JP2021500362A

JP2021500362A - 進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ｐｆ−ｉｌｄ）の処置のための活性剤の新規組み合わせ

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Publication number: JP2021500362A
Application number: JP2020522715A
Authority: JP
Inventors: ヘルマン，フランツィスカ・エレナ; ニコラウス，ペーター; ヴォリン，シュテファン・ルートヴィッヒ・ミヒャエル
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2021-01-07
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: IL273169B2; US20220378793A1; BR112020003973A2; PH12020550452A1; US11813266B2; AU2024203045A1; CN111278442A; KR20200075864A; IL273169B1; CN111278442B; IL309150A; AU2018357775A1; JP7196169B2; AU2018357775B2; IL273169A; TWI700088B; CA3079299A1; WO2019081235A1; CL2020000627A1; EA202090977A1

Abstract

本出願は、第一の組み合わせパートナーとして治療有効量のニンテダニブまたはその薬学的に許容し得る塩および第二の組み合わせパートナーとして治療有効量の式（Ｉ）［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして、Ｒは、Ｃｌであり、かつ、Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、Ｓ＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩を含む、ＰＦ−ＩＬＤ処置のための新規組み合わせ処置／組み合わせ医薬を指す。これにより、第二の組み合わせパートナーは、好ましくは、治療有効量の式（ＩＩＩ）で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩である。

Description

１．発明の背景
間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、間質（肺の気嚢間の組織および空間）の炎症および線維化によって特徴付けられる、２００を超える肺疾患および呼吸器病態の大きく多様な群を含む（例えば、du Bois, Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9, 129-140を参照のこと）。ＩＬＤは、肺胞上皮、肺毛細血管内皮、基底膜、血管周囲組織およびリンパ管周囲組織に関わる。ＩＬＤは、肺への傷害が異常な治癒反応を誘発したときに生じ得る。通常、身体は、適切な組織を生成して損傷を修復する。しかし、ＩＬＤでは、修復過程が上手く進まず、気嚢（小窩）周囲の組織が瘢痕化および肥厚する。これは、血流への酸素流入をより困難にしている。

長期のＩＬＤは、肺線維化をもたらし得るが、必ずしもそうなるとは限らない。

それゆえ、ＩＬＤはまた、いわゆる進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）も含む。

進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）では、線維化を伴うＩＬＤにおける肺傷害に対する応答は、進行性かつ自己継続的で初期の臨床的関連性または誘発とは独立した、線維化の発生を含む。現段階では、この疾患の進行を遅らせるために標的抗線維化治療が必要であると想定されている。

それらの生物学的挙動と臨床的挙動、すなわち自己継続的な線維化と進行性の肺機能の減退および早期死亡の両方の類似性に基づき、ＰＦ−ＩＬＤ患者を初期ＩＬＤ診断にかかわらず一緒に分類することが妥当であると考えられる。

異なる線維化を伴うＩＬＤ、例えば、特発性非特異的間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）または慢性過敏性肺臓炎（ＣＨＰ）の患者数は、ＩＰＦ患者数と同等かまたはより少ない；各群内の進行性表現型を有する患者数は、依然として有意ではあるが、さらにより少ない。それゆえ、ＰＦ−ＩＬＤ患者を一緒に分類することが、進行性線維化を伴う間質性肺疾患の患者全てにとって有効な治療を提供するための唯一最適な方法と考えられる。

患者がＰＦ−ＩＬＤに罹患している場合は、この患者が間質性肺疾患（ＩＬＤ）であると医師によって診断された場合と、加えて、ＩＬＤを処置するために臨床診療で使用される未承認薬による処置にもかかわらず医師による初診後２４ヶ月以内に医師による評価で以下の進行性線維化を伴う間質性肺疾患の基準の少なくとも１つを満たす場合である（ＩＬＤを処置するために臨床診療で使用される未承認薬は、コルチコステロイド類、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、リツキシマブ、シクロホスファミド、シクロスポリン、タクロリムスを含むが、それらに限定されない）：
・相対的減退に基づく予測努力肺活量（ＦＶＣ）％の臨床的に有意な減退が≧１０％
・呼吸器症状の悪化と組み合わせて、相対的減退に基づく予測ＦＶＣ％の限界減退が≧５〜＜１０％
・胸部画像検査上での線維性変化の程度の増加と組み合わせて、相対的減退に基づく予測ＦＶＣ％の限界減退が≧５〜＜１０％
・呼吸器症状の悪化に加えて胸部画像検査上での線維性変化の程度の増加。これにより、併存疾患、例えば、感染症、心不全に起因する変化は、除外されなければならない。
・医師による初診後１２ヶ月以内の実施で、蜂巣肺の有無を問わず牽引性気管支拡張を伴う網状影として定義される高分解能コンピュータ断層撮影（ＨＲＣＴ）上での線維化を伴う肺疾患の程度が＞１０％
・結合組織病（ＣＴＤ）を基礎疾患に持つ患者にとって：医師による初診前の６週間以内に、新規治療の開始なしまたはＣＴＤに対する治療の停止による定義で安定なＣＴＤ
・医師による初診時のヘモグロビン（Ｈｂ）に対して補正された一酸化炭素拡散能（ＤＬＣＯ）が、医師による再診時、正常予測値の≧３０％〜＜８０％
・ＦＶＣが、医師による再診時、予測値の≧４５％。

ＰＦ−ＩＬＤの例は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性非特異的間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、過敏性肺臓炎（ＨＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎、関節リウマチＩＬＤ（ＲＡ−ＩＬＤ）、シェーグレン症候群ＩＬＤ、全身性エリテマトーデスＩＬＤ（ＳＬＥ−ＩＬＤ）、多発性筋炎および皮膚筋炎ＩＬＤ（ＰＭ／ＤＭ−ＩＬＤ）、混合性結合組織病ＩＬＤ（ＭＣＴＤ−ＩＬＤ）、全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳｃ−ＩＬＤ）、他の結合組織病ＩＬＤ（ＣＴＤ−ＩＬＤ）、サルコイドーシス、石綿肺症、珪肺症である。

最も有名なＰＦ−ＩＬＤは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）および全身性強皮症間質性肺疾患（ＳＳｃ−ＩＬＤ）である。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、明白な原因を特定できない（「特発性」の定義である）ならびに放射線学的（蜂巣肺を伴う基底および胸膜に基づく線維症）と病理学的（時間的かつ空間的に不均一な線維症、病理組織学的蜂巣肺および線維芽細胞巣）の両方に典型的な知見に関連する、ＰＦ−ＩＬＤである。

特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺容量の減少および進行性の肺機能不全へと導く、肺の間質における進行性線維化によって特徴付けられる慢性の線維性の不可逆かつ最終的に死に至る肺疾患である。ＩＰＦはまた、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）として知られている特定の病理組織学的パターンによっても特徴付けられる（Raghu et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183: 788-824.）。ＩＰＦまたは任意の他のＰＦ−ＩＬＤのいずれかによって引き起こされる肺線維症患者の肺機能は、努力肺活量（ＦＶＣ）として判定される。

ＩＰＦという用語は、肺組織の瘢痕化を意味し、呼吸困難（息切れ）を悪化させる原因である。ＩＰＦは、通常、診断後の生存期間中央値が２〜３年の予後不良を伴う。ＩＰＦは、肺間質における異常で過剰なコラーゲン沈着（線維化）を含む／伴う、最小限の炎症を伴う異常な創傷治癒過程の結果であると考えられている（Harari S, Caminati A (2010). “IPF: new insight on pathogenesis and treatment”. Allergy. 65 (5): 537-553）。

線維芽細胞は、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する線維化過程の病理発生において中心的な役割を果たしており、いくつかの要因がそれらの増殖およびそれらの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）合成に影響を及ぼす。ＩＬＤでは、これらの間葉系細胞は、増殖、遊走、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）合成および線維形成性サイトカインに対する応答に関して、増加した活性を有する。活性化された線維芽細胞（「筋線維芽細胞」と呼ばれる）からのＥＣＭの増加した沈着は、肺組織の硬縮および肺胞酸素交換域の破壊を助長し、これが、進行性の呼吸困難をもたらし、最終的に死亡に至る。

ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦの根底にある病態生理学および臨床経過の両方の類似性に基づき、ＩＰＦにおける進行性肺線維化の基本的過程を標的とした治療活性剤が、ＰＦ−ＩＬＤにおいて同等な治療効果を発揮すると期待される。

２０１４年に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、米国でＩＰＦ処置用の最初の薬物を承認した：ベーリンガーインゲルハイム社（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.）によるニンテダニブ（ＯＦＥＶ）およびインターミューン社（InterMune Inc.）によるピルフェニドン（ＥＳＢＲＩＥＴ）。ピルフェニドンは、当時すでに、欧州、日本および他のいくつかの国でＩＰＦ処置用に承認されており、ニンテダニブは、２０１５年１月に欧州でＩＰＦ用の処置法として承認された。

したがって、今日のＩＰＦの標準処置は、ピルフェニドン処置（US 3,974,281 B）またはニンテダニブ処置（US 6,762,180 B；P05-1275）のいずれかである（https://consultqd.clevelandclinic.org/2015/09/pirfenidone-and-nintedanib-novel-agents-in-the-treatment-of-idiopathic-pulmonary-fibrosis）。

しかしながら、軽度または中程度のＦＶＣの障害（予測値の≧５０％）を有するＩＰＦ患者では、現在承認されている医薬ピルフェニドンおよびニンテダニブはいずれも、ＦＶＣの減退を低減する（疾患進行の遅延と一致する）ことしかできず、いずれもＩＰＦの症状を停止することもさらには回復または治癒することもできない（Tzouvelekis et al Ther. Clin. Risk Management 2015, 11, 359-370）。

それにもかかわらず、ピルフェニドンまたはニンテダニブのいずれかによる処置選択は共に、ＩＰＦの疾患進行を遅らせる際に有意な有益効果を示す。

ニンテダニブとピルフェニドンの両方に伴う最も有名な副作用は、消化器系事象、特定すると、下痢、吐き気、嘔吐、腹痛、食欲減退および体重減少である。消化器系副作用が生じた場合、これらは、通常、処置介入、用量低減または消化器系副作用の対症療法のいずれかによって管理される（Mazzei et al, Ther. Adv. Respir. Dis. 2015, Vol. 9 [3], pp. 121-129を参照のこと）。

一方でピルフェニドンの他方でニンテダニブのこれらの「蓄積消化器系副作用」が原因で、ピルフェニドンとニンテダニブの組み合わせによるＩＰＦに対する組み合わせ処置は頻繁に使用されない。ピルフェニドンとニンテダニブによる組み合わせ処置は、増加した消化器系副作用、特に、下痢、吐き気、嘔吐および上部腹痛を導くことが調査によって示されている（Vancheri et al., Nintedanib with Add-on Pirfenidone in Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Results of the INJOURNEY Trial. Am J Respir Crit Care Med. 2017, Epub ahead of print）。

したがって、ＩＰＦに対する処置用にこれまで承認されている両活性剤ピルフェニドンおよびニンテダニブが、単独で投与されたときにはＩＰＦを停止も治癒もできないが、代わりにＩＰＦの疾患進行を一定の割合まで遅らせることのみできること（Tzouvelekis et al Ther. Clin. Risk Management 2015, 11, 359-370）に起因して、かつ、加えてニンテダニブおよびピルフェニドンが共に、両化合物が組み合わせられたときに累積する有意な消化器系副作用を示すことに起因して、第一の組み合わせパートナーとしてＩＰＦにおいて承認されている医薬ニンテダニブまたはピルフェニドンのいずれか１つ（ＩＰＦ処置において有効性が証明されている）およびＩＰＦ／ＰＦ−ＩＬＤ処置において許容し得る耐容性で活性である第二の他の好適な組み合わせパートナー（ピルフェニドンまたはニンテダニブとは異なる）を含む、ＩＰＦ処置／ＰＦ−ＩＬＤ処置のための改善された医薬に対する、特に、改善された組み合わせ処置／組み合わせ医薬に対する大きな医学的ニーズが依然としてある。これにより、特に消化器系副作用に関して、良好／改善された治療有効性および許容し得る耐容性を有する新規組み合わせ医薬を提供することが非常に有益であろう。

したがって、本発明の問題は、第一の組み合わせパートナーとしてＩＰＦにおいて現在承認されている医薬ニンテダニブまたはピルフェニドンのいずれか１つおよび第二の組み合わせパートナー（ニンテダニブまたはピルフェニドンとは異なる）を含む、ＰＦ−ＩＬＤ処置／ＩＰＦ処置のための新規組み合わせ処置／組み合わせ医薬であって、それによって、第一の組み合わせパートナー単独によるＰＦ−ＩＬＤ／ＩＰＦ処置と比べて改善される、組み合わせ処置／組み合わせ医薬を提供することであった。

この問題は、第一の組み合わせパートナーとして治療有効量のニンテダニブまたはその薬学的に許容し得る塩および第二の組み合わせパートナーとして治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩を含む、ＰＦ−ＩＬＤ処置／ＩＰＦ処置のための組み合わせ処置／組み合わせ医薬を提供することによって解決された。

これにより、第二の組み合わせパートナーは、好ましくは、治療有効量の式ＩＩ：

または式ＩＩＩ：

で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩であり、
より好ましくは、第二の組み合わせパートナーは、式ＩＩＩ：

で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩である。

第一の組み合わせパートナーとしてニンテダニブおよび第二の組み合わせパートナーとして式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤、好ましくは式ＩＩまたはＩＩＩのいずれかで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤、特定するといずれかの式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を含む、ＰＦ−ＩＬＤ処置／ＩＰＦ処置のためのこの上述した新規組み合わせ処置／組み合わせ医薬は、ニンテダニブ単独による処置と比べてまたは上記ＰＤＥ４Ｂ阻害剤単独による処置と比べて改善された治療有効性をＰＦ−ＩＬＤ／ＩＰＦ処置において示す。

チャプター６（実験データ）に記載の通りの実験Ａ）およびＢ）は、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤およびニンテダニブを含む組み合わせが、以下を示すことを実験により示した：
ａ）「線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行」（「ＰＦ−ＩＬＤに共通する第二のレベルの線維化過程の病理発生」に対応する）に対する明らかな阻害効果（一方で、ニンテダニブ（ＩＰＦ処置用にすでに承認されている医薬）は、「線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行」に対して対応する阻害効果を示さない）（したがって、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、ニンテダニブを「補完する治療効果」を示し、このことは、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤とニンテダニブの組み合わせがニンテダニブ単独による処置に勝る強い利点を有するはずであることを示す）および
ｂ）「線維芽細胞増殖」（「ＰＦ−ＩＬＤに共通する第三のレベルの線維化過程の病理発生」に対応する）に対する明らかな「過剰付加的な相乗的阻害効果」（試験した他のＰＤＥ４阻害剤／ニンテダニブの組み合わせ、ロフルミラスト／ニンテダニブおよびアプレミラスト／ニンテダニブは、驚くべきことにその効果を示さなかった）。

第一の組み合わせパートナーとしてニンテダニブおよび第二の新規組み合わせパートナーとして式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤、好ましくは式ＩＩまたはＩＩＩのいずれかで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤、特定すると式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を含む、本発明のＰＦ−ＩＬＤ処置のための、特定するとＩＰＦ処置のためのこの上述した組み合わせ処置／組み合わせ医薬はさらに、ＰＦ−ＩＬＤ処置において許容し得る耐容性を示す。

「許容し得る耐容性」は、この文脈において、ニンテダニブと式Ｉで示される、好ましくは式ＩＩおよびＩＩＩで示される、特定すると式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤との組み合わせによる処置の耐容性が、ニンテダニブとピルフェニドンの組み合わせの耐容性よりも良好であり、好ましくはニンテダニブ単独による処置と比べてわずかに劣るだけ、より好ましくはほとんど劣ることがなく、それゆえ患者による良好な耐容性を示すはずであることを意味する。

ニンテダニブ、すなわち、式Ａ：

で示される化合物（遊離塩基）は、US 6762180 B1（WO 01/27081）に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

US 7119093B（WO 2004/013099）は、式Ａで示されるこの化合物のモノエタンスルホン酸塩を開示しており；さらなる塩形態は、US 2009/0318471 A（WO 2007/141283）に提示されている。

US 7119093BおよびUS 2009/0318471 Aはいずれも、参照により本明細書に組み入れられる。

ニンテダニブは、極めて強力で、経口で生物学的に利用可能な、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）および線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）の阻害剤である。ニンテダニブは、これらの受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合ポケットに競合的に結合し、細胞内シグナル伝達を遮断する。加えて、ニンテダニブは、Ｆｍｓ様チロシン−プロテインキナーゼ３（Ｆｌｔ３）、リンパ球特異的チロシン−プロテインキナーゼ（Ｌｃｋ）、チロシン−プロテインキナーゼｌｙｎ（Ｌｙｎ）および癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼｓｒｃ（Ｓｒｃ）を阻害する（Hilberg et al., Cancer Res. 2008, 68, 4774-4782）。最近、ニンテダニブがコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）を阻害することも発見された（Tandon et al., Am J Respir Crit Care Med 2017;195:A2397）。

ニンテダニブは、血管新生を助長する細胞増殖（Hilberg et al., Cancer Res. 2008, 68, 4774-4782）だけでなく、肺線維芽細胞の増殖、遊走（Hostettler et al., Respir Res. 2014, 15, 157）ならびに肺線維症（例えばＩＰＦ）、ＳＳｃ−ＩＬＤおよびＲＡ−ＩＬＤを助長する筋線維芽細胞への形質転換（Wollin et al., Eur. Respir J 2015, 45, 1434-1445.）も阻害または減弱できることが示された。その上、ニンテダニブは、肺線維化モデルにおいて抗線維化活性および抗炎症活性を明らかにした（Wollin et al., Eur. Respir J 2015, 45, 1434-1445; Wollin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2014, 394, 209-220）。加えて、ニンテダニブは、ＳＳｃ細胞モデルにおける線維芽細胞の遊走、増殖および筋線維芽細胞への形質転換を阻害する能力、ＳＳｃおよびＳＳｃ−ＩＬＤ動物モデルにおける皮膚および肺線維化を減弱する能力（Huang et al., Ann. Rheum. Dis. 2016, 74, 883-890, Huang et al., Ann Rheum Dis. 2017, EPub ahead of print）、ＲＡ−ＩＬＤ動物モデルにおける肺線維化を低減する能力（Redente et al., Am J Respir Crit Care Med 2016, 193, A4170）ならびにＨＰの局面に似ているアレルギー性肺機能障害の慢性マウスモデルにおける肺線維化を減弱する能力（Lee et al. Exp Lung Res. 2017 EPub ahead of print）を実証した。

ニンテダニブを含む薬学的剤形は、US 9907756B（WO 2009/147212）およびUS 2011/0190318（WO 2009/147220）に開示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。また、吸入用の乾燥粉末製剤も記載されている（Vartiainen et al., poster presentation at the International Colloquium of Lung and Airway Fibrosis in Dublin, September 2016）。

ニンテダニブの多種多様な疾患の処置のための使用、中でも線維性疾患の処置のための使用が、WO 2006/067165に記載されている。

特発性肺線維症のための単回処置としてのニンテダニブは、通常、１５０mgで１日２回投薬される（軽度肝障害患者に対しては１００mgを１日２回）。

さらに、WO 2006/067165は、ニンテダニブを多種多様な異なる組み合わせパートナーと組み合わせてよいことを開示している。多くの他の組み合わせパートナーの中で、WO 2006/067165はまた、ニンテダニブを、例えばロフルミラストなどのＰＤＥ４阻害剤と組み合わせることを提案している。

しかしながら、ニンテダニブ（この間にＩＰＦの処置用に承認されている）と対照的に、ＰＤＥ４阻害剤ロフルミラスト（US 5,712,298 Bに最初に開示されている）は、これまで、増殖性線維性疾患（例えば、特にＰＦ−ＩＬＤまたはＩＰＦ）の処置用に開発も承認もされていない。代わりに、ロフルミラストは、この間に、線維化症状を全く伴わない呼吸器疾患である慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置用にのみ承認された。また、その後数年のうちに市場に登場した他のＰＤＥ４阻害剤、例えば、アプレミラスト（US 6020358Bに最初に開示されている）は、これまで、増殖性線維性疾患（例えば、特にＰＦ−ＩＬＤまたはＩＰＦ）の処置用に開発されることも承認されることも考慮されたことがなく、代わりにアプレミラストは、乾癬（皮膚疾患）の処置用にのみ承認された。

ロフルミラストおよびアプレミラストに加えて、改善された特性を有する他のＰＤＥ４／ＰＤＥ４Ｂ阻害剤が描かれた多くのさらなる特許出願が公開された：
・WO 2006/056607、WO 2006/058869、WO 2006/058868およびWO 2006/058867におけるＰＤＥ４阻害剤としてのプテリジン
・WO 2006/111549、WO 2007/118793およびWO 2009/050242におけるＰＤＥ４阻害剤としてのピペラジノ−ジヒドロチエノピリミジン
・WO 2009/050248およびWO 2013/026797におけるＰＤＥ４Ｂ阻害剤としてのピペリジノ−ジヒドロチエノピリミジン。

式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤、
特に、式ＩＩ：

および式ＩＩＩ：

で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、US 8609670B（WO 2013/026797）に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

２．一般用語および定義
本明細書で具体的に定義されていない用語には、本開示および文脈に照らして当業者によってそれらに与えられる意味が与えられるべきである。しかしながら、本明細書において使用される場合、反対のことが明記されない限り、以下の用語は、示される意味を有し、以下の慣習が順守される。

「薬学的に許容し得る」という語句は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合う、それら化合物、材料、組成物および／または剤形を指すために用いられる。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容し得る塩」は、親化合物がその酸塩または塩基塩を作製することによって修飾された本開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容し得る塩の例は、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などを含むが、それらに限定されない。

「処置」および「処置すること」という用語は、本明細書において使用される場合、治療的、すなわち治癒的および／または待期的処置と、予防的、すなわち防止的処置の両方を包含する。

治療的処置は、すでに急性型または慢性型の前記状態の１つまたは複数が明らかに発生している患者の処置を指す。治療的処置は、特定の徴候の症状を軽減するための対症療法であっても、徴候の状態を回復させるもしくは部分的に回復させるためのまたは疾患の進行を停止もしくは遅らせるための原因療法であってもよい。

予防的処置（「予防」）は、前記状態の１つまたは複数を発生するリスクのある患者を、前記リスクを低減させるために疾患の臨床的発症より前に処置することを指す。

「処置」および「処置すること」という用語は、症状もしくは合併症の発症を予防もしくは遅延させるため、および疾患、状態もしくは障害の発生を予防もしくは遅延させるため、ならびに／または、疾患、状態もしくは障害を排除もしくは制御するためだけでなく、疾患、状態もしくは障害に関連する症状もしくは合併症を軽減するための、１つまたは複数の活性化合物の投与を含む。

「治療有効量」という用語は、（ｉ）特定の疾患もしくは状態を処置もしくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を減弱する、緩和させるもしくは排除する、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を予防もしくは遅延させる、本発明の化合物の量を意味する。

３．発明の詳細な説明
本出願は、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法であって、その必要のある患者に、治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩
ならびに治療有効量のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤を投与することを含む方法を指す。

上述した方法のある好ましい実施態様において、前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、より好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式Ｉで示される化合物の推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

上述した方法のある好ましい実施態様において、進行性線維化を伴う間質性肺疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳｃ−ＩＬＤ）である。

上述した方法の別の好ましい実施態様において、上述した式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与される。

上述した方法のあるさらに好ましい実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである。

上述した方法の別のさらに好ましい実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブであり、１nMol/L〜３００nMol/Lの間、より好ましくは１０nMol/L〜１００nMol/Lの間のニンテダニブモノエタンスルホナートの推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

上述した方法のあるより好ましい実施態様において、前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。

上述した方法のある特に好ましい実施態様において、前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である。

上述した方法の別の特に好ましい実施態様において、前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、式ＩＩＩで示される化合物であり、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、より好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式ＩＩＩで示される化合物の推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

その上、本出願は、式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩であって、
その必要のある患者に、治療有効量の前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を治療有効量のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩を指す。

ある好ましい実施態様において、上で特定された進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳＣ−ＩＬＤ）のいずれかであり、より好ましくはＩＰＦである。

別の好ましい実施態様において、上述した式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与される。

あるさらに好ましい実施態様において、上述したチロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである。

別のさらに好ましい実施態様において、上述したチロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブであり、１nMol/L〜３００nMol/Lの間、より好ましくは１０nMol/L〜１００nMol/Lの間のニンテダニブモノエタンスルホナートの推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

あるより好ましい実施態様において、上述した式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、式ＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。

ある特に好ましい実施態様において、上述した式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、式ＩＩＩ：

別の特に好ましい実施態様において、上述した式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、式ＩＩＩで示される化合物であり、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、より好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式ＩＩＩで示される化合物の推定ヒト遊離血漿画分を導く用量で投与される。

さらに、本出願は、ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤であって、その必要のある患者に、治療有効量のチロシンキナーゼ阻害剤を治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩と組み合わせて投与することを含む、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための、チロシンキナーゼ阻害剤を指す。

ある好ましい実施態様において、上記の１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳＣ−ＩＬＤ）のいずれかであり、より好ましくはＩＰＦであろう。

別の好ましい実施態様において、上述したチロシンキナーゼ阻害剤は、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与される。

上述した方法の別のさらに好ましい実施態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブであり、１nMol/L〜３００nMol/Lの間、より好ましくは１０nMol/L〜１００nMol/Lの間のニンテダニブモノエタンスルホナートの推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

本出願は、式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩の
治療有効量の前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩が、その必要のある患者に、治療有効量のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与されるべきである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための、使用を指す。

ある好ましい実施態様において、本出願は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳＣ−ＩＬＤ）のいずれかであり、より好ましくはＩＰＦである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の上述した使用を指す。

あるさらに好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与されるべきである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の上述した使用を指す。

別の好ましい実施態様において、本出願は、チロシンキナーゼ阻害剤がモノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の上述した使用を指す。

上述した使用の別のさらに好ましい実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブであり、１nMol/L〜３００nMol/Lの間、より好ましくは１０nMol/L〜１００nMol/Lの間のニンテダニブモノエタンスルホナートの推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

あるより好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の上述した使用を指す。

ある特に好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の上述した使用を指す。

別の特に好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩで示される化合物であり、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、より好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式ＩＩＩで示される化合物の推定ヒト遊離血漿画分を導く用量で投与される、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための上述した使用を指す。

本出願は、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の使用であって、治療有効量の前記チロシンキナーゼ阻害剤が、その必要のある患者に、治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩と組み合わせて投与されるべきである、使用を指す。

ある好ましい実施態様において、本出願は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳＣ−ＩＬＤ）のいずれかであり、より好ましくはＩＰＦである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の上述した使用を指す。

あるさらに好ましい実施態様において、本出願は、チロシンキナーゼ阻害剤が、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与されるべきである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の上述した使用を指す。

別の好ましい実施態様において、本出願は、チロシンキナーゼ阻害剤がモノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の上述した使用を指す。

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の上述した使用を指す。

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の使用を指す。

別の特に好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩで示される化合物であり、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、より好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式ＩＩＩで示される化合物の推定ヒト遊離血漿画分を導く用量で投与される、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのチロシンキナーゼ阻害剤の上述した使用を指す。

別の実施態様において、本出願は、以下を含む医薬組成物を指す：
・式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩
・ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤、そして
・場合により、１つまたは複数の薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤。

ある好ましい実施態様において、本出願は、チロシンキナーゼ阻害剤がモノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、上述した医薬組成物を指す。

上述した医薬組成物の別のさらに好ましい実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブであり、１nMol/L〜３００nMol/Lの間、より好ましくは１０nMol/L〜１００nMol/Lの間のニンテダニブモノエタンスルホナートの推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

ある好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４−Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、上述した医薬組成物を指す。

ある特に好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４−Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、上述した医薬組成物を指す。

別の特に好ましい実施態様において、本出願は、式Ｉで示されるＰＤＥ４−Ｂ阻害剤が、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式ＩＩＩで示される化合物の推定ヒト遊離血漿画分を導く用量の式ＩＩＩで示される化合物である、上述した医薬組成物を指す。

あるさらなる実施態様において、本出願は、以下を含むキットを指す：
・式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩を含み、
そして場合により、１つまたは複数の薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を含む第一の医薬組成物または剤形、ならびに
・ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤を含み、そして
場合により、１つまたは複数の薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を含む第二の医薬組成物または剤形。

ある好ましい実施態様において、本出願は、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するためのものである上で特定されたキットを指す。

あるより好ましい実施態様において、本出願は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳｃ−ＩＬＤ）のいずれかを処置する方法において使用するためのものである上で特定されたキットを指す。

別の好ましい実施態様において、本出願は、第一の医薬組成物または剤形が、第二の医薬組成物または剤形と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与されるべきである１つまたは複数のＰＦ−ＩＬＤを処置する方法において使用するためのものである上で特定されたキットを指す。

あるさらに好ましい実施態様において、本出願は、第二の医薬組成物または剤形のチロシンキナーゼ阻害剤がモノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、上で特定されたキットを指す。

上述したキットの別のさらに好ましい実施態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブであり、１nMol/L〜３００nMol/Lの間、より好ましくは１０nMol/L〜１００nMol/Lの間のニンテダニブモノエタンスルホナートの推定ヒト遊離画分を導く用量で投与される。

あるより好ましい実施態様において、本出願は、第一の医薬組成物または剤形が、式ＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を含む、上で特定されたキットを指す。

ある特に好ましい実施態様において、本出願は、第一の医薬組成物または剤形が、式ＩＩＩ：

で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤化合物またはその薬学的に許容し得る塩を含む、上で特定されたキットを指す。

別の特に好ましい実施態様において、本出願は、第一の医薬組成物または剤形中の式Ｉで示されるＰＤＥ４−Ｂ阻害剤が、１nMol/L〜２０００nMol/Lの間、好ましくは１nMol/L〜１０００nMol/Lの間の式ＩＩＩで示される化合物の推定ヒト遊離血漿画分を導く用量の式ＩＩＩで示される化合物である、上述したキットを指す。

ある特に好ましい実施態様において、本出願は、以下をさらに含む、上で特定されたキットのいずれかを指す：
・１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）の処置における第一および第二の医薬組成物または剤形の同時、併行、順次、連続的、交互または別々の使用のための印刷された説明書を含む、添付文書。

別の特に好ましい実施態様において、本出願は、以下をさらに含む、上で特定されたキットのいずれかを指す：
・特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置における第一および第二の医薬組成物または剤形の同時、併行、順次、連続的、交互または別々の使用のための印刷された説明書を含む、添付文書。

別の特に好ましい実施態様において、本出願は、以下をさらに含む、上で特定されたキットのいずれかを指す：
・全身性強皮症ＩＬＤ（ＳＳｃ−ＩＬＤ）の処置における第一および第二の医薬組成物または剤形の同時、併行、順次、連続的、交互または別々の使用のための印刷された説明書を含む、添付文書。

実験Ａ１）：式ＩＩＩで示される化合物（黒丸、黒色線；ＩＣ_５０＝２１０nMol/L）または式ＩＩＩで示される化合物と１００nMol/Lのニンテダニブとの組み合わせ（白丸、灰色線；ＩＣ_５０＝１１０nMol/L）による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現の濃度依存性阻害。□は、阻害効果を示さなかった１００nMニンテダニブ単独の存在下での線維芽細胞のα−ＳＭＡタンパク質発現の測定された阻害を表す。データは、ｎ＝５ドナーの±ＳＥＭで提示する。データを、未処置（刺激しなかった）対照細胞（＝１００％阻害）およびＴＧＦ−β処置細胞（＝０％阻害）に対して正規化した。実験Ａ２）：アプレミラスト（黒丸、黒色線；ＩＣ_５０＝３μMol/L）またはアプレミラストと１００nMol/Lのニンテダニブとの組み合わせ（白丸、灰色線；ＩＣ_５０＝２μMol/L）による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現の濃度依存性阻害。□は、阻害効果を示さなかった１００nMニンテダニブ単独の存在下での線維芽細胞のα−ＳＭＡタンパク質発現の測定された阻害を表す。データは、ｎ＝５ドナーの±ＳＥＭで提示する。データを、未処置（刺激しなかった）対照細胞（＝１００％阻害）およびＴＧＦ−β処置細胞（＝０％阻害）に対して正規化する。実験Ａ３）：ロフルミラストＮ−オキシド（黒丸、黒色線；ＩＣ_５０＝１４nMol/L）またはロフルミラストＮ−オキシドと１００nMol/Lのニンテダニブとの組み合わせ（白丸、灰色線；ＩＣ_５０＝８．５nMol/L）による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現の濃度依存性阻害。□は、阻害効果を示さなかった１００nMニンテダニブ単独の存在下での線維芽細胞のα−ＳＭＡタンパク質発現の測定された阻害を表す。データは、ｎ＝５ドナーの±ＳＥＭで提示する。データを、未処置（刺激しなかった）対照細胞（＝１００％阻害）およびＴＧＦ−β処置細胞（＝０％阻害）に対して正規化する。実験Ｂ１）：式ＩＩＩで示される化合物（黒丸、黒色実線；ＩＣ_５０＝２５５nMol/L）または式ＩＩＩで示される化合物と１００nmol/Lのニンテダニブとの組み合わせ（白丸、灰色実線；ＩＣ_５０＝２３nMol/L）による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＦＧＦ＋ＩＬ−１βで刺激された増殖の濃度依存性阻害。両薬物の組み合わせの計算された相加的曲線が白三角および破線によって表される。□は、１００nMニンテダニブ単独による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＦＧＦ＋ＩＬ−１βで刺激された増殖を表す。データは、ｎ＝５ドナーの±ＳＥＭで提示する。データを、未処置（刺激しなかった）対照細胞（＝１００％阻害）およびＦＧＦ＋ＩＬ−１β処置細胞（＝０％阻害）に対して正規化する。実験Ｂ２）：アプレミラスト（黒丸、黒色実線；ＩＣ_５０＝１．８μMol/L）またはアプレミラストと１００nMol/Lのニンテダニブとの組み合わせ（白丸、灰色実線；ＩＣ_５０＝１．６μMol/L）による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＦＧＦ＋ＩＬ−１βで刺激された増殖の濃度依存性阻害。両薬物の組み合わせの計算された相加的曲線が白三角および破線によって表される。□は、１００nMニンテダニブ単独による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＦＧＦ＋ＩＬ−１βで刺激された増殖を表す。データは、ｎ＝５ドナーの±ＳＥＭで提示する。データを、未処置（刺激しなかった）対照細胞（＝１００％阻害）およびＦＧＦ＋ＩＬ−１β処置細胞（＝０％阻害）に対して正規化する。実験Ｂ３）：ロフルミラストＮ−オキシド（黒丸、黒色実線；ＩＣ_５０＝４４０pMol/L）またはロフルミラストＮ−オキシドと１００nMol/Lのニンテダニブとの組み合わせ（白丸、灰色実線；ＩＣ_５０＝５３４pMol/L）による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＦＧＦ＋ＩＬ−１βで刺激された増殖の濃度依存性阻害。両薬物の組み合わせの計算された相加的曲線が白三角および破線によって表される。□は、１００nMニンテダニブ単独による、ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＦＧＦ＋ＩＬ−１βで刺激された増殖を表す。データは、ｎ＝５ドナーの±ＳＥＭで提示する。データを、未処置（刺激しなかった）対照細胞（＝１００％阻害）およびＦＧＦ＋ＩＬ−１β処置細胞（＝０％阻害）に対して正規化する。

５．実験データ
６．１ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する線維化過程の病理発生
ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する線維化過程の病理発生は、現在のところ、完全に理解されていない。

ＩＰＦの主な特徴は、上皮細胞および間葉系細胞における変化ならびにこれらの細胞間の相互作用であるが、一方で、炎症過程がほんの小さな役割を果たしているとこれまで考えられている［Lehtonen et al, Respiratory Research (2016) 17: 14］。ＩＰＦの病理発生の機序を説明する１つの広く受け入れられている仮説は、肺胞上皮の傷害が、成長因子および転写因子ならびにサイトカインの度を超えた放出とその後の線維芽細胞の活性化および分泌筋線維芽細胞表現型への形質転換を伴う、過剰な創傷治癒反応をもたらし、その結果、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が過剰に産生されると仮定している［King TE, Jr, Pardo A, Selman M.,. Lancet. 2011;378:1949-1961］。ＩＰＦの典型的な組織学的特徴である線維芽細胞巣は、傷害を受けた上皮および過形成上皮ならびに筋線維芽細胞によって産生されたＥＣＭによって覆われた、細胞、とりわけ線維芽細胞および筋線維芽細胞の特定の凝集体である［Kuhn C, McDonald JA.,. Am J Pathol. 1991;138:1257-1265］。多数の線維芽細胞巣を有するＩＰＦ患者が、生存期間の短縮を有することが研究によって明らかになった［Kaarteenaho R., Respir Res. 2013 ;14(1): 43］。加えて、ＩＰＦ患者の肺における筋線維芽細胞のマーカーとしてのアルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現の程度が、患者の生存に負に関連することが示された［Waisberg DR, Parra ER, Barbas-Filho JV, Fernezlian S, Capelozzi VL］。増加した線維芽細胞テロメラーゼ発現が、特発性肺線維症における筋線維芽細胞アルファ平滑筋アクチン発現より先に起こる［Clinics (Sao Paulo) 2012;67:1039-1046］。

線維化過程の病理発生の現在のパラダイムは、内因性または外因性の刺激への曝露後、肺上皮が傷害応答を開始して、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）ならびにインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含むサイトカインなどの可溶性因子の産生をもたらすと示唆している。これらの物質は、炎症細胞の動員および間葉系活性化を促進し、これが、活性化された筋線維芽細胞を生じると考えられている組織常在性の後胚期線維芽細胞の増大を引き起こす。これらの細胞は、創傷治癒の過程の中核をなすが、モジュレートされなければ、過剰なＥＣＭを沈着させ、正常な肺構造を破壊する。正常な創傷治癒の間、筋線維芽細胞は、一時的に活性化され、ＥＣＭを産生してけん引力を発揮することによって肉芽組織の産生を指示する。一旦治癒が達成されたら、肉芽組織は再吸収され、筋線維芽細胞はプログラム細胞死を受けて、正常な組織構造および機能を修復する［Klingberg et al, J Pathol. 2013; 229: 298-309］。この過程のいずれかの段階に混乱が起これば、組織病理を引き起こし得る。治癒反応が不十分であると、急性呼吸窮迫症候群で見られるように、急性傷害およびびまん性肺胞損傷が優位の病理が後に起こる。しかしながら、治癒期が優位に立つと、組織環境は、線維化および再構築へとシフトし、調節不全の瘢痕組織の蓄積が優位の病理が見られる。線維芽細胞および活性化された筋線維芽細胞は、この過程の中核をなすと考えられる［Moore et al Curr Pathobiol Rep. 2013 September; 1 (3): 199-208］。

さらなるレベルでは、ＩＰＦにおける線維芽細胞および筋線維芽細胞は、無制御の増殖および生存によって特徴付けられる病理学的表現型を実証する。これらの細胞は、肺間質に蓄積し、そこで、これらは、過剰量のコラーゲン−ＩリッチＥＣＭを沈着し、最終的に上記の線維芽細胞巣に組織化する。これらの領域が増大し、肺胞空間に並置されるようになるにつれて、これらは、最初に肺胞基底膜を断裂させ、その後、最終的にこれを破壊するように思われる［White et al, J Pathol. 2003; 201: 343-354］。

この増大は、ＩＰＦ肺組織から得られた初代線維芽細胞について記載されているプログラム細胞死に対する抵抗性に主に起因する［Maher et al, Am J Respir Crit Care Med. 2010; 182: 73-82 and Nho et al, PLoS one 2013; 8］。アポトーシス経路における異常、異常なＷｎｔシグナル伝達［Chang et al, J Biol Chem. 2010; 285; 8196-8206］およびオートファジー不全［Patel et al, PLoS One 2012; 7］を含めたいくつかの可能性のある機序がこの観察に対して提唱されている。

しかしながら、ＴＧＦ−βを含めた多数の十分に特徴付けられているサイトカインが、傷害を受けた肺に見いだされているか、または肺から取り除かれた炎症細胞によって産生された。さらに、肺線維化の動物モデルにおいて、ＴＧＦ−β産生が、コラーゲン合成の前に増加し、肺胞マクロファージによって主に産生された。進行した特発性肺線維症では、免疫組織化学染色によって、主に肺再生および再構築の領域の上皮細胞において、広範囲に及ぶＴＧＦ−β沈着を検出することができる。これは、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦなどの肺疾患に特徴的である進行性線維化の病理発生が異常な修復過程であり得ることを示唆している（Khali et al Ciba Found Symp. 1991; 157: 194-207およびCutroneo et al, J. Cell. Physiol. 211: 585-589, 2007を参照のこと）。

線維化に関するこの背景情報から、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよび特にＩＰＦの根底にある線維化過程の病理学を「３つの異なるレベルの線維化過程の病理発生」に分類できることが明らかである（とりわけ第二のレベルと第三のレベルの時系列順は、まだ完全に理解されておらず、これらが並行して部分的に起こることもある）。

第一のレベルの線維化過程では、内因性または外因性の刺激への曝露後、肺上皮は、通常、傷害応答を開始して、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、サイトカインなどの可溶性因子、ならびに、例えばプロコラーゲン、フィブロネクチンおよびＭＣＰ−１などの線維化促進性メディエーター／線維化マーカーの産生をもたらす。

次いで、第二のレベルの線維化過程の病理発生では、これらの線維化促進性メディエーター／線維化マーカーが、間葉系活性化を促進し、これが、線維芽細胞の活性化形態である筋線維芽細胞を生じると考えられている組織常在性の後胚期線維芽細胞の増大を引き起こす。これらの筋線維芽細胞は、創傷治癒の過程の中核をなすが、モジュレートされなければ、過剰な量の細胞外マトリックス物質およびコラーゲン／瘢痕組織を産生する。この「筋線維芽細胞表現型」はさらに、強いα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）発現によって特徴付けられる。α−ＳＭＡタンパク質を強く発現する、線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換／活性化は、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する第二のレベルの線維化過程の病理発生を生じる。

したがって、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）タンパク質発現の定量は、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する第二のレベルの線維化過程の病理発生に対応する、線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換／活性化の程度の好適な測定法である。

ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する第三のレベルの線維化過程の病理発生は、おそらくはプログラム細胞死に対する抵抗性による、線維芽細胞および筋線維芽細胞の無制御な増殖／細胞分裂および生存によって特徴付けられる。増殖性の線維芽細胞および筋線維芽細胞は、肺間質に蓄積し、そこで、これらは、過剰量のコラーゲン−ＩリッチＥＣＭを沈着し、最終的に線維芽細胞巣に組織化する。

細胞分裂の定量（例えば、増殖性の線維芽細胞のＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込みの定量による）は、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよびＩＰＦに共通する第三のレベルの線維化過程の病理発生に対応する、線維芽細胞の増殖の程度の好適な測定法である。

６．２実験アッセイＡ）およびＢ）の原理：
９６ウェルプレート中で成長させたＩＰＦ−患者の肺線維芽細胞（ＩＰＦ−ＬＦ細胞）を、異なる濃度のＰＤＥ４阻害剤「式ＩＩＩで示される化合物」、「アプレミラスト」もしくは「ロフルミラスト−Ｎ−オキシド」と共にまたは前述のＰＤＥ４阻害剤の各々とニンテダニブとの組み合わせと共に３０分間インキュベートした。

化合物インキュベーション後、細胞をアッセイ関連刺激で刺激し、試験化合物の存在下でアッセイ関連時間インキュベートした。

α−ＳＭＡタンパク質を、モノクローナル抗平滑筋アクチン抗体を使用したウェスタン置換アッセイ（ＭＳＤ）によって判定した。

増殖性細胞のＤＮＡに組み込まれたＢｒｄＵを、ＥＬＩＳＡによって判定した。

ＢｒｄＵは、ＤＮＡ前駆体チミジンの類似体である。増殖性細胞では、ＤＮＡは、分裂が起こり得る前に複製されなければならない。ＢｒｄＵが細胞培養物に加えられたら、増殖性細胞は、チミジンを組み込むかのうように、ＢｒｄＵをそれらのＤＮＡに組み込む。細胞のＤＮＡ中のＢｒｄＵの量を、特異的な抗ＢｒｄＵ蛍光抗体によって、続いて、ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーまたは細胞ＥＬＩＳＡによって検出することができる。

６．３実験Ａ）：α−ＳＭＡ（平滑筋アクチン）タンパク質アッセイ（ウェスタン置換アッセイ）
細胞播種および飢餓
ＩＰＦ−肺線維芽細胞（５〜８代継代）を、９６ウェル細胞培養プレートに４５００細胞／ウェルで１００μL／ウェルのＦＢＭ＋サプリメントと共に播種した。播種の２４時間後、細胞をサプリメントなしのＦＢＭ培地で１回洗浄し、２４時間飢餓させた。

実験Ａ１）
実験Ａ１）では、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を「試験化合物」として使用した：
・上昇濃度で、いずれか単独で（図１の黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）または
・上昇濃度で、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に（図１の白丸および灰色実線を参照のこと）。

実験Ａ２）
実験Ａ２）では、アプレミラストを「試験化合物」として使用した：
・上昇濃度で、いずれか単独で（図２の黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）または
・上昇濃度で、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に（図２の白丸および灰色実線を参照のこと）。

実験Ａ３）
実験Ａ３）では、ロフルミラスト−Ｎ−オキシドを「試験化合物」として使用した：
・上昇濃度で、いずれか単独で（図３の黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）または
・上昇濃度で、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に（図３の白丸および灰色実線を参照のこと）。

試験化合物の希釈物
全ての「試験化合物」（式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤、アプレミラストまたはロフルミラスト）を０．１mmol/L ＨＣｌまたはＤＭＳＯ中に１０００×で調製し、１：３．１６希釈系列を実施した（０．１ mmol/L ＨＣｌまたはＤＭＳＯ中）。２×濃縮化合物−培地を得るために、１：５００希釈物（１０００×希釈物の２μlを９９８μlのＦＢＭ＋２nmol/L ＰＧＥ２に加えた）を調製した。

試験化合物とのプレインキュベーション
播種の４８時間後、培地をアスピレーションし、ＦＢＭ（１ウェル当たり１００μl）を加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、２×濃縮化合物（異なる濃度の）＋２×濃縮ＰＧＥ２（２nmol/L）を含有する培地９０μlを３０分間加えた。ＰＧＥ２の最終濃度は１nmol/Lであった。

刺激
試験化合物プレインキュベーション（１９０μL）の３０分後、１０μlの２０×濃縮ＴＧＦ−βを加え、細胞を３７℃の温度で４８時間刺激した。

この目的のために、ＴＧＦ−βストック溶液（４mmol/Lの無菌ＨＣＬ中で再構成した２０μg/mL）を、飢餓培地中１００ng/mLの濃度に達するように１：２００希釈した。このＴＧＦ−β培地または飢餓培地１０μLを表示ウェルに加えた。試験化合物濃度を刺激の間維持した。最終ＴＧＦ−β濃度は、４ng/mLであった。

タンパク質溶解物
刺激の４８時間後、上清を取り出し、さらなる実験のため−８０℃で保存した。細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、１×プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液を１ウェル当たり５０μl加えた。溶解物を氷上で５分間インキュベートした後に−８０℃で保存した。

α−ＳＭＡウェスタン置換アッセイ
融解後、各溶解物２５μlをマルチアレイ９６ウェルプレート（ＭＳＤ）のメンブレンに移し、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。そのインキュベーション時間後、プレートを１×Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ＭＳＤ）２００μlで３回洗浄し、３％ブロッキング緩衝液１５０μlを１時間加えた。ブロッキング後、プレートを１×Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２００μlで３回洗浄し、２５μlの抗体溶液（１プレート当たり、３％ブロッキング緩衝液０．７５ml、１×Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２．２５ml、抗α−ＳＭＡ抗体（１：２５００）１．２μl、ヤギ抗マウススルホタグ抗体（１：２００）１５μl）を１時間加えた。ＡＢ−インキュベーション後、プレートを１×Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２００μlで３回洗浄し、１×ＭＳＤ読み取り緩衝液を１ウェル当たり１５０μl加えた。プレートをSector Imager（ＭＳＤ）で測定した。

６．４実験Ｂ：細胞増殖アッセイ
細胞播種および飢餓
ＩＰＦ−肺線維芽細胞（５〜８代継代）を、９６ウェル細胞培養プレートに２５００細胞／ウェルで１００μL／ウェルのＦＢＭ＋サプリメントと共に播種した。播種の２４時間後、細胞をサプリメントなしのＦＢＭ培地で１回洗浄し、次いで、この培地中で飢餓を２４時間維持した。

実験Ｂ１）
実験Ｂ１）では、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を「試験化合物」として使用した：
・上昇濃度で、いずれか単独で（図４の黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）または
・上昇濃度で、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に（図４の白丸および灰色実線を参照のこと）。

白三角を有する破線は、１００nMol/Lのニンテダニブと対応する濃度の式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤との組み合わせ処置の「計算された相加的曲線」を表す。

実験Ｂ２）
実験Ｂ２）では、アプレミラストを「試験化合物」として使用した：
・上昇濃度で、いずれか単独で（図５の黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）または
・上昇濃度で、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に（図５の白丸および灰色実線を参照のこと）。

白三角を有する破線は、１００nMol/Lのニンテダニブと対応する濃度のアプレミラストとの組み合わせ処置の「計算された相加的曲線」を表す。

実験Ｂ３）
実験Ｂ３）では、ロフルミラスト−Ｎ−オキシドを「試験化合物」として使用した：
・上昇濃度で、いずれか単独で（図６の黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）または
・上昇濃度で、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に（図６の白丸および灰色実線を参照のこと）。

白三角を有する破線は、１００nMol/Lのニンテダニブと対応する濃度のロフルミラスト−Ｎ−オキシドとの組み合わせ処置の「計算された相加的曲線」を表す。

試験化合物の希釈物
全ての試験化合物を０．１mmol/L ＨＣｌまたはＤＭＳＯ中に１０００×で調製し、１：３．１６希釈系列を実施した（０．１mmol/L ＨＣｌまたはＤＭＳＯ中）。１×濃縮化合物培地を得るために、１０００×ＤＭＳＯ希釈物１μlを９９９μlのＦＢＭに加えた。

試験化合物とのプレインキュベーション
播種の４８時間後、培地を吸引によって除去し、化合物培地または飢餓培地９０μlを３０分間加えた。

刺激
試験化合物プレインキュベーション（９０μL）の３０分後、１０μlの１０×濃縮ＦＧＦ＋ＩＬ−１βを加え、細胞を３７℃の温度で９２時間刺激した。

この目的のために、ＦＧＦおよびＩＬ−１βストック溶液（それぞれ、２５０μg/mLおよび１０μg/mL）を、飢餓培地中、ＦＧＦおよびＩＬ−１βについてそれぞれ２００ng/mLおよび３００pg/mLの濃度に達するように希釈した。この刺激培地または飢餓培地１０μLを表示ウェルに加えた。試験化合物濃度を刺激の間維持した。

最終ＦＧＦ濃度は２０ng/mLであった。最終ＩＬ−１β濃度は３０pg/mLであった。

ＢｒｄＵアッセイ
ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵ組み込みの測定に基づいた細胞増殖の定量のための比色イムノアッセイによって、増殖を判定した。製造業者の指示に従ってアッセイを行った。

刺激の７２時間後、飢餓培地中でのＢｒｄＵの１：１００希釈（得られた濃度１００μmol/L）を実施し、１ウェル当たり１０μlを加えた（１ウェル当たりの最終濃度１０μmol/l）。約１８時間後、ＢｒｄＵ培地を吸引によって除去した。FixDenat試薬で細胞を室温で３０分間固定および変性させた。試薬をタッピングによって除去し、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ希釈標準溶液を加えた（インキュベーション時間：９０分）。プレートを洗浄緩衝液２００μLで３回洗浄した後、基質溶液と約１０分間インキュベーションした。基質溶液に１mol/L Ｈ_２ＳＯ_４を加えることによって反応を停止し、光度計（EnVision 2104 Multilabel reader, PerkinElmer）にて４５０nmでプレートを読み取った。

６．５データ解析
ＢｒｄＵアッセイについては光学密度読み取り値（ＯＤ）からまたはＭＳＤ単位（α−ＳＭＡアッセイ）から、未刺激対照に対するｘ倍率を計算した。

未刺激対照に対するｘ倍率から％阻害値を計算した。

異なるドナーについての実験の各々で、全ての阻害値を２連または３連で判定した。

全ての値からブランクの平均を差し引いた。

刺激した細胞のＩＣ_５０値を以下の通り判定した：
％阻害値＝１００−（Ｙ／Ｋ１）＊１００
Ｋ１＝刺激したが化合物処置しなかった対照ウェルのＯＤの平均−刺激も化合物処置もしなかった対照ウェルのＯＤの平均
Ｙ＝刺激して化合物処置したウェルのＯＤ

Graph Pad Prism Softwareパッケージの可変勾配を用いた３パラメータ−フィッティングを使用して、log（阻害剤濃度）対％阻害値の非線形回帰を計算した。

ニンテダニブと組み合わせた式ＩＩＩで示される化合物、アプレミラストまたはロフルミラスト−Ｎ−オキシドの相加効果を計算するために、以下の式を使用した：
ＰＤＥ４阻害剤（ＥＢ）の効果＋ニンテダニブ（ＥＮ）の効果＝ＥＢ＋Ｎ＝ＥＢ＋ＥＮ−（ＥＢ＊ＥＮ）
＝破線曲線（Poch & Holzmann, 1980)。

試験化合物
試験化合物の式ＩＩＩで示される化合物、アプレミラスト、ロフルミラスト−Ｎ−オキシドおよびニンテダニブをＤＭＳＯ中に溶解し、−２０℃で保存した。各実験の前に７種の濃度の系列希釈物を調製した。

６．６材料および方法
材料
試験物品供給会社注文番号
ＩＰＦ−ＬＦ細胞株（５〜８代継代） Asterand DI16769
DI16783
DI19873
BI209755
BI210978
BI212020
ｒｈＴＧＦ−β R&DSystems 240-B-010
ｒｈＦＧＦ（塩基性） R&Dsystems 234_FSE
ｒｈＩＬ−１β R&DSystems 201-LB-005
ｒｈＰＧＥ２ Tocris 2296
モノクローナル抗平滑筋アクチン抗体 Sigma A2547
ヤギ抗マウススルホタグ抗体ＭＳＤ R32AC-1
マルチアレイ９６ウェルプレート高結合プレートＭＳＤ L15XB-3
ＭＳＤブロッカーＡＭＳＤ R93BA-4
ＭＳＤＴｒｉｓ洗浄緩衝液（１０×）ＭＳＤ R61TX-1
ＭＳＤ読み取り緩衝液Ｔ（４×）ＭＳＤ R92TC-2
ＲＩＰＡ緩衝液 Sigma R0278-500ML
Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（１００×） ThermoScientific 78437
ＰＢＳ Gibco 10010023
ＢｒｄＵ−Ａｓｓａｙ Roche 11647229001
細胞培養フラスコ（７５cm²、組織培養処理） BD Falcon（商標） 353110
細胞培養フラスコ（１７５cm²、組織培養処理） BD Falcon（商標） 353112
９６ウェルプレート（細胞培養） Nunc microwell 96F 167008
ＤＭＳＯ Merck 1.02952.1000
Cells-to-CT 1StepTaqMankit Ambion A25602

細胞繁殖培地：
インスリン、ＦＧＦ−２、０．５％ＦＢＳ、ＧＡ−１０００（全て、FGM-2 SingleQuots, Lonza, Cat. No. CC-4126内）を補充した、ＦＢＭ（線維芽細胞基礎培地、Lonza, Cat. No: CC-3131）

ＩＰＦ−ＬＦ細胞を二次培養するための試薬：
Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（Lonza, Cat. No. CC-5022）
トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５mg/mL）（Lonza, CC-5012)
ＴＮＳ（トリプシン中和液、Lonza, CC-5002）

飢餓培地：
サプリメントなしのＦＢＭ

刺激培地α−ＳＭＡアッセイ：
ＦＢＭ＋４ng/mL ｒｈＴＧＦ−βおよび１nmol/L ＰＧＥ２

刺激培地ＢｒｄＵアッセイ：
ＦＢＭ＋２０ng/mL ｒｈｂＦＧＦ＋３０pg/mL ｒｈＩＬ−１β

６．７実験の解釈
実験Ａ）：ＩＰＦ患者由来のヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現の阻害
ある特定の活性剤が、ＩＰＦ患者のヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現を阻害する傾向が強ければ強いほど、この活性剤は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への移行である第二のレベルの線維化過程の病理発生においてより治療効果を有するだろう。

したがって、第二のレベルの線維化過程を模倣するこの実験Ａ）において、
ａ）ニンテダニブ単独の、式ＩＩＩで示される化合物単独の、アプレミラスト単独のおよびロフルミラスト−Ｎ−オキシド単独の、ならびに
ｂ）式ＩＩＩで示される化合物とニンテダニブとの、アプレミラストとニンテダニブとのおよびロフルミラスト−Ｎ−オキシドとニンテダニブとの
ＩＰＦ患者のヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現に対する効果を実験により判定した。

濃度１００nMol/Lで単独投与されたニンテダニブは、この実験において、ヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現に対して阻害効果を示さなかったが（この濃度のニンテダニブだけが第二のレベルの線維化過程の病理発生に対して治療効果を示さなかったことを裏付けている（図１、２および３の□を参照のこと：阻害は≦０であった））、全ての試験したＰＤＥ４阻害剤（式ＩＩＩで示される化合物、アプレミラストおよびロフルミラスト−Ｎ−オキシド）は、単独で投与したときおよびまた固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと一緒に投与したとき、少なくともある一定の濃度では、ヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現に対して濃度依存的阻害を示し、このことは、これらのＰＤＥ４阻害剤全ての第二のレベルの線維化過程の病理発生におけるある一定の治療効果を裏付けている（筋線維芽細胞への活性化）。

これらの結果から、ＰＤＥ４阻害剤は、少なくともある一定の濃度範囲では、「線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行／活性化」（ＩＬＤ、特定するとＰＦ−ＩＬＤに共通する第二のレベルの線維化過程の病理発生を表す事象である）に対して濃度依存的な治療効果を示す可能性を有するが、一方で、濃度１００nMol/Lのニンテダニブだけでは、この実験によればこの全く同じ「第二のレベルの病理発生」に対して治療効果を示さないと結論付けることができる。

したがって、ＰＤＥ４阻害剤は、ニンテダニブとの関連で、「線維芽細胞の筋線維芽細胞への移行／活性化」（＝第二のレベルの線維化過程の病理発生）に対していわゆる「補完的効果」または「補足的効果」を示す。それゆえ、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤と一緒のニンテダニブの投与は、例えばニンテダニブ単独によるＩＰＦ処置と比べて治療有効性に対して優れた効果を示すだろう。

ヒト肺線維芽細胞のＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現に対する測定された阻害を、式ＩＩＩで示される化合物（図１）、アプレミラスト（図２）およびロフルミラスト−Ｎ−オキシド（図３）で比較した場合、式ＩＩＩで示される化合物（図１）のみ、完全濃度／阻害曲線が「約ゼロ」の阻害に位置し、一方、例えばアプレミラスト、特にロフルミラスト−Ｎ−オキシドでは、「低いＰＤＥ４阻害剤濃度（単独またはニンテダニブとの組み合わせのいずれか）」が「ＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現の負の阻害」を導くことが明白である（アプレミラスト、特にロフルミラスト−Ｎ−オキシドについてこれらのより低い濃度では、第二のレベルの線維化過程に対して治療効果がないことを裏付けている）（一方で、式ＩＩＩで示される化合物は、全ての試験濃度で、ＴＧＦ−βで刺激されたα−ＳＭＡタンパク質発現の正の阻害を示すと思われる）。

実験Ｂ）：線維芽細胞増殖の阻害
ある特定の活性剤が、ＩＰＦ患者の培養されたヒト肺線維芽細胞の増殖を阻害する傾向が強ければ強いほど、この活性剤は、線維芽細胞増殖である第三のレベルの線維化過程の病理発生においてより治療効果を有するだろう。

したがって、
ａ）ニンテダニブ単独の、式ＩＩＩで示される化合物単独の、アプレミラスト単独のおよびロフルミラスト−Ｎ−オキシド単独の、ならびに
ｂ）式ＩＩＩで示される化合物とニンテダニブとの、アプレミラストとニンテダニブとのおよびロフルミラスト−Ｎ−オキシドとニンテダニブとの
ＩＰＦ患者のヒト肺線維芽細胞の増殖に対する効果を、実験Ｂ）において実験により判定した。

第三のレベルの線維化過程の病理発生（「線維芽細胞増殖」）を模倣するこの実験Ｂ）では、濃度１００nMol/Lで単独投与されたニンテダニブはすでに、ヒト肺線維芽細胞増殖に対して明らかな阻害効果を示した（図４、５および６の記号□で表される阻害データ点を参照のこと）。

しかしながら、図４の実験Ｂ１）、図５の実験Ｂ２）および図６の実験Ｂ３）の結果は、ニンテダニブ単独が線維芽細胞増殖に対して阻害効果を有するだけでなく、式ＩＩＩで示される化合物（図４のＢ１における黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）、アプレミラスト（図５のＢ２における黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）およびロフルミラスト−Ｎ−オキシド（図６のＢ３における黒丸および黒色実線曲線を参照のこと）などのＰＤＥ４阻害剤もまた、一般に、線維芽細胞増殖に対して濃度依存的阻害効果を示すことを示しており、それゆえ線維芽細胞増殖（第三のレベルの線維化過程の病理発生）に対して治療効果を有すると思われる。

明らかに、固定濃度１００nMol/Lのニンテダニブと試験したＰＤＥ４阻害剤はいずれも、線維芽細胞増殖に対して濃度依存的に阻害効果を示すので、１００nMol/Lのニンテダニブと対応するＰＤＥ４阻害剤（そのそれぞれの濃度での）の組み合わせによる線維芽細胞増殖の阻害に単純な「相加効果」が期待されるはずである。

図４、５および６において、白三角を有する破線曲線は、これらの「計算された相加的組み合わせ曲線」を表し、これは、１００nMol/Lのニンテダニブの測定された阻害値＋可変濃度の対応するＰＤＥ４阻害剤単独の測定された阻害値の単純な「相加」から計算された。

しかしながら、図４、５および６の白丸を有する灰色実線曲線は、「１００nMol/Lのニンテダニブおよび可変濃度の対応するＰＤＥ４阻害剤を含む組み合わせの実験により測定された阻害曲線」を表す。

驚くべきことに、実験Ｂ１）の結果を示す図４において、ニンテダニブと式ＩＩＩで示される化合物との組み合わせの「線維芽細胞増殖の実験により測定された阻害曲線」（灰色実線、白丸）は、ニンテダニブと式ＩＩＩで示される化合物との組み合わせの対応する「計算された相加的阻害曲線」（白三角を有する破線曲線）と比べて「左に有意にシフトする」（式ＩＩＩで示される化合物のより低い濃度への方向を意味する）。

この有意な「左シフト」は、１００nMol/Lのニンテダニブと式ＩＩＩで示される化合物との組み合わせの「過剰付加的な相乗的効果」の明白な指標である。ニンテダニブと式ＩＩＩで示される化合物との組み合わせのこの実験により観察された「過剰付加的な相乗的効果」は、特にこの相乗的な過剰付加的効果が「クラス効果」であると思われないので、全く驚くべきことであった。

図５は、対応する実験Ｂ２）の結果を示しており、ここでは、式ＩＩＩで示される化合物をアプレミラストに交換した。図５は、ニンテダニブとアプレミラストとの組み合わせの「実験により測定された阻害曲線」（灰色実線、白丸）が、ニンテダニブとアプレミラストとの組み合わせの対応する「計算された相加的阻害曲線」（白三角を有する破線曲線）と比べて左にシフトすることなく、代わりに右にわずかにシフトさえする（より高いアプレミラスト濃度を意味する）ことを示している。そのような「右シフト」は、理論上まさに、ニンテダニブとアプレミラストとの組み合わせによる「線維芽細胞増殖の相加的阻害未満」（「抗相乗的効果」）の指標であろう。しかしながら、「計算されたニンテダニブ／アプレミラスト組み合わせ曲線」と比べた「測定されたニンテダニブ／アプレミラスト組み合わせ曲線」のこのややわずかな右シフトは、ほぼエラーバー内にあり、それゆえ、統計学的に関係性がない。したがって、ニンテダニブとアプレミラストとの組み合わせについて、期待されるようなほぼ正常な「相加効果」を実験により観察することができた。

図６は、対応する実験Ｂ３）の結果を示しており、ここでは、式ＩＩＩで示される化合物をロフルミラスト−Ｎ−オキシドに交換した。図６は、ニンテダニブとロフルミラスト−Ｎ−オキシドとの組み合わせの「実験により測定された阻害曲線」（灰色実線、白丸）もまた、ニンテダニブとロフルミラスト−Ｎ−オキシドとの組み合わせの対応する「計算された相加的阻害曲線」（白三角を有する破線曲線）と比べて左の代わりに右にシフトすることを示している。そのような「右シフト」は、ニンテダニブとロフルミラスト−Ｎ−オキシドとの組み合わせの「線維芽細胞増殖の相加的阻害未満」（抗相乗的効果）の指標であろう。「計算されたニンテダニブ／ロフルミラスト組み合わせ曲線」と比べた「測定されたニンテダニブ／ロフルミラスト組み合わせ曲線」のこの「右シフト」は、エラーバー範囲を超える非常に高いロフルミラスト−Ｎ−オキシド濃度についてだけである。したがって、ニンテダニブとロフルミラスト−Ｎ−オキシドとの組み合わせについてもまた、期待されるようなほぼ「相加効果」を実験により判定することができた。

ニンテダニブと式ＩＩＩで示される化合物との組み合わせにだけ観察された線維芽細胞増殖の阻害に対するこの「過剰付加的な相乗的効果」はまた、以下の濃度／阻害曲線について計算されたＩＣ_５０値の大きな差異にも反映される：
ａ）図４における式ＩＩＩで示される化合物単独で処置したＩＰＦ患者のヒト肺線維芽細胞について測定された（黒色実線曲線、ＩＣ_５０値２５５nMol/L）および
ｂ）図４における式ＩＩＩで示される化合物およびニンテダニブを含む組み合わせで処置したＩＰＦ患者のヒト肺線維芽細胞について測定された（灰色実線曲線、ＩＣ_５０値２３nMol/L）。

ここで、単独で投与された式ＩＩＩで示される化合物について測定された阻害曲線のＩＣ_５０値は、式ＩＩＩで示される化合物とニンテダニブとの組み合わせについて測定された阻害曲線のＩＣ_５０値と比べて１１倍大きい（２５５nMol/L／２３nMol/L＝１１）。

それと対照的に、単独で投与された他のＰＤＥ４阻害剤アプレミラストおよびロフルミラスト−Ｎ−オキシドについて測定された阻害曲線の、対応するＰＤＥ４阻害剤／ニンテダニブ組み合わせについて測定された阻害曲線と比べたＩＣ_５０値の対応する差異は、はるかにより小さかった（アプレミラストに関して１，１３倍大きい、ロフルミラスト−Ｎ−オキシドに関して０，８２倍小さい）。

式ＩＩＩで示される化合物とニンテダニブとの組み合わせにだけ観察された線維芽細胞増殖の阻害に対するこの実験により判定された「過剰付加的な相乗的効果」は、あきらかに「クラス効果」であると思われないが、その理由は、他の試験したＰＤＥ４阻害剤アプレミラストまたはロフルミラストはいずれもニンテダニブと組み合わせても、対応する類似の「過剰付加的な相乗的効果」を示さず、代わりに期待される「相加的阻害効果」だけを示した（ニンテダニブ／ロフルミラスト−Ｎ−オキシドは、大きなロフルミラスト−Ｎ−オキシド濃度で「相加的阻害効果未満」をも示した）からである。

したがって、ニンテダニブと式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤との組み合わせは、線維芽細胞増殖に対する実験により観察された過剰付加的な相乗的阻害効果に起因して、驚くべきことに、個々の単一薬剤による処置と比べてだけでなく、代替組み合わせニンテダニブ／ロフルミラスト−Ｎ−オキシドおよびニンテダニブ／アプレミラストと比べても、ＰＦ−ＩＬＤ患者の処置に対して明らかに改善された治療有効性を示す。

したがって、実験Ａ）およびＢ）は、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤およびニンテダニブを含む組み合わせが、以下を実験により示した：
１．）「ＰＦ−ＩＬＤに共通する第二のレベルの線維化過程の病理発生」（線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化）に対して、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の全試験濃度範囲にわたる明らかな治療効果を示すこと（それによって、ニンテダニブ単独は、その第二のレベルに対して治療効果を示さなかった）および
２．）「ＰＦ−ＩＬＤに共通する第三のレベルの線維化過程の病理発生」（線維芽細胞増殖）に対して、驚くべきことに「過剰付加的な相乗的な治療効果」さえ示すこと（ロフルミラスト−Ｎ−オキシド／ニンテダニブ組み合わせおよびアプレミラスト／ニンテダニブ組み合わせは、驚くべきことに示さなかった）。

式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤とニンテダニブとの組み合わせが、他のＰＤＥ４阻害剤／ニンテダニブ組み合わせ（例えば、ロフルミラスト−Ｎ−オキシド／ニンテダニブなど）と比べて明白に示す別の追加の利点は、その比較的良好な耐容性である（特に消化器系副作用に関して）。

ニンテダニブおよびまたピルフェニドン（ＩＰＦの処置用に現在承認されているたった２つの治療薬剤）は共に、下痢、吐き気、嘔吐、体重低下などの有意な消化器系副作用を示すことが知られており、これが、ニンテダニブおよびピルフェニドンが、それらの相加作用、それゆえより高頻度の消化器系副作用が原因で通常組み合わされないことの主な理由である。

ニンテダニブおよびピルフェニドンと対照的に、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、対応するラット実験においてＰＤＥ４阻害剤に典型的な消化器系副作用（下痢など）を比較的伴わないことが示されている（WO 2013/026797 Chapter 5.3：「胃内容排出」および「腸管輸送」の実験ならびに図２ａ（胃内容排出）および２ｂ（腸管輸送）を参照のこと）。これらの実験では、上昇量の実施例化合物第２（本出願において式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤と同一である）が、未処置ラットと比べて、ラットにおける試験食の胃内容排出および腸管輸送に対して基本的に効果がなかったことを示すことができた。

しかしながら、類似の「胃内容排出」および「腸管輸送」実験では、代替ＰＤＥ４阻害剤ロフルミラストは、消化器系副作用を示す明らかな傾向を示した。

加えて、臨床試験から、ロフルミラスト（ＣＯＰＤの処置用に唯一認可を受けている）が、下痢、吐き気、体重低下などの有意な消化器系副作用をヒトＣＯＰＤ患者において示すこともよく知られている。

http://www.rxlist.com/daliresp-drug.htmでは、ＣＯＰＤ患者に１日用量５００μgで与えられたロフルミラストが、
全患者の９．５％で下痢を導く（プラセボを受けた患者わずか２．７％と比べて）
全患者の４．７％で吐き気を導く（プラセボを受けた患者わずか１．４％と比べて）
全患者の７．５％で体重減少を導く（プラセボを受けた患者わずか２．１％と比べて）および
全患者の４．４％で頭痛を導く（プラセボを受けた患者わずか２．１％と比べて）
ことが開示されている。

上述した観察に起因して、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤とニンテダニブとの組み合わせは、例えばロフルミラストとニンテダニブとの組み合わせと比べて、消化器系副作用に関してより良好な耐容性を有する。加えて、式ＩＩＩで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤とニンテダニブとの組み合わせは、消化器系副作用に関する許容し得る耐容性（WO 2013/026797 Chapter 5.3）と組み合わせて、ＩＬＤ、ＰＦ−ＩＬＤおよび特にＩＰＦの処置に関してより良好な治療有効性（図１〜６を参照のこと）を有する。

Claims

１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法であって、その必要のある患者に、治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩
および治療有効量のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤
を投与することを含む、方法。
進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項１に記載の方法。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与される、請求項１または２に記載の方法。
チロシンキナーゼ阻害剤が、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項１〜４の一項に記載の方法。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、請求項１〜４の一項に記載の方法。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、請求項１、２、３または４の一項に記載の方法。
式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩であって、
その必要のある患者に、治療有効量の前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を治療有効量のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩。
進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項７に記載の１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤。
ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与される、請求項７または８に記載の方法において使用するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤。
チロシンキナーゼ阻害剤が、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項７〜９の一項に記載の方法において使用するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤。
式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、請求項７〜１０の一項に記載の方法において使用するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤。
式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、請求項７、８、９または１０の一項に記載の方法において使用するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤。
ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤であって、その必要のある患者に、治療有効量のチロシンキナーゼ阻害剤を治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩と組み合わせて投与することを含む、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための、チロシンキナーゼ阻害剤。
進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項１３に記載の１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置するための方法において使用するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与される、請求項１３または１４の一項に記載の方法において使用するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤。
モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項１３、１４または１５の一項に記載の方法において使用するためのチロシンキナーゼ阻害剤。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、請求項１３、１４、１５または１６の一項に記載の方法において使用するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、請求項１３、１４、１５または１６の一項に記載の方法において使用するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤。
式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩の
治療有効量の前記の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩が、その必要のある患者に、治療有効量のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与されるべきである、１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための、使用。
進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項１９に記載の１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するための式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の使用。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩が、ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与されるべきである、請求項１９または２０に記載の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の使用。
チロシンキナーゼ阻害剤が、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項１９、２０または２１の一項に記載のＰＤＥ４Ｂ阻害剤の使用。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、請求項１９、２０、２１または２２の一項に記載の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の使用。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、請求項１９、２０、２１または２２に記載の式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の使用。
１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の使用であって、治療有効量の前記チロシンキナーゼ阻害剤が、その必要のある患者に、治療有効量の式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩と組み合わせて投与されるべきである、使用。
進行性線維化を伴う間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項２５に記載の１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための医薬組成物を調製するためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用。
チロシンキナーゼ阻害剤が、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与されるべきである、請求項２５または２６に記載のニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤の使用。
チロシンキナーゼ阻害剤が、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項２５、２６または２７の一項に記載のチロシンキナーゼ阻害剤の使用。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、請求項２５、２６、２７または２８の一項に記載のチロシンキナーゼ阻害剤の使用。
式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、請求項２５、２６、２７または２８の一項に記載のチロシンキナーゼ阻害剤の使用。
以下を含む、医薬組成物：
・式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく，
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩
・ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤、そして
・場合により、１つまたは複数の薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤。
チロシンキナーゼ阻害剤が、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項３１に記載の医薬組成物。
式Ｉで示されるＰＤＥ４−Ｂ阻害剤が、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
式Ｉで示されるＰＤＥ４−Ｂ阻害剤が、式ＩＩＩ：

で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である、請求項３１、３２または３３の一項に記載の医薬組成物。
以下を含む、キット：
・式Ｉ：

［式中、環Ａは、１個または２個の窒素原子を場合により含んでよい６員芳香族環であり、そして
Ｒは、Ｃｌであり、かつ、
Ｒは、環Ａのパラ位、メタ位またはオルト位のいずれかに位置してよく、
Ｓ^＊は、キラル中心を表す硫黄原子である］
で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤またはその薬学的に許容し得る塩を含み、
そして場合により、１つまたは複数の薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を含む第一の医薬組成物または剤形、ならびに
・ニンテダニブおよびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択されるチロシンキナーゼ阻害剤を含み、そして
場合により、１つまたは複数の薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を含む第二の医薬組成物または剤形。
１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）を処置する方法において使用するための、請求項３５に記載のキット。
特発性肺線維症（ＩＰＦ）を処置する方法において使用するための、請求項３５に記載のキット。
第一の医薬組成物または剤形が、第二の医薬組成物または剤形と同時に、併行して、順次に、連続的に、交互にまたは別々に投与されるべきである、請求項３５、３６または３７の一項に記載のキット。
第二の医薬組成物または剤形のチロシンキナーゼ阻害剤が、モノエタンスルホナートの形態のニンテダニブである、請求項３５、３６または３７の一項に記載のキット。
第一の医薬組成物または剤形が、式ＩＩ：

で示される化合物、その薬学的に許容し得る塩、
式ＩＩＩ：

で示される化合物およびその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される式Ｉで示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤を含む、請求項３５、３６または３７の一項に記載のキット。
第一の医薬組成物または剤形が、式ＩＩＩ：

で示されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤化合物またはその薬学的に許容し得る塩を含む、請求項３５、３６、３７または３８の一項に記載のキット。
以下をさらに含む、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のキット：
・１つまたは複数の進行性線維化を伴う間質性肺疾患（ＰＦ−ＩＬＤ）の処置における第一および第二の医薬組成物または剤形の同時、併行、順次、連続的、交互または別々の使用のための印刷された説明書を含む、添付文書。
以下をさらに含む、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のキット：
・特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置における第一および第二の医薬組成物または剤形の同時、併行、順次、連続的、交互または別々の使用のための印刷された説明書を含む、添付文書。