KR20180004816A - Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 gata-3 저해제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것으로서, 상기 환자는 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 DNA자임 (DNAzymes)에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 (blood eosinophil count) 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 (fractional expiratory nitric oxide) 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.
만성 염증은 날로 증가하는 의학적 문제 분야로서 높은 사회경제적 중요성을 갖는다. 여기에는 구체적으로 다음과 같은 질병 그룹이 포함된다: 자가면역 질환 및 류마티스 질환 분야의 질환 (피부, 폐, 신장, 혈관계, 신경계, 결합 조직, 운동계, 내분비계에서 나타남), 직접형 알레르기 반응 및 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 동맥경화증, 건선 및 접촉성 습진 및 장기 및 골수 이식 후의 만성 거부 반응. 이러한 질병 중 대부분은 지난 수십 년간 선진국뿐만 아니라 부분적으로는 전세계에서 확산되고 있다. 예를 들면, 유럽, 북아메리카, 일본 및 호주에서는 인구의 20% 이상이 알레르기성 질환 및 천식을 앓고 있다. 만성 폐쇄성 폐질환은 현재 전 세계적으로 다섯 번째로 많이 발생하는 사망 원인일 뿐만 아니라 WHO의 산출에 따르면 2020년에는 세 번째로 빈번하게 발생하는 질병이 될 것으로 보인다. 동맥경화증과 이에 따른 질병인 심장마비, 뇌졸중 및 말초 동맥 질환은 전 세계적으로 이환율 (morbidity) 및 사망률 (mortality) 통계를 이끌고 있다. 건선 및 접촉성 습진은 일반적으로 신경피부염과 더불어 피부에서 가장 빈번하게 발생하는 만성 염증 질환이다.
천식은 일반적인 기도의 만성 염증 질환이고, 다양한 기도 폐쇄, 점액 과다-분비, 기도 염증 및 증가된 기도 과민반응을 포함한다. 선천적 및 후천적 면역 반응의 조절장애가 상기 질환의 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. 다양한 임상적 표현형과 병태생리학적 엔도타입의 정의를 유도하는 상이한 환자 집단 간에 고도의 개체간 이질성이 확인되었다.1 최선으로 연구된 병태생리학적 천식 상태는 T-헬퍼 (TH)-2 유도된 (알레르기) 반응이고,2 ,3 이는 또한 "TH2 분자 엔도타입"이라고 한다4 ,5.
천식 환자의 약 절반은, 질병의 중증도와 관계없이, 상기 TH2 엔도타입을 나타내고, 이는 IL-4, IL-5, 및 IL-13과 같은 시토킨을 생성하는 TH2 세포의 주된 활성화를 특징으로 한다. 모든 상기 TH2 시토킨의 발현 및 생성은 징크 핑거 전자 인자 (zinc finger transcription factor) GATA-3에 의해 결정적으로 조절되고, 이는 TH2 세포 분화 및 활성화에 필수적이고, 면역 활성화의 타입 2 (TH2) 경로의 마스터 전사 인자로 간주된다6. GATA-3은 주로 나이브 (naive) CD4+ T 세포의 TH2 세포로의 분화를 담당한다. 상기 과정에서, 상기 TH2 세포 분화는 주로 2개의 시그날 전달 경로인, T 세포 수용체 (TZR) 및 IL-4 수용체 경로에 의해 조절되고: TZR로부터 전달된 시그날은 TH2 세포-특이적 전사 인자 cMaf 및 GATA-3뿐만 아니라 전사 인자 NFAT 및 AP-1을 활성화시킨다. 상기 IL-4 수용체의 활성화는 상기 IL-4 수용체의 세포질 도메인 상에 STAT6의 결합을 유도하고, 여기서 상기는 Jak1 및 Jak3 키나제에 의해 포스포릴화된다. 그 일부에 대한 포스포릴화에 의해 이량체화 및 STAT6의 핵 (nucleus)으로의 전좌 (translocation)를 유도하고, 여기서 STAT6은 GATA-3 및 다른 유전자의 전사를 활성화시킨다. GATA-3은 TH1 세포가 아닌 성숙한 TH2 세포에서 독점적으로 발현되는 징크 핑거 전사 인자이다. GINA 지침에 따라 최적의 치료에도 불구하고 중증 천식 환자의 기관지폐포 세척 시료 및 폐 생검에서 GATA-3 과발현이 관찰되었다7. 그러므로, 상기 면역 네트워크는 유망한 치료 표적이다. 이미 승인된 항-IgE 모노클로날 항체 이외에도, 전사 인자 GATA-3의 하류에 있는 개별 성분을 표적으로 하는 몇가지 새로운 치료제가 개발 중에 있다8.
대안의 접근법은 전략적인 전사 인자 GATA-3을 직접적으로 표적으로 하여 모든 하류 분자/시토킨을 동시에 방해한다. 만성 염증 질환을 앓고 있는 환자의 분자 표현형을 결정하고 및 환자를 "TH2 high" 및 "TH2 low" 하위그룹으로 계층화하기 위해 GATA-3 발현이 분석되었고, "TH2 high" 환자를 GATA-3 특이적 불활성화제 (inactivators)로 치료하는 것이 제안되었다 (WO 2014/040891). GATA-3은 세포내에서만 발현되기 때문에, 인 비보 세포-침투 능력을 갖는, GATA-3-특이적 DNA자임과 같은 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 개발되었다 (WO 2005/033314).
알레르기성 천식과 같은 만성 염증 질환에서, 적절한 치료 계획을 확인하는 과제는 더욱 복잡하다. 알레르기 반응에서, 호산구의 수가 증가하여, 특정 환자에서 호산구증가증을 일으키는 것이 알려져 있다. 그러나, 호산구는 또한 GATA-3을 발현시키는 것이 알려져 있고 (Zon et al., Blood 81 (1993) 3234-3241), GATA-3의 발현은 T-세포에 제한되지 않기 때문에, GATA-3의 발현은 또한 호염기구 (basophils), 비만 세포 (mast cells) 및 상피 세포 (epithelial cells)에서 확인될 수 있다. GATA-3은 만성 염증 질환, 구체적으로 알레르기성 천식의 면역병인 (immunopathogenesis)에서 중요한 역할을 한다. 알레르겐에 의한 급성 감작 및 챌린지 (challenges)는, 림프구의 최소 보충과 함께, 기도내 호산구 축적의 정도가 매우 높고 (Paul Justice et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282 (2002) L302-L309), 알레르겐 챌린지는 폐 호산구에서 GATA-3 및 GATA-3 반응 유전자의 발현을 유도한다고 개시하였다. 요약하면, 이는 호산구가 염증 반응에 대해 긍정적인 피드백을 제공할 수 있다고 가정하였다. 대조적으로, 알레르기성 천식과 같은 만성 알레르기성 기도 염증에서, 인간 폐 조직에서 GATA-3 포지티브 세포의 60-90%는 CD3-포지티브 T 세포이고, 단지 15% 미만의 세포가 호산구로 확인되었다 (Nakamura et al., J Allergy Clin Immunol 103 (1999) 215-222). 그러므로, 인간 천식에서, GATA-3-반응성 유전자의 호산구 발현은 기도 염증을 일으키는 전염증성 (proinflammatory) 시토킨의 주요 근원은 아니라는 결론을 내렸지만, 만성 염증 과정을 지원하기 위한 TH2 시토킨의 풍부한 근원을 제공할 수도 있다 (Paul Justice et al., loc. cit.).
그러므로, TH2 세포에서 GATA-3은 알레르기성 천식과 같은 알레르기 장애의 사례에서 치료적 개입을 위한 매력적인 표적인 것으로 보이고, 이는 GATA-3을 발현하는, 호산구의 동시 존재가 어떠한 영향을 미치는지, 이러한 치료 접근법의 성공 여부에 대해 전혀 알려져 있지 않다. 또한 이러한 접근법으로부터 혜택을 얻는 특정 환자 집단을 동정할 수 있는지 여부를 전혀 예측할 수 없다.
그러므로, 알레르기성 천식 환자에 대한 신규하고 효율적인 치료법을 개발해야 한다는 여전히 많은 요구가 있다. 특정 GATA-3 저해제의 투여로부터 구체적으로 혜택을 얻는 특정 환자 집단의 동정에 기반하여, 본 출원에서 제시된 해결책은 지금까지는 알려져 있지 않았고, 당분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 기대될 수 없었다.
본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 특정 하위집단의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것이다.
그러므로, 제1 양태에서, 본 발명은, 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한, GATA-3의 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.
제2 양태에서, 본 발명은 Th2-유도된 천식, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 각각 4% 또는 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 방법은 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 GATA-3에 대한 DNA자임을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 연구 설계 및 순서도를 나타낸다. 도 1a는 연구 설계 및 주요 연구 절차의 개요를 보여준다. 도 1b는 상기 분석에 등록되고 포함된 환자 수를 요약하였다. SB010 그룹의 21명의 환자가 모든 연구 평가를 완료하였고, 1명의 환자는 치료 전 및 치료 후 알레르겐 챌린지에서 상이한 알레르겐 용량의 투여로 인해서 평가 대상이 되지 못했다. 플라시보 그룹에서, 2명의 환자는 평가 대상이 되지 못했다 (1명은 알레르겐 챌린지 중에 SABA를 필요로 했고; 1명은 치료 전과 치료 후 알레르겐 챌린지에서 다른 알레르겐 용량이 투여되었다). 그러므로, SB010 그룹의 평가가능한 환자 21명과 플라시보 그룹의 평가가능한 환자 19명이 상기 연구를 완료했다"*": 상기 플라시보 그룹에서, 알레르겐 유발하고 4시간 후에 연속 폐활량측정 (serial spirometry)이 의도하지 않게 중단되었기 때문에 1명 환자의 LAR 데이터가 누락되었다.
도 2는 치료전 및 치료 4주 후 알레르겐 챌린지 후에 폐 기능의 변화를 보여주었다. 도 2a: 알레르겐 챌린지 후에 기준 FEV1의 백분율로 FEV1 수준이 개시되었다. 알레르겐 챌린지는 치료 전 () 및 4주 치료 기간의 완료 후 ()에 수행되었다. 폐 기능이 알레르겐 챌린지 후 7시간 동안 기록되었다. 치료 그룹 당 평균 값 +/- SEM으로 나타내었다. SB010에 의한 치료 (▲)는, 플라시보 (■)와 비교하여, 초기 단계 천식 반응 (P=0.04, Wilcoxon 순위 합 검정)뿐만 아니라 후기 단계 천식 반응 (P=0.02, ANCOVA)을 현저하게 감쇠시켰다. 전체적인 상기 연구 그룹에 대한 결과가 도 2a에 개시되었고; 혈중 호산구 ≥ 4% (도 2b) 및 FeNO ≥ 40ppb (도 2c)를 갖는 사전-지정된 하위그룹이 개시되었다. 혈중 호산구 및 FeNO 수준이 무작위 배정 전에 측정되었다. 하위그룹은 12명의 SB010/12명의 플라시보 환자로 구성되고, 여기서 상기 SB010 그룹의 9명의 환자 및 플라시보 그룹의 11명의 환자가 양쪽 하위그룹에 존재한다. EAR 및 LAR 둘 다가 혈중 호산구 ≥ 4% 하위그룹 (각각 P=0.02 및 P=0.05) 및 FeNO ≥ 40 ppb 하위그룹 (각각 P=0.02 및 P=0.05)에서 현저하게 향상되었다. 알레르겐 챌린지 후에 처음 1시간 동안 스프레드 X-축이 확대되어 있다는 것에 주의한다. 도 2b: 폐 기능이 경시적으로 기준 FEV1의 백분율로 표시된다. 각각 혈중 호산구 ≥ 3 %, ≥ 4 % 및 ≥ 5 %인 3개의 하위 그룹에 대해 SB010 및 플라시보 치료에 대한 개별의 치료 전 및 치료 후 곡선이 개시되었다. 치료 그룹 당 평균 값 +/- SEM으로 나타내었다. 삽입된 네모는 초기 단계 반응 (좌측 네모) 및 후기 단계 반응 (우측 네모)에 대해 플라시보와 비교하여, SB010 치료 그룹에서 FEV1 곡선 아래 면적 (AUC)의 개선 %를 나타낸다. 통계 분석은 ANCOVA에 의한다. X-축은 알레르겐 챌린지 후 처음 1시간 동안 다른 척도로 신장시켰음에 주의한다. 폐 기능의 연속적인 향상은 기준 혈중 호산구 수에 기반한다. 도 2c: 여기서, SB010으로 치료하고 28일 후 알레르겐 챌린지에 대한 반응이 기준 혈중 호산구 수로 계층화된 모두 3개의 하위그룹에 대해 조합하여 개시되었다. 비교를 위해, 혈중 호산구 ≥ 3 % 하위그룹에 있어서 치료 후 플라시보 반응에서 다른 2개의 하위그룹에서 플라시보 반응과 현저하게 다르지 않다는 것을 보여주었다. 상세한 내용은 도 2의 범례를 참조한다.
도 3은 후기 천식 반응 (LAR) 동안 곡선하 면적 (AUC)에서 개별 절대 변화를 나타내었다. 상기 SB010 치료 그룹 (n=21) 및 상기 플라시보 그룹 (n=18)에서 각 환자에 있어서, 후기 단계 반응 (LAR) 동안 AUC 값에서의 절대 변화가 산출 및 도시되었다. 선 (line)은 평균을 나타내고; 검정색 점 (black points): 기준에서 혈중 호산구 수 ≥ 4%인 환자; 원 (circles): 기준에서 혈중 호산구 수 < 4%인 환자. LAR 반응은 상기 2개의 하위그룹 사이에서 현저하게 상이하지 않았다. 전체 그룹에 있어서, SB010 치료는 상기 후기 단계 천식 반응을 현저하게 감쇠시켰다 (P=0.02, 도 2). 개별 데이터 요소는 보충 부록 (Supplementary Appendix) 표 S4A 및 S4B를 참조한다.
도 4는 SB010 또는 플라시보로 치료하기 전 및 후에 알레르겐 챌린지 후 혈장 IL-5 수준에서의 변화를 나타내었다. 이는 치료전 알레르겐 챌린지에 반응하여 검출가능한 혈장 IL-5 수준을 나타내는 환자의 혈장 IL-5 농도에서 절대 변화의 평균 ± SEM으로 개시되었고, 이는 각각 상기 SB010 그룹 (13명의 환자)에서 4.21 ± 1.51pg/ml이고, 상기 플라시보 그룹 (12명의 환자)에서 4.03 ± 0.92pg/ml이었다. 상기 차이는 P=0.05 (*)로 통계적 유의성이 있다.
도 5 (= 보충 부록의 도 S1)는, 보충 부록에서 토의된 바와 같이, 알레르기성 천식의 발병기전 (pathogenesis) 및 SB010의 작용 기작 (mode-of-action)에서 Th2 세포 및 GATA-3의 중심 역할을 보여주었다.
도 6 (= 보충 부록의 도 S2)은, 보충 부록에서 토의된 바와 같이, mRNA 절단 활성 및 GATA-3 DNA자임을 나타내었다. GATA-3 카피 (c)RNA에 대한 GATA-특이적 DNA자임 hgd40의 인 비트로 절단 활성. 인 비트로 전사된 전체 오픈 리딩 프레임 cRNA가 hgd40의 다른 시간 간격 동안 (키네틱스 - A) 또는 증가된 용량으로 (용량 의존성 - B) 인큐베이트되었고, 결과의 절단 산물 (cleavage products)이 분리되었고, 아가로스 겔 상에 에티듐 브로미드 (ethidium bromide)로 염색되었다. 유사하게, GATA-3 cRNA가, 스크램블된 결합 도메인을 갖지만 온전한 촉매적 서열 (catalytic sequence)을 갖는 비특이적 DNA자임 (스크램블된 DNA자임 1-6) 또는 상이한 전사 인자 서열에 대한 DNA자임 (T 박스 전사 인자 Tbet, Tbet DNA자임 1-3)과 인큐베이트되어서, 상기 DNA자임 접근법 (C)의 서열 특이성을 입증하였다.
도 7 (= 보충 부록의 도 S3)은 hgd40 - SB010의 활성 성분의 생체활성 (bioactivity) 및 인간 원발성 T 세포 및 비강 조직 이식편에서 hgd40 치료의 효과를 나타내었다. A - 인간 극성화된 (polarized) Th2 세포의 hgd40 형질감염에 의한 GATA-3 단백질 발현의 감소. B - 인간 극성화된 Th2 세포의 hgd40 형질감염에 의한 IL-13 분비의 감소. 도 S2A 및 S2B의 데이터는 FAM-포지티브 형질감염된 세포의 세포내 (intracellular) 염색을 나타내었고, 그룹당 n = 8-10에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. C 및 D - 코 폴립을 갖는 만성 코굴염 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps: CRSwNP)을 앓는 환자로부터 수득된 인간 코 폴립 조직 이식편에 존재하는 CD3+ T 세포 (녹색)에 의해 형광 표지된 hgd40 (적색)의 흡수율. 결과는 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)에 의해서 수득되었고, 치료되지 않은 (도 C) 및 hgd40 치료된 세포 (도 D)에 대해 두 색상을 오버레이 (overlay)하여 나타내었다. E - 엑스 비보 (ex vivo) 조직 분석에서 CRSwNP를 앓고 있는 환자로부터 수득된 인간 코 폴립 조직 이식편에서 GATA-3 mRNA의 발현. 데이터는 정규화된 상대 발현 유닛으로 나타내었고, 그룹 당 n=6에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. F - 엑스 비보 조직 분석에서 인간 코 폴립으로부터 IL-5 단백질의 방출. 데이터는 그룹 당 n=16에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. 유의성이 GraphPad Prism 5를 사용하여 students t 검정에 의해 산출되었다; (*) P<0.05; (**) P<0.01. 기술적인 상세는 보충 부록, 물질 및 방법을 참조한다.
도 8 (= 보충 부록의 도 S4)은 전체 ITT 개체군 및 사전-지정된 하위그룹에서 평균 치료 차이를 나타내었다. 이는 SB010 치료 그룹과 플라시보 그룹 사이에서 상대 변화의 델타를 반영하는 그룹 차이를 시각화하였다. 전체 연구 개체군에 대한 값이 표 S2에 개시되었고, 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹에 대한 값이 표 S3a에 개시되었고, 및 FeNO ≥ 40 ppb인 환자의 사전-지정된 하위그룹에 대한 값을 표 S3B에서 찾을 수 있다. 상단: 치료전 및 치료후 사이에서 폐 기능의 백분율 변화가 곡선하 면적 (AUC)으로 표시되었다. 하단: FEV1에서 최대 감소로서 폐 기능의 백분율 변화가 표시되었다. EAR: 초기 단계 천식 반응; LAR: 후기 단계 천식 반응.
도 9 (= 보충 부록의 도 S5)는 객담 호산구에서 SB010 및 플라시보 치료의 효과를 나타내었다 (백분율로). 측정은 유도된 객담 시료에서, 상기 물질 및 방법에 개시된 바와 같은 알레르겐 흡입 전 및 후에, 수행되었다. 알레르겐 흡입이 SB010 (▲) 및 플라시보 (■)에 의한 치료 이전 및 치료하고 28일 후에 수행되었다. 각 시점 및 치료 그룹에 대해서 중간 값 및 25 및 75 백분위수 범위를 나타내었다. 좌측 패널: 전체 그룹; 중간 패널: 사전-지정된 하위그룹, 혈중 호산구 ≥ 4%; 우측 패널: 사전-지정된 하위그룹, FeNO ≥ 40ppb. 전체 그룹에서 호산구 백분율당 챌린지 후 절대 변화는 상기 치료 그룹들 사이에서 비-유의성 추세 (P=0.06)를 나타내었고, 이는 상기 호산구 하위그룹 (P=0.009) 및 상기 FeNO 하위그룹 (P=0.02)에서 유의성이 있었다. 객담 호산구의 감소 백분율은 보충 부록의 표 S8에 개시된 바와 같이 증가된 중성구의 유입에 기인하는 것은 아니다.
도 2는 치료전 및 치료 4주 후 알레르겐 챌린지 후에 폐 기능의 변화를 보여주었다. 도 2a: 알레르겐 챌린지 후에 기준 FEV1의 백분율로 FEV1 수준이 개시되었다. 알레르겐 챌린지는 치료 전 () 및 4주 치료 기간의 완료 후 ()에 수행되었다. 폐 기능이 알레르겐 챌린지 후 7시간 동안 기록되었다. 치료 그룹 당 평균 값 +/- SEM으로 나타내었다. SB010에 의한 치료 (▲)는, 플라시보 (■)와 비교하여, 초기 단계 천식 반응 (P=0.04, Wilcoxon 순위 합 검정)뿐만 아니라 후기 단계 천식 반응 (P=0.02, ANCOVA)을 현저하게 감쇠시켰다. 전체적인 상기 연구 그룹에 대한 결과가 도 2a에 개시되었고; 혈중 호산구 ≥ 4% (도 2b) 및 FeNO ≥ 40ppb (도 2c)를 갖는 사전-지정된 하위그룹이 개시되었다. 혈중 호산구 및 FeNO 수준이 무작위 배정 전에 측정되었다. 하위그룹은 12명의 SB010/12명의 플라시보 환자로 구성되고, 여기서 상기 SB010 그룹의 9명의 환자 및 플라시보 그룹의 11명의 환자가 양쪽 하위그룹에 존재한다. EAR 및 LAR 둘 다가 혈중 호산구 ≥ 4% 하위그룹 (각각 P=0.02 및 P=0.05) 및 FeNO ≥ 40 ppb 하위그룹 (각각 P=0.02 및 P=0.05)에서 현저하게 향상되었다. 알레르겐 챌린지 후에 처음 1시간 동안 스프레드 X-축이 확대되어 있다는 것에 주의한다. 도 2b: 폐 기능이 경시적으로 기준 FEV1의 백분율로 표시된다. 각각 혈중 호산구 ≥ 3 %, ≥ 4 % 및 ≥ 5 %인 3개의 하위 그룹에 대해 SB010 및 플라시보 치료에 대한 개별의 치료 전 및 치료 후 곡선이 개시되었다. 치료 그룹 당 평균 값 +/- SEM으로 나타내었다. 삽입된 네모는 초기 단계 반응 (좌측 네모) 및 후기 단계 반응 (우측 네모)에 대해 플라시보와 비교하여, SB010 치료 그룹에서 FEV1 곡선 아래 면적 (AUC)의 개선 %를 나타낸다. 통계 분석은 ANCOVA에 의한다. X-축은 알레르겐 챌린지 후 처음 1시간 동안 다른 척도로 신장시켰음에 주의한다. 폐 기능의 연속적인 향상은 기준 혈중 호산구 수에 기반한다. 도 2c: 여기서, SB010으로 치료하고 28일 후 알레르겐 챌린지에 대한 반응이 기준 혈중 호산구 수로 계층화된 모두 3개의 하위그룹에 대해 조합하여 개시되었다. 비교를 위해, 혈중 호산구 ≥ 3 % 하위그룹에 있어서 치료 후 플라시보 반응에서 다른 2개의 하위그룹에서 플라시보 반응과 현저하게 다르지 않다는 것을 보여주었다. 상세한 내용은 도 2의 범례를 참조한다.
도 3은 후기 천식 반응 (LAR) 동안 곡선하 면적 (AUC)에서 개별 절대 변화를 나타내었다. 상기 SB010 치료 그룹 (n=21) 및 상기 플라시보 그룹 (n=18)에서 각 환자에 있어서, 후기 단계 반응 (LAR) 동안 AUC 값에서의 절대 변화가 산출 및 도시되었다. 선 (line)은 평균을 나타내고; 검정색 점 (black points): 기준에서 혈중 호산구 수 ≥ 4%인 환자; 원 (circles): 기준에서 혈중 호산구 수 < 4%인 환자. LAR 반응은 상기 2개의 하위그룹 사이에서 현저하게 상이하지 않았다. 전체 그룹에 있어서, SB010 치료는 상기 후기 단계 천식 반응을 현저하게 감쇠시켰다 (P=0.02, 도 2). 개별 데이터 요소는 보충 부록 (Supplementary Appendix) 표 S4A 및 S4B를 참조한다.
도 4는 SB010 또는 플라시보로 치료하기 전 및 후에 알레르겐 챌린지 후 혈장 IL-5 수준에서의 변화를 나타내었다. 이는 치료전 알레르겐 챌린지에 반응하여 검출가능한 혈장 IL-5 수준을 나타내는 환자의 혈장 IL-5 농도에서 절대 변화의 평균 ± SEM으로 개시되었고, 이는 각각 상기 SB010 그룹 (13명의 환자)에서 4.21 ± 1.51pg/ml이고, 상기 플라시보 그룹 (12명의 환자)에서 4.03 ± 0.92pg/ml이었다. 상기 차이는 P=0.05 (*)로 통계적 유의성이 있다.
도 5 (= 보충 부록의 도 S1)는, 보충 부록에서 토의된 바와 같이, 알레르기성 천식의 발병기전 (pathogenesis) 및 SB010의 작용 기작 (mode-of-action)에서 Th2 세포 및 GATA-3의 중심 역할을 보여주었다.
도 6 (= 보충 부록의 도 S2)은, 보충 부록에서 토의된 바와 같이, mRNA 절단 활성 및 GATA-3 DNA자임을 나타내었다. GATA-3 카피 (c)RNA에 대한 GATA-특이적 DNA자임 hgd40의 인 비트로 절단 활성. 인 비트로 전사된 전체 오픈 리딩 프레임 cRNA가 hgd40의 다른 시간 간격 동안 (키네틱스 - A) 또는 증가된 용량으로 (용량 의존성 - B) 인큐베이트되었고, 결과의 절단 산물 (cleavage products)이 분리되었고, 아가로스 겔 상에 에티듐 브로미드 (ethidium bromide)로 염색되었다. 유사하게, GATA-3 cRNA가, 스크램블된 결합 도메인을 갖지만 온전한 촉매적 서열 (catalytic sequence)을 갖는 비특이적 DNA자임 (스크램블된 DNA자임 1-6) 또는 상이한 전사 인자 서열에 대한 DNA자임 (T 박스 전사 인자 Tbet, Tbet DNA자임 1-3)과 인큐베이트되어서, 상기 DNA자임 접근법 (C)의 서열 특이성을 입증하였다.
도 7 (= 보충 부록의 도 S3)은 hgd40 - SB010의 활성 성분의 생체활성 (bioactivity) 및 인간 원발성 T 세포 및 비강 조직 이식편에서 hgd40 치료의 효과를 나타내었다. A - 인간 극성화된 (polarized) Th2 세포의 hgd40 형질감염에 의한 GATA-3 단백질 발현의 감소. B - 인간 극성화된 Th2 세포의 hgd40 형질감염에 의한 IL-13 분비의 감소. 도 S2A 및 S2B의 데이터는 FAM-포지티브 형질감염된 세포의 세포내 (intracellular) 염색을 나타내었고, 그룹당 n = 8-10에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. C 및 D - 코 폴립을 갖는 만성 코굴염 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps: CRSwNP)을 앓는 환자로부터 수득된 인간 코 폴립 조직 이식편에 존재하는 CD3+ T 세포 (녹색)에 의해 형광 표지된 hgd40 (적색)의 흡수율. 결과는 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)에 의해서 수득되었고, 치료되지 않은 (도 C) 및 hgd40 치료된 세포 (도 D)에 대해 두 색상을 오버레이 (overlay)하여 나타내었다. E - 엑스 비보 (ex vivo) 조직 분석에서 CRSwNP를 앓고 있는 환자로부터 수득된 인간 코 폴립 조직 이식편에서 GATA-3 mRNA의 발현. 데이터는 정규화된 상대 발현 유닛으로 나타내었고, 그룹 당 n=6에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. F - 엑스 비보 조직 분석에서 인간 코 폴립으로부터 IL-5 단백질의 방출. 데이터는 그룹 당 n=16에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. 유의성이 GraphPad Prism 5를 사용하여 students t 검정에 의해 산출되었다; (*) P<0.05; (**) P<0.01. 기술적인 상세는 보충 부록, 물질 및 방법을 참조한다.
도 8 (= 보충 부록의 도 S4)은 전체 ITT 개체군 및 사전-지정된 하위그룹에서 평균 치료 차이를 나타내었다. 이는 SB010 치료 그룹과 플라시보 그룹 사이에서 상대 변화의 델타를 반영하는 그룹 차이를 시각화하였다. 전체 연구 개체군에 대한 값이 표 S2에 개시되었고, 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹에 대한 값이 표 S3a에 개시되었고, 및 FeNO ≥ 40 ppb인 환자의 사전-지정된 하위그룹에 대한 값을 표 S3B에서 찾을 수 있다. 상단: 치료전 및 치료후 사이에서 폐 기능의 백분율 변화가 곡선하 면적 (AUC)으로 표시되었다. 하단: FEV1에서 최대 감소로서 폐 기능의 백분율 변화가 표시되었다. EAR: 초기 단계 천식 반응; LAR: 후기 단계 천식 반응.
도 9 (= 보충 부록의 도 S5)는 객담 호산구에서 SB010 및 플라시보 치료의 효과를 나타내었다 (백분율로). 측정은 유도된 객담 시료에서, 상기 물질 및 방법에 개시된 바와 같은 알레르겐 흡입 전 및 후에, 수행되었다. 알레르겐 흡입이 SB010 (▲) 및 플라시보 (■)에 의한 치료 이전 및 치료하고 28일 후에 수행되었다. 각 시점 및 치료 그룹에 대해서 중간 값 및 25 및 75 백분위수 범위를 나타내었다. 좌측 패널: 전체 그룹; 중간 패널: 사전-지정된 하위그룹, 혈중 호산구 ≥ 4%; 우측 패널: 사전-지정된 하위그룹, FeNO ≥ 40ppb. 전체 그룹에서 호산구 백분율당 챌린지 후 절대 변화는 상기 치료 그룹들 사이에서 비-유의성 추세 (P=0.06)를 나타내었고, 이는 상기 호산구 하위그룹 (P=0.009) 및 상기 FeNO 하위그룹 (P=0.02)에서 유의성이 있었다. 객담 호산구의 감소 백분율은 보충 부록의 표 S8에 개시된 바와 같이 증가된 중성구의 유입에 기인하는 것은 아니다.
본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 DNA자임, 특히 특정 환자 하위집단의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 DNA자임에 관한 것이다.
그러므로, 제1 양태에서, 본 발명은, 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한, GATA-3의 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.
제2 양태에서, 본 발명은 Th2-유도된 천식, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 각각 4% 또는 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 방법은 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 GATA-3에 대한 DNA자임을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "핵산-기반 불활성화제"는 표적 유전자 서열과 적어도 일부 상보적이고, 예컨대 중복 (reduplication), 전사 (transcriptions) 또는 번역 (translation)을 차단, 또는 상기 표적 서열을 절단하여, 상기 표적 유전자 활성을 불활성화시키는 핵산-기반 물질을 나타낸다. 핵산-기반 불활성화제는 리보뉴클레오티드, 데속시리보뉴클레오티드, 비-자연 발생하는 뉴클레오티드 및 그 혼합물로 구성될 수 있고, 단일-가닥 서열, 이중-가닥 서열 또는 그 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 핵산-기반 불활성화제는 siRNA 분자, shRNA 분자 및 DNA자임을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "DNA자임"은 촉매적으로 활성인 단일-가닥, 합성 DNA 분자를 나타내고, 이는 자연에서 발생되지 않는다. 10-23 패밀리의 DNA자임은 안티-센스 분자의 새로운 부류를 나타내고, 이는 1990년대에 개발되었지만, 최근에 임상적 적용이 발견되었다9.
본 발명의 문맥에서, 용어 "10-23 패밀리"는 일반적인 DNA자임 모델을 나타낸다 (Sontoro & Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94 (1997) 4262-4266). 또한 "10-23 DNA자임"으로 언급되는 상기 10-23 모델의 DNA자임은 15개의 데속시리보뉴클레오티드의 촉매적 도메인을 가지며, 이는 2개의 기질 결합 도메인에 의해 플랭크 (flank)된다 (WO 2005/033314 참조). DNA자임의 잠재적 이점은 상대적으로 높은 안정성을 포함하지만, 세포내 효소에 대한 의존성은 없다는 것이다.
특정 구현예에서, 상기 촉매적 도메인은 서열 ggctagctacaacga (서열번호: 1)를 갖는다. 상기 기질 결합 도메인의 길이는 가변할 수 있다: 이는 동일하거나 또는 상이한 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 기질 결합 도메인은 6개 내지 14개의 뉴클레오티드로 구성되고, 더 구체적으로 각 경우에 적어도 9개의 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 DNA자임은 일반적 서열 nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (서열번호: 2)을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 기질 결합 도메인은 단백질 GATA-3을 코딩하는 mRNA에 결합한다.
명시된 중심 촉매적 도메인 ggctagctacaacga은 단지 특정 구현예이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 변형된 촉매적 도메인에 의해 비교가능한 생물학적 활성을 갖는 "10-23 DNA자임"이 수득될 수 있다는 사실을 알 수 있다.
일 특정 구현예에서, 상기 기질 결합 도메인은 상기 절단 부위를 플랭크하는 영역에 완전히 상보적이다. 그러나, 상기 표적 RNA에 결합하고 이를 절단하기 위해서, 상기 DNA자임은 완전히 상보적일 필요는 없다. 10-23 타입의 DNA자임은 퓨린-피리미딘 서열에서 표적 mRNA를 절단한다. 본 발명의 범위안에서, 상기 DNA자임은 바람직하게 WO 2005/033314에 따른 GATA-3에 대한 인 비보 활성인 DNA자임을 포함하고, 그 전문이 임의의 적용가능한 특허법 하에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 환자는 4% 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 환자는 5% 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 환자는 350 x 106 / L 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 환자는 450 x 106 / L 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 혈중 호산구 수가 (i) 종래의 자동 분별 혈구 계산 (automated differential blood counting) (예컨대 Coulter Technology 또는 Sysmex Technology 또는 다른 기술 사용), 또는 (ii) 종래의 혈액 도말표본 (blood smear)을 사용하는 수동 현미경 세포 분별화에 의해 결정된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 환자는 40 ppb 이상의 분획 호기 산화질소를 갖는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 분획 호기 산화질소가 휴대용 (hand-held) NIOX MINO® 장치를 사용하여 결정된다.
본 발명의 특정 구현예에서, GATA-3에 대한 DNA자임이, WO 2005/033314의 서열 hgd1 내지 hgd70으로부터 선택되고 (WO 2005/033314의 도 3 참조), 구체적으로 서열들 hgd11, hgd13, hgd17 및 hgd40, 더 구체적으로 서열 hgd40 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG; 서열번호: 3)으로부터 선택된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "hgd40"은 GATA-3에 대한 DNA자임을 나타내고, 이는 서열 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG를 갖는 34개의 염기로 구성된다. 상기 3' 및 5' 영역 둘 다에서 9개의 염기는 2개의 결합 도메인을 형성하고, 이는 GATA-3의 표적 mRNA에 고도로 특이적으로 결합한다. 상기 분자의 중심 코어는 hgd40이 상기 GATA-3 mRNA에 결합한 후에 상기 표적의 절단을 설명하는 촉매적 도메인을 나타낸다10 (도 5 및 6 참조). 상기 약제 물질 hgd40은 흡입에 의해 약물 전달의 부위에서 높은 생물활성 및 생체이용률을 특징으로 한다.12
본 발명의 특정 구현예에서, 환자에게 경구, 직장, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌수조내 (intracisternally), 질내, 복강내, 지주막하강내 (intrathecally), 혈관내, 국소 (분말, 연고 또는 점적약 (drops)) 또는 스프레이 또는 흡입제의 형태로 투여될 수 있는 제형내에 상기 hgd40이 포함된다. 상기 활성 성분이 멸균 조건 하에 생리학적으로 허용가능한 부형제 및 가능한 보존제, 완충제 또는 분사제 (propellants)와 필요에 따라 혼합된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 hgd40이 흡입을 위한 제형에 포함된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 hgd40이 PBS에 용해된다.
투여량 (dosage)의 타입 및 투여량 계획 (dosage scheme)이 임상적 요인들에 따라 참석한 의사에 의해 결정될 것이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 투여량 타입 및 투여량 계획이 상이한 요인들, 가령 예컨대 환자의 몸 크기, 체중, 체 표면, 연령, 성별 또는 일반적인 건강 상태에 의존할 뿐만 아니라, 투여되는 작용제, 투여 기간 및 형태 및 동시에 투여될 수 있는 기타 약제에 의존한다. 상기 과정에서, 특히 유익한 구현예에 따르면, 상기 약제의 활성 성분의 양이 측정된 발현 수준으로 조정될 수 있다. 그러므로, 하위 그룹 "Th2 high"의 배정 및 수립된 매우 높은 GATA-3 유전자 발현의 경우에, 상기 활성 성분, 구체적으로 GATA-3에 대해 특이적인 DNA자임의 증가된 용량이 투여될 수 있다. 상응하게, 하위그룹 "Th1 high"의 배정 및 수립된 매우 높은 Tbet 유전자 발현의 경우에, 상기 활성 성분, 구체적으로 Tbet에 대해 특이적인 DNA자임의 증가된 용량이 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 투여량은 5 내지 50 mg의 hgd40, 구체적으로 5 내지 20 mg의 hgd40, 구체적으로 10 mg의 hgd40으로 구성된다. 특정 구현예에서, 상기 투여량이 2 ml의 PBS에 용해된다. 특정 구현예에서, 상기 투여량은 일일 (daily) 투여량이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 1일 1회, 1일 2회, 또는 1일 3회, 구체적으로 1일 1회로 투여된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 GATA-3에 대한 DNA자임이 연속 요법, 구체적으로 유지 요법에서 연속 28일 동안 1일 1회 투여된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 천식 치료를 위해 하기의 목록으로부터 선택된 하나 이상의 흡입 또는 경구 요법제에 대한 부가 (add-on) 요법으로 사용된다: 코르티코스테로이드, 장시간-작용 베타 작용제 (long-acting beta agonists: LABAs), 장시간 작용 무스카린성 길항제 (long acting muscarinic antagonists: LAMAs), 항류코트리엔 (antileukotrienes), 단시간-작용 베타 작용제 (short-acting beta agonists: SABAs), 항콜린작용제 (anticholinergics) 및 모노클로날 항체.
본 발명의 부가의 특성, 상세 및 이점은 하기 청구범위뿐만 아니라 도면을 참고로 하기 예시되는 실시예의 설명으로부터 나온다.
실시예
실시예
1: 임상 연구 "흡입된
GATA
-3 특이적 DNA자임에 의한 알레르겐-유도된 천식 반응의 감쇠"
요약
배경
천식의 가장 우세한 표현형은 TH2-유도된 호산구 지배 염증 (TH2-driven eosinophil dominated inflammation)인 것을 특징으로 한다. GATA-3의 치료적 표적화인 TH2 경로의 마스터 전사 인자가 도움이 될 수 있다. 본 발명자들은 GATA-3 mRNA에 대해 특이적인 신규한 DNA자임 (SB010)의 안전성 및 효능을 평가하였다.
방법
본 무작위 배정, 이중-맹검, 플라시보-대조, 다기관 임상 실험에서, 알레르겐 유발 후에 이상 (biphasic) 초기 및 후기 단계 천식 반응 (EAR 및 LAR)을 나타내는 객담 호산구증가증이 있는 알레르기성 천식 환자에게 10 mg의 SB010 (21명의 평가가능한 환자) 또는 플라시보 (19명의 평가가능한 환자)를 몇일 동안 1일 1회 흡입에 의해 투여받도록 배정하였다. 알레르겐 챌린지가 치료 전과 치료 후에 수행되었다. LAR에서 FEV1 곡선하 면적 (AUC)에서의 변화가 1차 종료점이었다.
결과
SB010 치료 28일 후에, 치료전과 비교하여 평균 LAR AUC가 34%까지 감쇠되었고, 반면 1%의 LAR AUC 증가가 플라시보 그룹 (P=0.02)에서 관찰되었다- EAR AUC가 SB010에 의해 11%까지 감쇠된 것에 대해, 플라시보는 10% 증가되었다 (P=0.03). 이러한 효과는 혈중 호산구증가증 ≥ 4% (향상 LAR 41.7%, P=0.05; 향상 EAR 28.3%, P=0.02) 또는 FeNO ≥ 40 ppb인 환자들의 사전-지정된 하위그룹에서 더 두드러졌다. SB010에 의한 LAR 저해는 알레르겐 유도된 객담 호산구증가증의 감쇠 (P=0.06 전체 그룹; P=0.009 호산구 하위그룹; P=0.02 FeNO 하위그룹), 더 적은 객담 트립타제 (P=0.05) 및 혈장 IL-5 수준 (P=0.05)과 관련이 있었다. 알레르겐 유도된 FeNO 수준 및 메타콜린에 대한 기도 과민반응은 치료에 의해 영향을 받지 않았다.
결론
SB010 치료는 알레르겐 유발 후에 알레르기성 천식에서 LAR 및 EAR 모두를 현저하게 감쇠시켰다. 바이오마커 분석으로 TH2 조절된 염증 반응에 있어서 현저한 효과를 확인하였다 (Clinical Trials - gov number, NCT 01743768).
도입
SB010의 활성 약물 제품의 중심 코어는, hgd40의 상기 GATA-3 mRNA로의 결합 후에 상기 표적을 절단하는 촉매적 도메인을 나타낸다10 (보충 부록의 도 S1 및 S2 참조). Sel et al.11은 DNA자임의 발생으로 GATA-3 mRNA를 절단할 수 있다고 보고하였고, 또한 알레르기성 기도 염증의 임상전 모델에서 그 효능을 입증하였다. 상기 약제 물질인 hgd40은 흡입에 의한 약물 전달의 부위에서 높은 생물활성 및 생체이용률을 특징으로 하고12, 그러므로 추가의 임상 개발을 위해 선택되었고; hgd40은 GATA-3 mRNA 및 단백질뿐만 아니라 후속하는 인간 T-세포 및 조직 이식편에서 TH2시토킨의 생성을 현저하게 감소시켰다 (도 S3, 보충 부록). 원하지 않는 오프-타켓 (off-target) 효과가 배제되었고13, 또한 광범위한 독성 프로그램에서 주요 안전성 우려가 확인되지 않았다14. 해당하는 약물 제품인 SB010이 3가지 최근 완료된 무작위 배정, 플라시보 대조된 용량 증가 (dose escalation) I상 실험 (수정 논문)에서 연구되었다. 유망한 결과가 SB010의 효능을 평가하기 위한 IIa상 실험에서 증명되었다. 상기 연구는 지금까지 흡입된 DNA자임의 제1 IIa상 실험을 나타낸다.
방법
연구 설계 및 감독
본 무작위 배정, 이중-맹검, 플라시보-대조 연구가 독일내 호흡기 연구 전문 7개의 연구 사이트에서 2013년 1월 (첫번째 환자가 등록)부터 10월 (마지막 환자의 마지막 방문)까지 수행되었다. 스크리닝 및 기준 평가 후에, 참가자들은, 활성 치료 또는 플라시보의 4-주 치료 기간에 대한 계층화 (stratification) 없이, 중앙 생성된 무작위 배정 목록 (Inamed GmbH, Munich, Germany)을 사용하여 무작위 배정되었다. 3번 흡입되는 알레르겐 챌린지는 스크리닝 시 (적격성), 무작위 배정 전 (치료 전) 및 28일 (치료 후)에 수행되었다. 상기 실험은 시작 전에 독일 규제 기관인 "Bundesinstitut fuer Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM)" 및 각 참여 센터의 중앙 및 지방 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 상기 연구가 양호한 임상 실무 원리 및 헬싱키 선언 (Declaration of Helsinki)에 따라 수행되었다. 모든 참가자들에게 연구-특이적 절차가 수행되기 전에 서면으로 정보 동의서를 제공하였다. 각 연구 사이트에서 데이터가 수집되었고, 이를 INAMED GmbH (Gauting, Germany)의 데이터 베이스로 넣었다. 통계 분석이 FGK Clinical Research GmbH (Munich, Germany)에 의해 독립적으로 수행되었다. 상기 논문의 제1 초안이 제1 및 마지막 저자에 의해 작성되었고, 이들은 또한 공개를 위해 논문 제출을 결정했다. 후원자에 의해 후원받은 전문 의학 저자는 작성 및 편집을 지원하였다. 제1 및 마지막 저자, 및 후원자의 고용인들인 저자들은 상기 데이터의 정확도 및 완전성, 통계 분석 및 최종 프로토콜에 대한 실험의 충실도를 보장한다.
환자
본 발명자들은, 스크리닝되기 적어도 6개월 전에 GINA 지침15에 따라 경미한 천식으로 진단받았고, 또한 흡입하는 단시간 작용하는 기관지확장제 이외의 임의의 천식 약제로 치료되지 않은, 18세 내지 64세의 백인 남성 환자를 모집하였다. 스크리닝 시에, FEV1은 단시간-작용하는 기관지확장제를 흡입하고 적어도 6시간 후에 예측된 정상의 ≥ 70%이었다. 이들 천식의 알레르기 특성은 통상의 공기알레르겐에 대한 포지티브 피부 단자 시험 (skin prick test) 및 포지티브 알레르겐-유도된 초기- 및 후기-단계 반응 (FEV1에서 각각 ≥20% 및 ≥15% 감소)을 통해 증명되어야 한다. 객담 호산구의 존재는 알레르겐 챌린지의 스크리닝 전 또는 후에 증명되어야 한다. 포함 및 배제 기준의 상세한 사항은 보충 부록에서 찾을 수 있다.
연구 치료
약물 제품인 SB010은 2 mL의 포스페이트 완충된 식염수 중 10 mg의 인간 GATA-3-특이적 DNA자임 hgd40 (BioSpring GmbH에 의해 제조, Frankfurt, Germany) (또는 부합하는 플라시보)이다. 최종 약물 제품은 블라인딩 (blinding)을 확실하게 하기 위해서 동일한 포장으로 중앙에서 제조되었다 (BAG Health Care GmbH, Lich, Germany). 약물 제품 또는 플라시보가, 최적화된 약물 침적을 보장하기 위해서16 AKITA2 APIXNEB 네불라이저 (Activaero GmbH, Gemuenden, Germany)를 사용하여 연속 28일 동안 약 3-8분 지속하는 흐름- 및 부피 조절된 흡입에 의해서 아침에 1일 1회 투여되었다. 환자는 등록 전에, 상기 장치의 사용에 대해 의무적인 훈련을 받았다. 상기 치료 기간 동안 각 방문에서, 활성 치료 또는 플라시보가 연구 스태프의 감독하에 연구 사이트에서 투여되었다. 남아있는 용량이 자가-투여되었고, 상기 장치의 스마트 카드를 사용하여 순응도가 체크되었다.
연구 절차
주요 연구 절차 및 개입에 대한 개요가 도 1a에 개시되었다 (연구 절차의 전체 요약은 보충 부록에서 찾을 수 있다).
알레르겐 챌린지를 위한 적합한 알레르겐이 첫번째 스크리닝 방문에서 피부 단자 시험에 의해 확인되었다 (상세한 사항은 보충 부록 표 S1 참조). (메타콜린 유발에 의한) 기도 반응성과 함께 두번째 스크리닝 방문에서 (첫번째 방문하고 적어도 1주 후) 후속하는 피부 단자 희석 시험을 사용하여 스크리닝 알레르겐 챌린지에 대한 안전한 개시 농도를 정의하였다17. 흡입된 공기알레르겐의 증가하는 농도가, FEV1에서 ≥20% 감소에 도달할 때까지, 투여되었다18. FEV1에서 20% 감소를 유도하는 흡입된 공기알레르겐의 최종 3개의 농도 단계가 무작위 배정 전 (치료 전) 및 치료 기간 28일 후 (치료 후)에 동일한 방식으로 투여되었다19. 일련의 폐활량측정법 측정이 최신 지침에 따라 알레르겐 챌린지 후에 10분 내지 180분 사이 (초기 단계 천식 반응, EAR) 및 7시간 사이 (후기 단계 천식 반응, LAR)에서 이중으로 수행되었다. 챌린지들 사이에 적절한 세척 횟수가 FEV1을 보장하기 위해서 수행되었고, FeNO 수준을 모든 환자에서 추가의 챌린지 전에 기준 값으로 되돌렸다.
기도 반응성이, ATS 지침에 따라 FEV1에서 ≥20% 감소를 유도하는 메타콜린 (Provocholine, Metapharm Inc., Brantford, ON, Canada)의 농도 (PC20 농도)로 도 1a에 개시된 시간에서 평가되었다21.
분획 호기 산화질소 (FeNO)의 수준이 제조사의 지시에 따른 ATS/ERS 권장사항22에 따라 휴대용 NIOX MINO® 장치 (Aerocrine, Solna, Sweden)를 사용하여 도 1a에 지시된 시간에서 측정되었다.
유도된 객담 시료가 5회의 시점에서 채취되었다 (도 1a): 스크리닝시, 치료전 챌린지 전 (최대 2주) 및 24시간 후, 및 치료후 전 (24-48시간) 및 24시간 후. 상층액 중 세포 분포 및 매개체의 분석이 중앙 실험실에서 평가되었다.
면역학적 파라미터의 측정
시토킨 및 케모킨 TNF-α, IL-1β, IL-8 MCP-1, MCP-4, MIP-1β, MDC, IP10 및 IL-4, IL-5 및 IL-13, 및 IFN-γ가 제조사의 지시에 따라 TH1/TH2 및 케모킨 다중 분석 (Meso Scale Discovery, Rockville, USA)에 의해 혈장 및/또는 객담 상층액에서 측정되었다. 객담 상층액 중 호산구 양이온 단백질 (Eosinophil cationic protein: ECP) 및 트립타제가 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 ELISA (ECP 및 트립타제: Cloud- Clone, Houston, USA)를 사용하여 측정되었다.
안전도 평가
유해 사례 및 수반되는 투약이 매 방문시 평가되었다. 안전도 실험실 분석 (혈액학, 임상 화학 및 소변검사 포함)이 처음 투여 전 및 치료 동안 2주 간격으로 수행되었다 (상세한 사항은 보충 부록 참조). 또한, 항핵 항체 (antinuclear antibodies) (면역형광 스크리닝 테스트) 및 류마티스 혈청학 (rheumatoid serology) (IgM)이, DNA자임-기반 약물에 의한 치료에 기인한 (자가-)항체 발생을 배제시키기 위해서 치료 전 및 후에 측정되었다.
연구 결과 측정
1차 결과 측정은 (알레르겐 챌린지 4시간 후) LAR 동안 기준 FEV1의 백분율로 표시되는 FEV1 곡선하 면적 (AUC)에 있어서 흡입된 SB010의 다중 투여의 영향이 있다. AUC가 사다리꼴 규칙 (trapezoidal rule)을 사용하여 산출되었다. 탐색적 종료점 (exploratory endpoints)은 EAR (0-3시간) 동안 FEV1 곡선하 면적에 있어서 SB010의 영향, 기도 반응성 (PC20 메타콜린)에서 알레르겐-유도된 변화, FeNO 수준, 및 혈장 및 객담내 바이오마커를 포함한다.
시료 크기 및 통계 분석
타입 I 오차 확률이 10%이고, 치료 그룹 간 효과 크기의 차이가 8%이고, 및 검정력 (power)이 적어도 80%인 것을 가정할 때, 적어도 38명의 평가가능한 피험체를 필요로 한다. 예상되는 탈락률 15%를 기준으로, 43명의 피험체가 무작위로 배정되고, 시험 약물 또는 플라시보에 노출되었다. 효능 및 약력학 결과가 도 1에 개시된 바와 같이 모든 평가가능한 환자들 (치료 의도 집단)에서 분석되었다.
상기 1차 효능 결과 (LAR에서 AUC)가, 공변수로서 LAR에서 기준 AUC를 갖는 ANCOVA 모델을 사용하여 치료 그룹들 사이에서 비교되었다. 4명의 SB010 그룹의 환자 및 3명의 플라시보 그룹의 환자는 처음 치료전 알레르겐 챌린지에서 LAR만 증명하였다. 상기 환자들에 있어서, 상기 알레르겐 챌린지로부터의 폐 기능 데이터가 치료전 값으로 사용되었다. 다른 종료점이 또한 동일한 모델에 의해 또는 통계적 분석 계획에서 정의된 바와 같이 백분율 변화의 그룹 비교들 사이에 있어서 Wilcoxon 순위 합 검정 (rank sum tests)을 사용하여 또한 분석되었다. 안전도 결과 측정이 환자에 의해 열거되었고, 서술되는 통계학이 산출되었다. 통계적 방법의 더 상세한 사항은 보충 부록에서 찾을 수 있다.
결과
환자
21명의 환자가 SB010 그룹에서 모든 연구 평가를 완료하였고, 18명 및 19명의 환자가 플라시보 그룹에서 각각 LAR 및 EAR 평가를 완료하였다 (도 1b). 상기 환자들에 대한 인구통계학적 (demographic) 및 기준 데이터가 표 1a 및 표 1b에 개시되었다.
천식 초기 및 후기 단계 반응
도 2a에 개시된 바와 같이 (보충 부록 표 S2), LAR이 SB010 치료 후에 감쇠되었고, 여기서 상기 평균 곡선하 면적 (AUC)이 33.7%로 현저하게 향상되었고 (P=0.02) 및 최대 FEV1 감소에서 31.6% 향상되었다 (P=0.09). EAR은 또한, 11.3%의 평균 AUC 향상 (P=0.04) 및 21.5%까지의 최대 FEV1 감소의 향상 (P=0.04)으로 현저하게 감쇠되었다.
사전-지정된 하위그룹에서 천식 초기 및 후기 단계 반응
사전-지정된 하위그룹에서, 기준에서 상대 혈중 호산구 수 ≥ 4%인 환자는, SB010 치료 후에 LAR에서 AUC의 더 큰 향상 및 EAR에서 현저한 효과를 보였다 (도 2b 및 보충 부록 S3A). LAR에서 AUC의 감소가 상기 SB010 그룹에서 41.7%까지 감쇠되었다 (P=0.05) (표 S3A). 이는 EAR에서 28.3%까지의 감쇠를 수반한다 (P=0.02). SB010 및 플라시보 치료 후에 상기 AUC의 개별 변화가 도 3 (및 보충 부록 표 S4A 및 S4B)에 도시되었다. 유사한 관찰이 기준에서 FeNO ≥ 40 ppb인 하위그룹에 대해 보고되었다 (도 2c, 보충 부록 표 S3B). 상기 하위그룹들의 계층들 사이의 이질성 (heterogeneity)에 대한 테스트는 유의성이 없었다.
TH2-유도된 염증의
마커에
의한 간섭
치료 28일 후에, SB010은 플라시보에 대해 알레르겐 유도된 객담 호산구증가증을 감쇠시켰고, 비록 이러한 차이는 전체 연구 그룹에서 통계적으로 유의하지 않았지만 (P=0.06), 혈중 호산구 ≥ 4% (P=0.009) 및 FeNO ≥ 40ppb (P=0.02)인 사전-지정된 하위그룹에서는 유의성이 있었다. 객담 호산구증가증에서 변화는 혈중 IL-5 수준에서 유의한 차이 (P=0.05)를 수반하였다 (도 4). 플라시보 그룹에서 관찰된 IL-5 수준의 치료후 증가는 SB010 치료 후에 부재했다. 치료 과정 28일 마지막에, 객담 트립타제 수준은, 플라시보와 비교하여 (중간 13.10 IQR 6.05-22.77 ng/mL), 상기 SB010 치료 그룹에서 현저하게 (P=0.05) 더 낮았다 (중간 6.39 IQR 2.03-13.88 ng/mL). 알레르겐-유도된 FeNO 수준 및 챌린지 24시간 후에 메타콜린에 대한 기도 과민반응은 연구 치료에 의해 영향을 받지 않았다 (보충 부록 표 S5).
안전도 및 내성 (tolerability)
SB010 또는 플라시보를 투여받은 환자들 사이에서 치료 응급 유해 사례 (treatment emergent adverse events: TEAEs)의 주목할만한 차이는 관찰되지 않았다. 플라시보 그룹에서 8명의 환자가 TEAEs를 가졌고, SB010 그룹에서 6명의 환자와 비교되었다 (표 3). 심각한 TEAEs나, 임의의 가능한 또는 특정한 SB010-관련 TEAEs는 없었다. 2명의 환자에서 2건의 TEAEs (구역 및 가려움)가 SB010과 관련이 있을 가능성이 있다. 심각한 TEAEs는 없었다. 다른 안전도 변수는, 보충 부록에 열거된 모든 안전도 종료점을 포함하여, 어떤 안전도 문제도 드러내지 않았다. TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1, MCP-4, MIP-1β, MDC 및 IP-10의 치료전 및 치료후 측정에서 연구 그룹들 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았고 (보충 부록 표 S7); 류마티스 혈청학 및 검출된 항핵 항체의 유의한 증가도 없었고, 이는 본래의 면역 활성화의 부재 및 오프-타켓 효과의 부재를 나타낸다.
토의
흡입된 기관지 알레르겐 챌린지는 알레르기성 염증 및 기관지수축의 널리 허용되는 인 비보 모델이고18, 또한 초기 임상 단계 실험에서 LAR의 치료적 저해는 약물 개발 프로그램의 나중 단계에서 임상 효능에 대한 합리적인 양호한 예측인자이다24. 예로는 TH2 시토킨 가령 IL- 425,26,27, IL-528,29,30, IL-1331,32, 및 TSLP33의 표적화 경로를 포함한다. 본 연구에서, SB010에 의한 치료는 알레르겐 흡입 후에 EAR 및 LAR 동안 폐 기능을 현저하게 향상시켰다. SB010이 전사 인자 GATA-3을 특이적 및 선택적으로 표적화하기 때문에, 상기 데이터는 TH2-유도된 천식 표현형을 갖는 환자에서 알레르겐 흡입 후에 천식 반응에서 GATA-3 의존성 및 조절된 경로의 중요성을 강하게 뒷받침하고, 또한 SB010이 알레르기성 천식에 대한 유망한 치료를 나타낼 수 있다고 제시하였다.
본원의 환자들은 향상된 혈중 및 객담 호산구뿐만 아니라 향상된 수준의 FeNO로 개시되는 바와 같이 통상의 TH2-유도된 엔도타입의 경미한 알레르기성 천식을 갖는다34 , 35. 상기 타입-2 엔도타입은 프로토타입 아토피 (prototypic atopic) 및 알레르기성 천식에서 나타날 뿐만 아니라, 과-호산구성 후기 발병 천식 (hyper-eosinophilic late onset asthma), 지속성 및 중증 천식, 및 아스피린-민감성 천식을 포함하는 다른 임상 표현형의 천식에서 최근에 관찰되었다5 ,36, 37. 포함 기준은 상기 엔도타입을 갖는 환자들의 더 넓은 스펙트럼을 커버하도록 정의되었고 (예컨대 단지 "객담 호산구의 존재"), 또한 폐 기능 데이터는 SB010이 전체적으로 본 연구 그룹에서 유의한 영향을 갖는다는 것을 보여주었다. 그러나, 사전-지정된 하위그룹 분석에서, 더 현저한 TH2-유도된 표현형 (적어도 4%의 혈중 호산구 수준 또는 적어도 40 ppb의 FeNO 수준)을 가진 환자는 SB010 치료로부터 특별한 혜택을 받는 것으로 보였다. LAR에 있어서 더 현저한 치료적 효과 외에도, EAR은 또한 현저한 감쇠를 보였다. 상기 천식 반응의 두 단계를 통한 이중 작용 기전은 항-IgE38 및 가장 최근의 항-TSLP33 이래로 임의의 생물학적 약물 후보체에 대해 보고되지 않았다. SB010 치료는 중증으로 악화되는 경향이 있는 환자에게 특히 유익할 수 있는지 여부가 앞으로의 임상 실험에서 연구될 필요성이 있다36. 상기 TH2 반응의 조절에서 GATA-3의 중심 역할이 잘 확립되었다. TH2 이펙터 기능의 개발 및 유지는 엄격하게 GATA-3에 의존한다39. 최근에, GATA-3의 필수 기능이 타입 2 본래의 림프 세포에서 확인되었다40. 그러나, 상기 전사 인자는 또한 상기 TH2-세포의 서브세트를 초과하는 중요한 기능을 발휘한다. GATA-3이 또한 비만-세포39, 호산구41 및 기도 상피세포에서 발현되었고, 여기서 상기는 알레르겐-유도된 알레르기 반응과 관련된 중요한 기능 및 이펙터 기전을 조절한다42 , 43. 알레르겐 챌린지 후에, EAR은 비만-세포 탈과립 (degranulation)에 의존하고, 반면에 LAR은 바람직한 T-세포 의존성이고, 또한 기도 및 기도 내강으로 호산구의 뚜렷한 유입을 수반한다. 비만-세포 트립타제는 비만-세포 활성화 및 비만-세포 탈과립을 반영하는 신뢰할 수 있고 강력한 마커를 나타낸다. 본 발명의 결과는 SB010 치료는 상기 천식 반응의 이펙터 세포에 직접 또는 간접적으로 영향을 준다는 것을 나타내었다. SB010은, TH2 세포를 조절하여 생존 및 활성화 인자를 갖는 이펙터 세포를 박탈할 뿐만 아니라 국소 염증 조직 중 호산구 및 비만-세포에서 GATA-3 mRNA와 직접적인 간섭을 통해서, 이중 형태로 저해 및 조절 기능을 수행할 것이다. 그러나, GATA-3 DNA자임 치료의 모든 생물학적 효과를 완전하게 설명하기 위해서는 부가의 기전 연구가 필요하다.
I상 프로그램 동안 노출된 개체들과 조합하여, 본 연구에 노출된 환자들은 120명 이상의 개인들에서 1200건 초과의 적용의 안전도 데이터베이스를 포함하고, 이중 39명은 천식을 가졌다. 광범위한 비-임상 프로그램의 결과와 함께 임상 개발 중에 안전도 시그날이 검출되지 않았다. 결론적으로, 본 개념-입증 실험 (proof-of-concept trial)은 흡입된 DNA자임 SB010 치료의 효능에 대한 증거를 제공하며, 알레르겐 유발 후 초기 및 후기 단계 천식 반응 둘 다에서 현저하게 감쇠되었다. 상기 효과가 우세한 TH2 표현형을 갖는 증상적, 지속적 천식 환자에서 임상적 혜택으로 해석될 수 있는지를 탐색하기 위한 추가의 임상 연구가 필요하다.
[표 1A]
본 연구를 완료한 환자들에 대한 인구통계학적 및 기준 데이터
모든 데이터는 평균 (SD)으로 표시되었고, 단 객담 중 호산구는 예외이다 (중간값, 제1 및 제3 사분위수). 분획 호기 산화질소 (FeNO), 기도 과-반응성 (PC20), 혈중 호산구 및 유도된 객담 중 호산구가 무작위 배정 전에 측정되었다. 객담 중 호산구 값은 각각 SB010에 대해 n=20 및 플라시보 그룹에 대해 n=17에 기반한다. P 값은 Wilcoxon 순위 합 검정에 따른다 (물질 및 방법 참조).
[표 1B]
본 연구를 완료한
환자들에 대한 상세한 인구통계학적
및 기준 데이터
모든 데이터는 평균 (SD)으로 표시되었다. 분획 호기 산화질소 (FeNO), 기도 과민반응성 (PC20), 혈중 호산구 및 유도된 객담 중 호산구가 무작위배정 전에 측정되었다. P 값은 Wilcoxon 순위 합 검정에 따른다 (물질 및 방법 참조).
[표 2]
치료전
및
치료후
알레르겐
챌린지
후에 후기 및 초기 단계 반응에서 변화
후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지의 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. AUC 치료전 및 치료후 값, 후속하는 SB010 및 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화가 제공된다. 상기 변화는 AUC의 전-후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화로 나타내었다. 양 (positive)의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음 (negative)의 값은 치료전과 비교하여 치료 후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 완전한 데이터세트는 보충 부록의 표 S2를 참조한다.
[표 3]
체계 기관 분류에 의한 치료 응급 유해 사례 (
TEAEs
)
장기 시스템
1
현기증;
2
설사, 구역;
3
단순 헤르페스, 비인두염;
4
열상;
5
근육통;
6
두통, 좌골신경통;
7
천식, 기관지 폐쇄, 호흡곤란,
증가된
상기도 분비,
구인두
통증, 상기도 기침 증후군;
8
가려움.
보충 부록: 흡입된
GATA
-3 특이적 DNA자임에 의한 알레르겐-유도된 천식 반응의 감쇠
물질 및 방법
포함 및 배제 기준
포함 기준
1. ≥ 18세 및 ≤ 60세의 성인 남성 백인 환자,
2. 스크리닝 전 적어도 6개월 동안 경미한 천식의 임상적 진단 (GINA 지침 2008에 따름). 흡입된 단시간 작용하는 기관지확장제 이외에 수반되는 천식 치료 없고,
3. 흡입된 단시간-작용하는 기관지확장제에 대해 적어도 6시간 씻어낸 후에 FEV1이 예측된 정상 값(ECSC)의 ≥ 70 %인 FEV1 값을 스크리닝하고,
4. 환자는 충분히 유도된 객담 생성을 입증해야 하고,
5. 통상적인 공기알레르겐 (예컨대, 동물 상피, 먼지 진드기)에 대한 포지티브 피부 단자 테스트 (피부 반응성),
6. 환자는 포지티브 알레르겐-유도된 초기- 및 후기-단계 기도 기관지수축을 입증해야 하고,
7. AC 및 MCh 이전의 모든 시점에서, 환자는 FEV1이 예측된 65 %보다 낮지 않아야 하고,
8. 알레르겐 챌린지를 스크리닝하기 전 또는 후에 객담 호산구의 존재 (제1 또는 제2 유도된 객담),
9. 환자에게 임상 실험의 목적, 방법, 예상되는 혜택 및 잠재적인 위험 및 노출될 수 있는 불편함에 대해 구두 및 서면으로 통보해야 하고, 실험 시작 및 임의의 실험-관련 절차 이전에 실험에 참여하는 것에 대한 서면 동의를 받았음.
10. 환자는 서면 정보 동의서를 이해하고 제공받을 수 있고, 조사자의 연구 윤리 위원회 (Research Ethics Board)가 승인한 서면 정보 동의서 양식에 서명했고,
11. 비-흡연자 또는 연간 < 10 팩으로 임상 연구 시작 전에 적어도 1년 동안 금연한 전-흡연자,
12. 적합한 방식으로 흡입할 수 있는 능력 (환자는 스크리닝 방문에서 플라시보 약제로 AKITA2 APIXNEB® 장치로부터 흡입하는 것을 훈련받을 것임),
13. SB010을 마지막으로 투여한 후 6개월 동안 아이를 갖기를 원치 않는 남성만이 본 연구에 포함될 것이다.
배제 기준
1. 천식 이외의 임상적으로 중요한 질병 (심혈관, 신장, 간장, 위장관, 혈액, 신경계, 비뇨생식기, 자가면역, 내분비, 대사 등)의 존재, 이는 조사자의 의견으로, 상기 실험의 참여로 환자를 위험에 빠뜨릴 수 있거나 또는 본 연구의 결과 또는 연구에 참여하는 환자의 능력에 영향을 줄 수 있음,
2. 관련 폐 질환 또는 흉부 수술의 병력의 존재, 가령:
3. 조사자에 의해 판단되는 바와 같이 흡입된 단시간-작용하는 기관지확장제를 제외하고, 수반되는 치료가 있는 환자,
4. 2, 3, 4, 5, 11, 및 12회 연구 방문 6시간 전에 단시간-작용하는 β2-작용제의 사용,
5. 스크리닝 전 6개월내, 스크리닝과 치료 기간의 시작 사이에 급성 천식으로 입원 또는 응급실 치료,
6. 상기 스크리닝 방문 이전 6개월 내에 천식 악화의 관리를 위해 24시간 이상 동안 삽관 (항상) 또는 입원,
7. 약물에 대한 임상적 관련 알레르기 또는 특이체질의 병력 또는 현재 증거,
8. 네불라이저 용액의 임의의 활성 또는 비활성 성분에 대한 알레르기 반응의 병력,
9. 임상 관련성의 ECG 이상,
10. 안정기 심박수 < 45 bpm, 수축기 혈압 < 100 mmHg, 이완기 혈압 < 60 mmHg인 피험체,
11. 기립성 조절장애, 기절, 또는 실신에 대한 경향
12. 절제된 기저세포암을 제외하고, 지난 5년 내에 악성종양의 병력,
13. 조사자의 판단에서와 같이 임상 화학, 혈액학 또는 임의의 다른 실험실 변수에서 임상적으로 관련된 이상,
14. AC 이전 지난 4주 내에 임상 관련 급성 감염,
15. 임상 관련 만성 감염,
16. 급성 또는 만성 감염 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 간염 B/C 바이러스 감염의 바이러스 테스트에서 양성 결과,
17. 포지티브 약물 스크린,
18. 알코올 또는 약물의 남용,
19. 포지티브 코티닌 (cotinine) 테스트,
20. 임상 약제의 처음 투여전 30일 내 또는 상기 실험의 치료 기간 동안 임의의 알려져 있는 효소를 유도 또는 저해하는 작용제 (St. John's Wort (Johanniskraut), 바르비투레이트 (barbiturates), 페노티아진 (phenothiazines), 시메티딘 (cimetidine), 케토코나졸 (ketoconazole) 등)에 의한 치료,
21. 처음 임상 약제 투여전 2주 내 (생물학적 제제의 경우: 6개월 또는 해당 약물의 제거 반감기의 10배 기간) 또는 상기 해당 약물의 제거 반감기 또는 약력학적 효과의 기간 중 더 긴 것의 < 10배 기간 내에, 임의의 금지된 수반된 약제 또는 치료 기간 동안 기대되는 수반되는 약제의 사용,
22. 처음 실험 약제 투여하기 전 14일 내에 및 상기 실험의 치료 기간 동안 임의의 효소를 유도 또는 저해하는 영양물 및 음료 (예컨대 브로콜리, 브뤼셀 스프라우트 (Brussels sprout), 자몽, 자몽 쥬스, 스타 플루트 (star fruit) 등)의 소비,
23. 각 연구 방문에서 처음 절차 시작 6시간 전에 카페인-함유 제품의 소비,
24. 삼켜진 분획의 약물 흡수를 방해할 수 있는 위장관의 수술 (주의: 충수절제술 또는 탈장절개술과 같은 경미한 복부 수술은 적용되지 않음),
25. 스크리닝하기 전 지난 30일 내에 헌혈,
26. 실험 과정 동안 또는 그 후 6개월 내에 배아 세포, 혈액, 장기 또는 골수의 계획된 기증,
27. 지난 1개월 내에 또는 해당 약물의 반감기의 10배 기간 이내에 연구 대상 약물 또는 장치로 또 다른 임상 실험에 참여. 생물학적 제제의 경우, 최소 기간은 적어도 6개월 또는 약력학적 효과 기간 또는 본 실험에 포함되기 전 해당 약물의 반감기의 10 배이고,
28. 정보에 입각하여 동의할 수 있는 능력 또는 의향의 결여 또는 적절하게 협조할 수 없는 능력,
29. 실험 방문/절차에 대한 예상치 못한 이용가능성,
30. 취약 계층 (예컨대, 구금 상태의 사람),
31. 연구 사이트에서 고용인, 상기 조사자의 친척 또는 배우자.
인-비트로 실험
인-비트로 실험이 상기 GATA-3 DNA자임의 절단 활성 및 특이성을 입증하기 위해 수행되었다. 생물활성 및 작용 기전이 점막 기도 조직의 모델로서 말초 혈액 T-세포 및 부비동 조직 (sino-nasal tissue) 단편을 사용한 세포 배양 실험에서 평가되었다.
DNA자임의 RNA 절단 촉매적 활성의 분석이 전술한 바와 같이 인 비트로 절단 분석을 사용하여 수행되었다 (Sel et al. JACI 2008). 간단하게, 2 μl의 인 비트로 전사된 GATA-3 카피(c)RNA (250 ng/μl)가 4 μl의 무-RNAse 물, 1 μl의 1 M NaCl, 1 μl의 10 mM MgCl2 및 1 μl의 500 mM 트리스 pH 7.4의 혼합물에 첨가되었다. 1 μl의 각 DNA자임 (hgd40, 스크램블된 결합 영역을 갖지만 본래의 촉매적 서열을 갖는 스크램블된 DNA자임 1-6, 전사 인자 Tbet-특이적 DNA자임 1-3) 또는 물 (네가티브 대조군)이 첨가되었고, 상기 혼합물이 37℃에서 인큐베이트되었다. 달리 명시되지 않으면, DNA자임이 10 μM의 농도로 적용되었고, 표준 인큐베이션 시간은 60분이다. 그 후, 반응 믹스가 아가로스 겔을 사용하여 전기영동으로 분리되었고, 표준 절차를 사용하는 에티듐 브로미드 염색에 의해 시각화되었다.
연구 대상이 코 폴립을 갖는 만성 코굴염 (CRSwNP)에 대한 서류 병력, 병리학적 비내시경 (pathological nasal endoscopy) 및 부비동의 CT-스캔에 기반하여 선택되었다. 벌집뼈동굴 (ethmoidal sinuses)로부터의 시료가, 현재 유럽 및 미국 지침에 따라, 벨기에의 Ghent University 병원 이비인후과에서, 본 연구와 독립적으로 지시되는 바와 같이, 기능적 부비동 내시경술 (functional endoscopic sinus surgery: FESS) 절차 동안 n=16 환자 (연령 16-72세, 중간 연령 44세; 남성 11명, 여성 5명; 아토피 8명 및 천식 10명)로부터 수집되었다. 모든 환자는 그들의 참여 전에 정보 동의서를 받았고, 본 연구는 지역 윤리 위원회에 의해 승인받았다. 매개체의 측정에 가능한 영향을 줄 수 있는 임의의 경구 또는 국소 약제의 사용은 수술 시작 적어도 4주 전에 모든 피험체에서 중지되었다.
환자로부터 코 폴립의 수술 제거 직후, 약 0.9 mm3의 각 조직 단편이 부비동 이식편을 절단함으로써 제조되었다. 상기 조직 단편이 RPMI-1640 배지에 현탁되었고, 조직 배양 배지 (tissue culture medium: TCM) 단독 또는 4 mg/ml의 DNA자임 hgd40과 6시간 (RNA) 및 24시간 (단백질) 동안 인큐베이트되었다. 그 후, 조직 단편 및 상층액이 스냅 동결 (snap frozen)되었고, -20℃ / -80℃에서 단백질 및 mRNA 분석때까지 보관되었다. DNA자임 hgd40 흡수의 조사를 위해서, 조직 단편이, TCM 단독 또는 4 mg/ml의 로다민 (rhodamine) 6G 표시된 hgd40과, 리포펙타민 형질감염 시약 (lipofectamine transfection reagent)의 존재 하에 24시간 동안 인큐베이트되었다. 그 후, 조직 단편이 내장되었고, 즉시 스냅 동결시키고, 5 μm 단면으로 절단되었다. 단편이 제조사의 권고사항에 따라 CD3 마커에 대해 염색되었다. 그 후, 슬라이드가 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 평가되었다.
나이브 (naive) 인간 CD4+ 세포가 Ficoll 구배 원심분리에 의해 전혈 또는 버피 코트 (buffy coats)로부터 단리되었고, 그후 제조사의 지시서에 따라 나이브 CD4 T-세포 단리 키트 (Miltenyi)를 사용하여 농축시켰다. 단리된 세포가, 전술한 바와 같이, IL-2 (20 ng/ml), IL-4 (20 ng/ml) 및 항-IFNγ (1 μg/ml)의 존재 하에 10일 동안 항-CD3 및 항-CD28에 의한 자극에 의해서 Th2 세포로 극성화되었다. 극성화 (polarization) 후에, 상기 Th2 세포가 Amaxa 시스템을 사용하는 전기천공에 의해서 FAM-표지된 인간 GATA- 3특이적 DNA자임 hgd40 또는 FAM-표지된 스크램블된 조절 DNA자임 ODNg3으로 형질감염되었다. 형질감염된 세포가 재플레이트 (replate)되었고, 22시간 동안 인큐베이트되었다.
인큐베이션 기간 후에, 상기 형질감염된 세포가 수확되었고, 형광 유세포측정 (fluorescence flow cytometry: FACS) 분석에 의해서 GATA-3 단백질 발현에 대해 분석되었다. 그러므로, 제조사의 지시서에 따라 "전사 인자 염색 버퍼 세트 (Transcription Factor Staining Buffer Set)" (eBioscience)를 사용하여 Alexa Fluor 647-표지된 마우스 항-GATA-항체 (Clone L50-823, BD Pharmingen)에 의해 GATA-3 단백질에 대해 세포가 세포내 염색되었다. 분석을 위해서, 게이트가 포지티브 형질감염된 세포에 설정되었고, GATA-3 발현 수준이 기하학적 평균 수준으로 상기 세포에서 결정되었다. FAM 양성화 (positivity)에 의해 조절되는 바와 같이 형질감염된 세포에서 GATA-3 단백질 발현의 기하학적 평균 수준이 hgd40 형질감염된 세포와 대조군 감염된 세포 사이에서 비교되었다.
6시간의 인큐베이션 시간 후에, 전체 RNA가 Aurum Total RNA Mini 키트 (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 추출되었고, cDNA가 iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad Laboratories)에 의해 합성되었다. 실시간 PCR 증폭이 하기 조건으로 수행되었다: 10분 동안 95℃, 이 후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 10초의 45 사이클, 60℃부터 95℃까지 해리 곡선 분석. β-액틴 (ACTB), 히포크산틴 포스포리보실트란스퍼라제 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase) 1, 및 신장 인자 (elongation factor) 1이 정규화를 위한 내인성 참조로 사용되었다.
24시간의 인큐베이션 기간 후에, 상층액이 수집되었고, IL-5의 농도가 제조사의 지침에 따라 상업적으로 이용가능한 Fluorokine MAP 키트 (R&D Systems Europe Ltd,)를 사용하여 Luminex xMAP 기술에 의해 측정되었고, Bio-Plex 200 Platform (Bio-Rad Laboratories)에서 측정되었다. 검출 한계는 1.5 pg/ml이었다.
IL-13 방출의 분석을 위해서, 형질감염된 세포가 1μg/ml의 스타필로코쿠스 아우레우스 엔테로톡신 B (Staphylococcus aureus enterotoxin B: SEB)로 22시간 동안 자극되었다. IL-13 분비가 제조자의 지시에 따라 IL-13 분비 분석 검출 키트 (Miltenyi)를 사용하여 FACS 분석에 의해 검출되었다. 분석을 위해서, 게이트가 포지티브 형질감염된 세포에 설정되었고, IL-13 발현 수준이 기하학적 평균 수준 (GeoMean)으로 상기 세포에서 결정되었다. FAM 양성화에 의해 조절되는 바와 같이 형질감염된 세포에서 IL13 단백질 발현의 기하학적 평균 수준이 hgd40 형질감염된 세포와 대조군 형질감염된 세포 사이에서 비교되었다.
안전도
종료점
하기의 임상 화학 파라미터가 평가되었다: 크레아티닌, 알카리성 포스파타제, 총 빌리루빈, 알라닌 아미노트란스퍼라제, 아스파르테이트, 아미노트란스퍼라제, 감마 글루타밀 트란스펩티다제, 총 단백질, 요산 (uric acid), 우레아, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 클로리드, 글루코스 (공복시), 락테이트 데히드로게나제, 및 크레아틴 포스포키나제. 혈액검사 파라미터는 하기이다: 헤모글로빈, 헤마토크리트 (haematocrit), 평균 적혈구 부피, 평균 적혈구 헤모글로빈, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, 적혈구 세포수, 분별 계수에 의한 백혈구 세포수 (중성구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구), 및 혈소판 계수, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 프로트롬빈 시간, INR, 피브리노겐. 하기의 소변검사 파라미터가 평가되었다: 백혈구, 니트라이트 (nitrite), pH, 단백질, 글루코스, 케톤, 유로빌리노겐 (urobilinogen), 빌리루빈, 혈액 (헤모글로빈 및 적혈구). 하기의 ECG 파라미터가 기록되었다: 12-유도 ECG가 Einthoven and Goldberger에 따른 유도뿐만 아니라 Wilson에 따른 6개의 심장전 유도 (precordial leads)를 사용하여 누운 자세에서 5분 휴식 후에 기록되었다.
통계 분석
통계 분석이 FGK Clinical Research GmbH (Munich, Germany)의 SAS (버전 9.3) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 S2가 GraphPad Prism (버전 5.0) 소프트웨어를 사용하여 제조되었다.
도 S1의 토의:
알레르겐 노출 후, 기도 수지상 세포는 TSLP, IL25 및 IL-33 및 초기 IL-4 (예컨대, 타입 2 본래 림프구 [ILC2]에 의해 생성)와 같은 상피-유도된 시토킨의 영향 하에 Th2 세포로 분화하는 Th0 세포에 대한 알레르겐을 제공한다. GATA-3은 Th2 분화 및 활성화를 위한 마스터 전사 인자를 나타내며, Th2 시토킨, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-13의 생성에 필수적이다. 이러한 시토킨의 방출에 의해서 Th2 세포는 몇가지 이펙터 메카니즘 가령 B 세포에 의한 IgE의 생성, 이후 비만-세포로의 결합, 호산구의 보충 및 활성화, 및 술잔세포 과다형성 (Goblet cell hyperplasia)의 발생에 관여한다. 상기 이펙터 세포에 의해 방출된 매개체는 염증을 더 촉진하고, 평활근 수축 및 점액 생성을 유도하여, 이후 기도 협착 및 혈관 누출을 유발한다. SB010은 Th2 세포에서 GATA-3에 대한 메신저 RNA를 특이적으로 절단함으로써 상기 과정에서 업-스트림을 방해한다. 결과적으로, 보다 적은 GATA-3 단백질이 생성되어, 전사 Th2 시토킨을 충분히 활성화시키지 못하여, 이후 모든 다운-스트림 과정을 저해할 수 있다. Th2 세포에서의 그 작용과 유사하게, SB010은 또한, 타입-2 시토킨 방출의 다운-스트림 저해 및 또한 비만 세포 및 호산구에서 이펙터 분자 생성에 의해서, ILC2, 비만-세포 및 호산구와 같은 다른 GATA-3 발현 세포에서 GATA-3 생성을 억제할 수 있다. 도 S1은 SB010의 활성 화합물인 hgd40의 생체활성을 추가로 나타내었다. 이는 GATA-3 발현 및 다운스트림 생물학적 효과에 있어서 SB010에서 활성인 GATA-3 DNA자임인 hgd40의 직접적이고 특별한 효과에 대한 구체적인 증거이다. 일련의 인 비트로 및 인 시투 실험은 도 S2 및 S3에서와 같이 포함된 결과인 SB010의 작용 기전을 입증하였다 (기술적 상세한 사항은 보충 부록 참조). SB010에서 활성인 GATA-3 DNA자임인 hgd40의 초기 특정 활성이 10-23 DNA자임의 촉매적 활성을 결정하기 위해서 고도로 특별한 인-비트로 방법을 나타내는 절단 분석 (부가의 도 S2)을 사용하여 개시되었다. 이를 위해서, 인-비트로 전사된 카피-RNA (cRNA) - 본 사례에서 인간 GATA-3 cRNA -가 DNA자임과 인큐베이트되었다. 상기 인큐베이션 동안, 활성인 DNA자임은 표적 cRNA를 2개의 절단 산물로 촉매적으로 절단하고, 이는 아가로스 겔 전기영동에 의해 입증될 수 있다. 일련의 절단 분석 분석법에 기반하여, SB010에서 활성 성분인 hgd40은 GATA-3 cRNA 절단 활성과 관련하여 가장 활성인 DNA자임이다. hgd40은 투여량과 시간-의존성으로 GATA-3 cRNA를 절단하는 것으로 개시되었다 (도 S2A 및 S2B). GATA-3 cRNA에 있어서 비-GATA-3-특이적 DNA자임의 효능 분석에 의해서 입증되는 바와 같이, 절단은 고도의 서열 특이적이다 (도 S2C). 또한, hgd40은 저농도 (0.5 μM hgd40)에서 조차도 단일가닥 RNA를 특이적으로 절단하고, 고농도가 아닐지라도 (20 μM hgd40) 이중가닥 DNA를 절단하지 않는다는 것이 입증되었다. 또한, 원치않는 오프 타겟 효과, 가령 본래 면역 세포의 활성화 또는 알레르기성 이펙터 기전에 관여하는 세포에서 효과가 사전에 배제되었다 (Dicke T et al. Nucleic Acid Therapeutics 2012;22(2):117-26). 이후에, 본 발명자들은 인간 세포 및 조직 물질에서 상기 분자의 생체활성을 입증하였다 (부가의 도 S3). hgd40에 의한 인간 극성화된 CD4+ TH2-세포의 형질감염은, 스크램블된 대조군 DNA자임 ODNg3에 의해 형질감염된 세포와 비교하여, GATA-3 단백질 발현 및 그 후 IL-13의 생성을 상당히 억제하였다 (도 S3A , S3B). 다음, 아토피성 천식으로부터 입수된 코 조직 이식편이 hgd40 DNA자임과 인큐베이트되었다. 도 3C 및 3D에서 개시된 바와 같이, 상기 이식편내에서 CD3+ 및 CD3- 세포에 의해서 hgd40이 흡수되었고, 6시간 내에 GATA-3 mRNA의 수준이 현저하게 감소되었고 (도 S3E) 또한 24시간에서 IL-5의 생성이 현저하게 감소되었다 (도 S3F).
보충 부록 표 S1. 알레르겐 유발을 위해 사용된 알레르겐
알터나리아 테누이스 (Alternaria tenuis)의 경우, ALK-Abello Arzneimittel GmbH, Germany, 또는 Allergopharma Joachim Ganzer KG, Germany에 의해 공급된 알레르겐.
보충 부록 표
S2. 치료
전 및 치료 후에 알레르겐
챌린지
후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - 폐 기능 데이터의 완전한 세트
범례 표 S2: 치료 전 및 치료 후에 알레르겐
챌린지
후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 -
폐 기능
데이터의 완전한 세트
알레르겐 유발이 SB010 또는 플라시보에 의해 치료 전 (pre) 및 후 (post) 28일에 수행되었다. 후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. 치료전 및 치료후 AUC 값이 제공되고, 그 후 상기 SB010 및 상기 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화를 제공한다. 상기 변화는 AUC의 치료전-치료후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화 (percent change)로 나타내었다. 양의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음의 값은 치료전과 비교하여 치료후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 상기 그룹의 차이는 SB010과 플라시보 그룹 사이의 상대 변화의 델타를 나타내었다. LAR AUC에 대한 P 값 및 LAR 및 EAR에서 최대 FEV1 감소가 ANCOVA 모델에 의해 산출되었고; EAR AUC에 대한 P 값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.
보충 부록 표
S3A. 치료
전 및 치료 후에 알레르겐
챌린지
후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석
범례 표
S3A
: 치료 전 및 치료 후에 알레르겐
챌린지
후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석
알레르겐 유발이 SB010 또는 플라시보에 의해 치료 전 (pre) 및 후 (post) 28일에 수행되었다. 후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. 치료전 및 치료후 AUC 값이 제공되고, 그 후 상기 SB010 및 상기 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화를 제공한다. 상기 변화는 AUC의 치료전-치료후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화로 나타내었다. 양의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음의 값은 치료전과 비교하여 치료후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 상기 그룹의 차이는 SB010과 플라시보 그룹 사이의 상대 변화의 델타를 나타낸다. LAR AUC에 대한 P 값이 ANCOVA 모델에 의해 산출되었고; EAR AUC에 대한 P 값 및 LAR 및 EAR에서 최대 FEV1 감소가 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.
보충 부록 표
S3B. 치료
전 및 치료 후에 알레르겐
챌린지
후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 -
FeNO
≥
40 ppb인
환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석
범례 표
S3B
: 치료 전 및 치료 후에 알레르겐
챌린지
후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 -
FeNO
≥
40 ppb인
환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석
알레르겐 유발이 SB010 또는 플라시보에 의한 치료 전 (pre) 및 후 (post) 28일에 수행되었다. 후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. 치료전 및 치료후 AUC 값이 제공되고, 그 후 상기 SB010 및 상기 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화를 제공한다. 상기 변화는 AUC의 치료전-치료후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화로 나타내었다. 양의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음의 값은 치료전과 비교하여 치료후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 상기 그룹의 차이는 SB010과 플라시보 그룹 사이의 상대 변화의 델타를 나타낸다. LAR AUC에 대한 P 값 및 LAR 및 EAR에서 최대 FEV1 감소가 ANCOVA 모델에 의해 산출되었고; EAR AUC에 대한 P 값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.
보충 부록 표
S4A
: 알레르겐
챌린지에
대한 개별 반응, 후기-단계 천식 반응 (LAR, 3-7시간)
*: 혈중 호산구 ≥ 4%인 사전-지정된 하위그룹에 포함된 환자.
보충 부록 표
S4B
: 알레르겐
챌린지에
대한 개별 초기-단계 천식 반응 (EAR, 0-3시간)
*: 혈중 호산구 ≥ 4%인 사전-지정된 하위그룹에 포함된 환자.
보충 부록 표 S5.
챌린지
후
FeNO
및 PC20
수준에 있어서
28일의 SB010 또는 플라시보 치료의 효과
범례 표 S5:
챌린지
후
FeNO
및 PC20
수준에 있어서
28일의 SB010 또는
플라시보
치료의 효과
FeNO 및 PC20 수준에 있어서 28일의 SB010 또는 플라시보 치료의 효과. FeNO 수준의 측정 및 기도 과민반응 (PC20)의 평가가 알레르겐 챌린지 후 SB010 또는 플라시보 치료전 및 28일의 치료 과정 후에 수행되었다. FeNO 수준이 ppb로 표시되었고, PC20이 메타콜린 mg/dl로 표시되었다. P 값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.
보충 부록 표 S6. 비-
챌린지된
FeNO
수준에 있어서
28일의 SB010 또는
플라시보
치료의 효과
범례 표 S6: 비-
챌린지된
FeNO
수준에 있어서
28일의 SB010 또는
플라시보
치료의 효과
FeNO가 기준 알레르겐 챌린지 전, 치료 전, 이후 60일의 추적 기간의 마지막인 88일에 측정되었다. 치료 의도 연구 집단뿐만 아니라 혈중 Eos ≥ 4% 및 기준 FeNO ≥ 40 ppb의 사전-지정된 하위그룹에 대해 중간 및 사분위 범위 (inter-quartile ranges: IQR)가 개시되었다. P-값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.
보충 부록 표 S7: 안전도
바이오마커
혈중 IL-4, IL-13 및 IFN-γ: 대부분의 값은 정량의 하한 미만임; IL-5는 보충 부록 도 S6을 참조한다.
보충 부록 표 S8:
객담내
분별화된
세포 계수 - 세포 x10
6
/g 객담으로 표시함)
표는 평균값 + 표준 편차 / 각각 치료전 및 치료후 알레르겐 후 변화를 나타내었다.
보충 부록 표 S9: 연구
종료점의
목록
참조 목록
Claims (14)
- Th2-유도된 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 (blood eosinophil count) 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 106 / L 이상, 구체적으로 450 x 106 / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 (fractional expiratory nitric oxide) 40 ppb 이상인 것을 특징으로 하는 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1에 있어서, 상기 핵산-기반 불활성화제는 GATA-3에 대한 DNA자임 (DNAzyme)인 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 환자는 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상의 혈중 호산구 수를 갖는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 350 x 106 / L 이상, 더 구체적으로 450 x 106 / L 이상의 혈중 호산구 수를 갖는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 혈중 호산구 수가 (i) 자동 분별 혈구 계산 (automated differential blood counting); 또는 (ii) 종래의 혈액 도말표본 (blood smear)을 사용하는 수동 현미경 세포 분별화 (manual microscopic cell differentiation)에 의해 결정되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 40 ppb 이상의 분획 호기 산화질소를 갖는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 6에 있어서, 상기 분획 호기 산화질소가 휴대용 (hand-held) NIOX MINO® 장치를 사용하여 결정되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제는 DNA자임 hgd40 (서열번호: 3)인 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 8에 있어서, 상기 hgd40이 흡입을 위한 제형에 포함되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 9에 있어서, 상기 hgd40이 PBS에 용해되어 있는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 10에 있어서, 5 내지 50 mg의 hgd40, 구체적으로 5 내지 20 mg의 hgd40, 구체적으로 10 mg의 hgd40의 hgd40이 2 ml의 PBS에 용해되어 있는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회, 구체적으로 1일 1회로 투여되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 12에 있어서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 연속 요법, 구체적으로 유지 요법에서 1일 1회로 투여되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.
- 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산-기반 불활성화제가 천식 치료를 위해 하기의 목록으로부터 선택된 하나 이상의 흡입 또는 경구 요법제에 대한 부가 (add-on) 요법으로 사용되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제: 코르티코스테로이드, 장시간-작용 베타 작용제 (long-acting beta agonists: LABAs), 장시간 작용 무스카린성 길항제 (long acting muscarinic antagonists: LAMAs), 항류코트리엔 (antileukotrienes), 단시간-작용 베타 작용제 (short-acting beta agonists: SABAs), 항콜린작용제 (anticholinergics) 및 모노클로날 항체.
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