JP6809713B2 - 炎症性腸疾患抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、炎症性腸疾患の予防用又は治療用医薬組成物に関する。より詳細には、本発明はクロドロン酸等の小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）を含む、炎症性腸疾患の予防用又は治療用医薬組成物に関する。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は主に潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）に大別され、どちらも腸管の炎症を主徴とする難治性の疾患で、ＵＣは１９７５年、ＣＤは１９７６年から厚生労働省指定の特定疾患治療研究対象に指定されている。患者数は常に増加の一途をたどり、現在国内にはＵＣが約１７万人、ＣＤが約４万人の患者が特定疾患医療受給者証の交付を受けている（非特許文献１）。

ＩＢＤは遺伝要因・環境要因・免疫要因が複雑に関与する多因子疾患である。疾患関連遺伝子として現在では１６０以上の遺伝子が同定されている（非特許文献２）。ＵＣ、ＣＤに共通する疾患関連遺伝子としては「ＩＬ２３シグナル」に関連する遺伝子、ＣＤに特異的な関連遺伝子としては主に「細胞内細菌処理」に関わる遺伝子、ＵＣに特異的な遺伝子としては「消化管上皮バリア異常」に関与する遺伝子群などが多く同定されている。

環境要因として、食事・衛生状態・薬物など腸管が曝露される様々な因子がリスクとなっているが、現在特に注目されているのが腸内細菌との関連である。この点に着目したＩＢＤへの治療アプローチとして抗生物質やプロバイオティクスなどが試みられている。

このような背景を持つ疾患の治療として、これまでは抗炎症剤（５−ＡＳＡ製剤、ステロイド）、免疫抑制剤などが使用されてきた。また、日本ではエレンタールなどの栄養剤を使った栄養療法や血球成分除去療法なども選択されている。近年では抗ＴＮＦα抗体製剤が効果を上げているが、依然としてＩＢＤを完治させる治療法は確立されていない。ＩＢＤは直接死に至る疾患ではないが、寛解と再燃を繰り返す特徴を持つ。その過程で手術に至るような穿孔や出血、癌の合併が起こるなど患者のＱＯＬを著しく低下させる。現在、長期にわたって寛解維持をするための治療法が求められている。

非特許文献３には、リポソームがマクロファージ特異的に取り込まれることが報告されており、クロドロン酸が封入されたリポソームの投与により、マクロファージ特異的に細胞死を誘導できることが報告されている。また、同文献には、クロドロン酸がリポソームに封入されていない場合は、マクロファージの細胞死が誘導されないことが記載されている。非特許文献４には、ＩＢＤを自然発症するインターロイキン１０欠損マウスに、クロドロン酸が封入されたリポソームを投与してマクロファージを殺傷することにより、該マウスの炎症を緩和させたことが報告されている。一方で、ＩＢＤの発症前からクロドロン酸が封入されたリポソームを投与すると、ＩＢＤの発症が早まり、悪化を促進することが報告されている（非特許文献５）。

ところで、小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ；ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）は細胞内の分泌小胞にＡＴＰを能動的に取り込むトランスポーターとして２００８年に岡山大の澤田らによって同定された。ＡＴＰはエネルギー通貨としての役割だけではなく、細胞間のシグナル伝達物質として作用し、痛みの伝達・尿意の伝達・インスリン分泌シグナルの伝達など多岐にわたる生理機能に関与している。このＡＴＰはＶＮＵＴによって細胞内の小胞に蓄えられ、細胞にＡＴＰ放出刺激が加わると、開口放出によって分泌されることが知られている。しかしながら、ＶＮＵＴと炎症性腸疾患との関係はこれまで全く知られていなかった。

渡辺守著「ＩＢＤ 炎症性腸疾患を究める」メジカルビュー社、２０１１年１０月２１日 Jostins, L., et al., Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature, 2012. 491(7422):p.119-24 Naito, M., et al., J Leukoc Biol. 1996 Sep;60(3):337-44. Watanabe, N., et al., Dig Dis Sci. 2003 Feb;48(2):408-14. Qualls JE, et al., J Leukoc Biol. 2006 Oct;80(4):802-15.

本発明の目的は、炎症性腸疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供することであり、それを用いた炎症性腸疾患の予防又は治療方法を提供することである。炎症性腸疾患は、寛解と再燃を繰り返す難治性の疾患であり、その根本的な治療法は現在までのところ知られておらず、再発性の炎症性腸疾患に対する効果的な予防薬及び治療薬の開発が求められている。従って、本発明の目的は、炎症性腸疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供することであり、それを用いた炎症性腸疾患の予防又は治療方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行う過程で、炎症性腸疾患患者の大腸に小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）が強く発現することを見出し、さらに、活動期のみならず寛解期においても、炎症性腸疾患患者の病変部でのＶＮＵＴの発現が亢進していることを見出した。また本発明者らは、クロドロン酸が高い選択性をもってＶＮＵＴを阻害する活性を有する化合物であることを見出した。クロドロン酸の塩の形態であるクロドロネートは、第一世代ビスホスホネート系の骨粗鬆症治療薬として欧米で上市されていたものであるが、現在はさらに効果の強い第二、第三世代のビスホスホネートに置き換わっている。さらに、本発明者らは、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与することによって、炎症性腸疾患を治療することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りのものである。
（１）小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）阻害活性を有する化合物を含有してなる、炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（２）該疾患の寛解期における投与用である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物が、クロドロン酸又はその塩である、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）予防上又は治療上有効量のＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を、その投与が必要な対象に投与することを含む、炎症性腸疾患の予防又は治療方法。
（６）該疾患の寛解期に投与することを特徴とする、（５）に記載の予防又は治療方法。
（７）ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物が、クロドロン酸又はその塩である、（５）又は（６）に記載の予防又は治療方法。
（８）炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、（５）〜（７）のいずれかに記載の予防又は治療方法。
（９）被検物質が、ＶＮＵＴを阻害し得るか否かを評価する工程を含む、炎症性腸疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
（１０）クロドロン酸又はその塩を有効成分として含有するＶＮＵＴ阻害剤。

本発明によれば、これまで効果的な予防又は治療薬が存在しなかった、再発性の炎症性腸疾患に対する予防又は治療が可能となる。
また、本発明によれば、ＶＮＵＴの阻害という新たなメカニズムに基づく炎症性腸疾患の予防又は治療に有用な医薬のスクリーニングが可能となる。

図１は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者での、インターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）（ａ）、ＶＮＵＴ（ｂ）、及びＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）（ｃ）の発現を示す図である。＊＊＊Ｐ＜０．００１ 図２は、各種のビスホスホネートのＶＮＵＴに対する阻害効果を示す図である。精製ＶＮＵＴを含むプロテオリポソームによるΔψ依存的なＡＴＰ取り込みに対する、２分間でのビスホスホネートの阻害効果を、１０ｍＭ Ｃｌ⁻の存在下で分析し、５０％阻害に必要な濃度として示す。ビスホスホネートとしては、第一世代ビスホスホネート（クロドロン酸、エチドロン酸、チルドロン酸、メドロン酸、ジフルオロメチレン−ジホスホン酸）、第二世代ビスホスホネート（パミドロン酸、アレンドロン酸、ネリドロン酸、イバンドロン酸）、第三世代ビスホスホネート（リセドロン酸、ミノドロン酸、ゾレドロン酸）、その他（メチレンビスホスホン酸ジクロライド、ピロリン酸）を用いた。ｎ＝３〜１３。これまでの報告に基づく、各種ビスホスホネートの骨粗鬆症阻害効果（骨吸収阻害効果）の程度を次のように示す；−、無し；＋、弱い；＋＋、中程度；＋＋＋、強い；＋＋＋＋、非常に強い。ＮＴ、試験されていない。 図３ａは、小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）、小胞型グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）、ＶＧＬＵＴ２、ＶＧＬＵＴ３、小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター（ＶＥＡＴ）、小胞型抑制性アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ）、小胞型モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）及びＮａ^＋−リン酸共輸送体１（ＮＰＴ１）の精製の程度を示す図である。各精製タンパク質（５μg）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＣＢＢ染色により可視化した。図３ｂは、ＶＮＵＴ、ＶＧＬＵＴ１、ＶＧＬＵＴ２、ＶＧＬＵＴ３、ＶＥＡＴ、ＶＩＡＡＴ、ＶＭＡＴ２及びＮＰＴ１に対する、クロドロン酸又はエチドロン酸の阻害効果を示す図である。 図４は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎マウスの体重変化率を示す図である。投与１日目の体重を１００とした時の体重の値を示した。ＤＳＳ摂取により６日間で約７％の体重減少がみられたが、クロドロン酸投与により体重減少が抑制された。 図５は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスの下痢（左）・血便（右）スコアを示す図である。ＤＳＳ摂取により下痢が誘発されたが、クロドロン酸投与により症状が抑制された。 図６は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスの大腸の長さ（ｃｍ）を示す図である。ＤＳＳ摂取により大腸長の短縮がみられたが、クロドロン酸投与により短縮が抑制された。 図７は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスのＤｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）を示す図である。ＤＳＳ摂取によりＤＡＩが高値となったが、クロドロン酸投与により抑制された。＊Ｐ＜０．０５ 図８は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、２％ＤＳＳ投与大腸炎マウスのクリプト構造の欠損率を示す図である。ＤＳＳ摂取によりクリプト構造欠損率が増加したが、クロドロン酸投与により抑制された。 図９は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスの筋層の肥厚（ｍｍ）（大腸の上部）を示す図である。ＤＳＳ摂取により筋層の肥厚がみられたが、クロドロン酸投与により抑制された。 図１０は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスの筋層の肥厚（ｍｍ）（大腸の下部）を示す図である。ＤＳＳ摂取により筋層の肥厚がみられたが、クロドロン酸投与により抑制された。 図１１は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスの大腸長の比較を示す図である。ＤＳＳ摂取により大腸長の短縮がみられ、ポジティブコントロール（薬効があることが知られている薬剤）として用いたシクロスポリンＡの投与、及びクロドロン酸の投与により抑制がみられた。＊＊Ｐ＜０．０１ 図１２は、クロドロン酸投与条件下又は非投与条件下における、ＤＳＳ大腸炎マウスの大腸長の比較を示す図である。ＤＳＳ誘発マウス急性大腸炎モデル及び再燃モデルにおいて、クロドロン酸の投与により大腸長の短縮が抑制された。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ 図１３は、クロドロン酸の皮下若しくは経口投与、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α抗体の腹腔内投与又は５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）経口投与による、大腸炎抑制効果の比較を示す図である。クロドロン酸の経口投与は、特に高い大腸炎抑制効果を示した。＊＊: Ｐ＜０．０１、＊＊＊: Ｐ＜０．００１、＃: Ｐ＜０．１ 図１４は、Ｃｌ⁻との競合を介して、クロドロン酸がＶＮＵＴを可逆的に阻害することを示す図である。（ａ）高濃度のクロドロン酸を添加しても、Δψは影響を受けない。１００μＭクロドロン酸の非存在下（コントロール、塗りつぶされたバー）又は存在下（灰色バー）における、バリノマイシン誘発Δψ形成を、２分において、Δψの指標であるオキソノールＶ蛍光クエンチングにより測定した。コントロールの活性は、カルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）存在下における値を差し引いた。（ｂ）１００ｎＭクロドロン酸の存在下（白三角）若しくは非存在下（黒丸）又はバリノマイシンの非存在下（白丸）、１分での、様々な［Ｃｌ⁻］におけるΔψ依存的なＡＴＰの取り込み。（ｃ）１００ｎＭクロドロン酸の存在下（白三角）又は非存在下（黒丸）での、ＡＴＰの取り込みのＨｉｌｌプロット。データは図１４ｂから得た。（ｄ）表示の濃度の化合物の存在下又は非存在下での、ＵＶ照射時の２０μＭビオチン−１１−ＡＴＰを用いたＶＮＵＴタンパク質（４μｇタンパク質）の光親和性標識（上）。それぞれの精製タンパク質（４μｇタンパク質）を、１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより解析し、クマシーブリリアントブルー染色により可視化した（下）。マーカータンパク質の位置を左側に示した。（ｅ）１μＭクロドロン酸による阻害は、プロテオリポソームのウオッシュにより完全に覆された。データは平均±ＳＥ、ｎ＝３〜９、＊＊Ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定）。

以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常に用いられる意味を有する。

本発明者らは、寛解期及び活動期のいずれにおいても、炎症性腸疾患患者の病変部での小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ；ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ又はＳＬＣ１７Ａ９；ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １７，ｍｅｍｂｅｒ ９とも呼ばれる）の発現が亢進していることを見出し、該疾患を有する動物に、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与することによって炎症性腸疾患を治療することができることを見出した。

より詳細には、本発明者らは、潰瘍性大腸炎患者の病変部において、炎症時にＶＮＵＴ発現量が亢進し、この亢進したＶＮＵＴの発現量が寛解期においても高いまま維持されることを見出した。さらに、本発明者は、クロドロン酸がＶＮＵＴ選択的な抑制作用を有することを見出し、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の飲水投与により作製した潰瘍性大腸炎モデルマウスに対し、クロドロン酸を投与することにより、該疾患の予防又は治療を行うことを試みた。その結果、１）体重の減少、２）大腸の長さの短縮、３）Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）の上昇、４）下痢・血便の発生等の潰瘍性大腸炎の症状を緩和させることに成功した。さらに、ＤＳＳの繰り返し投与により作製した再燃モデルにおいても、大腸の長さの短縮等の症状の増悪を緩和させ再燃を抑制させることに成功した。

１．小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）阻害活性を有する化合物を含有してなる、炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬組成物（本明細書中、本発明の医薬組成物とも称する。）

本発明は、小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）阻害活性を有する化合物を含有してなる、炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。

ＶＮＵＴは、細胞内の分泌小胞内に能動的にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を取り込む作用を有するトランスポーターであり、ＡＴＰの分泌小胞内への蓄積及びＡＴＰの細胞外への放出にも不可欠な役割を担っていることが報告されている。

ＶＮＵＴのヌクレオチド配列やアミノ酸配列は公知である。ヒト及びマウスのＶＮＵＴの代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が、ＮＣＢＩに以下の通りに登録されている。
ヒトＶＮＵＴ（アイソフォーム１）ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号ＮＭ＿０２２０８２．３、アミノ酸配列：アクセッション番号ＮＰ＿０７１３６５．３
ヒトＶＮＵＴ（アイソフォーム２）ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号ＮＭ＿００１３０２６４３．１、アミノ酸配列：アクセッション番号：ＮＰ＿００１２８９５７２．１
マウスＶＮＵＴヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号ＮＭ＿１８３１６１．３、アミノ酸配列：アクセッション番号ＮＰ＿８９８９８４．３

本明細書中、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物とは、ＶＮＵＴの機能を阻害する化合物をいう。具体的には、「ＶＮＵＴの機能」とは、細胞内分泌小胞へのＡＴＰの取り込みや細胞外へのＡＴＰの放出等が挙げられ、「ＶＮＵＴの機能を阻害する」とは、例えば、ＶＮＵＴによる小胞へのＡＴＰの取り込みを阻害する、ＶＮＵＴによる小胞性ＡＴＰの細胞外への放出を阻害する等を指し、例えば、「ＶＮＵＴの発現を抑制する」ことも結果としてＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害するため、ＶＮＵＴの機能を阻害することに含まれる。
本明細書中、「ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物」とは、例えば、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴにより細胞外へのＡＴＰの放出を阻害する効果を有する化合物等を指し、具体的には、ＶＮＵＴとＣｌ⁻との結合を阻害する化合物、ＡＴＰアナログなどのＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害する化合物、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸等のＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物などが挙げられる。
ＶＮＵＴに対するアンチセンス核酸等のＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸、又はこれらの核酸を発現し得るベクターも、ＶＮＵＴの発現を抑制することにより結果としてＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害するため、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物に含まれ得る。ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、ＶＮＵＴの機能を阻害する限り特に限定されることではないが、例えば、アセト酢酸、３−ヒドロキシ酪酸等のケトン体、グリオキシル酸、クロドロン酸、及びＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸又はこれらの核酸を発現し得るベクター等が挙げられる。
好ましくは、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、アセト酢酸及び３−ヒドロキシ酪酸等のケトン体、グリオキシル酸、又はクロドロン酸であり、より好ましくはアセト酢酸、グリオキシル酸、３−ヒドロキシ酪酸及びクロドロン酸からなる群より選択されるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物であり、さらに好ましくは、クロドロン酸である。

本発明に用いられるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴ阻害活性を有する限り特に限定されず、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸等との塩の形態であってもよい。上記無機塩基との塩の例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。上記有機塩基との塩の例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。上記無機酸との塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。上記有機酸との塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。これらの塩のなかでも、薬理学的に許容される塩が好ましい。

本発明に用いられるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、結晶であっても非結晶であってもよく、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれもＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物に包含される。

本発明に用いられるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、同位元素（例、^３Ｈ，^１４Ｃ，^３５Ｓ等）等で標識されていてもよい。

クロドロン酸（ＣＡＳ：１０５９６−２３−３）は、ジクロロメチレンビス（ホスホン酸）とも呼ばれる化合物であり、その塩であるクロドロネートはビスホスホネートの一種として知られている。ビスホスホネートは、破骨細胞を枯渇させ骨吸収を阻害することが知られており、クロドロネートも、骨粗鬆症等の骨疾患の治療剤として、従来より使用されている（商品名：ＢＯＮＥＦＯＳ（Ｂａｙｅｒ）等）。また、特開２００１−１３１０７３には、クロドロン酸の疼痛治療剤としての使用が教示されている。

本発明に用いられるクロドロン酸は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２ ４１１１（１９６７）記載の方法等により製造することもできる。また、クロドロン酸は、既に骨粗鬆症の骨疾患治療剤として販売されているため、これらの市販薬を用いてもよく、東京化成工業株式会社、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などから販売されている試薬を用いてもよい。

本発明に用いられるクロドロン酸は、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸等との塩の形態であってもよい。上記無機塩基との塩の例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。上記有機塩基との塩の例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。上記無機酸との塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。上記有機酸との塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらの塩のなかでも、薬理学的に許容される塩が好ましい。
好ましくは二ナトリウム塩が挙げられる。
一態様として、クロドロン酸は、クロドロン酸の二ナトリウム塩四水和物である。
尚、本明細書中、クロドロン酸の塩の形態であるクロドロネートについても、便宜上、その遊離形態である「クロドロン酸」と記載する場合がある。クロドロネート以外の各種ビスホスホネートに関しても同様に、塩の形態であっても、その遊離形態の名称を用いて記載する場合がある。

ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸としては、ＶＮＵＴに対するＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡ又はアンチセンス核酸等が挙げられる。「ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する」とは、標的となるＶＮＵＴの発現をそれ以外の遺伝子の発現よりも強く抑制することを意味する。

ＶＮＵＴに対するＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡとしては、例えば（Ａ）ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列又は１８塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ、及び（Ｂ）ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と投与対象の哺乳動物（例えばヒト等の霊長類やマウス等のげっ歯類）の細胞内でハイブリダイズし得る１８塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることにより当該ＶＮＵＴのＲＮＡ干渉を誘導する１本鎖又は２本鎖のＲＮＡを挙げることができる。

ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡの例としては、ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列（以下、標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる２本鎖オリゴＲＮＡが挙げられる。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖ＲＮＡであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造を形成するＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）もＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡの好ましい態様の１つである。

ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約１８塩基以上、好ましくは約１９塩基以上、より好ましくは約２１塩基以上の長さであるが、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡが２３塩基よりも長い場合には、該ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡは細胞内で分解されて、約２０塩基前後のｓｉＲＮＡを生じ得るので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列の全長である。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約５０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、最も好ましくは約２３塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、通常、約１８〜５０塩基、好ましくは約１９〜約２５塩基、より好ましくは約２１〜約２３塩基である。

また、ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡを構成する各ＲＮＡ鎖の長さも、通常、約１８塩基以上、好ましくは約１９塩基以上、より好ましくは約２１塩基以上の長さであるが、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されず、理論的には各ＲＮＡ鎖の長さの上限はない。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡを構成する各ＲＮＡ鎖の長さは、例えば約５０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、最も好ましくは約２３塩基以下である。即ち、各ＲＮＡ鎖の長さは、例えば通常、約１８〜５０塩基、好ましくは約１９〜約２５塩基、より好ましくは約２１〜約２３塩基である。なお、ｓｈＲＮＡの長さは、２本鎖構造をとった場合の２本鎖部分の長さとして示すものとする。

尚、本明細書において、全長が２３塩基以下の２本鎖のＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡをｓｉＲＮＡという。

標的ヌクレオチド配列と、ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、当該相補配列の中央から外れた位置についての塩基の変異（少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）については、完全にＲＮＡ干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、相補配列の中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下し得る。

ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡは、５’及び／又は３’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡがＶＮＵＴの発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常５塩基以下、例えば２〜４塩基である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。

ｓｈＲＮＡのヘアピンループのループ部分の長さは、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されないが、通常、５〜２５塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、ｓｈＲＮＡがＶＮＵＴの発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。

「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞内の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。

ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制し得るアンチセンス核酸としては、例えば
（Ａ）ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は１２塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
（Ｂ）ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と治療対象動物（好ましくはヒト）の細胞内でハイブリダイズし得る１２塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で当該ＶＮＵＴへの翻訳を阻害し得る核酸等を挙げることが出来る。

アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する限り特に制限はなく、通常、約１２塩基以上であり、長いものでｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、該長さは好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、通常、約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約１２〜約２００塩基、好ましくは約１５〜約５０塩基、より好ましくは約１８〜約３０塩基である。

アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制可能であれば特に制限はなく、ＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）の全長配列であっても部分配列（例えば約１２塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、好ましくは、標的配列はＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。

アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の同一性を有するものである。

アンチセンス核酸の大きさは、通常約１２塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。

ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸としては、ヌクレオチド又は該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。また、これらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸に含まれる。またウラシル（Ｕ）は、チミン（Ｔ）に一義的に読み替えることができる。

ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばＲＮＡ又はＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、又は可視化させるために、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。

ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。

糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、２’−修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。

２’−修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群（Ｒはアルキル又はアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキルであり、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンである）から選択される置換基で置換されたヌクレオチド、好ましくは２’−ＯＨ基がＨ、Ｆ又はメトキシ基で置換されたヌクレオチド、より好ましくは２’−ＯＨ基がＦ又はメトキシ基で置換されたヌクレオチドがあげられる。また、２’−ＯＨ基が２−（ｍｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ基、３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ基、２−［（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ基、３−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｏｘｙ基、２−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ基、２−（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ基、２−（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ基および２−ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙ基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等もあげられる。

糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（ＢＮＡ）があげられ、具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、エチレン架橋構造型人工核酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＥＮＡ）［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｅ１７５（２００４）］等があげられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２，６２４（１９９９）］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３，４６５３（２００１）］、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，６９００（２０００）］等もあげられる。

リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。

塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数１〜６のアルキル基（例、メチル基、エチル基、プロピル基）、ハロゲン（例、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素）等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数２〜６（例、エチル基、プロピル基、ブチル基）のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルカノイル基（例、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基）、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものがあげられる。

ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチド又は糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を、直接又はリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、５’−ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Ｃｙ５付加ヌクレオチド誘導体、Ｃｙ３付加ヌクレオチド誘導体、６−ＦＡＭ付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。

ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸は、核酸の分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。

ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸は、標的とするＶＮＵＴをコードするｍＲＮＡ配列や染色体ＤＮＡ配列に基づいて標的配列を決定し、市販の核酸自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を合成することにより調製できる。２本鎖のＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を核酸自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い２本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。

ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸を発現し得る発現ベクターにおいては、投与対象である哺乳動物（例えばヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類）の細胞（好ましくは、標的とするＶＮＵＴを発現している細胞（例えば、杯細胞等））内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に、上述のＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡ又はアンチセンス核酸或いはそれらをコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）が機能的に連結されている。

使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物（例えばヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類）の細胞（好ましくは、標的とするＶＮＵＴを発現している細胞（例えば、杯細胞等））内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。

ＲＮＡ干渉誘導性ＲＮＡの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することが好ましい。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター等を挙げることができる。

上記発現ベクターは、好ましくはＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸或いはそれらをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、上記発現ベクターは、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。上記発現ベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジンなどを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。

発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、プラスミドベクター；レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。

本明細書中、用語「治療」は、炎症性腸疾患の症状のうち１以上を除去する、重症度を弱める、及び増悪を抑制すること、活動期（例、再燃期、急性期）から寛解期に移行させること、炎症性腸疾患の再燃を抑制すること、再燃を遅延させること、寛解期を延長すること、並びに、炎症性腸疾患の活動期（例、再燃期、急性期）の期間を短縮することを包含する。
本明細書中、用語「予防」とは、炎症性腸疾患の発病を抑制すること、炎症性腸疾患の発病を遅らせること、又は炎症性腸疾患の発病の可能性を弱めることを包含する。

ヒトの炎症性腸疾患の症状としては、
１）下痢・血便の発生
２）下痢や出血、狭窄などに伴う腹痛の発生
３）腸管の出血などに伴う貧血の発生
４）発熱
５）体重減少
６）大腸粘膜の出血、びらん及び／又は潰瘍
等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物をヒトに用いる場合、本発明の医薬組成物は、上記１）〜６）からなる群より選択される少なくとも１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上、最も好ましくは６全ての症状を予防又は治療する効果を有する。

ヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）の炎症性腸疾患の症状としては、
１）体重の減少
２）大腸の長さの短縮
３）Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）の上昇
４）下痢・血便の発生
５）病理学的所見の変化（筋層の肥厚、好中球の浸潤及び／又はクリプト構造の脱落）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物を、非ヒト哺乳動物に用いる場合、本発明の医薬組成物は、上記１）〜５）からなる群より選択される少なくとも１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、最も好ましくは５の症状を予防又は治療する効果を有する。
ＤＡＩの評価は、実施例に記載の方法に準じて行うことができる。

本発明の医薬組成物の投与対象となる炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性結腸炎、空置結腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、および分類不能大腸炎からなる群より選択される１種以上の疾患である。本発明の医薬組成物の投与対象となる好ましい炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）が挙げられ、どちらも腸管の炎症を主徴とする難治性の疾患である。潰瘍性大腸炎は、大腸に限局した炎症性疾患で原因が不明である。クローン病は、口から肛門にかけて起こる慢性の炎症を特徴とする原因不明の腸疾患であり、寛解と再燃を繰り返す難治性の疾患である。
本発明の医薬組成物は、炎症性腸疾患の予防又は治療用であり、好ましくは潰瘍性大腸炎又はクローン病の予防又は治療用であり、さらに好ましくは、潰瘍性大腸炎の予防又は治療用である。
本発明の医薬組成物は、炎症性腸疾患の再発を抑制する効果を有するため、再発性の炎症性腸疾患にも有用である。

本発明の医薬組成物は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット等の哺乳動物に好適に用いることができる。好ましい態様として、本発明の医薬組成物はヒト用である。
本発明の医薬組成物は、炎症性腸疾患を有するヒト又は炎症性腸疾患の罹患の可能性の高いヒト用であることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、非病変部と比較して病変部においてＶＮＵＴの発現量が亢進していることにより特徴付けられる炎症性腸疾患患者に好適に用いられる。

非病変部と比較して病変部においてＶＮＵＴの発現量が亢進しているか否かは、例えば、非病変部の組織及び病変部の組織をそれぞれ採取し、ＶＮＵＴの発現量を測定し、比較することにより検証できる。ＶＮＵＴの発現量は、自体公知の方法によって測定することができる。例えば、ＶＮＵＴの発現量は、ＶＮＵＴをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸又はそれと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（ＤＮＡ）を用いて、ＶＮＵＴ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、ＲＮＡレベルで測定することができる。あるいは、ＶＮＵＴの発現量は、ＶＮＵＴに対する抗体を用いて、ＶＮＵＴタンパク質を検出することにより、タンパク質レベルで測定することもできる。

ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，６．３．１−６．３．６，１９９９に記載される条件、例えば、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）／４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／５０〜６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。

本発明の医薬組成物に用いられるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、そのままあるいは自体公知の方法に従って、医薬的に許容し得る担体とともに混合した医薬組成物として、経口又は非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、坐薬、注腸、軟膏、貼布、舌下、点眼、吸入等のルート）により投与することもできる。上記目的のために用いる投与量は、有効成分であるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により決定されるが、経口もしくは非経口のルートにより、通常成人一日あたりの投与量として経口投与の場合で１μｇ〜２０ｇ、非経口投与の場合で１μｇ〜２０ｇを用い、１日１回〜数回投与する。また、上記医薬組成物中のＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物の含有量は、組成物全体の約０．０１重量％〜１００重量％である。
しかしながら、これらの投与量、投与回数、投与期間及び投与方法等は、種々の条件により変化する。
好ましくは、本発明の医薬組成物は経口投与又は皮下投与される。
本発明の医薬組成物にＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としてクロドロン酸を用いる場合、本発明の医薬組成物は、好ましくは経口投与又は皮下投与、より好ましくは経口投与される。
一態様において、本発明の医薬組成物は、投与対象の体重（ｋｇ）に対して有効成分が３０ｍｇとなるように、経口投与される。
クロドロン酸は、既に医薬品として上市されており、安全性についての知見が蓄積されているため、これらの情報を考慮し、製剤化及び投与方法等を検討することができる。

本発明の医薬組成物は、活動期（例、急性期、再燃期）及び寛解期のいずれの期間においても、投与することができる。
急性期とは、症状が急激に現れる時期のことを指す。寛解期とは、症状が一時的に軽くなったり、消えたりしている時期のことを指す。寛解期は必ずしも完治した状態ではなく、病気が再発する可能性もある。再燃期とは、寛解期後に症状が再発する時期のことを指す。本発明の医薬組成物は、再燃抑制等の作用を有するため、寛解期での投与用としても有用である。

炎症性腸疾患患者が、活動期又は寛解期のいずれであるかは、臨床症状や内視鏡検査等により判定することができる。

炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎の場合、寛解の判定は、例えばＵＣ−ＤＡＩ（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ−ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）スコアを用いて行うことができる（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＬＲ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９８７ Ｊｕｎ；９２（６）：１８９４−８）。ＵＣ−ＤＡＩスコアは、排便回数、血便、大腸内視鏡検査による粘膜所見、医師の全般的評価の４項目を点数化した合計点により算出されるスコアである。患者のＵＣ−ＤＡＩスコアが２以下かつ血便スコアが０である場合、該患者は寛解期の状態にあると判定される。患者のＵＣ−ＤＡＩスコアが３以上かつ血便スコアが１以上である場合、該患者は活動期の状態にあると判定される。

炎症性腸疾患がクローン病の場合、寛解の判定は、例えばＣＤＡＩ（Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）スコアを用いて行うことができる（Ｂｅｓｔ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９７６ Ｍａｒ；７０（３）：４３９−４４．）。患者のＣＤＡＩ スコアが１５０点未満の場合、該患者は寛解期の状態にあると判定される。患者のＣＤＡＩスコアが１５０点以上である場合、該患者は活動期の状態にあると判定される。ＣＤＡＩスコアが１５０点以上２２０点未満の場合、軽症と診断され、２２０点以上４５０点未満の場合、中等症、４５０点以上の場合、重症と診断される。

本発明の医薬組成物における医薬的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、水溶性高分子、塩基性無機塩；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等があげられる。また、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、発泡剤、香料等の添加物を用いることもできる。

本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、液剤、糖衣剤、デポー剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、舌下剤、貼付剤、口腔内崩壊剤（錠）、吸入剤、注腸剤、軟膏剤、貼付剤、テープ剤、点眼剤等の剤形にしてよく、必要に応じて製剤助剤を用い、常法に従って製造することができる。

本発明の医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。
例えば、本発明の医薬組成物を経口用製剤として調製する場合には賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、糖衣剤、デポー剤、又はシロップ剤等とする。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブトウ糖、ソルビット、結晶セルロース等が、結合剤としては例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガカント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドン等が、崩壊剤としては例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチン等が、滑沢剤としては例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤又は顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差しつかえない。

注射剤を調製する場合には必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤とすることができる。

本発明の医薬組成物を細胞内に運搬しやすくするために、必要に応じ、適切な粒子径や構成成分を有するリポソームに封入することもできる。本明細書中「リポソーム」とは、一つの分子上に親水性部分と疎水性部分とを持つ分子から作られる、少なくとも１つの二重膜を有する小胞を指す。好ましいリポソームは、正電荷リポソーム、正電荷コレステロール、膜透過性ペプチド結合リポソームなどである（中西守ら、タンパク質核酸酵素、４４：１５９０−１５９６（１９９９）、二木史朗、化学と生物、４３：６４９−６５３（２００５）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：４３２５−４３３３（１９９９）など）。一方で、リポソームに封入されていないＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物もまた好ましい態様である。ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がクロドロン酸である場合、マクロファージへの影響を排除できるため、リポソームに封入されていないクロドロン酸を用いることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の活性成分、例えば、５−ＡＳＡ製剤（例えばメサラジン）、ステロイド、免疫調節薬（例えばＡＺＡ等）、免疫抑制剤（例えばＣｓＡなど）、抗炎症薬、抗ＴＮＦα抗体（例えばインフリキシマブ等）、抗ヒスタミン成分、局所麻酔薬成分、ビタミン成分、有効アミノ酸以外のアミノ酸成分（例：バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、シトルリン、オルニチン、シスチン、タウリン、グリシン）、食物繊維、炎症性腸疾患でみられる低栄養の原因となる栄養素などをさらに含有していてもよい。そのような他の活性成分としては、自体公知の各種薬剤を適宜使用することができる。また、他の活性成分は、本発明の剤とは別個に製剤化し、同一対象に対して、同時又は時間差をおいて、また、同一経路又は別経路で投与してもよい。炎症性腸疾患でみられる低栄養の原因となる栄養素としては、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｂ１２、葉酸、銅、カルシウム、マグネシウム、鉄、セレン、亜鉛などが挙げられる。

２．予防上又は治療上有効量のＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与することを特徴とする炎症性腸疾患の予防又は治療方法
本発明は、予防上又は治療上有効量のＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与することを特徴とする炎症性腸疾患の予防又は治療方法（本発明の治療方法）を提供する。本発明の治療方法の好ましい態様としては、予防上又は治療上有効量の本発明の医薬組成物を投与することを特徴とする。
好ましい一態様において、本発明の治療方法は、炎症性腸疾患の寛解期にあると診断されたヒトに対し、予防上又は治療上有効量のＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与する工程を含む。別の好ましい態様において、本発明の治療方法は、炎症性腸疾患に罹患しているか罹患の可能性が高いと診断されたヒトに対し、予防上又は治療上有効量のクロドロン酸（但しクロドロン酸はリポソームに封入されていない）を投与する工程を含む。より好ましい態様において、本発明の治療方法は、炎症性腸疾患の寛解期にあると診断されたヒトに対し、予防上又は治療上有効量のクロドロン酸（但しクロドロン酸はリポソームに封入されていない）を投与する工程を含む。

本明細書中、「有効量」とは、所望の効果を生み出す活性成分の量を意味する。
本明細書中使用される「治療上有効量」とは、対象に投与される時、所望の治療効果（例、炎症性腸疾患の症状のうち１以上を除去する、重症度を弱める、及び増悪を抑制すること、活動期（例、再燃期、急性期）から寛解期に移行させること、炎症性腸疾患の再燃を抑制又は遅延させること、寛解期を延長すること、又は、炎症性腸疾患の活動期（例、再燃期、急性期）の期間を短縮すること等）をもたらす活性成分の量を意味する。治療上有効量は、一度に投与されてもよく、複数回に分けて投与されてもよい。
本明細書中使用される「予防上有効量」とは、対象に投与される時、所望の予防効果（例、炎症性腸疾患の発病を抑制すること、炎症性腸疾患の発病を遅らせること、又は炎症性腸疾患の発病の可能性を弱めること）をもたらす活性成分の量を意味する。予防上有効量は、一度に投与されてもよく、複数回に分けて投与されてもよい。

本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の医薬組成物の投与方法、用量、調製方法等を援用できる。

３．ＶＮＵＴへの阻害活性を指標とする炎症性腸疾患の予防剤又は治療剤の探索方法
本発明はさらに、被検物質が、ＶＮＵＴを阻害し得るか否かを評価する工程を含む、炎症性腸疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法（本発明のスクリーニング方法）を提供する。後述の実施例に示されるように、ＶＮＵＴの働きを阻害すると、炎症性腸疾患の症状が軽減されるので、ＶＮＵＴの阻害活性を指標として、炎症性腸疾患（好ましくは潰瘍性大腸炎又はクローン病、より好ましくは潰瘍性大腸炎）の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることが可能である。

本発明のスクリーニング方法は、被検物質が、ＶＮＵＴを阻害し得るか否かを評価する工程を含む。ＶＮＵＴを阻害し得るか否かを評価する工程は、具体的には、被検物質の存在下及び非存在下でのＶＮＵＴの活性を測定し両者を比較することによって実施される。ＶＮＵＴの活性の測定は、通常、インビトロにおいて行われる。
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、以下の工程を含む：
（１）被検物質の存在下において、ＶＮＵＴの活性を測定する工程；
（２）当該被検物質の非存在下において、ＶＮＵＴの活性を測定する工程；
（３）当該被検物質の存在下における当該ＶＮＵＴの活性を、当該被検物質の非存在下における当該ＶＮＵＴの活性と比較する工程；及び
（４）比較の結果、当該被検物質の非存在下におけるＶＮＵＴの活性と比較して、当該被検物質の存在下におけるＶＮＵＴの活性が低い被検物質を、炎症性腸疾患の予防剤又は治療剤の候補物質として選択する工程。

本発明のスクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

一実施態様として、ＶＮＵＴの活性の測定は、例えば、Ｊｕｇｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ６８，９９−１１２．（２０１０）に記載の方法、本願明細書の実施例１に記載の方法等に準じて、ＶＮＵＴを介したＡＴＰのとりこみを測定することにより測定することができる。例えば、精製したＶＮＵＴタンパク質が組込まれたプロテオリポソームを、標識したＡＴＰ（例えば、［^３Ｈ］−ＡＴＰ等の放射性同位元素で標識されたＡＴＰ等）を含む測定溶液中でインキュベートし、リポソーム内に取り込まれたＡＴＰ量を測定することにより（例えば、標識したＡＴＰとして放射性同位元素で標識されたＡＴＰを用いる場合、液体シンチレーションカウンターを用いて測定する等）、ＶＮＵＴの活性を測定することができるが、これに限定されない。ＶＮＵＴが組込まれたプロテオリポソームは、例えば、実施例１に記載するように、精製したＶＮＵＴタンパク質とリポソームとを混合し、凍結させた後に溶解をし、再構成バッファーに溶解することにより作製することができる。このプロテオリポソームを、Δψを付与する物質（例、バリノマイシン等）、Ｃｌ⁻（例、ＫＣl等）及び標識したＡＴＰ（例、［^３Ｈ］−ＡＴＰ）を含む溶液中で、一定時間インキュベートし、遠心カラムを用いてプロテオリポソームを外部培地から分離することにより輸送を終結させ、液体シンチレーションカウンターにより得られた溶出物中の放射線を測定し取り込まれたＡＴＰ量を計算することにより、ＶＮＵＴの活性を測定することができる。
また別の態様として、ＶＮＵＴの活性の測定は、ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞を用い、ＡＴＰ放出刺激に対して、細胞外に放出されるＡＴＰ量を測定することにより測定することができる。ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞を用いたＶＮＵＴの活性の測定は、例えば、Ｊｕｇｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ６８，９９−１１２．（２０１０）に記載の方法、Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４，１−１０（２０１４）に記載の方法、Ｈｉａｓａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．２，ｅ１２０３４（２０１４）に記載の方法等に準じて行うことができる。ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞としては、海馬神経初代培養等の神経細胞、血小板などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＶＮＵＴの活性の測定は、ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞に被検物質を接触させた後、該細胞にＶＮＵＴ依存的なＡＴＰ放出刺激を与え、細胞外に放出されるＡＴＰ量を測定することにより、測定することができる。大腸においては、内在性のＶＮＵＴの発現が杯細胞において観察されることから、ＶＮＵＴの活性の測定は、杯細胞を用いて行うことも好ましい。杯細胞としては、ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを放出する限り特に限定されるものではないが、例えば、生体内の杯細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞等の培養杯細胞モデル、多能性幹細胞等の未分化細胞から分化誘導された大腸杯細胞などが挙げられる。

工程（１）及び（２）は、同時に行ってもよく、別々に行ってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に行うことが好ましい。

ＶＮＵＴの活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の非存在下におけるＶＮＵＴの活性は、被検物質の存在下におけるＶＮＵＴの活性の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。

尚、被検物質の存在下におけるＶＮＵＴの活性測定についての試験条件（リポソームの作製方法、用いる細胞の種類及び培養条件等）は、被検物質が存在する点を除き、被検物質の非存在下で行うＶＮＵＴの活性測定と同一であることが好ましい。

そして、比較の結果、ＶＮＵＴの活性を抑制した被検物質を、炎症性腸疾患を予防又は治療する作用を有する物質の候補物質として選択することが出来る。

このようにして選択された候補物質が、実際に炎症性腸疾患の予防又は治療作用を有するか確認する試験を引き続き行ってもよい。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、さらに下記の（５）〜（７）の工程を含み得る；
（５）炎症性腸疾患モデル非ヒト哺乳動物に工程（４）で選択した候補物質を投与すること；
（６）該非ヒト哺乳動物における炎症性腸疾患の症状を評価すること；
（７）候補物質を投与した非ヒト哺乳動物における炎症性腸疾患の症状を、候補物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における炎症性腸疾患の症状と比較すること。

炎症性腸疾患モデル非ヒト哺乳動物の作製方法は、当業者に周知であり、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲水投与する方法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９０ Ｍａｒ；９８（３）：６９４−７０２）、及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を注腸する方法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９８９ Ｍａｒ；９６（３）：７９５−８０３）、インターロイキン１０ノックアウトマウスに自然に発症させる方法（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６ Ａｕｇ １５；９８（４）：１０１０−２０）、ＳＣＩＤマウスにＣＤ４^＋ＣＤ４５^ｈｉｇｈ細胞を移入する方法（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｆｅｂ；２９６（２）：Ｇ１３５−４６）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の飲水投与は、急性大腸炎の確立されたマウス炎症性損傷モデルである。ＤＳＳの飲水投与によって腸粘膜上皮細胞の障害を誘導し、下痢、下血、体重減少など潰瘍性大腸炎と類似の症状を引き起こすことが知られている。

非ヒト哺乳動物における炎症性腸疾患の症状の評価は、当業者に周知のパラメーター、例えば、１）体重（体重の減少が症状の悪化を意味する）、２）大腸の長さ（大腸の長さの短縮が症状の悪化を意味する）、３）Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）（ＤＡＩの上昇が症状の悪化を意味する）、４）下痢・血便の有無（下痢・血便の発生が症状の悪化を意味する）、５）病理学的所見の変化（筋層の肥厚、好中球の浸潤又はクリプト構造の脱落などが症状の悪化を意味する）等に基づき行われる。

尚、対照非ヒト哺乳動物についての試験条件（動物の種類、炎症性腸疾患モデルの種類等）は、候補物質を投与しない点を除き、候補物質を投与する非ヒト哺乳動物と同一であることが好ましい。

そして、候補物質を投与した非ヒト哺乳動物における炎症性腸疾患の症状が、候補物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における炎症性腸疾患の症状よりも有意に軽減されている場合には、当該候補物質を、炎症性腸疾患を予防又は治療する活性を有する物質として得ることが出来る。

本明細書中、ＶＮＵＴは、通常、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット等の哺乳動物由来のものを意味する。本明細書中、ＶＮＵＴが哺乳動物由来であるとは、ＶＮＵＴのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、哺乳動物のものであることを意味する。

４．クロドロン酸又はその塩を有効成分とする、ＶＮＵＴ阻害剤
本発明者らは、クロドロン酸又はその塩を有効成分として含有するＶＮＵＴ阻害剤（以下、本発明のＶＮＵＴ阻害剤とも称する）を提供する。
クロドロン酸は、後述の実施例に記載するように、小胞型グルタミン酸トランスポーター２（ＶＧＬＵＴ２／ＳＬＣ１７Ａ６）、ＶＧＬＵＴ３（ＳＬＣ１７Ａ８）、ＶＧＬＵＴ１（ＳＬＣ１７Ａ７）、小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター（ＶＥＡＴ）、小胞型抑制性アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ／ＳＬＣ３２Ａ１）、小胞型モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２／ＳＬＣ１８Ａ２）及びＮａ^＋−リン酸共輸送体１（ＮＰＴ１／ＳＬＣ１７Ａ１）と比較して、ＶＮＵＴに対して強力な阻害作用を有する。従って、本発明のＶＮＵＴ阻害剤は、選択性の高いＶＮＵＴ阻害剤として機能する。

一態様において、本発明のクロドロン酸又はその塩を有効成分として含有するＶＮＵＴ阻害剤の、ＶＮＵＴが媒介するＡＴＰの取り込みに対するＩＣ_５０値は、１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらに好ましくは２０ｎＭ以下である。さらに好ましい態様においては、本発明のクロドロン酸又はその塩を有効成分として含有するＶＮＵＴ阻害剤は、小胞型グルタミン酸トランスポーター２（ＶＧＬＵＴ２／ＳＬＣ１７Ａ６）依存的なグルタミン酸の取り込み、ＶＧＬＵＴ３（ＳＬＣ１７Ａ８）依存的なグルタミン酸の取り込み、ＶＧＬＵＴ１（ＳＬＣ１７Ａ７）依存的なグルタミン酸の取り込み、小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター（ＶＥＡＴ）依存的なアスパラギン酸の取り込み、小胞型抑制性アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ／ＳＬＣ３２Ａ１）依存的な４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の取り込み、小胞型モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２／ＳＬＣ１８Ａ２）依存的なセロトニンの取り込み及びＮａ^＋−リン酸共輸送体１（ＮＰＴ１／ＳＬＣ１７Ａ１）依存的なパラアミノ馬尿酸（ＰＡＨ）の取り込みからなる群から選ばれる１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上、特に好ましくは６以上、最も好ましくは７に対して、ＩＣ_５０値が１μＭ以上であり、かつ、ＶＮＵＴが媒介するＡＴＰの取り込みに対するＩＣ_５０値が１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下である。

クロドロン酸は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル、ヒト等、好ましくはヒト）に対して、優れたＶＮＵＴ阻害活性を有しているので、ＶＮＵＴ阻害剤として有用である。

本発明のＶＮＵＴ阻害剤は、ＶＮＵＴが関与する疾患の予防又は治療に有用であり、当該疾患の予防又は治療用の医薬として製剤化することができる。
ＶＮＵＴは、糖尿病などに関与することが知られている。

本発明のＶＮＵＴ阻害剤を、ＶＮＵＴが関与する疾患の予防又は治療に用いる場合、本発明のＶＮＵＴ阻害剤は、上述の本発明の医薬組成物の製剤化方法に準じて製剤化することができる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

試験例：大腸でのＶＮＵＴの発現
ＮＣＢＩ ＧＥＯに登録されているマイクロアレイのデータベース（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ：ｃｏｌｏｎ ｂｉｏｐｓｉｅｓ）を用い、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の病理検査サンプルの遺伝子発現量を比較した（図１）。
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の病理検査サンプルの遺伝子発現量を比較したところ、ＵＣ患者の病変部において、炎症時に亢進したＶＮＵＴの発現が、寛解期も高いまま保たれることを見出した（図１（ｂ））。一方、炎症性サイトカインであるインターロイキン−１７ａは、活動期病変部と比較して、寛解期病変部では発現量が低下していた（図１（ａ））。
また、骨髄球（マクロファージ及び顆粒球等）のマーカーであるＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）は、活動期病変部では高い発現がみとめられたが、寛解期病変部では健常なヒトと同程度まで発現量が低下していた（図１（ｃ））。急性期では病変部にマクロファージが集積するが、炎症が治まるとマクロファージが減少し、寛解期では健常なヒトとほぼ同じ程度までに戻ることが示された。

実施例１：クロドロン酸の小胞型核酸トランスポーター阻害効果評価
ＶＮＵＴに対する、ビスホスホネートの阻害作用を検証するため、図２に記載の各種ビスホスホネート（クロドロン酸、エチドロン酸、チルドロン酸、メドロン酸、ジフルオロメチレン−ジホスホン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、ネリドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、ゾレドロン酸、メチレンビスホスホン酸ジクロライド）を用いて、ＶＮＵＴのＡＴＰ取り込みを観察した。ピロリン酸については、Ｌｉｕ，Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ Ｎｏｖ ４；６８（３）：５４３−５６（２０１０）に記載の値を参考にした。
また、様々な小胞型神経伝達物質トランスポーター（ＶＮＵＴ）、小胞型グルタミン酸トランスポーター２（ＶＧＬＵＴ２／ＳＬＣ１７Ａ６）、ＶＧＬＵＴ３（ＳＬＣ１７Ａ８）、ＶＧＬＵＴ１（ＳＬＣ１７Ａ７）、小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター（ＶＥＡＴ）、小胞型抑制性アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ／ＳＬＣ３２Ａ１）、小胞型モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２／ＳＬＣ１８Ａ２）及びＮａ^＋−リン酸共輸送体１（ＮＰＴ１／ＳＬＣ１７Ａ１）を用いて、それぞれのトランスポーターに対するクロドロン酸又はエチドロン酸の阻害効果を検証した。

大腸菌を用いた小胞型神経伝達物質トランスポーターの発現と精製は、Ｌｅｖｉａｔａｎ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，２３５４８−２３５５６（２０１０）に記載の方法に準じて行った。
ＶＮＵＴ、小胞型グルタミン酸トランスポーター２（ＶＧＬＵＴ２／ＳＬＣ１７Ａ６）、ＶＧＬＵＴ３（ＳＬＣ１７Ａ８）、小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター（ＶＥＡＴ／ＳＬＣ１７Ａ５）及びＮａ^＋−リン酸共輸送体１（ＮＰＴ１／ＳＬＣ１７Ａ１）のｃＤＮＡを、両末端のＨｉｓタグ及び可溶性αへリックスタンパク質と共に、大腸菌発現ベクターにクローニングし、大腸菌に過剰発現させた。さらに、ＶＧＬＵＴ１（ＳＬＣ１７Ａ７）、小胞型抑制性アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ／ＳＬＣ３２Ａ１）及び小胞型モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２／ＳＬＣ１８Ａ２）のｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターにクローニングし、昆虫細胞に過剰発現させた。昆虫細胞を用いた小胞型神経伝達物質トランスポーターの発現と精製は、Ｊｕｇｅ，Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ６８，９９−１１２．（２０１０）に記載の方法に準じて行った。Ｊｕｇｅ，Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ６８，９９−１１２．（２０１０）、およびＬｅｖｉａｔａｎ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，２３５４８−２３５５６（２０１０）に記載の方法に準じ、これらの膜画分を可溶化させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製したタンパク質は電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色して、予想されるサイズに、主要なバンドが存在するのを確認した。
次に、精製したタンパク質をプロテオリポソームに組込み、鎮痛効果を有する第一世代ビスホスホネートとして知られるクロドロン酸及びエチドロン酸が、これらのトランスポーターを阻害するのか否かを検証した。

（方法）
〈ｃＤＮＡ〉
マウスＶＮＵＴ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ１８３１６１）、ラットＶＧＬＵＴ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ０５３８５９．２）、ラットＶＧＬＵＴ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ０５３４２７．１）、ヒトＶＧＬＵＴ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ００１１３８７６０．１）、マウスＶＥＡＴ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ１７２７７３）、マウスＶＩＡＡＴ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０５２０２０）、ラットＶＭＡＴ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ０１３０３１．１）及びマウスＮＰＴ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ００１１７０６３８．１）のｃＤＮＡをＰＣＲによってクローニングした。

〈化学物質〉
クロドロン酸（Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）、エチドロン酸（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）、チルドロン酸（ｔｉｌｕｄｒｏｎａｔｅ）、メドロン酸（ｍｅｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロン酸（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、ネリドロン酸（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、イバンドロン酸（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、及びメチレンビスホスホン酸ジクロライド（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｉｓ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ジフルオロメチレンジホスホン酸（Ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）はＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．から購入した。アレンドロン酸（Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）及びリセドロン酸（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）は、ＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。ミノドロン酸（ｍｉｎｏｄｒｏｎａｔｅ）はＴｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。化合物は、それぞれ蒸留水に溶解した。

〈再構成系〉
精製タンパク質２０μｇを、リポソーム５５０μｇと−８０℃で少なくとも１５分間混合させた。サンプルチューブを手で握ることにより混合物を素早く溶解させ、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び５ｍＭ酢酸マグネシウムを含む再構成バッファーで６０倍に希釈した。バッファー組成は、必要に応じて変化させた。再構成したプロテオリポソームは、４℃、２００，０００ｇ、１時間の遠心によりペレットにし、０．２ｍＬの再構成バッファーに懸濁した。アゾレクチンリポソームは、Ｊｕｇｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ６８，９９−１１２．（２０１０）に記載のとおり準備した。大豆レクチン（１０ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ＩＩＳ）を、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）及び１ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含むバッファーに懸濁した。バス型ソニケーター中で、混合物が透き通るまでソニケーションを行い、使用まで−８０℃で保存した。いくつかの実験において、精製したＶＭＡＴ２はリポソームと共に再構成を行った。簡潔に、２０μｇ ＶＭＡＴ２をリポソーム（脂質５５０μｇ）と混合し、−８０℃で凍結させ、この温度で少なくとも１５分間放置した。混合物を、４０ｍＭ ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．７）、１５０ｍＭ酢酸カリウム及び５ｍＭ酢酸マグネシウムを含む再構成バッファーで６０倍に希釈した。再構成させたプロテオリポソームは、２００，０００ｇ、１時間、４℃の遠心によりペレットにし、０．２ｍＬの共再構成バッファーに懸濁した。

〈輸送アッセイ〉
プロテオリポソームに組込んだ０．３μｇのタンパク質、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＫＣｌ及び２μＭバリノマイシン、並びに１００μＭ［^３Ｈ］−ＡＴＰ（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、１００μＭ［２，３−^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、１００μＭ［２，３−^３Ｈ］Ｌ−アスパラギン酸（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、１００μＭ［２，３−^３Ｈ］ＧＡＢＡ（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）又は１００μＭ パラアミノ馬尿酸（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）からなる反応混合物（１３０μＬ）を２７℃でインキュベートした。表示された時点に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（ｆｉｎｅ）を包含する遠心カラムを用いて、プロテオリポソームを外部培地から分離することにより、輸送を終結させた。溶出物中の放射線を、液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により測定した。セロトニン輸送のためには、ＶＭＡＴ２（タンパク質０.３μｇ）を含有するプロテオリポソームを、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム及び１０ｍＭＫＣｌ並びに１０μＭ［２−^３Ｈ］セロトニン（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）からなる反応混合物（１３０μＬ）を２７℃でインキュベートした。表示の時点で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（ｆｉｎｅ）を包含する遠心カラムを用いて、外部培地からプロテオリポソームを分離することにより、輸送を終了させた。溶出物中の放射線を、液体シンチレーションカウンターにより測定した。

〈データ解析〉
特筆しない限り、実施例１及び６に関して、全ての数値を平均±標準誤差（ｎ＝３〜２３）として示す。統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）により決定した。有意性は、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１として定義した。

（結果）
ＶＮＵＴに対する、各種ビスホスホネート（クロドロン酸、エチドロン酸、チルドロン酸、メドロン酸、ジフルオロメチレン−ジホスホン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、ネリドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、ゾレドロン酸、メチレンビスホスホン酸ジクロライド、ピロリン酸）の、ＶＮＵＴのＡＴＰ取り込みに対する阻害作用を図２に示す。エチドロン酸は、ＩＣ_５０ ２０．８μＭを示すわずかな阻害効果を有していた。試験した化合物の中で、クロドロン酸は、ＶＮＵＴが媒介するＡＴＰの取り込み抑制に対しＩＣ_５０ １５．６ｎＭを示す最も強い阻害効果を有した（図２）。
ミノドロン酸は、わずかな阻害効果を示したが、他のいずれのビスホスホネートも、ＶＮＵＴ依存的なＡＴＰの取り込みに対する、強力な阻害効果は示さなかった（図２）。
興味深いことに、メドロン酸（ビスホスホネートの基礎骨格）、ジフルオロメチレン−ジホスホン酸（特性基の塩素を、フッ素で置換したクロドロン酸アナログ（類似体））、及びメチレンビスホスホン酸ジクロライド（リン酸基中の水酸基を塩素で置換したクロドロン酸アナログ（類似体））は、ＶＮＵＴ依存的なＡＴＰの取り込みに対して、阻害効果が弱かったか又は全く示さなかった（図２）。

各種小胞型神経伝達物質トランスポーターに対するビスホスホネート（クロドロン酸又はエチドロン酸）の阻害効果を図３に示す。各種小胞型神経伝達物質トランスポーターを精製し、最終画分をCBB染色した。各トランスポーターの分子量の位置に単一バンドを検出することで、それぞれのタンパク質が精製できていることを確認した（図３a）。クロドロン酸及びエチドロン酸は、ＶＧＬＵＴ１〜３媒介性のグルタミン酸の取り込みに対し阻害効果をわずかに示したが、その効果はクロドロン酸のＶＮＵＴに対する阻害効果の１０００分の１であった（図３ｂ）。
クロドロン酸及びエチドロン酸のいずれも、ＶＥＡＴ媒介性のアスパラギン酸の取り込み、ＶＩＡＡＴ媒介性のＧＡＢＡの取り込み、又はＶＭＡＴ２媒介性のセロトニンの取り込みに対して、阻害効果を示さなかった。ＶＥＡＴは、Δψ依存的なアスパラギン酸輸送に加え、Ｈ^＋／シアル酸共輸送機能を有するが、Ｈ^＋／シアル酸共輸送も阻害されなかった。また、腎臓からの尿酸及び薬剤の排出を制御するＮＰＴ１−媒介性のパラアミノ馬尿酸（ＰＡＨ）の取り込みも、阻害されなかった。

従って、クロドロン酸は、ビスホスホネートの中で、ＶＮＵＴの最も強い阻害剤であることが、シス阻害研究により示された。これらの結果から、クロドロン酸は、小胞型核酸トランスポーターの強力で選択的な阻害剤であることが示された。

［大腸炎モデル］
実施例２：急性モデルに対するクロドロン酸の薬効評価
（方法）
〈動物〉
マウスは日本チャールス・リバー社から購入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、８週齢を用いた。ＳＰＦ環境下にて、固形飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業株式会社）、水道水を自由に与え、小ケージ内で個飼いとした。入荷から５日間の馴化期間をおいた後、試験に用いた。
〈試薬の調製〉
・２％ＤＳＳ溶液
重量の２％量のデキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ：ＤＳＳ，ＭＰバイオ）をミリＱ水に溶解し、０．２２μｍフィルターにて滅菌を行った。調製後は４℃で保管した。
・クロドロン酸投与液
クロドロン酸二ナトリウム四水和物（東京化成工業株式会社）を１０ｍｇ／ｋｇ用は２．０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｋｇ用は６．０ｍｇ／ｍｌ溶液を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）で用時調製した。

〈ＤＳＳ大腸炎〉
マウスを無処置群（ｎ＝４）とＤＳＳ投与群（ｎ＝１８）に分け、ＤＳＳ投与群には２％ＤＳＳ溶液を飲水として６日間自由摂取させた。無処置群は水道水を自由に飲水させた。この間、体重と下痢、血便のスコア、飲水量を毎日観察した。下痢、血便のスコアは下記表１を基準とした。

ＤＳＳ投与群の１８匹はさらに無作為に３群に分け、生理食塩水又はクロドロン酸の投与を行った。クロドロン酸投与群は上記のクロドロン酸投与液（１０ｍｇ／ｋｇ用又は３０ｍｇ／ｋｇ用）を体重１ｇあたり５μｌずつ、ＤＳＳ投与１日目〜５日目までの間、毎日皮下投与した。生理食塩水群は同量の生理食塩水を同じスケジュールで投与した。群構成は下記に記す。

ＤＳＳ投与６日目に剖検を行い、大腸の長さを測定し、組織学的解析のためのサンプリングを行った。
〈Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）〉
ＤＳＳを投与している６日間の体重減少、下痢、および血便のスコアの最も高い値を足し合わせた値をＤＡＩとして算出した。
体重減少のスコアは、
０：体重減少率（％）が１％未満；
１：体重減少率（％）が１％以上５％未満；
２：体重減少率（％）が５％以上１０％未満；
３：体重減少率（％）が１０％以上１５％未満；
４：体重減少率（％）が１５％以上；
とした。
下痢、および血便のスコアは
０：表１のスコアが０；
２：表１のスコアが１又は２；
４：表１のスコアが３又は４；
とした（Ｈａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１１７：４６２−４６８）。

［組織学的評価］
上記の大腸炎モデル剖検時に採取した大腸を縦に割き、肛門側を中心に内腔側を内側に巻き、渦巻き状のまま４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク）中で１時間固定した。定法に則り、パラフィン置換を行い、５μｍの切片を作成した。
〈ＰＡＳ・アルシアンブルー（ｐＨ１．０）〉
脱パラフィン後、水洗し１Ｎ ＨＣｌに５分間浸けた。アルシアンブルー液ｐＨ１．０（和光純薬）に３０分浸け、水洗後、０．５％過ヨウ素酸水溶液（和光純薬）に１０分、流水で５分水洗後、ＤＷで水洗し、その後シッフ試薬（和光純薬）に１０分間浸し、亜硫酸水に３分ｘ３回浸け、発色させた。核染色のためにヘマトキシリン（和光純薬）に１０秒程度浸け、水道水で１０分間水洗した。この後定法に則り、脱水、透徹、封入を行った。
カメラ付き顕微鏡にて撮影後、筋層の厚さと、クリプト構造が破壊されている割合を画像解析ソフトウェアであるｉｍａｇｅＪを用いて解析した。さらに、ｉｍａｇｅＪを用いて、大腸全長の病理画像の解析を行った。全体の腸の長さと、クリプトが破壊されている部分の長さを算出し、その割合を計算してクリプト構造の欠損率とした。

（結果）
図４に体重の変化における結果を示す。ＤＳＳ摂取により６日間で約７％の体重減少がみられたが、クロドロン酸投与により体重減少が抑制された。体重変化率のデータを表３に示す。

図５に下痢及び血便スコアを示した。ＤＳＳ摂取により下痢が誘発されたが、クロドロン酸投与により症状が抑制された。下痢・血便スコアのデータを表４に示す。

図６に大腸の長さを示した。ＤＳＳ摂取により大腸長の短縮がみられたが、クロドロン酸投与により短縮が抑制された。大腸の長さデータを表５に示す。

図７にＤＡＩを示した。ＤＳＳ摂取によりＤＡＩが高値となったが、クロドロン酸投与により抑制された。ＤＡＩデータを表６に示す。

図８にクリプト構造の欠損率を示す。ＤＳＳ摂取によりクリプト構造欠損率が増加したが、クロドロン酸投与により抑制された。表７にクリプト構造の欠損率のデータを示した。

図９に筋層の肥厚（大腸の上部）を、図１０に筋層の肥厚（大腸の下部）を示す。ＤＳＳ摂取により筋層の肥厚がみられたが、クロドロン酸投与により抑制された。表８は、筋層の肥厚（大腸の上部）のデータを示し、表９に筋層の肥厚（大腸の下部）のデータを示した。

実施例３：ビスホスホネート３種の大腸炎モデルに対する薬効評価
（方法）
〈試薬の調製〉
・２．８％ＤＳＳ溶液
重量の２．８％量のＤＳＳをミリＱ水に溶解し、０．２２μｍフィルターにて滅菌を行った。調製後は４℃で保管した。
・クロドロン酸投与液（Ｃｌｏ）（３０ｍｇ／ｋｇ）
クロドロン酸二ナトリウム四水和物６．０ｍｇ／ｍｌを生理食塩水で用時調製した。
・エチドロン酸投与液（Ｅｔｉ）（２１ｍｇ／ｋｇ）
エチドロン酸二ナトリウム水和物（東京化成工業株式会社）４．２ｍｇ／ｍｌを生理食塩水で用時調製した。
・アレンドロン酸投与液（Ａｌｅ）（３．０ｍｇ／ｋｇ）
アレンドロン酸ナトリウム三水和物（東京化成工業株式会社）０．６０ｍｇ／ｍｌを生理食塩水で用時調製した。
・シクロスポリンＡ投与液（ＣｙＡ）（１０ｍｇ／ｋｇ）
シクロスポリンＡ（東京化成工業株式会社）２．０ｍｇ／ｍｌを生理食塩水で用時調製した。
〈各投与濃度について〉
クロドロン酸については実施例２で効果が高かった３０ｍｇ／ｋｇの用量を採用した。エチドロン酸の用量はクロドロン酸３０ｍｇ／ｋｇと等モルとした。アレンドロン酸についてはクロドロン酸と等モル量を投与すると毒性が出現するため、１週間の投与でこれが出現しない用量を選択した。シクロスポリンＡについては既報の論文（Ｓａｎｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２０１３．９２（１２）：ｐ．７０８−１８）と事前の検討でＤＳＳ大腸炎に効果のある投与量を決定した。

〈ＤＳＳ大腸炎〉
実施例２の方法と同様に行った。ただしＤＳＳ溶液は２．８％とした（ＤＳＳのロット間で発症や増悪度に差があるため、最適化を行っている。）。
各群にクロドロン酸投与液、エチドロン酸投与液、アレンドロン酸投与液、又はシクロスポリンＡ投与液を体重１ｇあたり５μｌずつ、ＤＳＳ投与１日目〜５日目までの間、毎日皮下投与した。生食群は同量の生理食塩水を同じスケジュールで投与した。群構成は表１０に記す。

ＤＳＳ投与６日目に剖検を行い、大腸の長さを測定した。

（結果）
図１１に大腸長の比較データを、表１１に大腸長のデータを示した。ＤＳＳ摂取により大腸長の短縮がみられ、ポジティブコントロール（薬効があることが知られている薬剤）として用いたシクロスポリンＡと、クロドロン酸の投与により抑制がみられた。

実施例４：再燃モデルに対するクロドロン酸の薬効評価
（方法）
〈試薬の調製〉
・ＯＶＡ含有２．８％ＤＳＳ溶液
重量の２．８％量のデキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ：ＤＳＳ，ＭＰバイオ）をミリＱ水に溶解し、卵白アルブミン（ＯＶＡ；シグマアルドリッチ）を０．１４ｍｇ／ｍｌとなるように添加、０．２２μｍフィルターにて滅菌を行った。調製後は４℃で保管した。
・ＯＶＡ含有２．１％ＤＳＳ溶液
ＯＶＡ ０．１４ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、ＤＳＳ２．８％溶液と１：３で混和することにより調製した。
・クロドロン酸投与液
クロドロン酸二ナトリウム四水和物（東京化成工業株式会社）６．０ｍｇ／ｍｌを生理食塩水で用時調製した。

〈ＤＳＳ大腸炎〉
試験開始日をｄａｙ０とし、体重により群分けを行い、２４時間の絶食をかけた。ｄａｙ１に再摂食させ、同時にＯＶＡ含有ＤＳＳ溶液を水道水の代わりにｄａｙ６までの５日間自由摂水で与えた。ｄａｙ１から体重、飲水量の測定を行い、糞便について血便、下痢のスコアリングを行った。血便が消失し下痢も軽度になったｄａｙ４４にｄａｙ０の体重に対する変化率、下痢スコアと、ｄａｙ４４までの最大体重減少率によりｎ＝５〜６で３群に分けた。ＯＶＡ含有ＤＳＳ溶液の対照としてｄａｙ１からｄａｙ４４まで水道水を与えたマウスはｄａｙ４４の体重変化率と下痢スコアによりｎ＝３〜４で３群に分けた。ｄａｙ４７、ｄａｙ４８、ｄａｙ４９の３日間、クロドロン酸二ナトリウム四水和物（東京化成工業株式会社）６ｍｇ／ｍｌ溶液又は生理食塩水を５ｍｌ／ｋｇで１日１回皮下投与を行った。また、ｄａｙ４８からｄａｙ４９にかけて絶食をかけ、ｄａｙ４９に再摂食、同時にＯＶＡ０．１４ｍｇ／ｍｌ含有ＤＳＳ２．１％溶液をｄａｙ５１までの２日間与え、大腸炎の再燃を誘発した。ｄａｙ５１に剖検を行い、大腸の長さを測定、評価項目とした。

（結果）
図１２に大腸長の比較を、表１２に大腸長のデータを示した。

急性期にＤＳＳ２．８％＋ＯＶＡを与えた群では、慢性期にＤＳＳ２．１％＋ＯＶＡを与えることにより、大腸長の有意な短縮がみられた。急性期に水を与えた群では、後にＤＳＳ２．１％ＯＶＡを与えても大腸長の短縮はみられなかった。また、再燃前のクロドロン酸投与により大腸長の短縮は有意に抑制された。

結論
ＤＳＳ誘発マウス急性大腸炎モデルおよび再燃モデルにおいて、クロドロン酸二ナトリウムによる大腸炎抑制作用が認められた。
一方、今回の解析では他のビスホスホネートであるエチドロン酸、アレンドロン酸には大腸炎抑制作用は認められなかった。

実施例５：クロドロン酸の経口投与による大腸炎改善効果
（方法）
〈試薬の調製〉
・ＯＶＡ含有２．８％ＤＳＳ溶液
重量の２．８％量のデキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ：ＤＳＳ，ＭＰバイオ）をミリＱ水に溶解し、卵白アルブミン（ＯＶＡ；シグマアルドリッチ）を０．１４ｍｇ／ｍｌとなるように添加、０．２２μｍフィルターにて滅菌を行った。調製後は４℃で保管した。
・ＯＶＡ含有２．１％ＤＳＳ溶液
ＯＶＡ ０．１４ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、ＤＳＳ２．８％溶液と１：３で混和することにより調製した。
・クロドロン酸投与液（皮下）
クロドロン酸二ナトリウム四水和物（東京化成工業株式会社）６．０ｍｇ／ｍｌを生理食塩水で用時調製した。
・クロドロン酸投与液（経口）
クロドロン酸二ナトリウム四水和物（東京化成工業株式会社）１０ｍｇ／ｍｌをミリＱ水で用時調製した。
・５−ＡＳＡ投与液（経口）
５−アミノサリチル酸（シグマアルドリッチ）５．０ｍｇ／ｍｌを注射用水（大塚）で用時調製した。
・抗ＴＮＦα抗体投与液（腹腔内）
抗ＴＮＦα抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）原液、０．５ｍｇ／ｍｌをそのまま使用した。
〈ＤＳＳ大腸炎〉
試験開始日をｄａｙ０とし、体重により群分けを行い、２４時間の絶食をかけた。ｄａｙ１に再摂食させ、同時にＯＶＡ含有ＤＳＳ溶液を水道水の代わりにｄａｙ６までの５日間自由摂水で与えた。ｄａｙ１から体重、飲水量の測定を行い、糞便について血便、下痢のスコアリングを行った。血便が消失し下痢も軽度になったｄａｙ６１に、ｄａｙ０の体重に対する変化率、下痢スコアと、ｄａｙ６１までの最大体重減少率により、ｎ＝６で７群に分けた。ＯＶＡ含有ＤＳＳ溶液の対照としてｄａｙ１からｄａｙ６１まで水道水を与えたマウスはｄａｙ６１の体重変化率と下痢スコアによりｎ＝６で２群に分けた。
ｄａｙ６１、ｄａｙ６２、ｄａｙ６３の３日間、クロドロン酸皮下投与群ではクロドロン酸二ナトリウム四水和物（東京化成工業株式会社）６ｍｇ／ｍｌ溶液を体重１グラム当たり、５μｌで１日１回皮下投与を行った。対照群では生理食塩水を体重１グラム当たり、５μｌで１日１回皮下投与を行った。クロドロン酸経口投与群では体重１グラム当たり、１０μｌクロドロン酸溶液を経口投与した。５−ＡＳＡ経口投与群では体重１グラム当たり、１０μｌ ５−ＡＳＡ溶液を経口投与した。対照群には蒸留水を体重１グラム当たり、１０μｌ経口投与した。
抗ＴＮＦα抗体投与群ではｄａｙ６１のみで、抗ＴＮＦα抗体投与液を０．２ｍｌ腹腔内投与した。
また、ｄａｙ６２からｄａｙ６３にかけて絶食をかけ、ｄａｙ６３に再摂食、同時にＯＶＡ０．１４ｍｇ／ｍｌ含有ＤＳＳ２．１％溶液をｄａｙ６４までの２日間与え、大腸炎の再燃を誘発した。ｄａｙ６５に剖検を行い、大腸の長さを測定、評価項目とした。

（結果）
図１３に大腸長の比較を、表１３に大腸長のデータを示した。

実施例５で示されたように、急性期にＤＳＳ２．８％＋ＯＶＡを与え、慢性期にＤＳＳ２．１％＋ＯＶＡを与えると、大腸長の短縮が観察された。この短縮は、クロドロン酸の皮下若しくは経口投与、５−ＡＳＡの経口投与又は抗ＴＮＦα抗体の腹腔内注射により抑制された。クロドロン酸の経口投与は、皮下投与よりも、高い大腸長短縮抑制効果を示した。さらに、クロドロン酸の経口投与は、一般的なＩＢＤ治療薬である５−ＡＳＡ及び抗ＴＮＦα抗体よりも、優れた大腸炎改善効果を示した。
結論
ＤＳＳ誘発マウス大腸炎再燃モデルにおいて、クロドロン酸の経口投与は高い大腸炎抑制作用を示した。

実施例６：クロドロン酸はＶＮＵＴのＣｌ ⁻ 依存のアロステリックなモジュレーターである。
次に、クロドロン酸についての薬理作用、その作用機序について検討した。
（方法）
〈蛍光クエンチングとしてのΔψの測定〉
Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６，１６８８−１６９１（２０１３）に記載されるように、オキソノールＶ（Ｓｉｇｍａ）の蛍光クエンチングを測定することによってΔψ（内側がプラス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｎｓｉｄｅ））を、分析した。プロテオリポソームに組込まれたタンパク質１μｇ、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム及び１μＭオキソノールＶからなる反応混合物（４５０μＬ）を、２７℃で５０秒間インキュベートした。記載された阻害剤の存在下又は非存在下で、２μＭバリノマイシンの添加により反応を開始させ、２μＭカルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の添加により反応を終了させた。

〈ＡＴＰ結合アッセイ〉
ＶＮＵＴタンパク質の光親和性標識は、基本的には、ＦＥＢＳ Ｊ．２８０，１４３０−１４４２（２０１３）に記載されるように行った。２０μＭの濃度のビオチン−１１−ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）は、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＫＣｌ及び０．１％ＤＴＭを含有するバッファー５０μＬ中で、ＶＮＵＴタンパク質４μｇと、暗所氷上で混合した。氷上で３分間のインキュベーション後、ハンドヘルドＵＶランプを用いて、２５４ｎｍで１０分間溶液を照射した。照射後、１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール、０．３％ＥＤＴＡ及び６％Ｔｒｉｓを含むサンプルバッファーの添加により架橋結合反応を停止させ、ブロモフェノールブルー及びサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いて、抗ストレプトアビジン抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、イムノブロッティングを行った。阻害剤はバッファーにＶＮＵＴタンパク質を加える前に添加した。

（結果）
クロドロン酸によるＶＮＵＴ依存的なＡＴＰの取り込みの阻害メカニズムの特性をさらに明らかにした。これまで報告されているように、バリノマイシンの添加によって、Ｋ^＋の拡散を通じて、〜９０ｍＶのΔψ（内側がプラス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｎｓｉｄｅ））が形成された。高濃度のクロドロン酸の添加でさえ、Δψのインジケーターへの影響はなかった（図１４ａ）。
次に、ＶＮＵＴによるＡＴＰ取り込みの、Ｃｌ⁻依存性を分析した。結果は、２ｍＭ Ｃｌ⁻までは、ＡＴＰ輸送活性の上昇が観察されず、３〜７ｍＭ Ｃｌ⁻において、ＡＴＰの取り込みが極端に増加し、８ｍＭ Ｃｌ⁻を過ぎてプラトーに達したことを示した（図１４ｂ）。Δψが形成されていない条件下においては、塩素イオンはＡＴＰの取り込みに対し何ら影響を示さなかった。特筆すべきは、Ｃｌ⁻依存的なＶＮＵＴの活性化は、Ｃｌ⁻に対して〜３のヒル係数を有する、強力かつ類まれなＡＴＰ輸送の正の共同性を示すことであった（図１４ｃ）。並行した実験において、クロドロン酸は、Ｃｌ⁻のより高い濃度側への、Ｃｌ⁻活性化シフトをもたらし、競争的相互作用が示唆された（図１４ｂ及びｃ）。
ＶＮＵＴのＡＴＰ結合部位の光親和性標識により、ＵＶ照射した際に、ＶＮＵＴの分子量に対応する部位で強力なシグナルが検出された（図１４ｄ）。光親和性標識による基質特異性は、ＡＴＰ輸送アッセイによるものとほぼ同一である。ＡＴＰのＶＮＵＴへの結合は、高濃度でのクロドロン酸又はエチドロン酸の添加によっても阻害されなかった（図１４ｄ）。一方、Ｃｌ⁻依存的なＶＧＬＵＴ媒介性グルタミン酸輸送を阻害するとして知られる、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンスルホン酸（ＤＩＤＳ）は、ＡＴＰのＶＮＵＴへの結合を阻害した（図１４ｄ）。また、すでに報告されているように、高濃度のアセトアセテート及びグリオキシル酸によっても、ＡＴＰのＶＮＵＴへの結合は阻害されなかった（図１４ｄ）。
クロドロン酸の効果は全体として可逆的であり、調合液から当該化合物をウオッシュアウトすることにより活性が完全に回復した（図１４ｅ）。
これらの結果は、クロドロン酸が直接的に、競争的にかつ可逆的にＶＮＵＴの結合部位を阻害することを示した。

実施例７：杯細胞はＶＮＵＴを発現する。
ＶＮＵＴを発現する細胞を明らかにするため、抗ＶＮＵＴ抗体を用いてＶＮＵＴを発現する細胞を探索した。
免疫組織化学実験による解析の結果、粘液を排出する役割を担う杯細胞にＶＮＵＴが強く発現することが明らかとなった。杯細胞は近年免疫細胞としての機能も注目されており、単に粘液による物理的なバリアだけではなく、インフラマソームによって有害な外来物の除去する役割を担う細胞であることが解明されてきた（Ｗｌｏｄａｒｓｋａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１５６（５）：ｐ．１０４５−５９（２０１４））。この細胞の機能の破綻はＩＢＤの増悪に関わることが明らかとなっており、ＶＮＵＴがこの細胞でどのような機能を持つか解析することにより、新たなＩＢＤ治療ターゲットを見出すことが期待される。

ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、体重の減少、大腸の長さの短縮、クリプト構造の脱落、筋層の肥厚、下痢・血便の発生等の炎症性腸疾患に起因する症状を抑制又は軽減するなどの優れた炎症性腸疾患抑制効果を奏するので、炎症性腸疾患、特に再発性の炎症性腸疾患に対する有効な予防又は治療手段が提供できる。

本出願は、日本で出願された特願２０１６−００９２９４（出願日２０１６年１月２０日）及び特願２０１６−１１９３３６（出願日２０１６年６月１５日）を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (4)

1. 被検物質が、小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）を阻害し得るか否かを評価する工程を含む、炎症性腸疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法であって、該方法は、以下の工程を含む：
   （１）被検物質の存在下において、ＶＮＵＴの活性を測定する工程；
   （２）当該被検物質の非存在下において、ＶＮＵＴの活性を測定する工程；
   （３）当該被検物質の存在下における当該ＶＮＵＴの活性を、当該被検物質の非存在下における当該ＶＮＵＴの活性と比較する工程；及び
   （４）比較の結果、当該被検物質の非存在下におけるＶＮＵＴの活性と比較して、当該被検物質の存在下におけるＶＮＵＴの活性が低い被検物質を、炎症性腸疾患の予防剤又は治療剤の候補物質として選択する工程。
2. ＶＮＵＴの活性が、ＶＮＵＴを介したＡＴＰのとりこみを測定することにより測定される、請求項１記載の方法。
3. 該予防剤又は治療剤が炎症性腸疾患の寛解期における投与用である、請求項１又は２記載の方法。
4. 炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。