FR2482981A1 - Produit de couplage entre une lectine et un ligand specifique, obtention et applications dans le domaine biologique - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PRODUIT DE COUPLAGE ENTRE UN LIGAND SPECIFIQUE ET UNE LECTINE, PAR LIAISON COVALENTE. LE PRODUIT DE L'INVENTION PEUT PAR EXEMPLE ETRE LE PRODUIT DE COUPLAGE DE CONCANAVALINE A ET D'UN ANTIGENE, D'UN HAPTENE, D'UN ANTICORPS, D'UNE HORMONE OU DE SON RECEPTEUR, D'UNE ENZYME OU DE SON INHIBITEUR OU D'UNE LECTINE, LE COUPLAGE ETANT REALISE A L'AIDE DE GLUTARALDEHYDE OU DE P-BENZOQUINONE. APPLICATION: DOSAGE IMMUNOLOGIQUE.
Description
La présente invention concerne un produit de couplage entre une lectine et un ligand spécifique, son obtention notamment et ses applications dans les techniques biologiques,/de loca- lisation, de mise en évidence et de dosages d'anticorps ou d'antigènes. Le produit de couplage selon l'invention est particulièrement approprié comme réactif universel dans les différents types de dosages biologiques et notamment immuno- logiques.
En immunologie, on a déjà utilisé,notamment,des pro- duits de couplage d'anticorps ou d'antigènes avec différen- tes substances, à titre de marqueurs, telles que par exem ples,les enzymes, les radioisotopes, la ferritine, les globules rouges,les fluorochromes.De tels produits de couplage sont utilisés à titre de réactifs selon divers procédés immunologiques pour la localisation, la mise en évidence ou le dosage des constituants humoraux ou cellulaires
Pour plus de détails sur oes produits de couplage connus, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après "Handbook of experimental immunology", 3 vol Ed. D.M.
Pour plus de détails sur oes produits de couplage connus, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après "Handbook of experimental immunology", 3 vol Ed. D.M.
Weir (1978) Blackwell Scientific.
On a maintenant trouvé une nouvelle série de produits de couplage qui peuvent être utilisés dans un grand nombre de domaines; il s'agit des produits de couplage entre une lectine et un ligand spécifique.
La présente invention concerne donc, à titre de pro duit nouveau, un produit de couplage entre une lectine et un ligand spécifique.
Bien que les indications détaillées qui suivent concernent certaines lectines particulières, il est à noter que l'enseignement de la présente description est valable pour n' importe quelle lectine
Les lectines sont des protéines extraites à partir de diverses sources, entre autres des plantes, qui réagissent d'une façon spécifique et par des liaisons non covalentes avec certains résidus glycosidiques.
Les lectines sont des protéines extraites à partir de diverses sources, entre autres des plantes, qui réagissent d'une façon spécifique et par des liaisons non covalentes avec certains résidus glycosidiques.
A titre d'exemples de lectines on peut citer: la
Concanavaline A extraite de Canavalia-ensiformis; la Ricine extraite de Ricinus communis et la lectine extraite de
Triticum vulgare. On trouvera une description détaillée des lectines dans les ouvrages ci-après qui sont cités à titre de références dans la présente description
- Science, 1972, vol. 177, p.949-959,
- Annales d'Immunologie, 1979, vol. lc NO 1, p.4-16.
Concanavaline A extraite de Canavalia-ensiformis; la Ricine extraite de Ricinus communis et la lectine extraite de
Triticum vulgare. On trouvera une description détaillée des lectines dans les ouvrages ci-après qui sont cités à titre de références dans la présente description
- Science, 1972, vol. 177, p.949-959,
- Annales d'Immunologie, 1979, vol. lc NO 1, p.4-16.
On indiquera que la Concanavaline A réagit de façon spécifique avec le méthyl-a-D-mannoside,la Ricine avec le
D-galactose, tandis que, la lectine extraite de Triticum vulgare réagit spécifiquement avec la N-acétylglucosamine.
D-galactose, tandis que, la lectine extraite de Triticum vulgare réagit spécifiquement avec la N-acétylglucosamine.
Parmi les lectines, la Concanavaline A est celle qui possède la plus vaste spécificité et qui peut être isolée facilement et en grande quantité. Elle est donc commode et peut coûteuse à utiliser. On peut utiliser, selon l'invention, une lectine quelconque; le choix de la lectine sera fonction de sa disponibilité et aussi de sa spécificité.
Par ligand spécifique on désigne dans la présente description toute substance soluble qui peut réagir de fa çon spécifique avec une autre substance biologique ou particulaire.
Par substance soluble, on désigne toute substance soluble dans les milieux couramment utilisés pour les réactions biologiques. I1 peut réagir de milieux aqueux, tels que des milieux physiologiques, ou de mélanges de milieux aqueux et organiques.
De plus, le ligand spécifique mis en oeuvre selon l'invention doit être tel que le produit de couplage lectine-ligand selon l'invention soit soluble en milieu aqueux, enprésence ou non du sucre spécifique de la lectine considérée, selon l'application dans laquelle ledit produit de couplage est mis en oeuvre.
Par"milieu aqueux" on désigne selon l'invention les milieux aqueux, tamponnés ou non, couramment utilisés dans le domaine biologique, tels que les solutions tampon phosphate; les solutions tampons contenant un détergent,tel que le "Tween", ou de la gélatine, la sérum albumine bovine, la lactalbumine bovine et autres substances habituellement mis en oeuvre dans de tels domaines.
Les ligands spécifiques répondant à une telle défi- nition sont notamment les anticorps, les antigènes macro- moléculaires ou les haptènes @ les hormones et leurs récep- teurs,les enzymes et leurs inhibiteurs, les lectines et substances similaires. Parmi les ligands spécifiques cités ci-dessus, on utilise le plus comflrnnément les anticorps et les antigènes.
Le produit selon l'invention est obtenu par couplage d'une lectine avec le ligand par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié,tel que par exemple le glutaraldé- hyde et la benzoquinone. Le coublage est avantageusement réalisé par liaisons covalentes.
Le couplage lectine-ligand spécifique est réalisé selon un procédé analogue à ceux utilisés pour le couplage de protéines.
Par exemple, on peut réaliser le couplage lectine-li- gand spécifique par un procédé similaire à celui décrit pour l'obtention de conjugués anticorps-enzyme dans le
Scand. J. Immunol., vol. 8 suppl. 7 p.7-23-,1978. Un tel pro- cédé de couplage consiste à mettre en contact, en une ou plusieurs étapes, un agent de couplage avec les substances à coupler.
Scand. J. Immunol., vol. 8 suppl. 7 p.7-23-,1978. Un tel pro- cédé de couplage consiste à mettre en contact, en une ou plusieurs étapes, un agent de couplage avec les substances à coupler.
Lorsqu'on utilise la benzoquinone comme agent de couplage on peut indifféremment activer en premier la lectine ou le ligand spécifique. A titre de document illustrant la technique de couplage à la benzoquinone on peut également citer le brevet RR 75.37.392 (publication N 2.334.107).
Lorsqu'on utilise le glutaraldéhyde comme agent de couplage, on mélange avantageusement la lectine et le ligand spécifique et on ajoute audit mélange le glutaraldéhyde en quantités appropriées pour réaliser le couplage. On peut cependant également réaliser ce couplage en deux temps, en mettant en contact avec le glutaraldéhyde l'un des réactifs, en éliminant le glutaraldébyde en excès et en ajoutant l'autre réactif.
Dals de @ombreux cas, le glutaraldéhyde convient comme agent de couplage,par exemple avec des antigènes ou des anticorps. Le tableau qui suit illustre la préparation de conjugués anticorps-lectine en utilisant le glutaraldéhyde comme agent de couplage. Cependant, ces exemples ne sont pas exhaustifs.
TABLEAU 1
Lectine Quantité Volume de glutaral
Origine Quantité d anticorpst déhyde (1%)
Lens culinaris 1,5 mg 0,7 mg 20 /ul
Triticum vulgare 0,7 mg 0,4 mg 20 pl Ric indus communis 1,7 mg 0,9 mg 20 ul
Canavalia ensiformis 4 mg 2 mg 20 /ul
* L'anticorps utilisé était de l'anticorps de mouton antiimmunoglobuline de lapin.
Lectine Quantité Volume de glutaral
Origine Quantité d anticorpst déhyde (1%)
Lens culinaris 1,5 mg 0,7 mg 20 /ul
Triticum vulgare 0,7 mg 0,4 mg 20 pl Ric indus communis 1,7 mg 0,9 mg 20 ul
Canavalia ensiformis 4 mg 2 mg 20 /ul
* L'anticorps utilisé était de l'anticorps de mouton antiimmunoglobuline de lapin.
La lectine et l'anticorps sont dissous dans un tampon phosphate pH 6,8 0,1M; à ce mélange on ajoute 20/ul de glutaraldéhyde à 1 %. Le volume total du milieu de réaction est de 1 ml.
Mais, lorsque la lectine ne possède pas de groupements amines primaires,le glutaraldéhyde ne peut pas etre mis en oeuvre pour le -couplage. Dans ce cas, d'autres agents de couplage peuvent être utilisés. Ceux-ci doivent permettre la fixation de la lectine sur un autre ligand sans perte importante dTactivité de l'un ou/et l'autre constituant.
Ainsi, avec la succinyl-concanavaline A, qui ne possède plus de groupements amines primaires, le glutaraldéhyde nTest pas utilisable mais la p-benzoquinone permet dTobtenir un conjugué anticorps-succinyl-concanavaline efficace.
Le produit de couplage lectine-ligand spécifique,selon l'invention, peut être caractérisé par sa capacité à réagir avec une substance spécifique et en même temps avec un marqueur spécifique de la lectine. Par exemple, si le produit de couplage lectine-ligand est un produit lectine-antigène, il pourra être caractérisé par sa capacité à réagir avec la substance spécifique correspondante, à savoir l'anticorps correspondant, et par sa capacité à réagir avec un marqueur
par exemple spécifique de la lectine,/ avec une enzyme glycoprotéinique.
par exemple spécifique de la lectine,/ avec une enzyme glycoprotéinique.
Il peut avantageusement entre conservé en solution aqueuse à basse température2 par exemple à 40C
On peut également le mélanger avec du glycérol (en général 50/50) et le conserver ainsi à 40C ou au congéla- teur à - 20 C.
On peut également le mélanger avec du glycérol (en général 50/50) et le conserver ainsi à 40C ou au congéla- teur à - 20 C.
Le produit de couplage lectine-ligand spécifique selon l'invention convient comme réactif dans divers procédés immunologiques de localisation 7 de mise en évidence et de dosage de substances biologiques, tels que les dosages immunologiques du type non compétitif, à double anticorps ou par compétition. Il est avantageusement mis en oeuvre sous la forme d'une solution aqueuse, tamponnée ou non pouvant contenir un excès du sucre de faible poids moléculaire,spécifique de la lectine du produit de l'invention.
Le produit de couplage lectine-ligand,selon l'inven- tion,sous la forme d'une solution aqueuse contenant un excès d'un sucre de faible poids moléculaire, spécifique de la lectine2 convient particulièrement bien à titre de réactif dans les techniques immunologiques, dans lesquelles l'un des réactifs ou la substance à identifier est insolu- ble ou immobilisée sur un support insoluble. Il convient donc en particulier dans tous les types de dosages mettant en oeuvre un support insoluble. Mais le produit de l'inven- tion peut aussi etre utilisé en phase soluble.
A titre d'exemple illustratif, on a indiqué sur la figure unique an@exée, le schéma d'un procédé de mise en évidence ce d'un antigène immobilisé (schéma A).
Pour mettre en évidence l'antigène immobilisé (1), on ajoute le produit de couplage lectine ligand (2) selon l'invention, dissous dans un milieu aqueux contenant un sucre de faible poids moléculaire spécifique de la lectine du produit de couplage 9 le ligand étant dans ce cas parti- culier un anticorps.
La partie anticorps du produit de couplage (2) réa- git avec l'antigène immobilisé, tandis que la partie lectine dudit produit de couplage, du fait de la présence du sucre en excès ne peut réagir avec d'autres substances glycosidiques qui pourraient éventuellement etre présentes dans le milieu réactionnel.
L'étape suivante de ce procédé consiste à laver le complexe antigène-produit de couplage (3) afin d'éliminer le sucre et l'excès de produit de couplage (2). On ajoute ensuite un marqueur portant une partie polyosidique pouvant réagir avec la lectine. Après lavage, le marqueur est mis en évidence par tout moyen approprié.
En variante, on peut également mettre en évidence l'antigène selon le schéma réactionnel B représenté sur la uniaue figure / annexée. Dans ce cas le produit de couplage lectine-ligand est utilisé en solution en l'absence de sucre spécifique de la lectine. Il faut noter toutefois, que ce schéma réactionnel ne peut etre utilisé que lorsque l'antigène à mettre en évidence n'est pas une substance portant des groupes glycosidiques susceptibles de réagir avec la lectine.
Dans le procédé de mise en évidence d'un antigène ci-dessus, la lectine liée à l'anticorps, joue le role d'accepteur de marqueur. Etant donné qu'un grand nombre de marqueurs possède des parties polysaccharidiques ou que des résidus saccharidiques peuvent leur etre facilement fixés, le meme produit de couplage lectine-anticorps ou lectine-antigène peut etre utilisé en combinaison avec un grand nombre de marqueurs. Par "marqueurll, on désigne selon l'invention,toute substance de nature quelconque, qui permet de faire une identification ou un dosage. A titre d'exemples de marqueurs,on on citera les enzymes, les dérivés fluorescents, les éléments radioactifs, les globules rouges et produits similaires.
Certaines enzymes qui peuvent être utilisées comme marqueurs ne sont pas des glycoprotéines; cependant il est possible, pour permettre leur utilisation avec un produit de couplage selon l'invention dans des procédés de dosage immunoenzymatiques, de coupler ou de fixer sur ces enzymes des fractions glycosidiques. Un moyen pour fixer de telles fractions consiste à greffer chimiquement une copule gl@cidique sur l'enzyme. Un autre moyen consiste à coupler une enzyme holoprotéique (par exempla la ss-galac- tosidase) avec une glycoprotéina (par exemple la péroxydase ou la glucose oxydase).Par exemple; on peut préparer une glucose oxydase - 0- galactosidase en mélangeant 2,5 mg (230 1) de glucose oxydase; 4,1 mg (410 1) de ss-galactosidase et 50 1 de glutaraldéhyde à 1%. On peut donc utiliser n'importe quel marqueur dans la mesure où celui-ci possède des fractions glycosidiques ou peut etre couplé ou fixé sur de telles fractions.
Le marqueur peut être également une substance portant un fluorochrome ou un isotope radioactif ou une substance particulaire pouvant réagir avec une lectine.
A chacun des marqueurs ci-dessus correspond une technique immunologique qui est respectivement la technique immunoenzymatique (dosage immunoenzymatique ou détection histochimique), l'immunofluorescence (dosage immuno fluorimétrique ou détection histochimique) la technique radioimmunologique, l'hémagglutination et autres techniques de ce genre.
Le produit de couplage lactine-ligandsalon l'inven- tion, trouve une application particulièrement intéressante dans les techniques immunologiques mettant en oeuvre des globules rouges, comme marqueurs. En En effet,dans les tech- niques connues d'hémagglutination, il est nécessaire d'utiliser des globules rouges sensibilisés par un antigène par exemple.Le produit de couplage selon l'invention per- met d'éviter cette sensibilisation puisque les globules rouges sont utilisés comme marqueurs pour révéler la prd- sence du produit de couplage lectine-ligand spécifique et ceci par l'intermédiaire de la lectina. le procédé de do- sage selon l'invention impliquant l'utilisation de globules rouges peut etre dénommé érythroadsorption spécifique.
De plus, en utilisant ce procédé d'érythroadsorption, la quantité de globules rouges à mettre en oeuvre est beaucoup moins importante que dans les procédés d'hémaggluti- nation classiques.
A titre d'exemple non limitatif, on décrira ci-après un procédé de dosage mettant en oeuvre un produit de couplage lectine-ligand selon l'invention.
Ce procédé de dosage pour la détermination d'une substance biologique donnée, consiste
1) à immobiliser une substance ayant une affinité de fixation vis-à-vis de la substance biologique à doser;
2) à faire incuber cette substance avec le milieu contenant la substance biologique à doser;
3) à faire incuber, après lavage, le milieu réactionnel résultant avec un produit de couplage lectine-ligand spécifique, en solution dans un milieu aqueux contenant un excès d'un sucre spécifique de la lectine, ledit ligand étant capable de réagir de façon spécifique avec-ladite substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser ou avec ladite substance biologique elle-meme;
4) à laver le milieu réactionnel résultant et à le faire incuber avec un marqueur portant des fractions glyco- sidiques pouvant réagir avec la lectine;;
5) à révéler le marqueur par un moyen approprié.
1) à immobiliser une substance ayant une affinité de fixation vis-à-vis de la substance biologique à doser;
2) à faire incuber cette substance avec le milieu contenant la substance biologique à doser;
3) à faire incuber, après lavage, le milieu réactionnel résultant avec un produit de couplage lectine-ligand spécifique, en solution dans un milieu aqueux contenant un excès d'un sucre spécifique de la lectine, ledit ligand étant capable de réagir de façon spécifique avec-ladite substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser ou avec ladite substance biologique elle-meme;
4) à laver le milieu réactionnel résultant et à le faire incuber avec un marqueur portant des fractions glyco- sidiques pouvant réagir avec la lectine;;
5) à révéler le marqueur par un moyen approprié.
Ce procédé est approprié pour doser des antigènes, des anticorps, des immunoglobulines et autres substances d'intérêt biologique.
La substance ayant une affinité de fixation vis-à-vis de la substance biologique à doser peut etre toute substance capable de se fixer de façon spécifique avec ladite substance biologique. Par exemple, si la substance biologique à doser est un anticorps, la substance ayant une affinité de fixation sera alors un antigène et réciproquement.
On'peut utiliser selon ce procédé un marqueur quelconque, telle ceux cités ci-dessus, notamment les enzymes et les globules rouges, auquel cas étape 5), est une étape de détermination enzymatique ou d'érythroadsorption.
Dans ce dernier cas, cfest-à-dire l'érythroadsorption, étant donné que les globules rouges sont fixés sur la lectine, qui est elle-meme fixée sur la substance à doser, on peut éliminer, par exemple par aspiration,les globules rouges qui n'ont pas réagi avec la lectina du produit selon l'invention, utilisé comme réactif, et on peut lyser les globules rouges fixés, par exemple à l'eau distillée et faire un dosage des substances libérées par les globules rouges, par exemple l'hémoglobine ou les substances artifi- ciellement introduites par l'expérimentateur, par exemple par spectrophotométrie à 403 nm,ce qui permet d'automatiser entièrement de tels procédés de dosages
La quantité de substances libérées par les globules rouges, par exemple la quantité d'hémoglobine libérée,est proportionnelle à la quantité té de la substance à doser, ce qui permet d'obtenir, par exemple, le dosage d'un antigène ou d'un anticorps présent dans l'échantillon an se référant à une gamme étalon d'hémolyse des globules rouges établie dans les mimes conditions.
La quantité de substances libérées par les globules rouges, par exemple la quantité d'hémoglobine libérée,est proportionnelle à la quantité té de la substance à doser, ce qui permet d'obtenir, par exemple, le dosage d'un antigène ou d'un anticorps présent dans l'échantillon an se référant à une gamme étalon d'hémolyse des globules rouges établie dans les mimes conditions.
L'utilisation de lectines hémolysantes, pour l'obtention du produit de couplage selon l'invention, peut suppri mer cette dernière étape de lyse des globules rouges
On utilise avantageusement des microplaques pour immobiliser l'antigène ou l'anticorps mis an oeuvre selon le procédé ci dessus, par exemple des microplaques en polystyrène.On peut également utiliser des supports sous forme de gais, de préférence des gels magnétiques, tels que ceux décrits dans le brevet FR 75.36889 (publié sous le n 2.334.106) et la demanda de brevet FR 79 21343.
On utilise avantageusement des microplaques pour immobiliser l'antigène ou l'anticorps mis an oeuvre selon le procédé ci dessus, par exemple des microplaques en polystyrène.On peut également utiliser des supports sous forme de gais, de préférence des gels magnétiques, tels que ceux décrits dans le brevet FR 75.36889 (publié sous le n 2.334.106) et la demanda de brevet FR 79 21343.
A titre de support, on peut utiliser n'importe quel support insoluble présenté sous une forme définie, talle qu'une plaque ou une feuille, ou sous une forme particulaire.
A titre de substance constitutive de tels supports, on peut utiliser la cellulose et ses dérivés, la polyacrylam.ide,les polyméthacrylates d'alk#le et autres polymères d'origine natutelle ou synthétique ainsi que la verra
On notera que le produit de couplage selon l'invention,utilisé sous la forme de solution, procure des avantages considérables dans le domaine des dosages immunologiques en ce sens que sa mise en oeuvre ne requiert aucune etape de séparation, centrifugation, filtration, autre que celle imposée par le support d'immobilisation de l'un des réactifs (par exemple,lavage du support ou séparation à l'aide d'un aimant dans le cas de gels magnétiques).
On notera que le produit de couplage selon l'invention,utilisé sous la forme de solution, procure des avantages considérables dans le domaine des dosages immunologiques en ce sens que sa mise en oeuvre ne requiert aucune etape de séparation, centrifugation, filtration, autre que celle imposée par le support d'immobilisation de l'un des réactifs (par exemple,lavage du support ou séparation à l'aide d'un aimant dans le cas de gels magnétiques).
La sensibilité du procédé de dosage défini ci-dessus est identique à celle des procédés de dosages immunoenzymatiques classiques, c'est-à-dire de l'ordre de 1 ng pour les antigènes et de 10 à 20 ng pour les anticorps.Cette sensibilité est également du même ordre de grandeur qu'en radioimmunologie quantitative.
Le produit de -couplage lectine-ligand spécifique selon l'invention convient également pour lier des antigènes (9b) ou des anticorps (9d) à des substances polyosidiques ou portant des groupements osidiques(8),pour former le complexe(10a ou 10b), la liaison étant réalisée par l'intermédiaire de la lectine comme indiqué par le schéma C représenté sur la figure unique annexée.
Les complexes résultants peuvent hêtre utilisés dans tous les procédés où une phase insoluble est nécessaire,com- me la chromatographie d'affinlté, ou en vue de l'extraction de la caractérisation et/ou du dosage d'un antigène ou d'un anticorps.
L'invention va autre maintenant décrite par les exemples non limitatifs ci-après dans lesquels la lectine mise en oeuvre est la Concanavaline A (Con.A).
EXEMPLE 1: Préparation du produit de couplage lectineanticorps à l'aide de glutaraldéhyde.
On a utilisé des anticorps de mouton anti-Ig de lapin purs isolés par chromatographie d'affinité.
Les anticorps et la Con.A ont été dialysés contre du tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 pendant 1 nuit à 40C. Les anticorps (2 mg) et la Con.A (4mg),dialysés, ont été mélangés dans une solution contenant du méthyl-α-D-mannoside (0,lM).
Le volume total était égal à 1 ml. 25Zul d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde ont été ajoutés au mélange, qui a ensuite été incubé pendant 3 heure': à température ambiante. Puis, on a ajouté 50 /ul de glycocolle 2M ;le mélange a été laissé 2 heures à la température du laboratoire avant d'être dialysé pendant 24 heures contre une solution de NaCl 0,3M contenant du CaC12 (lmM) et du MnCl2 (lmM). Après la dialyse et la centrifugation,on a ajouté 1 ml de glycérol,puis la préparation a été conservée dans un congélateur à -2O0C.
EXEMPLE 2 : Préparation du produit de couplage lectineanticorps à l'aide de p-benzoquinone.
EXEMPLE 2 : Préparation du produit de couplage lectineanticorps à l'aide de p-benzoquinone.
A - par activation des anticorps
Les anticorps et la Con. A ont été dialysés contra une solution de NaCl 0915 M.
Les anticorps et la Con. A ont été dialysés contra une solution de NaCl 0915 M.
A la solution d'anticorps (4 mg dans 0,7 ml) on a ajouté successivement 70 1 de tampon phosphate pH 6 1 M et 100 1 de p-benzoquinone (en solution alcoolique à 40 mg/ml). Après 1 heure d'incubation à l'obscurité et à température ambiante, la préparation a été filtrée sur une colonne de Sephadex
G25 (0,9 x 20 cm). Le premier pic obtenu (1,6 ml) contenait les anticorps activés. Ceux-ci ont été alors mélangés avec 6 mg de Con.A (360 1). 200 1 de tampon dicarbonate- carbonate 1 M pH 9 ont été ajoutés au mélange. Celui-ci a été maintenu pendant 48 heures à 4 C. La réaction a été arrêtée par l'addition de 100 1 de glycocolle 2 M. Après deux heures, le mélange a été dialysé contre une solution de NaCl 0,30 M contenant du CaCl (1 mM) et du MnC12 (1 mM) puis centrifugé. Ensuite, on a ajouté un volume égal de glycérol. La préparation a été conservée à -200C.
G25 (0,9 x 20 cm). Le premier pic obtenu (1,6 ml) contenait les anticorps activés. Ceux-ci ont été alors mélangés avec 6 mg de Con.A (360 1). 200 1 de tampon dicarbonate- carbonate 1 M pH 9 ont été ajoutés au mélange. Celui-ci a été maintenu pendant 48 heures à 4 C. La réaction a été arrêtée par l'addition de 100 1 de glycocolle 2 M. Après deux heures, le mélange a été dialysé contre une solution de NaCl 0,30 M contenant du CaCl (1 mM) et du MnC12 (1 mM) puis centrifugé. Ensuite, on a ajouté un volume égal de glycérol. La préparation a été conservée à -200C.
B - par activation de la lectine Con.A.
La Con. A préalablement dialysée contre une solution de NaCl 0,1) M a été activée de la fac onsui- vante : à la solution de Con.A (5,4 mg dans 0,6 ml) contenant du tampon phosphate 0,1 M pH 6 et du méthyl-α-D- mannoside 0,1 Mson a ajouté 100 1 de p-benzoquinone (40 mg par ml d'éthanol). Après une heure,la préparation a été fil trée sur Sephadex G25.Le premier pic a été recueilli (1,7 ml) et mélangé avec 0,6 ml d'anticorps (3,5 mg) et 230 l de tampon bica-rbonate-carbonate de 1 M pH 9. Après 48 heures à 4 C, la mélange a été dialysé, centrifugé, puls mélangé avec un volume égal de glycérol. La préparation a été conservée à -20 C.
EXEMPLE 7 : Préparation d'un produit de couplage lectine- antigène
On a opéré selon le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 1 en utilisant des immunoglo- bulines de mouton à la place des anticorps de mouton anti-Ig de lapin
Dans cet exemple on a alors utilisé les ingrédients ci-après dans les proportions suivantes
On a opéré selon le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 1 en utilisant des immunoglo- bulines de mouton à la place des anticorps de mouton anti-Ig de lapin
Dans cet exemple on a alors utilisé les ingrédients ci-après dans les proportions suivantes
<tb> Con.A <SEP> ìIg <SEP> mouton| <SEP> Tampon <SEP> phosphatelMéthyl- -D-Glutaral- <SEP>
<tb> 28,8 <SEP> mg/ml <SEP> 4,4 <SEP> mg/ml <SEP> pH <SEP> 6,8 <SEP> lM <SEP> mannoside <SEP> lM <SEP> déhyde
<tb> 174 l 568 l 90 l 90 l 20 l =5 mg =2,5 mg
La solution obtenue a été conservée à -20 C.
<tb> 28,8 <SEP> mg/ml <SEP> 4,4 <SEP> mg/ml <SEP> pH <SEP> 6,8 <SEP> lM <SEP> mannoside <SEP> lM <SEP> déhyde
<tb> 174 l 568 l 90 l 90 l 20 l =5 mg =2,5 mg
La solution obtenue a été conservée à -20 C.
EXEMPLE 4 : Dosage d'anticorps et d'antigènes
A - dosage d'anticorps
Comme modèle expérimental, on a choisi le système suivant : dosage d'anticorps présents dans des sérums de lapins immunisés avec l'albumine sérique bovine.
A - dosage d'anticorps
Comme modèle expérimental, on a choisi le système suivant : dosage d'anticorps présents dans des sérums de lapins immunisés avec l'albumine sérique bovine.
Les godets d'une plaque de polystyrène ont été recouverts d'albumine sérique bovine. Après l'adsorption, les godets ont été lavés avec une solution tampon phosphate contenant du "Tween" 20 (10/oc), dénommée ci-après : PBS-Tween. L'immunsérum de lapin a été dilué de 1/40 000 à 1/10 240 000 dans du PBS contenant de la gélatine (0,5%) et du Tween 20 (1 /..). Les godets ont reçu 200 1 de chaque dilution. Un témoin a été effectué en remplaçant l'immunsérum par un sérum de lapin non immunisé. Après incubation (2 heures à 370C) et 5 lavages avec du PBS Tween, tous les godets ont reçu 200 1 d'une solution du produit de couplage anticorps de mouton anti-Ig de lapin
Con A (5 g/ml)préparé selon l'exemple 1 ci-dessus. Le diluant était constitué de NaCl 0,3M contenant du CaCl2 lmM,MnCl2 1mM, du Tween (0,5%), de la gelatine (0,5%) et du méthyl-α-D mannoside. Après 2 heures à 370C, les godets ont été vidés et lavés avec du PBS Tween. Puis les godets ont reçu 200 1 d'une solution de péroxydase (10 g/ml) dans du NaCl 0,15 M contenant du"Tween 20"0,5 %,du CaCl2 1 mM, et du MnCl2 1 mM.
Con A (5 g/ml)préparé selon l'exemple 1 ci-dessus. Le diluant était constitué de NaCl 0,3M contenant du CaCl2 lmM,MnCl2 1mM, du Tween (0,5%), de la gelatine (0,5%) et du méthyl-α-D mannoside. Après 2 heures à 370C, les godets ont été vidés et lavés avec du PBS Tween. Puis les godets ont reçu 200 1 d'une solution de péroxydase (10 g/ml) dans du NaCl 0,15 M contenant du"Tween 20"0,5 %,du CaCl2 1 mM, et du MnCl2 1 mM.
Après une incubation de 3 heures à 37 C, les godets ont à nouveau été lavés avec du PBS Tween puis remplis par 200 1 de substrat de la peroxydase (H2O2 + o-phénylène diamine).
Après 15 minutas, la réaction enzymatique a été arrCtée par l'addition de 50 1 HCl 3 N. La densité optique a été mesurée à 492 nm.
Résultats :
Dilution Do moyenne 1/40.000 2.325 1/80.000 1.477 1/160.000 1.019 1/320.000 662 1/640.000 341 1/1.280.000 181 1/2.560.000 120 1/5.120.000 72 1/10.240.000 23
Témoin : sérum de lapin normal 1/40.000 160 B - dosage d'antigènes
En utilisant un mode opératoire similaire à celui décrit ci-dessus, on a dosé de l'IgE humaine.
Dilution Do moyenne 1/40.000 2.325 1/80.000 1.477 1/160.000 1.019 1/320.000 662 1/640.000 341 1/1.280.000 181 1/2.560.000 120 1/5.120.000 72 1/10.240.000 23
Témoin : sérum de lapin normal 1/40.000 160 B - dosage d'antigènes
En utilisant un mode opératoire similaire à celui décrit ci-dessus, on a dosé de l'IgE humaine.
Ce mode opératoire comprend les étapes ci-après - Adsorption des anticorps anti-IgE sur une plaque de polystyrène.
- incubation (2 heures) du sérum du malade à titrer; diluant : PBS contenant du Tween 20 et de l'albumine bovine 1%.
- incubation (2 heures) avec les anticorps anti-IgE couplés avec la Con.A (5 g/ml); diluant : PBS contenant 0,1 M de méthyl-α-D-mannoside.
- Incubation (3 heures) avec la peroxydase (10 g/ml) diluée dans du NaCl 0,15 M contenant 1 mM CaCl2 et 1 mM
MnCl2.
MnCl2.
- Réaction enzymatique, 30 minutes.
- Mesure de la densité optique à 492 nm.
En suivant le schéma réactionnel, on a pu doser les
IgE humaines entre 1 et 500 U.I./ml.
IgE humaines entre 1 et 500 U.I./ml.
EXEMPLE 5 : Titrage d'antigènes par érythroadsorption.
La déroulement du dosage est le même que celui décrit an détails pour la dosage immunoenzymatique dans l'exem- ple 4 excepté que, lors de la troisième incubation (incubation avec l'enzyme) on remplace ltenzyme par une suspension de globules rouges de mouton à 0,1% non sensibilisés. Après deux heures dtincubation,on note la dernière dilution de 1' immun-sérum ou de l'antigène donnant une érythroadsorption encore visible. La spécificité de ce dosage est attestée par la non-érythroadsorption lorsquton remplace l'immun-sérum par un sérum normal, et par l'inhibition de l'adsorption en présence de méthyle -D-mannoside. On a donné ci-après les résultats obtenus lors du dosage de l'immun-sérum de lapin anti-albumine bovine.
TABLEAU 1
Résultats
Résultats
<tb> Immun-sérum <SEP> de <SEP> lapin <SEP> Erythroadsorptionn <SEP> Erythroadsorption <SEP> des
<tb> anti-albumine <SEP> bovine <SEP> des <SEP> érythrocytes <SEP> érythrocytes <SEP> en <SEP> pré
<tb> <SEP> sence <SEP> de <SEP> méthyl-α-D
<tb> <SEP> mannoside <SEP> 0,1 <SEP> M
<tb> 1/160.Q00 <SEP> +++ <SEP> ~ <SEP>
<tb> 1/320.000 <SEP> +++ <SEP>
<tb> 1/640.000
<tb> 1/280.000
<tb> 1/2.560.000 <SEP> ++
<tb> 1/5.120.000 <SEP> +
<tb> Sérum <SEP> normal
<tb> 1/10.000 <SEP> - <SEP>
EXEMPLE 6 : Détection immunocytochimique d'immunoglobulines des immunocytes à l'aide du produit de couplage lectine anticorps.
<tb> anti-albumine <SEP> bovine <SEP> des <SEP> érythrocytes <SEP> érythrocytes <SEP> en <SEP> pré
<tb> <SEP> sence <SEP> de <SEP> méthyl-α-D
<tb> <SEP> mannoside <SEP> 0,1 <SEP> M
<tb> 1/160.Q00 <SEP> +++ <SEP> ~ <SEP>
<tb> 1/320.000 <SEP> +++ <SEP>
<tb> 1/640.000
<tb> 1/280.000
<tb> 1/2.560.000 <SEP> ++
<tb> 1/5.120.000 <SEP> +
<tb> Sérum <SEP> normal
<tb> 1/10.000 <SEP> - <SEP>
EXEMPLE 6 : Détection immunocytochimique d'immunoglobulines des immunocytes à l'aide du produit de couplage lectine anticorps.
Des suspensions de lymphocytes provenant de divers organes lymphoides ont été cytocentrifugées sur lame ou des frottis cellulaires ont été effectués à partir de ces suspensions. Les préparations cellulaires ont ensuite été fixées et ensuite incubées dans du PBS contenant 10 ,ug/ml dranti corps de mouton anti-immunogloDulines de souris couplés avec la Concanavaline A. Après une heure d'incubation, les préparations cellulaires ont été lavées au PBS puis incubées avec du PBS contenant de la peroxydase de raifort ou de la glucose oxydase à une concentration de 100 /ug/ml.Après 2 heures d'incubation à la température de laboratoire,les lames ont été lavées et ltenzyme associée aux cellules a été révélée par une coloration histochimique spécifique de lten- zyme utilisée comme marqueur.
EXEMPLE 7
Cet exemple illustre l'utilisation d'une substance marquée par un fluorochrome,à savoir la glucose-oxydase marquée par l'isothiocyanate de fluorescéine.
Cet exemple illustre l'utilisation d'une substance marquée par un fluorochrome,à savoir la glucose-oxydase marquée par l'isothiocyanate de fluorescéine.
(a) En vue du marquage de la glucose-oxydase par la fluorescé me, on procède comme suit:
On dissout 3 mg de glucose-oxydase dans 140 1 de
NaCl 0,15 M. On agite et on ajoute ensuite 48 1 dtisothio- cyanate de fluorescéine (solution à 10 mg/ml dans du blcar- bonate 1 M pH 9,5). On laisse 4 heures à la température du laboratoire. On passe le produit obtenu sur une colonne remplie d'Ultrogel Ac-A-202 (marque déposée par Industrie
Biologique Française -Pharmalndustrie)préalablement lavée avec du NaCl 0,15 M. On élue avec la même solution de NaCl et on recueille les fractions contenant la glucose-oxydase marquée par la fluorescéine.
On dissout 3 mg de glucose-oxydase dans 140 1 de
NaCl 0,15 M. On agite et on ajoute ensuite 48 1 dtisothio- cyanate de fluorescéine (solution à 10 mg/ml dans du blcar- bonate 1 M pH 9,5). On laisse 4 heures à la température du laboratoire. On passe le produit obtenu sur une colonne remplie d'Ultrogel Ac-A-202 (marque déposée par Industrie
Biologique Française -Pharmalndustrie)préalablement lavée avec du NaCl 0,15 M. On élue avec la même solution de NaCl et on recueille les fractions contenant la glucose-oxydase marquée par la fluorescéine.
(b) Le déroulement du dosage d'anticorps et d'antigène est identique à celui précédemment décrit. La révélation de la présence du conjugué anticorps-Con.A se fait par incubation avec la glucose-oxydase rendue fluorescente. La mesure de la fluorescence est effectuée soit dans le surnageant après l'incubation soit dans l'éluat après traitement de la phase solide par un réactif dissociant, tel que l'urée, le dodécyl-sulfate de sodium, des tampons acides ou alcalins, des solutions concentrées d'acide fort (HCl 6N) ou de base forte (NaOH 6N), et autres produits analogues, ou par le sucre spécifique de la lectine (exemple méthyl- -D-mannoside 1M).
Des résultats d'essais concrets réalisés avec la glu cose-oxydase marquée par la à fluoresceîne sont présentés dans le tableau 2 suivant TABLEAU 2 Fluorescence (unités de
Dilution de la dans le sur@a- fluorescence) glucose oxydase dans la solugeant après dans le marquée par la tion de départ incubation godet # fluoresceine 1/100 155 UF 150 2,9 1/500 35 27 2,6 1/1.000. 19 12 2,4 # mesurée après dissociation par du méthyl-α-D-mannoside (1M) de la liaison entre la Con-A et la glucose oxydase marquée.
Dilution de la dans le sur@a- fluorescence) glucose oxydase dans la solugeant après dans le marquée par la tion de départ incubation godet # fluoresceine 1/100 155 UF 150 2,9 1/500 35 27 2,6 1/1.000. 19 12 2,4 # mesurée après dissociation par du méthyl-α-D-mannoside (1M) de la liaison entre la Con-A et la glucose oxydase marquée.
EXEMPLE 8
Cet exemple illustre l'utilisation d'une substance mar quée par un isotope radioactif àsavoir la glucose oxydase marquée par î'1251
La technique utilisée à l'exemple 7 pour la fluorescence est applicable dans ce système, mais la mesure de la radioactivité dans les godets, sur la phase solide remplace la mesure de la fluorescence.
Cet exemple illustre l'utilisation d'une substance mar quée par un isotope radioactif àsavoir la glucose oxydase marquée par î'1251
La technique utilisée à l'exemple 7 pour la fluorescence est applicable dans ce système, mais la mesure de la radioactivité dans les godets, sur la phase solide remplace la mesure de la fluorescence.
Des résultats d'essais concrets réalisés avec la glucose oxydase marquée à 1' 125I sont présentés dans le tableau 3 qui suit : TABLEAU 3
Radioactivité mesurée pour chaque
godet après élut ion par NaOH 6N
Dilution de la Ac Con.A# Ac Conta Ac Con A# glucose oxydase 125 marquée par 1 Si 1/100 1/1000 0 1/10 45.000 cpm 7500 cpm 350 1/30 30.000 cpm 5700 cpm 210 1/90 6500 cpm 3000 cpm 1/270 2400 cpm 550 cpm 90 1/810 1000 cpm 200 cpm - # Ac Con.A = Anticorps couplé par le glutaraldéhyde avec la
Concanavaline A.
Radioactivité mesurée pour chaque
godet après élut ion par NaOH 6N
Dilution de la Ac Con.A# Ac Conta Ac Con A# glucose oxydase 125 marquée par 1 Si 1/100 1/1000 0 1/10 45.000 cpm 7500 cpm 350 1/30 30.000 cpm 5700 cpm 210 1/90 6500 cpm 3000 cpm 1/270 2400 cpm 550 cpm 90 1/810 1000 cpm 200 cpm - # Ac Con.A = Anticorps couplé par le glutaraldéhyde avec la
Concanavaline A.
EXEMPLE 9
Cet exemple illustre la technique de lecture par hémolyse.
Cet exemple illustre la technique de lecture par hémolyse.
Après l'érythroadsorption spécifique, les globules rouges n'ayant pas réagi avec le réactif (Anticorps-lectine) dé- cantent et tombent dans le fond des godets.Les globules rouges décantés sont alors aspirés doucement avec une pipette.
Les globules rouges liés au réactif (Anticorps-lectine) restent dans les godets. On ajoute de l'eau distillée ou autre liquide permettant de lyser les globules rouges.La lyse est immédiate. La lecture se fait par absorption à 403 nm de l'hémoglobine libérée.
Des résultats d'essais concrets sont présentés dans le tableau 4 qui suit
TABLEAU 4
Dilution du conjugué anti-* corps-lectine** DO403 nm
1/500*** 488
1/1000 365
1/2000 336
1/4000 272
1/8000 217
1/16.000 133
1/32.000 88
Témoin sans conjugué 83 * l'anticorps était l'antiimmunoglobuline de lapin.
TABLEAU 4
Dilution du conjugué anti-* corps-lectine** DO403 nm
1/500*** 488
1/1000 365
1/2000 336
1/4000 272
1/8000 217
1/16.000 133
1/32.000 88
Témoin sans conjugué 83 * l'anticorps était l'antiimmunoglobuline de lapin.
** la lectine était la Concanavaline A.
*** pour la dilution au l/500,la concentration était de
2 g/ml d'anticorps et 4 g/ml de Concanavaline A.
2 g/ml d'anticorps et 4 g/ml de Concanavaline A.
Claims (14)
1. A titre de produit nouveau le produit de coupla-
notamment ge,/par liaisons covalentes, entre une lectine et un ligand spécifique, ledit produit étant soluble dans un milieu aqueux,
2. Produit de couplage selon la revendication 1, ca ractérisé en ce qutil est soluble en milieu aqueux en présence d'un sucre de faible poids moléculaire spécifique de la lectine.
3. Produit de couplage selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la lectine est la Concanavaline
A, la Ricine, ou la lectine extraite de Triticum vulgare.
4. Produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que le ligand spécifique est un antigène ou un haptène, un anticorps, une hormone ou son récepteur, une enzyme'ou son inhibiteur, une lectine0
5. Produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qutil est obtenu par couplage à l'aide de glutaraldéhyde.
6. Produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est obtenu par couplage à l'aide de benzoquinone en deux étapes, la première consistant à activer la lectine ou le ligand avec la benzoquinone et la seconde à faire incuber le produit résultant avec le second produit à coupler.
7. Réactif de dosageimmunologique, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un produit de couplage d'une lectine avec un ligand spécifique, ledit produit de couplage étant soluble dans un milieu aqueux.
8. Réactif de dosage selon la revendication 6, caractérisé en ce que la lectine est la Concanavaline A et en ce que le ligand spécifique est un antigène ou un anticorps.
9. Application du produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la localisation, la mise en évidence et le dosage dlun antigène ou d'un anticorps par fluorimêtrie, radioinlmunologie, immunoenzymologie, érythroadsorption.
10. Procédé de dosage immunologique d'une substance biologique, caractérisé en ce qu'il consiste 1) à immobiliser une substance ayant une affinité de fixa tion pour la substance biologique i doser; 2) à faire incuber cette substance avec le milieu contenant la substance biologique à doser; 3) à faire incuber, après lavage, le milieu réactionnel résultant avec un produit de couplage lectine-ligand spéci- fique, en solution dans un milieu aqueux contenant un excès d'un sucre spécifique de la lectine , ledit ligand étant capable de réagir de façon spécifique avec ladite substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser ou avec ladite substance biologique elle meme.
4) à laver le milieu réactionnel résultant et à le faire incuber avec un marqueur portant des fractions glycosidiques pouvant réagir avec la lectine.
5) à révéler le marqueur par un moyen approprié.
11. Procedé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur est une enzyme, une substance portant un isotope radioactif ou un fluorochrome ou une substance particulaire apte à réagir avec la lectone.
12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur est constitué par des globules rouges.
13 Procédé selon l'une des revendications 10 ou 12, caractérisé en ce que pour révéler les globules rouges uti- lisés à titre de marqueur on élimine les globules rouges n'ayant pas réagi, on réalise une lyse des globules rouges fixés sur le produit de couplage lectine-ligand et on dose les substances libérées par les globules rouges.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la lyse est réalisée à laide d'eau distillée
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8011470A FR2482981A1 (fr) | 1980-05-22 | 1980-05-22 | Produit de couplage entre une lectine et un ligand specifique, obtention et applications dans le domaine biologique |
| DE8181400777T DE3172879D1 (en) | 1980-05-22 | 1981-05-18 | Coupled product between a lectin and a specific ligand, obtention and use in the biological field |
| EP81400777A EP0041426B1 (fr) | 1980-05-22 | 1981-05-18 | Produit de couplage entre une lectine et un ligand spécifique, obtention et application dans le domaine biologique |
| US06/265,427 US4526871A (en) | 1980-05-22 | 1981-05-20 | Conjugate obtained by coupling a lectin and a specific ligand, containing such a conjugate and its applications in biology |
| CA000378051A CA1174971A (fr) | 1980-05-22 | 1981-05-21 | Conjugaison d'une lectine et d'un ligand |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8011470A FR2482981A1 (fr) | 1980-05-22 | 1980-05-22 | Produit de couplage entre une lectine et un ligand specifique, obtention et applications dans le domaine biologique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2482981A1 true FR2482981A1 (fr) | 1981-11-27 |
| FR2482981B1 FR2482981B1 (fr) | 1983-10-14 |
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ID=9242246
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| Country | Link |
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| FR (1) | FR2482981A1 (fr) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2334107A1 (fr) * | 1975-12-05 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Procede de couplage de substances biologiques par des liaisons covalentes |
| WO1980002296A1 (fr) * | 1979-04-16 | 1980-10-30 | Massachusetts Inst Technology | Methode enzymatique de detection du cancer dans les tissus mamellaires |
-
1980
- 1980-05-22 FR FR8011470A patent/FR2482981A1/fr active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2334107A1 (fr) * | 1975-12-05 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Procede de couplage de substances biologiques par des liaisons covalentes |
| WO1980002296A1 (fr) * | 1979-04-16 | 1980-10-30 | Massachusetts Inst Technology | Methode enzymatique de detection du cancer dans les tissus mamellaires |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EXBK/69 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| FR2482981B1 (fr) | 1983-10-14 |
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