólisis alcalina) conocidos en el campo de la técnica. El ácido linoleico también puede sintetizarse a partir de alcoholes grasos petroquímicos. De forma alternativa, los ácidos grasos libres y los triglicéridos se pueden obtener de proveedores comerciales, incluyendo Cargill, Archer Daniel Midlands y Central Soya.
El CLA también se puede encontrar en la carne de rumiantes, productos lácteos pasteurizados y quesos procesados.
Además, se puede incrementar la cantidad de CLA en los productos lácteos mediante los métodos conocidos en el campo de la técnica. Por ejemplo, la cantidad de CLA en la leche de vaca se puede incrementar alimentando a la vaca en lactación con una dieta compuesta solamente de hierba o con una dieta que contenga alrededor de desde el 1% hasta alrededor del 5% en peso de un aceite vegetal que contenga ácido linoleico o ácido linolénico, tal como se describe en la U. S. Patent No. 5,770, 247 a Satter y col. El CLA también se puede obtener mediante una reacción de conversión enzimática del ácido linoleico tal como se conoce en el campo de la técnica. Por ejemplo, el CLA se puede preparar utilizando el enzima W^{11}-cis, W^{11}-trans-isomerasa. El enzima se puede obtener, por ejemplo, a partir de bacterias de rumen, como Butyrivibrio fibrisolvens. Los microorganismos inofensivos del tracto intestinal de ratas y otros animales monogástricos también se puede convertir el ácido linoleico en CLA tal como se describe en Chin, SF y col., FASEB J, 6 (1992).
El CLA se puede administrar de diversas formas. Por ejemplo, el CLA se puede administrar en forma de tabletas, en solución o emulsión, o en una cápsula. El CLA también se puede mezclar con un vehículo aceptable para su uso farmacéutico. Cuando se administra en forma de tabletas, puede incluir un vehículo sólido, por ejemplo, lactosa, almidón, carboximetil celulosa, dextrina, fosfato de calcio, carbonato de calcio, silicato de calcio sintético o natural, óxido de magnesio, hidróxido de aluminio seco, estearato de magnesio, bicarbonato de sodio, levadura desecada o una combinación de los anteriores. En solución, el vehículo puede ser un aceite pero es preferiblemente agua estéril o una solución salina estéril para administración parenteral. El CLA también puede administrarse como se administran otros fármacos conocidos en el campo de la técnica.
El CLA se puede administrar de diversas formas. Por ejemplo, el CLA se puede administrar tanto parenteralmente, como oralmente, de forma intravenosa, vía rectal, así como intraperitonealmente.
En otra característica de la invención, se ha descubierto que ciertos isómeros de CLA poseen una mayor actividad. Así pues, se pueden administrar isómeros purificados de CLA a animales que lo necesiten, y se pueden añadir a los productos alimentarios para formar una composición alimentaria. Los isómeros de CLA pueden añadirse al producto alimentario en cualquier forma, como en forma de polvo o en un aceite, como aceite de maíz, bien solo o con otro aceite, como aceite de coco. Una composición alimentaria preferida incluye un CLA compuesto de forma predominante (es decir, por encima del 50%) de una mezcla de ácido cis,trans-9,11-octadecadienoico y ácido trans,cis-9,11octadecadienoico purificados. Otra composición alimentaria beneficiosa puede incluir una mezcla compuesta de forma predominante de ácido cis,cis-9,11-octadecadienoico o ácido trans,cis-10,12-octadecadienoico. En otro ejemplo de realización preferido adicional, la composición alimentaria puede incluir una mezcla de ácido cis,trans-9,11-octadecadienoico y ácido trans,cis-9,11-octadecadienoico purificados. En este contexto, el término "purificado" que se utiliza aquí haciendo referencia a un isómero de CLA particular o a una mezcla de isómeros significa una composición de CLA que contiene por debajo de un 10% en peso de isómeros de CLA distintos a los que se han especifica-
do.
Preferiblemente, el isómero o la mezcla identificados no contendrán más de un 5% en peso, y preferiblemente no más de un 3% en peso, de otros isómeros de CLA. La composición alimentaria puede incluir ácido cis,cis-9,11-octadecadienoico purificado, u otros isómeros de CLA purificados, incluyendo ácido trans,cis-10,12-octadecadienoico. En otros ejemplos de realización adicionales, la composición alimentaria puede incluir una mezcla purificada de CLA. Por ejemplo, el CLA puede purificarse en distintos grados para producir una mezcla purificada de CLA que no incluya todos los isómeros de CLA. Los isómeros de CLA purificados pueden incluirse en cualquier producto alimentario incluyendo, por ejemplo, cereales, carnes, huevos, quesos y otros productos lácteos, vegetales, panes y otros productos basados en harina o en fibra, y productos de confección. Los isómeros de CLA también pueden añadirse a cualquier líquido consumible pero puede requerir diversos agentes de emulsificación para su disolución.
La cantidad con eficacia terapéutica administrada tendrá un efecto beneficioso en animales con diabetes mellitus tiipo II. Por ejemplo, la cantidad con eficacia terapéutica es de forma deseable suficiente para normalizar la tolerancia frente a la glucosa en un animal diabético. La normalización de la tolerancia a glucosa se puede determinar, por ejemplo, mediante una prueba frente la tolerancia de glucosa tal como se conoce en el campo de la técnica y tal como se describe en los ejemplos que se presentan a continuación. Además, la cantidad de CLA administrada será preferiblemente suficiente para reducir los niveles sanguíneos de insulina y/o para reducir en nivel de ácidos grasos libres o triglicéridos libres en la circulación. Los niveles en sangre de insulina, ácidos grasos libres y triglicéridos se reducen de forma deseable por al menos alrededor de un 5%, más preferiblemente por al menos alrededor de un 20%, y aún más preferiblemente por al menos alrededor de un 50%. La cantidad de CLA administrada al animal con diabetes mellitus tipo II variará dependiendo de la edad del animal, el estado de salud general del animal y la gravedad de su condición diabética. Sin embargo, se espera que un animal que esté siendo tratado frente a la diabetes mellitus tipo II recibirá usualmente al menos 1 mg/kg de peso corporal de CLA/día hasta alcanzar como máximo el mayor nivel que no resulte tóxico para el animal. Normalmente un animal puede recibir 1 mg/kg de peso corporal de CLA/día hasta 10.000 mg/kg de peso corporal de CLA/día. Sin embargo, se espera que dosis relativamente bajas de CLA serán suficientes, por ejemplo, en el rango de 1 mg/kg de peso corporal de CLA/día hasta 150 mg/kg de peso corporal de CLA/día, y más deseablemente 10 mg/kg de peso corporal de CLA/día hasta 50 mg/kg de peso corporal de CLA/día.
En otra característica adicional de la invención, el CLA se puede administrar a un animal en una composición que libera el CLA internamente, por ejemplo, en la forma de un éster de CLA, preferiblemente un triglicérido. En otro ejemplo de realización adicional, el triglicérido incluye al menos un residuo de CLA en la forma de un éster con glicerol, y puede tener otros residuos de ácido graso saturado o insaturado, pero preferiblemente el ácido graso insaturado del ácido linoleico. En un aspecto más preferido, el triglicérido incluye tres residuos de CLA en la forma de un éster con glicerol. Los residuos de CLA son preferiblemente los isómeros más activos de CLA, como el isómero cis,trans-9,11 y trans,cis-9,11 o el isómero cis,cis-9,11, pero puede incluir cualquiera de los otros isómeros. Después de su ingestión, los residuos de CLA pueden liberarse en el estómago del animal mediante hidrólisis enzimática a través de, por ejemplo, la acción de una lipasa. Los triglicéridos pueden purificarse a partir de plantas tal como se ha descrito anteriormente, pueden adquirirse comercialmente o pueden sintetizarse a partir de glicerol y de los respectivos ácidos grasos mediante los métodos conocidos en el campo de la técnica.
La cantidad con eficacia terapéutica que se administra dependerá de al menos los tres factores discutidos anteriormente. La cantidad de triglicérido que se administra puede ser la que proporciona la cantidad de CLA especificada anteriormente. La cantidad de triglicérido que se requiere para alcanzar una dosis específica dependerá del número de ésteres o de residuos de CLA que comprenden el triglicérido y puede ser calculada fácilmente por cualquier persona con experiencia en el campo de la técnica. El triglicérido puede administrarse en formas similares a las descritas anteriormente para el CLA.
El CLA se puede administrar a un animal con diabetes, incluyendo vertebrados de sangre caliente como mamíferos. La lista de mamíferos incluye, por ejemplo, los humanos.
Ahora se hará referencia a ejemplos específicos que ilustran las composiciones y los usos mostrados anteriormente. Los datos de los estudios que se muestran a continuación se analizaron mediante ANOVA (Modelo Lineal General, LSD) utilizando Statistical Analysis System (SAS; Cary, NC) o StatView para Macintosh (Abacus Concepts,Berkeley, CA).
Ejemplo 1 Activación del Receptor activado por proliferador de peroxisoma (PPAR) por CLA
En este ejemplo, se muestra que el CLA está involucrado en la activación de diversos subtipos del PPAR. El PPAR, un receptor intracelular, es un miembro de la superfamilia de las hormonas esteroideas, que puede ser importante en la regulación de la expresión de los enzimas del metabolismo de lípidos y puede tener un efecto en el crecimiento y/o en la diferenciación celular. Se han identificado tres subtipos de PPAR (\alpha, \beta y \gamma) en diversas especies, incluyendo en humanos. Se cree que el PPAR\gamma está involucrado en la actividad anti-diabética y de disminución de la glucosa de los grupos de fármacos conocidos como tiazolidindionas y en los fármacos hipolipidémicos fibratos. El PPAR puede ser activado por proliferadores de peroxisoma, tiazolidindionas y ácidos grasos. El mecanismo de acción de los proliferadores de peroxisoma se muestra en la Fig.1 y los efectos de los activadores de los subtipos de PPAR se muestra el la Tabla 1.
TABLA 1 Activadores de los subtipos de PPAR y sus efectos
Fármaco/Grupo Químico PPAR\alpha PPAR\beta PPAR\gamma Uso Clínico o efectos
Proliferadores de peroxisoma ++++ ++ +++ \begin{minipage}{65mm}Hipolidemia, posible antidiabético, proliferación del peroxisoma hepático, diferenciación de adipocitos\end{minipage}
Ácidos grasos de cadena larga +++ + ++ \begin{minipage}{65mm}Hipolidemia, proliferación del peroxisoma hepático, diferenciación de adipocitos\end{minipage}
Tiazolidindionas - - ++++ \begin{minipage}{65mm}Antidiabético, diferenciación de adipocitos, disminución en la resistencia a insulina, disminución en los niveles de glucosa en sangre\end{minipage}
CLA +++ - ++ \begin{minipage}{65mm}Efectos anti-cáncer, efectos anti-aterogénicos, hipolipidemia, proliferación del peroxisoma hepático. Antidiabético tal como se muestra en esta revelación.\end{minipage}
Se mantuvieron células COS-1 (American Type Culture Collection) en un medio \alpha-mínimo esencial (Sigma) complementado con un 8% de suero fetal bovino (Gibco BRL), 0.2 mg/ml de estreptomicina y 200 U/ml de penicilina. Las construcciones para la expresión de la quimera pSG5-GAL4-PPAR, que contiene el dominio de unión del ligando de PPAR\alpha, \beta y \gamma, así como la construcción indicadora (UAS) 5-tk-CAT fueron amablemente proporcionados por Steven A. Kliewer (Glaxo Research Institute). A una confluencia del 75-90%, las células COS-1 se co-transfectaron con GAL4-PPAR, (UAS)5-tk-CAT, y pSV-Gal (Promega) tal como se describe en Lehmann, J. M. y col., J.Biol. Chem. 270,12953-12956(1995). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con las cantidades indicadas de CLA, o con una única dosis 100 \muM de ácido 4-cloro-6-(2,3-xilindino)-2-pirimidiniltio)-acético (Wy 14,643; un fármaco hipolipidémico conocido como proliferador del peroxisoma). Después de 6 horas de tratamiento, las células se recogieron y se midieron los niveles de cloramfenicol acetiltransferasa mediante un ensayo ELISA (Gibco BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los datos se expresan en relación a la actividad \beta-galactosidasa.
El CLA utilizado en este experimento se obtuvo de una mezcla que se puede adquirir comercialmente de NuChek Prep, Elysian MN. La mezcla contenía un 41.2% en peso de una composición que incluía ácido cis, trans-9,11octadecadienoico y ácido trans,cis-9,11-octadecadienoico, un 44% en peso de ácido trans,cis-10,12octadecadienoico, un 9.4% en peso de ácido cis,cis10,12-octadecadienoico, un 1. 3% en peso de una composición que incluía ácido trans,trans-9,11-octadecadienoico y ácido trans,trans-10,12-octadecadienoico, un 1.1% en peso de ácido cis,cis-9,11-octadecadienoico, un 0.7% en peso de ácido linoleico y un 2.2% de otros lípidos tal como se ha mencionado anteriormente.
La Fig. 2 muestra que todos los subtipos de PPAR estudiados fueron activados por el CLA. El PPAR\alpha fue activado en mayor extensión que los PPAR\beta o PPAR\gamma. Sin embargo, PPAR\beta y PPAR\gamma fueron activados de forma significativa (aproximadamente 2 veces más que el valor de control).
Se cree que la activación de PPAR\alpha por la mezcla adquirida comercialmente es resultado del isómero ácido cis,trans9,11-octadecadienoico, tal como se discute en el Ejemplo 2. Además, los efectos biológicos de la activación de PPAR por CLA dependerán del tejido y del subtipo de PPAR dominante que esté siendo examinado tal como se muestra en la Fig. 3.
Ejemplo 2 Activación de los subtipos de PPAR por isómeros de CLA
En este ejemplo, se muestra que ciertos subtipos de PPAR son activados por isómeros de CLA. Se llevó a cabo el mismo procedimiento experimental que se ha descrito en el Ejemplo 1 para generar los datos que se muestran el la Fig. 4. Sin embargo, también se utilizó una concentración de 100 \muM de isómeros de ciertos isómeros de CLA seleccionados en el ensayo de tranfección para determinar si isómeros específicos de CLA podían activar alguno de los subtipos de PPAR.
Los datos de las Figs. 5-7 se generaron utilizando construcciones que incluían PPAR\alpha, PPAR\beta o PPAR\gamma de ratón de cadena entera y un gen indicador de luciferasa. Se utilizó la línea celular CV-1 (células de riñón de mono verde africano) adquiridas de American Type Culture Collection (#CCL-70). Las células se hicieron crecer en medio esencial mínimo Eagle que contenía un 10% de serum bovino fetal (GIBCO). Para cada transfección que incluía PPAR\alpha, se utilizaron 625 ng del vector de expresión pcDNA3-PPAR\alpha junto con 250 ng del plásmido indicador psV-GL2-PPRE-luciferasa y 250 ng del plásmido de control interno pSV-\beta-galactosidasa. Para cada transfección que incluía PPAR\beta o PPAR\gamma, se utilizaron 625 ng de pSGS-ratón-PPAR\beta o 625 ng de pSG5-ratón-PPAR\gamma junto con 250 ng del plásmido indicador psV-GL2-PPRE-luciferasa y 250 ng de plásmido de control interno pSV-\beta-galactosidasa. Las células se transfectaron utilizando el reactivo Lipofect AMINE™ (GIBCO) y medio libre de rojo fenol y libre de serum (OptiMEM®I, GIBCO Life Technologies, Grand Island, NY). Siete horas después de la transfección, se añadió al medio serum depurado por carbón (Cocalico Biologicals, Inc. Reamstown, PA) (concentración final del 10%) para una incubación durante la noche (16 horas).
Las células transfectadas se trataron durante seis horas con diversas dosis 100 \muM de CLA, el isómero 9Z,11E (cis, trans 9,11) (97% de pureza), el isómero 9E,11E (trans,trans-9,11) (98% de pureza), el isómero 10E,12Z (trans,cis-10,12) o los otros activadores que se han indicado. Las actividades de la luciferasa y la \beta-galactosidasa se ensayaron en lisatos celulares siguiendo los protocolos de los fabricantes (Promega, Madison, WI). Los datos se cuantificaron en relación a la actividad luciferasa/\beta-galactosidasa expresada como la razón respecto a las células tratadas con vehículo (0.1% DMSO).
La Fig. 4 muestra que todos los isómeros examinados activaron todos los subtipos de PPAR. Sin embargo, el isómero 9Z11Z (cis,cis-9,11) y el 9Z11E (cis,trans-9,11) activaron el PPAR\alpha y el PPAR\beta más que la mezcla de CLA, y el isómero 9E11E (trans,trans-9,11) sólo activó el PPAR\beta más que la mezcla de CLA sola. Ninguno de estos isómeros activó el PPAR\gamma más que la mezcla de CLA. Además, en un estudio similar, el PPAR\gamma humano también fue activado por CLA (datos no mostrados), mostrando que los sucesos moleculares que subyacen en la presente invención también se dan en humanos.
Los datos que se muestran en las Figs. 5-7 muestran que todos los isómeros de CLA probados, incluyendo el ácido trans,cis-10,12octadecadienoico, activan los respectivos subtipos de PPAR respecto al control de DMSO.
Además, los datos en las Figs. 5 y 6 muestran de forma adicional que el isómero trans,cis-10,12 del CLA activó al PPAR\alpha y al PPAR\beta en una extensión significativamente mayor que solamente la mezcla de CLA.
Ejemplo 3 Efecto del CLA sobre la Expresión Génica
La activación de ciertos subtipos del PPAR resulta en una alteración de la expresión génica, como por ejemplo inducción génica. En este ejemplo, se encontró que inducía dos marcadores de diferenciación de preadipocitos 3T3-L1 de ratón en adipocitos diferenciados, que requiere activación por PPAR\gamma. Los dos marcadores estudiados fueron mARN de proteína-2 de adipocito (mAP2) y mARN de PPAR\gamma.
Cultivo Celular 3T3-L1
Se mantuvieron preadipocitos de ratón 3T3-L1 (American Type Culture Collection) en medio Eagle modificado por (DMEM) complementado con suero fetal bovino 10% (Gibco BRL), 0.2 mg/ml de estreptomicina y 200 U/ml de penicilina ("medio de crecimiento"). La diferenciación se indujo tal como se describe en Brandes, R., Arad R., and Bar Tana, J., Biochem. Pharmacol. 50,1949-1951 (1995).
De forma resumida, la diferenciación se indujo mediante la adición de diversas concentraciones de CLA (concentración final de 25-250 \muM), ácido linoleico (100 \muM), Wy 14,643 (100 \muM) o vehículo (DMSO) en DMEM con FCS 10% y dexametasona 0.1 \muM ("medio de inducción") a preadipocitos 3T3-L1 confluentes.
Después de 48 horas, se eliminó el medio de inducción y se reemplazó por el medio de inducción con 4 mU/ml de insulina. Este medio se cambió cada 48 horas. A diversos intervalos de tiempo, las células se lavaron dos veces con PBS y el ARN total se extrajo utilizando TriReagent (Molecular Research Center).
La diferenciación de las células 3T3-L1 de ratón se monitorizó mediante el examen de marcadores específicos de adipocitos incluyendo PPAR\gamma (\gamma1 y \gamma2) y proteína-2 de adipocito (mAP2). También se examinó el gen constitutivo de la \beta-actina tal como se describe en Vanden Heuvel, J. P. y col., Cancer Res. 54, 62-68 (1994). Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa reversa cuantitativa para determinar la expresión de mARN para estos genes (tal como se describe en Vanden Heuvel, J. P., PCR Applications in Molecular Toxicology, 218 pgs. CRC Press, Boca Raton, FL (1997), ver Tabla 2 para las secuencias cebadoras utilizadas) utilizando estándares internos específicos para cada grupo de cebadores (tal como se describe en Vanden Heuvel, J. P., Tyson, F. and Bell, D. A., Biotechniques 14, 395-398 (1993)).
TABLA 2 Secuencias de los cebadores utilizados en RT-PCR Longitud del producto (bp)
Cebador Interno^{*} Secuencia Diana Estándar
mAP2 directo 5' ACT GTG GCC TGA GCG ACT TCT ATG 190 314
mAP2 inverso 5' AGG GGG CTT CTG GCA AAC AAT
mPPAR\gamma directo 5' TGC TGG CCT CCC TGA TGA ATA 315 352
mPPAR\gamma inverso 5' TTG GCG AAC AGC TGA GAG GAC
actina directa 5' CCT CTA TGC CAA CAC AGT 125 153
actina inversa 5' AGC CAC CAA TCC ACA CAG
ACO directo 5' ATT CGG TGT TGT AAG TGC 417 340
ACO inverso 5' TTG GTG GGT GGG TGT TGA
^{*}Todos los estándares internos se sintetizaron sólo para los genes a cuantificar
Tal como se observa en la Fig. 8, el CLA es eficaz en la inducción de ARN de mAP2 y PPAR\gamma. También se observa que el CLA es más potente como ligando del PPAR\gamma en el bio-ensayo 3T3-L1 que lo que cabría esperar a partir de los ensayos de transactivación, los resultados de los cuales se muestran en la Fig. 4. La Fig. 8 también muestra que la concentración más efectiva de CLA en los ensayos de diferenciación fue 50 \muM.
Estudios Animales
Se obtuvieron ratas Zucker macho obesas (fa/fa) y hemanos de camada delgados (wt) de seis semanas de edad de Genetic Models, Inc. (Indianapolis, IN). Debido a que el objetivo principal del estudio era determinar la capacidad del CLA de mejorar la acción de la insulina y prevenir el inicio de la diabetes, se determinó que todas las ratas fueran normoglicémicas antes de asignarlas a los tratamientos experimentales. (Las dietas se discuten en la sección que sigue). Después de mantener las ratas bajo dietas experimentales durante 14 días, las ratas se sacrificaron mediante CO_{2} y dislocación cervical y se recogieron, pesaron y congelaron los tejidos. Los experimentos de RT-PCR se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente.
Los genes utilizados como marcadores del tejido y de la activación de PPAR específica para subtipo incluyeron acil Co-A Oxidasa (ACO; se encuentra en el hígado y es inducido por la activación del PPAR\alpha), Proteína Específica de Adipocitos (mAP2; se encuentra en el tejido adiposo y es inducida por la activación del PPAR\gamma) y ACO en el músculo (inducida por PPAR\beta).
Tal como se observa en la Fig. 9, el CLA y la Troglitazona (5-([4-[3,4-dihidro-6-hidroxi-2,5,-7,8-tetrametil-2H-1-benzopiran-2-il)metoxi]fenil]metil]-2,4-tiazolidindiona; TDZ; Rezulin, Parke-Davis) inducen de forma significativa la expresión de mARN de ACO en el tejido que contiene PPAR\alpha (hígado) y en el tejido que contiene de forma predominante PPAR\gamma (tejido adiposo) pero no tienen efecto sobre el tejido que contiene de forma predominante PPAR\beta (músculo). La inducción de mAP2 en el tejido adiposo verifica la activación de PPAR\gamma observada en las células 3T3-L1.
Ejemplo 4 Efecto del CLA en la dieta en la normalización de la tolerancia a la glucosa en ratas fa/fa Zucker obesas
Las ratas fa/fa Zucker son un modelo animal excelente para el estudio del inicio de la diabetes en adultos. En este ejemplo, se determinó el efecto de tres dietas distintas (control, CLA, TZD) sobre los niveles de insulina, triglicéridos y ácidos grasos libres en circulación en ratas fa/fa así como en sus homólogos delgados (naturales, wt). Además, para determinar si el CLA incrementaba la sensibilidad a la insulina como un activador del PPAR\gamma, como la TZD, se llevó a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa.
Los componentes de las dietas se obtuvieron de Dyets, Inc. (Bethlehem, PA), y la mezcla de isómeros de CLA (mezcla de 90% de pureza) de PharmaNutrientes, Chicago, IL. La mezcla de CLA tenía la siguiente distribución isomérica: 42% de una composición que incluía ácido cis,trans-9,11 y trans,cis-9-11-octadecadienoico; 43.5% ácido trans,cis-10,12-octadecadienoico; 1% ácido cis,cis-9-11-octadecadienoico, 1% ácido cis,cis-10,12-octadecadienoico, y 1.5% de una composición que incluía ácido trans,trans-9,11-octadecadienoico y ácido trans,trans-10,12-octadecadienoico, siendo todos los porcentajes en peso. La mezcla de CLA también incluía, en porcentajes en peso, un 0.5% de linoleato, un 5.5% de oleato y un 5% de otros lípidos tal como se ha discutido anteriormente. En estos estudios se utilizó tiazolidindiona, TZD (Rezulin™, Parke-Davis, Ann Arbor, MI) como control positivo para la actividad anti-diabética. Las ratas Zucker obesas (fa/fa) macho y sus hermanos de camada delgados (wt) se adquirieron con seis semanas de edad de Genetic Models, Inc. (Indianapolis, IN). Debido a que el objetivo principal del estudio era determinar la capacidad del CLA de mejorar la acción de la insulina y prevenir el inicio de la diabetes, se determinó que todas las ratas fueran normoglicémicas antes de asignarlas a los tratamientos experimentales. Después de mantener las ratas bajo dietas experimentales durante 14 días, las ratas se sacrificaron mediante CO_{2} y dislocación cervical, y se recogió sangre que se analizó de forma inmediata para determinar las concentraciones de glucosa post-prandial (ver más adelante) o se colocó en tubos de ensayo heparinizados para llevar a cabo análisis de plasma tal como se describe a continuación.
Se recogieron y pesaron bloques de grasa epididimal y los hígados. Se aisló una alícuota del bloque de grasa epididimal en tampón salino para los análisis de transporte de glucosa y el resto del bloque de grasa epididimal y músculo gastrocnemio se aislaron, se congelaron de forma inmediata en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta que se llevaron a cabo los análisis de mARN y proteína.
Dietas experimentales
Se formularon tres dietas experimentales isocalóricas de acuerdo con una mezcla AIN-76 modificada que contenía un 6.5% (en peso) de grasa (dieta descrita en American Institute of Nutrition: Report of the American Instituye of Nutrition Ad Hoc Committee on Standards for Nutritional Studies, J. Nutr. 107 1340-1348 (1977), pero que contiene un 6.5% en peso de grasa en lugar de un 5% en peso de grasa). Se utilizó la misma cantidad de aceite de maíz (5%) en todas las dietas ya que el aceite de maíz es rico en ácido linoleico, un ácido graso esencial. Las dietas contenían un 5% de aceite de maíz + 1.5% de manteca + no CLA (dieta de control), un 5% de aceite de maíz + 1.5% de CLA (dieta CLA) o bien un 5% de aceite de maíz + 1.5% de manteca + 0.2% de troglitazona (dieta TZD). Se escogió una dosis de 1.5% de CLA en base a estudios previos en nuestro laboratorio que muestran que esta dosis modula la expresión génica asociada a PPAR en el hígado (Belury, M.A. y col., Nutr. Biochem. 8: 579-84 (1997)) e inhibe la tumorigenesis en piel murina (tal como se muestra en Belury, M.A. y col., Nutr. Cancer 26: 149-157 (1996)). Se ha mostrado que la dosis de TZD (0.2%) utilizada en este estudio es efectiva para normalizar la tolerancia a glucosa después de 15 días y para suprimir los niveles elevados de glucosa, triglicéridos, ácidos grasos libres y proteína en orina en ratas Zucker (fa/fa). Las dietas se proporcionaron en días alternos y se permitió a las ratas tener acceso libre a comida y agua. Se midieron los pesos corporales dos veces a la semana y el consumo de comida se estimó midiendo las diferencias en peso entre las dietas recién proporcionadas y la dieta que quedaba en los alimentadores dos días después. Teniendo en cuenta el peso corporal promedio de las ratas fa/fa y la cantidad de comida que consumían, las ratas fa/fa recibieron una dosis diaria de 1.71 mg de CLA/kg de peso corporal, que sumaba una dosis diaria de 375 mg.
Pruebas de Tolerancia a la Glucosa
Para comparar los efectos del CLA y de la TZD sobre la acción de la insulina, se llevó a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa en el día 11 de la intervención sobre la dieta. Se hizo ayunar a los animales durante la noche (16 horas). A las ratas conscientes se les inyectó intraperitonealmente D-glucosa (1 g/kg de peso corporal) y se recogieron muestras de sangre a través de la vena de la cola antes de la inyección (tiempo 0), y a 2, 5, 10, 15, 20, 40, 60, 120 y 180 minutos después de la inyección.
Determinación de los Metabolitos en Sangre y de las Concentraciones de Hormonas
Los niveles de glucosa en sangre se determinaron utilizando un medidor de glucosa One Touch (Lifescan, Inc.). Los niveles de insulina en plasma se determinaron utlizando kits de radioinmunoensayo asequibles comercialmente (Linco Research, St. Charles, MO). Los ácidos grasos no esterificados en plasma se cuantificaron utilizando un kit colorimétrico (Watco). Las concentraciones de triglicérido en plasma se determinaron utilizando un kit asequible comercialmente (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO).
La Fig. 10 muestra los resultados de las pruebas de tolerancia frente a la glucosa. Tal como se esperaba, se observa una menor capacidad para eliminar la glucosa de la sangre en las ratas fa/fa (compárese en control en animales delgados frente al control en animales obesos). En las ratas fa/fa que se habían alimentado con CLA o bien con TZD, el nivel de glucosa en sangre se redujo mucho más rápidamente que en los respectivos animales de control. Como la tolerancia a la glucosa es la principal prueba utilizada para confirmar la existencia de diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), los datos que se muestran en la Fig. 10 muestran de forma convincente que el CLA es tan eficaz como la TZD para mejorar la tolerancia a la glucosa. Así pues, el CLA puede ser un tratamiento eficaz para individuos con NIDDM.
Los resultados que muestran los niveles relativos de insulina en circulación, triglicéridos en plasma y ácidos grasos libres en circulación se muestran el la Tabla 3.
TABLA 3 Efecto del CLA en la Dieta sobre las Concentraciones de Glucosa, Triglicéridos y Ácidos Grasos Libres en Ratas Zucker
Dieta Insulina Triglicéridos en Plasma Ácidos Grasos Libres
(ng/dl) \pm D.E. (mg/dl) \pm D.E. (mMol) \pm D.E.
wt, Control 2.8\pm0.1^{a} 92.1\pm16.7^{bc} 1.651\pm0.497^{ab}
wt, CLA 2.8\pm0.5^{a} 66.2\pm18.0^{bc} 1.170\pm0.335^{he}
wt, TZD 1.4\pm0.1^{a} 61.1\pm12.1^{c} 1.139\pm0.277^{c}
fa/fa, Control 38.9\pm2.8^{b} 408.3\pm148.7^{a} 1.959\pm0.402^{a}
fa/fa, CLA 20.6\pm3.3^{c} 149.4\pm78.4^{b} 1.004\pm0.262^{c}
fa/fa, TZD 5.6\pm0.5^{d} 57.08\pm12.3^{c} 0.778\pm0.378^{c}
\hskip0.3cm \begin{minipage}{145mm}Las concentraciones de insulina, triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma se midieron en las ratas alimentadas después de que las dietas experimentales se hubieran suministrado durante 14 días.\end{minipage}
^{a-d} \begin{minipage}[t]{145mm}Los valores (\pm D.E.) con diferencias significativas (p<0.005) en las columnas se denotan mediante distintos superíndices.\end{minipage}
Tal como se esperaba, las ratas fa/fa mostraron unos niveles más altos de insulina y triglicéridos en plasma en comparación con los animales wt. Sin embargo, el CLA mejoró de forma significativa los síntomas de la diabetes provocando una disminución del 50-60% de la insulina, triglicéridos y ácidos grasos en plasma. Además, la TZD hizo disminuir marcadamente los niveles de insulina, triglicéridos y ácidos grasos en la circulación de las ratas fa/fa, verificando, así que la TZD es un agente anti-diabético efectivo. Para información adicional sobre la normalización de la tolerancia a la glucosa y otros efectos biológicos utilizando CLA, puede consultarse Biochem. Biophys. Res. Comm., 244, 678-682 (1998).

Claims (17)

1. La utilización de ácido linoleico conjugado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.
2. La utilización de la reivindicación 1, en la cual dicho ácido linoleico conjugado se administra de forma oral.
3. La utilización de la reivindicación 2, en la cual dicho ácido linoleico conjugado se administra en una forma de dosificación unitaria.
4. La utilización de la reivindicación 3, en la cual dicha forma de dosificación unitaria es un producto alimentario.
5. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico conjugado se selecciona de entre el grupo consistente en ácido 9,11-octadecadienoico, sus ésteres, sus isómeros geométricos, sus sales y sus mezclas.
6. La utilización de la reivindicación 5, en la cual dichos isómeros geométricos tienen configuraciones seleccionadas de entre el grupo consistente en trans,trans; cis,cis; trans,cis; y cis,trans.
7. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico conjugado se selecciona de entre el grupo consistente en ácido 10,12-octadecadienoico, sus ésteres, sus isómeros geométricos, sus sales y sus mezclas.
8. La utilización de la reivindicación 7, en la cual dichos isómeros geométricos tienen configuraciones seleccionadas de entre el grupo consistente en trans,trans; cis,cis; trans,cis; y cis,trans.
9. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico conjugado está compuesto de ácido cis,trans-9,11-octadecadienoico y ácido trans,cis-9,11-octadecadienoico.
10. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho ácido linoleico está compuesto por ácido cis,cis-9,11-octadecadienoico.
11. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la cual dicho ácido linoleico conjugado se administra en una cantidad de 1 mg de dicho ácido linoleico conjugado/kg de peso corporal hasta 10,000 mg de dicho ácido linoleico conjugado/kg de peso corporal.
12. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la cual dicho animal es un mamífero.
13. La utilización de la reivindicación 12, en la cual dicho mamífero es un humano.
14. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en las cuales dicho ácido linoleico conjugado se administra en un vehículo aceptable para su uso farmacéutico.
15. La utilización de la reivindicación 14, en la cual dicho vehículo aceptable para su uso farmacéutico incluye agua.
16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 1 para la normalización de la tolerancia a la glucosa y la reducción de la insulina en plasma en un animal con diabetes mellitus tipo II.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 para la fabricación de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 1 para el tratamiento de niveles de glucosa elevados en un animal con diabetes mellitus Tipo II.
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