CN113116904B - 尼达尼布-甘草次酸复方制剂和药物复方制剂及在制备治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尼达尼布‑甘草次酸复方制剂和药物复方制剂及在制备治疗肺纤维化药物中的应用，该尼达尼布‑甘草次酸复方制剂由包括尼达尼布、尼达尼布盐中的至少一种与甘草次酸组成的混合原料制成，所述尼达尼布盐为尼达尼布与酸形成的盐，所述尼达尼布的化学结构为
Figure DDA0002988655660000011
本发明将尼达尼布与药性温和的甘草次酸进行药物联合使用，大大提升了治疗药效，在治疗肺纤维方面具有较大的应用价值。

Description

尼达尼布-甘草次酸复方制剂和药物复方制剂及在制备治疗 肺纤维化药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种尼达尼布-甘草次酸复方制剂和药物复方制剂及在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
背景技术
肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种以弥漫性肺炎和肺泡结构紊乱并最终导致肺间质纤维化为特征的疾病，是一类临床上称为间质性肺病共有的一种严重的病理特征。间质性肺病按其发病原因可以分成特发性和继发性两类，其共同的特征是先由各种原因所致的炎症损伤正常的肺泡结构，即产生肺泡炎；代之以胶原疤痕组织累积修复该损伤，即产生纤维化而使肺组织逐渐丧失正常呼吸功能，产生呼吸困难、缺氧等症状，最终导致呼吸衰竭。各种原因引起的肺纤维化尤其是特发性的肺纤维化近年来其发病率呈不断上升的趋势，慢性支气管炎、慢阻肺、肺气肿、哮喘等疾病，最终都会发展成肺纤维化。
目前，FDA批准了两种抗肺纤维化的口服药物，分别为吡非尼酮与尼达尼布。尼达尼布是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)，具有抗纤维化和抗炎活性。吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)是一种新型口服小分子化合物，具有抗纤维化、抗炎和抗氧化作用。两种药物的主要治疗机制在于抑制肌成纤维细胞活化从而降低胶原蓄积，而对于纤维化发生起始阶段无法起到治疗的目的，因此两种上市药物仅能延缓病情发展，却不能从根本上治疗肺纤维化。且吡非尼酮治疗过程中会出现光敏反应、厌食、头晕、转氨酶升高、湿疹、腹部不适和白细胞降低等副作用；尼达尼布(Nintedanib)与显著的全身性不良事件有关，包括腹痛，呕吐和腹泻等，现有研究中，采用尼达尼布治疗的患者肺功能均为轻-中度受损，肺功能严重受损以及有合并症的患者能否从中获益尚不清楚。此外，目前二者均因价格昂贵导致临床疗效有限。因此寻找新的防治肺纤维化经济有效、副作用少、毒性低的药物仍然是国内外药物研究的热点。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种尼达尼布- 甘草次酸复方制剂和药物复方制剂及在制备治疗肺纤维化药物中的应用，复合药剂药效高、副作用少，在治疗肺纤维化方面具有较大的应用价值。
本发明的第一方面，提出了一种尼达尼布-甘草次酸复方制剂，由包括尼达尼布、尼达尼布盐中的至少一种与甘草次酸组成的混合原料制成，所述尼达尼布盐为尼达尼布与酸形成的盐，所述尼达尼布的化学结构为
Figure BDA0002988655640000021
根据本发明实施例的尼达尼布-甘草次酸复方制剂，至少具有如下有益效果：
本发明实施例利用尼达尼布与甘草次酸形成复方制剂，尼达尼布与甘草次酸之间的协同作用大大提高了药效，相当于在同等药效剂量下降低了尼达尼布的用量，从而降低了尼达尼布的潜在副作用，协同使用的甘草次酸属于温和的中药药材，相较于单独使用单一药剂，本发明将尼达尼布与药性温和的甘草次酸进行药物联合使用，大大提升了治疗药效，降低了副作用，在治疗肺纤维化方面具有较大的应用价值。
在本发明的一些实施方式中，所述酸为酸度系数pKa不大于6.9的酸。优选地，所述酸为乙基磺酸。尼达尼布的pKa(base)为7.9，根据FDA指导原则，当酸碱ΔpKa>1时可以成盐，因此选取酸度系数不大于6.9的酸。常见的药用酸根都在此范围中，形成的盐可以例举的有盐酸盐、富马酸盐、2-氯扁桃酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、L-酒石酸盐、戊二酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、谷氨酸盐、棕榈酸盐、奎宁酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、乙酸盐、L- 苹果酸盐、L-天冬氨酸盐、甲酸盐、氢溴酸盐、草酸盐、丙二酸盐、苯磺酸盐、丁烷二磺酸盐、1-5-萘二磺酸盐、萘-1-磺酸盐或1-羟基萘甲酸盐。
在本发明的一些实施方式中，所述尼达尼布-甘草次酸复方制剂由包括乙磺酸尼达尼布与甘草次酸的混合原料制成。
在本发明的一些实施方式中，所述尼达尼布-甘草次酸复方制剂为共无定型物。共无定型是基于无定型药物的不稳定性缺点和共晶药物的单相二元体系理念提出的一种新的药物固态形式，各组分在分子水平上通过形成氢键等超分子作用力。共无定型处在一种热力学高能态，其物理性质包括溶解度和溶出速率与共晶药物或是无定型药物相比均会发生变化，其稳定性也较无定型单体要高，将尼达尼布-甘草次酸复方制剂制成共无定形物能够进一步提高复方药剂的生物利用度，能够更好地被胃肠道吸收。
本发明的第二方面，提出了一种药物复方制剂，包括上述的尼达尼布-甘草次酸复方制剂，以及至少一种药学上接受的载体或辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为固态载体、液体载体、气体载体中的至少一种；优选地，所述固态载体选自乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸中的至少一种；优选地，所述液体载体选自糖浆、花生油、橄榄油和水中的至少一种；优选地，所述气体载体选自二氧化碳和氮气中的至少一种；优选地，所述药物复方制剂为口服剂型。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料选自胶态二氧化硅、润滑剂、填充剂、崩解剂、增塑剂、着色剂、乳化剂、稀释剂、调味剂、粘合剂、成膜聚合物、抗氧化剂、光稳定剂、自由基清除剂、表面活性剂、pH调节剂、药物络合剂和抗微生物攻击的稳定剂中的至少一种。
本发明的第三方面，提出了一种共无定型的尼达尼布-甘草次酸复方制剂的制备方法，包括以下步骤；
取尼达尼布、尼达尼布盐中的至少一种和甘草次酸溶解于溶剂中，然后通过喷雾干燥制得。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述溶剂为混合溶剂，所述混合溶剂选自二氯甲烷、水、丙酮、甲醇和乙醇，混合溶剂的使用可在提高固含量的同时使溶剂残留降低；优选地，尼达尼布与甘草次酸的质量比为0.1～10：1。混合溶剂是指两种及以上的溶剂混合形成。
本发明的第四方面，提出了上述的尼达尼布-甘草次酸复方制剂、上述的药物复方制剂或根据上述的制备方法制得的共无定型的尼达尼布-甘草次酸复方制剂在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
在本发明的一些优选的实施方式中，肺纤维化为放射性肺纤维化、药物性肺纤维化、细菌性肺纤维化、病毒性肺纤维化或其他肺纤维化等。所述肺纤维化形成的病变为人胚肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞、人肺二倍体细胞系等异常增殖引起。优选地，所述肺纤维化形成的病变为人胚肺成纤维细胞异常增殖引起。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中不同浓度乙磺酸尼达尼布对人胚肺成纤维细胞(HFL1)增殖抑制影响图；
图2为本发明实施例1中不同浓度的甘草次酸对人胚肺成纤维细胞(HFL1)增殖抑制影响图；
图3为本发明实施例1中不同浓度的乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对人胚肺成纤维细胞(HFL1)增殖抑制影响图；
图4为本发明实施例1中乙磺酸尼达尼布、甘草次酸、乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对人胚肺成纤维细胞的抑制形态图；
图5为本发明实施例1中乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞增殖抑制影响图；
图6为本发明实施例1中乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中α-SMA、Col-I蛋白表达条带；
图7为本发明实施例1中乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中α-SMA蛋白表达水平的影响图；
图8为本发明实施例1中乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中Col-I蛋白表达水平的影响图；
图9为本发明实施例2中尼达尼布-甘草次酸的共无定型物的XRPD图；
图10为本发明实施例4中乙磺酸尼达尼布-甘草次酸的共无定型物的XRPD图；
图11为本发明实施例5中尼达尼布-甘草次酸的共无定型物与物理混合的对照组在纯水介质中尼达尼布的溶出测量对比图；
图12为本发明实施例5中尼达尼布-甘草次酸的共无定型物与物理混合的对照组在纯水介质中甘草次酸的溶出测量对比图；
图13为本发明实施例6中中甘草次酸共无定型物的XRPD图；
图14为本发明实施例6中尼达尼布共无定型物的XRPD图；
图15为本发明实施例6中的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物及在40℃/75％相对湿度环境下放置60天的XRPD图；
图16为本发明实施例6中尼达尼布共无定型物和甘草次酸共无定型物的物理混合物及在 40℃/75％相对湿度环境下放置3天的XRPD图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的实验材料如下：
细胞：人胚肺成纤维细胞(HFL1)
主要药品和试剂：乙磺酸尼达尼布(NE，购自芜湖诺威化学技术有限公司)，尼达尼布 (购自芜湖诺威化学技术有限公司)，甘草次酸(GA，购自西亚化学科技(山东)有限公司)，胎牛血清(购自美国Gibco公司)，DMEM(培养基，购自HyClone公司)，青链霉素混合液(100X)(购自北京索莱宝科技有限公司公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)(购自北京索莱宝科技有限公司公司)，CCK-8(细胞增殖检测试剂盒，购自美国艾克索生物科技股份有限公司)，RIPA组织细胞快速裂解液(beyotime)，BCA蛋白定量试剂盒(beyotime)， 1.0MTris-HCl,pH＝8.8电泳缓冲(solarbio)，1.0M Tris-HCl,pH＝6.8电泳缓冲(solarbio)，TEMED(solarbio)，4*蛋白上样缓冲液(solarbio)，蛋白预染Marker(Fermentas)，NC 膜(硝酸纤维素膜)，发光液(Millipore)，TGF-β1(PeproTech)，α-SMA(proteintech)， CollagenI(proteintech)，GAPDH(CST)，羊抗鼠HRP标记二抗(碧云天)，羊抗兔HRP 标记二抗(碧云天)。
主要仪器：离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)，细胞培养耗材(TRUELINE)，生物安全柜(苏州金净净化设备公司)，CO2恒温培养箱(赛默飞世尔科技公司)，显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，电泳仪(BIO －RAD公司)，电转仪(大连竞迈科技有限公司)，酶标仪(芬兰雷勃酶标仪)，成像系统 (TanonTanon-5200)。
X-射线粉末衍射(XRPD)使用荷兰帕纳科锐影X射线粉末衍射仪(PW3040/60)进行，采用Cu-Kα辐射，波长
Figure BDA0002988655640000051
Ni滤波片；入射光路：发散狭缝FDS 1/8°，避光框Mask 5mm，防散射狭缝FDS 1/4°；衍射光路：防散射狭缝P7.5，X射线光管电压45kV，X射线光管电流40mA，扫描范围2-40°(2θ)，步长0.0260°，每步扫描时间36.4650s。将样品平铺于样品盘进行测试。数据采集软件X’Pert Data Collector，数据查看软件HighScore Plus。
实施例1：乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂的体外细胞实验
1.1人胚肺成纤维细胞传代培养
收到贴壁细胞后，用75％酒精擦拭细胞培养瓶表面，将培养瓶在37℃，5％CO2的培养箱内静置4h，镜下观察记录细胞状态，转移至安全柜中更换新鲜培养基继续培养，培养7天左右至细胞密度达80％后，进行传代培养；
传代细胞从第三代开始可以将完全培养液换为含小牛血清的完全培养液培养，隔天换一次培养液，人胚肺成纤维细胞至少可以传十五代，取生长良好的一代细胞进行后续实验。
1.2CCK8法检测乙磺酸尼达尼布、甘草次酸、乙磺酸尼达尼布-甘草次酸对HFL1细胞的细胞毒性作用，其中乙磺酸尼达尼布-甘草次酸为乙磺酸尼达尼布(NE)与甘草次酸(GA) 直接混合联用。
(1)取对数生长期人胚肺成纤维细胞用含10％胎牛血清，1％双抗(青链霉素混合液) 的DMEM高糖培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察细胞为贴壁细胞，台盼蓝染色活细胞率达95％以上。
(2)将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化，显微镜下计数后制成1～5×104个细胞/mL 的细胞悬液。分别取100μL至96孔培养板，每组细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，1～ 5×103个细胞/孔，以100μL培养液做空白对照，37℃培养过夜。
(3)每块板设置以下分组：空白作为对照组，药物乙磺酸尼达尼布浓度为：0、0.001、0.01、0.1、1、5μM；药物甘草次酸浓度为：0、5、10、20、40、80、120μM，每孔100μL；药物乙磺酸尼达尼布-甘草次酸组：0、0.01μM NE/40μM GA、0.1μM NE/40μM GA、0.1μM NE/120μMGA、1μM NE/120μM GA。
(4)分别在转染72h后，按1:10体积比混合Cell Counting Kit-8(CCK-8)和无血清必需基本培养基，每孔100μL加入待测孔中，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h；
(5)用酶标仪测定450nm波长吸光度。记录每块板的数值。
(6)细胞增殖率*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100
其中：A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度；
A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；
A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
细胞毒性实验结果：
(1)图1示出了不同浓度乙磺酸尼达尼布对人胚肺成纤维细胞(HFL1)增殖抑制影响图，从图中可以看出，CCK-8法检测浓度为0.001μM-1μM的乙磺酸尼达尼布对HFL1的正常增殖无影响，这一结果表明0.001μM-1μM实验浓度的乙磺酸尼达尼布对HFL1无细胞毒性，浓度为5μM的乙磺酸尼达尼布稍微降低了HFL1的增殖活力。
(2)图2示出了不同浓度的甘草次酸对人胚肺成纤维细胞(HFL1)增殖抑制影响图，从图中可以看出，CCK-8法检测浓度为5μM-120μM的甘草次酸对HFL1的正常增殖无影响，这一结果表明实验浓度的甘草次酸对HFL1无细胞毒性。相较于乙磺酸尼达尼布，甘草次酸在高浓度时对HFL1增殖活力的影响仍然较低，说明甘草次酸对细胞毒性的影响远低于乙磺酸尼达尼布。
(3)图3示出了不同浓度的乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对人胚肺成纤维细胞 (HFL1)增殖抑制影响图，从图中可以看出，CCK-8法检测浓度为0.01μM乙磺酸尼达尼布/40μM甘草次酸-1μM乙磺酸尼达尼布/120μM的甘草次酸对HFL1的正常增殖无影响，这一结果表明实验浓度的乙磺酸尼达尼布-甘草次酸对HFL1无细胞毒性，联用甘草次酸后，使用高浓度的复方制剂时HFL1仍然具有较高的增殖活力，利于同等药效剂量下降低尼达尼布的副作用。
1.3CCK8法检测乙磺酸尼达尼布、甘草次酸、乙磺酸尼达尼布-甘草次酸对TGF-β1诱导的HFL1细胞增殖的抑制作用
(1)HFL1细胞用含10％胎牛血清，1％双抗(青链霉素混合液)的DMEM/F12高糖培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察细胞为贴壁细胞，台盼蓝染色活细胞率达95％以上.
(2)将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化，显微镜下计数后制成1～5×104个细胞/ml 的细胞悬液。分别取100μL至96孔培养板，每组细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔， 1～5×103个细胞/孔，以100μL培养液(DMEM/F12+10％血清)做空白对照，37℃培养过夜。
(3)分别加样：空白对照组(正常培养基)、模型组(含5ng/mL TGF-β1培养基)、药物组(0.01μM NE+5ng/mL TGF-β1、0.1μM NE+5ng/mL TGF-β1、1μM NE+5ng/mL TGF-β1、80μMGA+5ng/mL TGF-β1、0.01μM NE+80μM GA+5ng/mL TGF-β1、0.1μM NE+80 μM GA+5ng/mLTGF-β1、1μM NE+80μM GA+5ng/mL TGF-β1)；
(4)在处理24h、48h后，按1:10体积比混合Cell Counting Kit-8(CCK-8)和无血清必需基本培养基(DMEM/F12培养基)，每孔100μL加入待测孔中，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h；
(5)用酶标仪测定450nm波长吸光度。记录每块板的数值。
细胞增殖抑制实验结果：
图4示出了乙磺酸尼达尼布、甘草次酸、乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对人胚肺成纤维细胞的抑制形态图，其中A表示人胚肺成纤维细胞正常生长形态图，B表示加入5ng/mL TGF-β1后人胚肺成纤维细胞异常增殖形态图，C表示异常增殖后加入0.1μM乙磺酸尼达尼布后人胚肺成纤维细胞增殖抑制形态图，D表示异常增殖后加入80μM甘草次酸后人胚肺成纤维细胞增殖抑制形态图，E表示异常增殖后加入0.1μM乙磺酸尼达尼布-80μM甘草次酸复方制剂后人胚肺成纤维细胞增殖抑制形态图。从图中可以看出，加入5ng/mL TGF-β1后，B 图细胞异常增殖明显，诱导剂造模成功，C图和D图单用0.1μM乙磺酸尼达尼布或单用80μM 甘草次酸均能一定程度抑制细胞异常增殖，而E图联用0.1μM乙磺酸尼达尼布-80μM甘草次酸效果明显，细胞异常增殖抑制明显，结果表明实验浓度的乙磺酸尼达尼布-甘草次酸对 HFL1细胞病理性增殖有增强抑制的效果。
图5示出了乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞增殖抑制影响图，图中“+”表示添加相应的物质，“-”表示未添加相应的物质，*P＜0.05。从图中可以看出：CCK8检测5ng/mL TGF-β1诱导的HFL1细胞增殖与空白对照组有显著性差异；培养24h和48h差异不显著。CCK8检测0.01μM、0.1μM、1μM乙磺酸尼达尼布分别配伍80μM甘草次酸后对5ng/mL TGF-β1诱导的HFL1细胞增殖抑制率有影响，在加入相同剂量乙磺酸尼达尼布的情况下，未添加GA的单方组细胞相对增殖率均高于添加GA的复方制剂组，这一结果表明实验浓度的乙磺酸尼达尼布-甘草次酸对HFL1细胞病理性增殖有增强抑制的效果。
1.4Western Blot检测乙磺酸尼达尼布、甘草次酸、乙磺酸尼达尼布-甘草次酸对TGF-β1 诱导的HFL1细胞中α-SMA蛋白和Collagen I蛋白表达的影响
(1)细胞准备：将处于对数生长期的HFL1细胞接种于96孔培养板中，1～5×103个细胞 /孔，37℃，5％CO2培养箱培养过夜，正常对照组加入新鲜培养基，其他各组加入含5ng/mL TGF-β1的新鲜培养基，在37℃，5％CO2培养箱中孵育0.5h后，给药组分别加入0.1μMNE、 80μM GA、0.1μM NE+80μM GA，继续培养24h。
(2)蛋白提取(全程低温操作)
将上述细胞从培养箱中取出，吸去培液，适量预冷的1×PBS洗涤2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5mL EP管中，95℃以上加热10分钟，12000g离心10分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
(3)蛋白定量
①标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表1加入试剂。
表1标准曲线绘制使用试剂
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8
蛋白标准液(μL) 0 2 4 6 8 12 16 20
去离子水(μL) 20 18 16 14 12 8 4 0
蛋白浓度(μg/μL) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5
②根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；
③各孔加入160μL BCA工作液；
④把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度(μg/μL)为纵坐标，绘出标准曲线；
⑤在酶标板中加入2μL待测蛋白和18μL PBS，加入160μL BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。
⑥根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(μg/μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。
(4)PAGE胶的制备
①下层分离胶的制备
根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。本实验中α-SMA分子量43kDa，Collagen I分子量139kDa，GAPDH分子量37kDa，故选用10％的胶。10％的分离胶按下表2进行配制，待下层胶凝固后进行上层浓缩胶的配制。
表2下层胶的组分配方
组分 10％凝胶
去离子水 4.0mL
30％丙烯酰胺 3.3mL
1.5M Tris-HCl分离胶缓冲液(pH 8.8) 2.5mL
10％SDS 0.1mL
10％过硫酸铵 0.1mL
TEMED 0.004mL
②上层浓缩胶的配制
根据需要按下表3配制浓缩胶，并插好梳子。
表3下层浓缩胶的配方
Figure BDA0002988655640000101
Figure BDA0002988655640000111
(5)上样及电泳
①上样
每孔上样量约为细胞/25μg(组织50μg)蛋白，可以根据实验要求加大上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10min后离心取上清上样。将配制好的 PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。
②电泳
一般浓缩胶80V 20分钟，分离胶120V 60分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。
(6)转膜
转膜分为湿转和半干转，本实验室选用半干转。
半干式转膜中，三明治的排列为：/虑纸/胶/膜/虑纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48mM Tris,39mM glycine,0.04％SDS,20％甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将 PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分钟(NC膜在电转液中浸泡10-20分钟)，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形。
(7)膜上蛋白的检测
为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，丽春红染色工作液：2％的丽春红贮备液1：10 稀释，即加9倍的ddH2O。
染色方法：将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，(膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色)PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。
(8)膜的封闭及抗体孵育
①封闭：5％脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭1小时或4℃过夜。
②一抗：根据说明书α-SMA 1:5000 Collagen I 1:5000 GAPDH 1:2000稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2小时或4℃孵育过夜。
③二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。
(9)显色
ECL化学发光检测：配制ECL发光液，根据用量，取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液，用纸小心吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸。将其放入成像系统中进行扫描。可以根据条带强弱再次感光或减短感光时间以达到理想结果。
蛋白表达实验结果：图6示出了乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中α-SMA、Col-I蛋白表达条带，图7示出了乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中α-SMA蛋白表达水平的影响图，其中*P＜0.05，图8示出了乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中Col-I 蛋白表达水平的影响图，其中*P＜0.05。从图6至8中的Western blot结果显示，与空白组细胞组表达量相比，模型组HFL1表达的α-SMA和Col-I蛋白显著增高，分别为空白组的401.9％和257.6％；乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂组(NE+GA组)α-SMA和Col-I蛋白的表达量分别为空白组的260.7％和126.0％，因此乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂组对蛋白异常表达的抑制作用分别为141.2％和131.6％。乙磺酸尼达尼布单方组(NE组)表达的α-SMA 和Col-I蛋白分别为空白组的344.9％和170.5％，对蛋白异常表达的抑制作用分别为57.0％和 32.5％，甘草次酸单方组(GA组)表达的α-SMA和Col-I蛋白分别为空白组的369.4％和 237.4％，对蛋白异常表达的抑制作用分别为87.1％和20.2％。根据蛋白表达量的数据和蛋白异常抑制表达的数据来看，乙磺酸尼达尼布单方组(NE组)和甘草次酸单方组(GA组)均能一定程度上抑制TGF-β1诱导的HFL1中α-SMA和Col-I蛋白表达增高，但是在与各单方组剂量相同的情况下，乙磺酸尼达尼布-甘草次酸复方制剂组对蛋白异常表达的抑制作用 (141.2％和131.6％)明显优于乙磺酸尼达尼布单方组对蛋白异常表达的抑制作用(57.0％和32.5％)和甘草次酸单方组对蛋白异常表达的抑制作用(87.1％和20.2％)之和，实验结果显示尼达尼布与甘草次酸联合用药时具有一定的协同作用，联合使用后的复方制剂具有更优的效果，同时甘草次酸的安全性明显高于乙磺酸尼达尼布，联用时还可以实现降低剂量，减毒高效。
实施例2：尼达尼布-甘草次酸的共无定型物的制备
2.1混合溶剂的选择：
按质量比为2:1称取尼达尼布和甘草次酸共12mg，分别逐步加入下表中二类溶剂和三类溶剂(来源2020版本中国药典溶剂残留规定)室温超声直至溶清，进行室温溶解度测试，溶剂加入量上限为40mL，测试结果见下表4。
表4不同溶剂下溶解度测定结果
Figure BDA0002988655640000131
测试结果显示尼达尼布和甘草次酸的混合物在二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃和乙醇中的溶解度较优，其中乙醇为三类溶剂(溶残限度0.5％)，甲醇虽然为二类溶剂，但溶残限度为0.3％，二氯甲烷的限度较低为0.06％。综合考虑溶解度、溶残限度、沸点(优选低沸点溶剂以提高相同喷雾干燥温度下的产能)因素，决定选择二氯甲烷和甲醇，或二氯甲烷和乙醇的混合溶剂作为实验用溶剂，混合溶剂中二氯甲烷的占比不大于50％。
2.2共无定型物的制备
按质量比为2:1称取尼达尼布和甘草次酸共360mg，加入乙醇和二氯甲烷(4:1体积比) 混合溶剂16mL室温超声形成溶液。
上述溶液通过配备了惰性循环B295的Büchi微型喷雾干燥机B290(
Figure BDA0002988655640000132
Labortechnik AG,瑞士)喷雾干燥分离。高性能的旋风分离器用于分离，圆底接收瓶安装到旋风分离器，用于产品收集。喷雾干燥过程的参数设置如下表5所示：
表5实施例2中喷雾干燥过程的参数
参数 设置值
抽吸力 40kg/h
进口温度 100℃
出口温度 65℃
进样速率 8mL/min
雾化气流 0.5kg/h
惰性回路冷却温度 -10℃
取喷雾干燥制得的产品用XRPD确定物理状态，结果如图9所示。图9中显示为弥散峰，未显示出尖锐衍射峰，证实了该产品为无定型。
实施例3
本实施例提供一种尼达尼布-甘草次酸的共无定型物，按照以下步骤制备：
按质量比为2:1称取尼达尼布和甘草次酸共300mg，加入甲醇和二氯甲烷(2:1体积比) 混合溶剂10mL室温超声形成溶液。
上述溶液通过配备了惰性循环B295的Büchi微型喷雾干燥机B290(
Figure BDA0002988655640000142
Labortechnik AG,瑞士)喷雾干燥分离。高性能的旋风分离器用于分离，圆底接收瓶安装到旋风分离器，用于产品收集。喷雾干燥过程的参数设置如下表6所示：
表6实施例3中喷雾干燥过程的参数
Figure BDA0002988655640000141
Figure BDA0002988655640000151
取喷雾干燥制得的产品用XRPD确定物理状态，显示为无定型。
实施例4：乙磺酸尼达尼布-甘草次酸的共无定型物的制备
按尼达尼布和甘草次酸质量比为2:1称取乙磺酸尼达尼布和甘草次酸共1.25g，加入甲醇和二氯甲烷(1:1体积比)混合溶剂30mL室温超声形成溶液。将该溶液转移至圆底烧瓶中， 45℃真空减压快速旋蒸制备得到固体。取得到的固体用XRPD确定物理状态，图10中显示为弥散峰，未显示出尖锐衍射峰，证实了该产品为无定型。
实施例5：尼达尼布-甘草次酸的共无定型物的溶出实验
使用溶出仪对实施例2中制得的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物进行溶出测试，以尼达尼布和甘草次酸(2:1质量比)的物理混合物作为对照组。实验过程为：溶出介质为500mL 的纯水，温度保持在37℃±0.5℃，调节转浆转速为50转/分钟。从加入所测物质至溶出杯后开始计时，分别于5、10、15、20、30、45、60min取样5mL(同时补加等量等温的溶出介质)，滤过(0.45μm微孔滤膜)，作为供试品溶液。使用紫外分光光度计在波长287nm检测尼达尼布吸光度，按外标法以紫外吸收计算每份样品在不同时间的释放，每组平行测试3次结果取平均值。使用紫外分光光度计在波长250nm检测甘草次酸吸光度，按外标法以紫外吸收计算每份样品在不同时间的释放，每组平行测试3次结果取平均值。
图11示出了尼达尼布-甘草次酸的共无定型物与物理混合的对照组在纯水介质中尼达尼布的溶出测量对比图，图12示出了尼达尼布-甘草次酸的共无定型物与物理混合的对照组在纯水介质中甘草次酸的溶出测量对比图。实验结果显示，在纯水介质中，本发明提供的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物中尼达尼布5分钟的释放度是对照组的至少10倍，10分钟的释放度是对照组的至少15倍，60分钟的释放度达到89％；本发明提供的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物中甘草次酸5分钟的释放度是对照物的6倍，10分钟的释放度是对照物的至少 11倍，60分钟的释放度达到86％。
实验结果说明本发明提供的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物溶解度和溶出速度与尼达尼布和甘草次酸的物理混合物相比，有着非常显著的提高，该提高有助于在联合施用药物时，改善药物在体内的吸收，进一步提高生物利用度，并减小高剂量带来的副作用或剂量不耐受。
实施例6：尼达尼布-甘草次酸的共无定型物的物理稳定性实验
对比例1：对比例1提供一种甘草次酸无定型物，按照以下步骤制备：称取1g甘草次酸，加入40mL甲醇室温超声形成溶液。得到的溶液通过配备了惰性循环B295的Büchi微型喷雾干燥机B290(
Figure BDA0002988655640000161
Labortechnik AG,瑞士)喷雾干燥分离。高性能的旋风分离器用于分离，圆底接收瓶安装到旋风分离器，用于产品收集。喷雾干燥过程的参数设置如下表7所示：
表7对比例1中喷雾干燥过程的参数
参数 设置值
抽吸力 40kg/h
进口温度 85℃
出口温度 61℃
进样速率 5mL/min
雾化气流 0.5kg/h
惰性回路冷却温度 -10℃
取对比例1中喷雾干燥制得的产品用XRPD确定物理状态，结果如图13所示，图13中显示为弥散峰，未显示出尖锐衍射峰，说明该产品为无定型。
对比例2：对比例2提供一种尼达尼布无定型物，按照以下步骤制备：称取80mg尼达尼布加入至球磨罐中，通过机械球磨的方式球磨15分钟(频率15次/秒)。然后用XRPD确定物理状态，结果如图14所示，图14中显示为弥散峰，未显示出尖锐衍射峰，说明该产品为无定型。
取对比例2的尼达尼布无定型物和对比例1中的甘草次酸无定型物按照质量比2:1配制成物理混合物，然后取该物理混合物、实施例2中的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物分别分装到玻璃小瓶中，并在无盖的情况下将其置于40℃/75％相对湿度的药物稳定性试验箱内保存，以测试随时间的物理稳定性。在3天、7天、14天、30天、60天的时间点进行XRPD采样，使用上述XRPD方法获得衍射图。
图15示出了实施例2中的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物及在40℃/75％相对湿度环境下放置60天的XRPD图，图16示出了尼达尼布无定型物和甘草次酸无定型物的物理混合物及在40℃/75％相对湿度环境下放置3天的XRPD图，从图15和16中可以看出，在整个研究过程中，本发明提供的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物在60天的时间内始终保持完全非晶态，即没有显示出衍射峰，而尼达尼布无定型物和甘草次酸无定型物的物理混合物在3天的时间内即出现了明显的结晶态，显示出尖锐衍射峰，实验结果表明，本发明提供的尼达尼布- 甘草次酸的共无定型物的物理稳定性与尼达尼布无定型物和甘草次酸无定型物的物理混合物 (2:1质量比)，有显著提高。无定型物理混合物在3天的时间内即转变为结晶态，成药性较差，而本发明提供的尼达尼布-甘草次酸的共无定型物有较好的稳定性，使得其成药后的稳定存储成为可能。
可以理解的是，可以将尼达尼布-甘草次酸复方制剂与药学中常用的载体或辅料结合使用，载体或辅料的选择可以根据实际需求进行调整。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种治疗肺纤维化的尼达尼布-甘草次酸复方制剂，其特征在于，由尼达尼布、尼达 尼布盐中的至少一种与甘草次酸组成的混合原料制成，所述尼达尼布盐为尼达尼布与酸形 成的盐，所述尼达尼布的化学结构为
Figure 388237DEST_PATH_IMAGE001
，所述酸为酸度系数pKa不大于 6.9的酸；所述尼达尼布-甘草次酸复方制剂中，尼达尼布的浓度为0.01～1μM，甘草次酸的 浓度为40～120μM。
2.根据权利要求1所述的尼达尼布-甘草次酸复方制剂，其特征在于，所述尼达尼布-甘草次酸复方制剂由乙磺酸尼达尼布与甘草次酸的混合原料制成。
3.根据权利要求1至2任一项所述的尼达尼布-甘草次酸复方制剂，其特征在于，所述尼达尼布-甘草次酸复方制剂为共无定型物。
4.一种治疗肺纤维化的药物复方制剂，其特征在于，包括根据权利要求1至3任一项所述的尼达尼布-甘草次酸复方制剂，以及至少一种药学上可接受的载体或辅料。
5.根据权利要求4所述的药物复方制剂，其特征在于，所述载体为固态载体、液体载体、气体载体中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的药物复方制剂，其特征在于，所述固态载体选自乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的药物复方制剂，其特征在于，所述液体载体选自糖浆、花生油、橄榄油和水中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的药物复方制剂，其特征在于，所述气体载体选自二氧化碳和氮气中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的药物复方制剂，其特征在于，所述药物复方制剂为口服剂型。
10.根据权利要求4所述的药物复方制剂，其特征在于，所述辅料选自润滑剂、填充剂、崩解剂、增塑剂、着色剂、乳化剂、调味剂、粘合剂、成膜聚合物、抗氧化剂、光稳定剂、自由基清除剂、表面活性剂、pH调节剂、药物络合剂和抗微生物攻击的稳定剂中的至少一种。
11.权利要求1至3任一项所述的尼达尼布-甘草次酸复方制剂或权利要求4至10任一项所述的药物复方制剂在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
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