JPS6036963A - 検定の方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は化学的及び生化学的検定に関し、より詳細には
懸濁流体の少なくとも１つの成分相の、与えられた試料
の容積に対する容積がこの相を互いに物理的に分離せず
に計量されるような検定に関する。

懸濁流体の検定において頻繁に生ずる問題は全容積に対
する１ないしそれ以上の成分相の容積全決定することで
ある。かくして例えば牛乳の検定において乳脂の含有率
を決定するのが望ましいことが多くある。他の例として
血液全体の検定において細胞容積率〔一般的に詰込んだ
細胞の容積（ｐｃｖ、）１．たはへマドクリットとして
表わされる〕が望ましいことが多くある。このような相
対的容積は普通懸濁液の成分相が遠心分離等により物理
的に分離された後に決定される。

このような分離のステップは懸濁液の成分相の計量に対
する典型的な準備ステップであるはかりでなく、一般的
に他の検定に対する準備ステップでもある。かくして再
び血液の検定を考えると、多くのプロトコールは血清試
料を必要とし、血液は最初に血清から約５０％の細胞容
積？分離させるように遠心分離される。その結果血液全
体の使用を可能にするいかなるプロトコールも臨床デー
タの容認部分をなす血清量に血液全体を関連させる細胞
容積についての修正を必要とする。他の懸濁液の成分相
の検定に関して同様な考えがなされる。

本発明による特殊な検定に免疫検定がるる。１種類捷た
はそれ以上の試薬と試料のアリコツ）ｋ種々反応させて
抗原−抗体あるいは同様な複合体を形成し、その際にこ
れ分所定量の複合体の滴定量について試料全検定するた
めに観測するこのような検定は周知である。このような
検定の典型的なものとして特定の抗体がそれに特有な抗
原の量を測定するために用いられる（あるいはその逆の
場合の）検定がある。しかしながらこの手法は抗原トト
モにハプテン（ホルモン、アルカロイドゝ、ステロイド
９等を含む）を、また完全な抗体とともに抗体断片（す
なわちＦａｈ）　ｆ計量するように拡張されてきておバ
この広い意味で本発明も理解ずべきである。

周知のように高感度の免疫検定は複合体の標識された成
分が試薬に加えられ、標識された非複合体の試薬が複合
体の試薬から分前され、それから複合体（あるいは非複
合体の試薬）は標識を観測することによシ計量されるト
レーサーの手法分用いている。免疫検定の試薬の標識成
分には放射性同位体と蛍光性マーカーとの両方が用いら
れてお９、標識はそれぞれガンマ線カウンターまたは蛍
光光度計で観測されている。しかしながら本発明は蛍光
による検定だけを意図している。

非複合体である標識の部分を複合体から分離さ分の複合
体形成時の反応度を低下させないようにして固相体（試
験管の内壁、ガラス捷たは重合体のビーズ等のような〕
に固定きせることにより通常なされている。例えば免疫
グログリンＧ　（工ｙＧ）のような抗体はフェニル・ジ
イソシアナート等の二重作用の試薬を用いて３−アミノ
ゾロビル・トリメトキシ・シラン等のシリル化合物によ
ってガラス等の固相体に結合してもよい。固体した成分
を含んで形成されたいかなる複合体もそれから管からの
流体のアスビレーション址たはデカンテーションにより
、あるいは粒子状ベットゝで流体紮溶離させることによ
り、溶液中に残っている非反応性の補体から物理的に分
離されよう。あるいは例えば関連米国特許出願第４０６
，３２４号（シリアル・ナンバー、１９８２年８月９日
出願）及び第４１０．３４０号（１９８２年８月２３日
出應４）に示されているように、蛍光の励起及び観測を
固相体に接した極めて薄い層に制限しそれによって固定
した標識された成分を光学的手段で溶液中に残’：Ｌ　
ｄ＞　Ａ−Ａ、Ｉ’−彊ｂ　Ｆａ　Ｗ　ｎ＆ｆ　Ｊ　ｕ
　Ｉ４１Ａ　ｖｒ　Δ［７６斗Ｍ９　＊−（ＴＲＦ）及
び蛍光の通り抜け（を昭謁ｅｌハｎｙ）を用いてもよい
。

前述の方法は多くの免疫処決に適用できる。例えば拮抗
的免役検定において試薬は複合体の固定した成分（この
場合抗体〕に対する既知の量の標識された補体（抗原等
）からなる。試薬は計量されるべき標識されない補体を
含む一定の量の試料と混合される。標識された補体も標
識されない補体もその相対的濃度に比例して複合体の固
定した成分に結合する。設定した時間だけ持続させると
流体の試料と試薬とが分離する。固体相に固定された複
合体はそれから標識の蛍光全励起させるように選択され
た波長の放射で照射され、蛍光が測定される。固定した
複合体の蛍光の強度は検定されている標識されない袖体
の濃度に反比例する。

あるいは計量すべき部分にある量の類似体（すなわち免
疫的に同様に反応する物質）？固定しこの試料を既知の
量の標識された補体と反応させることにより検定ケ行な
ってもよい。標識された補体は試料中の未知６量の部分
と固定した類似体との両方との複合体となる。捷だ固定
した複合体の蛍光の強度は計量される（遊離した）部分
の濃度に反比例する。

固定した成分に対する多価の補体に関しいわゆる「サン
ドイッチ」免疫検定を行なってもよく、このとき加えら
れた補体ばさらに固定した成分の標識された類似体と反
応する。かくして二価の抗原は固定した抗体と結合し、
それから標識された蛍光性の抗体と反応して抗体−抗原
−標識された抗体のサンドイッチを形成し、それからこ
れが未反応の標識された抗体から分離されよう。このよ
うにして形成された固定した複合体の蛍光の強度は計量
される部分の濃度に正比例する。

生体流体の蛍光による検定において多くの問題が生ずる
。かくして例えばエリトロサイトは吸収性が高い。従っ
て従来技術の血液の蛍光による検定は典型的には試料全
遠心分離させ、表面側の血清を検定している。代表的な
遠心分離法は検定の結果が迅速に要求されるようなある
種の臨床処決（いわゆる「スタット」処決）に反する時
間となる１５ないし３０分程度ケ必要とする。このよう
な場合、現在の微量抽出法及び遠心分離法で実際に１分
以下で血清の抽出が可能になるが、このような遠心分離
法は今でも全ての臨床研究室で実施できるのではなく、
どの場合にも血清抽出は、どのような手段でも追加のス
テップとな９、従って人的誤シを招く可能性の加因七な
る。さらに血清抽出の手段は迅速な検定が望捷れる全て
の施設（自動車事故施設、家庭保護等）において実施で
きるわけではない。

前述の米国特許出願第４０６，３２４号及び第４１０，
３４０号に示されているような、極めて薄い層の試料の
抽出による全反射蛍光による検定の方法で光学的に高い
密度の試料の検定が可能になる。本来これで血液全体の
蛍光による検定が可能ＶＣなるであろうが、一般に血清
の試料について臨床実験がなされており、その結果実験
データの容認された部分に血液全体の検定を関連きせる
には試料中の血清の容積の言ＩＭが必要となっている。

質に対する懸濁した物質の未知の比率分もった分散系（
例えば唾液の場合流体容積に対する泡容積の未知の比率
）である唾液等のような他の生体流体について同様の考
察がなされる。

発明の目的 従って懸濁流体の成分相の相対的容積を物理的な相の分
離ケ行なうことを必要とせずに計量するための方法及び
装置〒提供することが本発明の１つの目的である。

測定の前に試料から懸濁相紮分離する必要のない蛍光に
よる免役検定の方法及び装置を提供することが本発明の
他の目的である。

また試料中の関連部分の相対的容積の測定を補償する装
置だけで血液全体、唾液等の免疫検定會行なうことも本
発明の目的である。

これらの、また他の目的は懸濁相がその大きさ及び形状
のためにほぼ除外される多相の懸濁液の些少な観測容積
全決定するための内面全反射の蛍おいて実現されている
。観測される容積を含む既知の容積の試料内に混入され
た既知の量の蛍光性物質の蛍光全観測することによシ懸
濁した、あるいは懸濁しつつある相の容積の泪量が可能
に”なる。

免疫検定に用いた好ましい実施例において、単層の抗原
−抗体の複合体の成分（例えば抗体）が固定されたほぼ
軸方向に配置された光ファイバー分有するある長さの精
密な直径ケ有する毛細管からなるディスポーザブルが用
いられている。ディスポーザブルはまた不活性の希釈剤
と、固定した成分（例えば蛍光性標識のある抗原）に対
する予め包含された既知の量の標識された補体と、例え
ば標識とは異なる波長で蛍光を発する既知の量の第２の
蛍光性物質とケ備えている。第２の蛍光性物質は試料の
成分に対して非反応性であるが試料の関連部分（例えば
血液全体の内の血清部分あるいは唾液の内の液体部分）
の予期される容積に完全に溶解するように選択され包含
されている。第２の蛍光性物質はまた少なくとも標識さ
れた成分及びその補体と同じ大きさΩ拡散率ケ有するよ
うに選択されている。

好ましい作用形態において、ファイバーが対象となる試
料中に没入され、第２の蛍光性物質と標識された成分及
びその補体との両方がファイバーと毛細管壁との間の容
積全体に拡散するのに十分な時間だけ留まっているよう
にされる。蛍光性物質が拡散する試料の全容積はとりわ
けファイバーと毛細管との形状によって決定される。第
２の蛍光性物質の量が予め設定されているので、試料中
の懸濁流体部分における第２の蛍光性物質の濃度は流体
の容積・についての量になり、容積に反比例する。

両方の蛍光性物質の観測は全反射蛍光によってなされ、
ファイバーの端部はファイバーの開口数の範囲内で照射
され観測される。エバネセント波の範囲内の蛍光性物質
の部分だけが蛍光を発し、この内ファイバー内に通り抜
けるものたけが観測される。その結果蛍光性の標識（フ
ァイバーに固定されたものと流体中に懸濁しているもの
との両方）か、第２の漸次変化する蛍光性物質（すでに
完全に懸濁流体中に溶解している）かについて観測され
るものは全て数百へのファイバーの範囲内にある。部分
的にはファイバーに近接した薄い領域に蛍光の観測を制
限することにょ９主として試料中の流体成分について観
測がなされるようになり、ファイバーの近くの懸濁相（
例えば血液の細胞あるいは泡）の容積が懸濁相の形状に
よって部分的に制限される。

適当な濾光によって標識及び溶解した浴光性物質による
蛍光の信号が個々に処理され、標識による信号は試料の
全容積内の免疫的に反応する部分の滴定量紮示し、第２
の蛍光性物質による信号はこの物質の濃度の１次的な量
螢、またそれゆえ懸濁流体の全容積分示す。ファイバー
に近接した流体中に懸濁している吸収性の粒子によるど
のような減衰の量をも示してそれにより試料の濃度の決
定に対する２次的修正を可能にするために蛍光の励起波
長における減衰した全反射によって試料分観測する保護
チャンネル音用いてもよい。

水金Ｂ月のオ頒宙のキ・ントｌｌ−１′臭１１２式り入
魯λ与γに公ダＪ一度の必要な試薬分合み、その構成で
試料の全容積が制御され懸濁物質の補償がなされるので
、検定を行なう技師にほとんど訓練や技巧が必要とされ
ず、分離、精密容量−差分の検出、計時の装置等はいず
れも必要でない。

精密な直径及び孔のファイバー及び毛細管は容易かつ安
価に使用でき、ファイバーのコーティング及びローディ
ングは製造時に容易に制御されるので、本発明のディス
ポーザブルは適度に安価に製造されることがわかるであ
ろう。

本発明の他の目的の内あるものは明らかであり、またあ
るものは以下に示される。従って本発明は以下の詳細な
説明に例示されているような構造、要素の結合、部品の
配置を有する装置と、いくつかのステップ及びこのよう
なステップの１っ址たばそれ以上と他の各々との関係か
らなる方法と孕含むものである。

本発明の目的及び特徴ケより十分に理解するために添付
の図面と併せて以下の詳細な説明？参照すべきである。

図において同心指示番号は同じ部分に関するものである
。

用語に関して、本発明の装置についての詳細な説明にお
いて装置の部分を「上方」部分及び「下方」部分と称す
る点に注意を侠する。これは全く便宜的なもので、説明
全図面における概略表示に関連させるためになされてい
る。この装置はいかなる位置または方向にあっても作用
し、得る仁とがわかるはずであり、そのようにすること
は本発明の範囲内の事項である。

さらに図面に示されているのは概略的なものであって、
実際の大きさや比率を示すことは意図していないことが
わかるであろう。

詳細な説明 本発明は１９８２年８月９日付の本出願人の関連米国出
願第４０６．３．２４号に示されているような蛍光放射
の通９抜けと結合した全反射蛍光によって作動するもの
であり、装置の作動の光学的形態についてのさらに詳細
な点についてはこれを参照するとよい。

後述のように本発明は他の検定とは独自に実施され、そ
れによって懸濁流体の成分相の相対的容積を単に割部“
するものであるが、ある種の他の検定と併せて利点を生
ずることもあろう。この場合このような組合せた装置及
び方法は明らかな結合の利点（すなわち１つだけの装置
及び手順でいくつかの項目の計量を行なうこと）を生ず
るばかフでなく、他の検定に通常必要なプロトコールを
単純化するためにも用いられよう。生体流体の免疫検定
はこの例であるが、これはこのような流体が一般的に懸
濁液であり、多くのプロトコールが免疫検定への準備と
して懸濁液の柚々の成分相の分離を必要とするからであ
る。このために本発明の好ましい実施例は免疫検定と組
合ぜたものであり、ここでの本発明の説明はこのような
実施例に関してである。ここで用いているディスポーザ
ブルは本出願人に権利譲渡された１９８２年８月２３日
付の関連米国特許出願第４１０，３４０号に示されてい
るものと同様であり、その基本的な勧進及び作用につい
てのさらに詳細な点についてはこれを参照するとよい。

第１図を参照すると本発明の趣旨によって形成された免
疫検定キット１０の縦方向の断面図が示されている。キ
ット１０は光ファイバー１２、毛ｌｆａ’ｆｌ　１４　
、ストツノ々１６を含む。

ファイバー１２はファイバーの軸の回シにほぼ回転対称
な設定された重体°角の範囲内でファイバーの端部に入
射する光放射全多数回の内面反射でその全長に伝えるよ
うにした長形のほぼ円筒形で光学的に透明な本体である
。ファイバー光学の技術において周知のように、ファイ
バーに入射しその中を伝わる放射についてのファイバー
の軸に関する最大受容角Ｂはファイバー及び周囲の媒体
の屈折率によって設定される。最初に屈折率ル。の媒体
中を伝わり入射面以外は屈折率ｎ２　の物質で囲まれた
屈折率町　のファイバーに入射する放射について最大受
容角は式 ％式％（１） から得られ、ここでＫＡ、はファイバーのいわゆバー１
２は検定される流体試料の屈折率（典型的には１３３近
くの屈折率を有する水溶液あるいは１３５近くの屈折率
を有する血清試料〕よりも犬き々屈折率を有するように
選択され、また流体に対して比較的不溶性で反応性がな
いように選択された、ガラス、水晶、ポリプロピレン、
ポリアミン、ナ゛イロン等いくつかの光学的に透明な拐
質のいずれでもよい。ファイバーの直径は２００μがよ
いことが知られているか、他の大きさのものも用いられ
よう。多くの検定で長さ２５間のファイバーで十分であ
ると思われるが、しかしながらファイバーの長さは行な
われる検定に適合され得ることがわかるであろう。

毛細管１４は光学的に透明な管で、その構成材質も検定
される流体に対し比較的不溶性で反応性のないように選
択されるのが好ましい。かくして毛細管１４はガラス、
水晶、ポリプロピレン、ポリオレンイン等の材質で形成
されるのが好ましい。

好ましい実施例において、毛細管１４はファイバ筒形の
孔を外している（例えば２００μのファイバーの直径で
は毛細管１４は約８００μの内径を有するであろう）。

ストッパ１６は毛細管］４の端部内に嵌合してファイバ
ー１２の端部１８を毛細管内にほぼ同軸に支持するよう
な形状及び大きさである。さらにストッパ１６は以下に
説明するように蛍光光度計にキット１０を設置するため
の硬い設置面を備えている。このためストッパ１６は毛
細管１４の外径と同程度の外径を有するフランジ２０と
、中心の孔２２と同軸の中心に配設された嵌め輪状の突
出部２１とが設けられている。孔２２はストッパ１６全
貫通しており、ファイバー１２の端部分取付ける大ゆき
になっている。好ましい実施例においてストッパ１６は
ファイバー１２の回りの適所に成形され、ストッパはシ
ロキサン等の低い屈折率の材質で形成されるのが好まし
い。ストッパ１６はさらに毛細管１４の内側と連通ずる
１つまたはそれ以上の通孔２３が設けられている。

ファイバー１２は端部１８以外のファイバーのほぼ全部
分毛細管の内側に露出させるようにストツ・ξ１６′ｆ
Ｋ：貫通してこれに支持され、端部１８の端面２４が毛
細管の外側の孔２２の端部に妨けられず重なり合うよう
になる。端面２４は平面状でファイバー１２の軸に垂直
に配置されるのが好ましい。端面２４はまた高度に透明
で、これに入射する光を散乱させようとする汚れがない
のが好ましい。このためには融解水晶のファイバー’ｋ
Ｗ開して十分な光学的面が与えられることが知られてい
るけれども端面２４を光学的に研磨してもよい。

端部２４と反対側のファイバーの端面２６も平坦に研磨
されるか襞間され、さらにファイバーの軸にほぼ垂直に
配設されたミラー・コーティング２８が施され、それに
よってファイ六−内に捕捉された放射がファイバーを二
重に通過するようになる。ファイバー１２１毛細管１４
、及びストッパ１６の全体的な大きさはファイバーの下
側の端面２６か毛細管内に確実にあるように選択される
。

放射がただ１回通過するのでよけれはミラー・コーティ
ング２８を施す必要がないことがわかるであろう。しか
しながらこのような実施例では、装置の作動についての
以下の説明から明らかなように、試料の容積をエバネセ
ント波によって決定される領域に限定するために、端面
２６孕不、透明にするか、毛細管１４の外側に配置する
か、あるいは測定時に流体試料に接しないように他の形
に配置することが必要である。

キット１０として組立てる前にファイバー１２は後述の
ように検定が行なわれる円筒面の領域３０を活性化する
コーティングが施される。好ましい実施例において、活
性化される領域３０はファイバーの両方の端部上に延び
る、例えば低い光学的指数のシリコンからなる化学的及
び光学的に不活性なコーティング３２ＶＣよってファイ
バー１２の内の所定の長さに制限されている。しかしな
がら活性化される領域３０の大きさは他の手段で制御さ
れてもよく（例えはコーティングの際にファイバーをマ
スキングすることによって）、ファイバー１２の全長を
活性化し毛細管１４内にあるファイバーの長さを慎重に
制御することもてきることかわかるであろう。

ここで第３図に移ると検定すべき試料４３を充填したフ
ァイバー１２の活性化領域３０内におけるキラ）１０の
縦方向断面の部分がかなり様式化されて示されている。

領域３０内のファイバー１２の表面に多数の結合箇所４
４が設けられ、このうちのいくつかに対象となる抗体−
抗原複合体の部分が結合している。

（ここで用いる「抗体−抗原複合体の部分」という用語
はこのような複合体の免疫反応性部分に関するもので、
完全な抗原とともにハプテンを、また完全な抗体ととも
に抗原反応性の抗体部分［ＦａＡ］ｉ含む。結合箇所４
４はまた複合体の補体部分に関し複合体部分の反応性（
例えば親和力、指向性）にそれ程影響分与えずに複合体
部分４６を固定するように選択されている。好ましい実
施例においてファイバー１２はガラスまたは水晶からな
シ、結合箇所４４は３−アミノプロビルトリメトキシラ
ーネ等のシＩＪ　）し化合物等の反応性基であり、複合
体部分４６は免疫グロブリン（ＩｎＧ）等の抗体である
。前述のようにとの砦定の固相体の結合に関して結合箇
所４４及び複合体部分４６は抗体のカルボキシル末端に
よって結合し、それによって抗体の抗原反応性のアミノ
末端分遊離させる。ファイバー１２のガラス面を形成し
、これにシリル化合物を付加し、シリル結合によシ抗体
をガラスに結合させる方法はライ−トール（Ｗｅｅｔａ
ｌｌ米国特許第３，６５２，７６１号）Ｋよって開示さ
れているが、ここにはカルボキシル、アミン、及び他の
抗体または抗原（またはそれらの断片）の反応性基が種
々の無機材質に共有結合するよう外方法及び他のシリル
化合物についての開示もなされている。抗原または抗体
ケ重合体に固定するための広範な技術も存在することが
わかるはずであシ、また抗原または抗体の結合箇所４４
は重合体のファイバーにも設けられることが当業者に理
解されよう。かくして例えばファイバーｊ２がナイロン
（ポリアミドｓ）からなるものであれば、結合は重合体
の官能基に結合した水素に適当な基に！換した形になろ
う。

結合箇所４４はまた周知のように抗体−抗原の結合過程
の立体障害を最少にするのに十分なファイバー１２と複
合体部分４６との間隔ができるようにするだめのスペー
サー基ｒ備えてもよいことがわかるはずである。例えば
ペプチドゝ結合によりファイバー１２に結合しそれぞれ
蛋白質部分４６、０カルボキシルまたはアミン末端に共
有結合するための遊離したアミノ基及びカルボキシル基
を与える１、６のジアミノヘキサンまたは６アミノヘキ
サン酸の場合のように、結合箇所４４はポリエチレン鎖
を含むこともある。これらの結合材質ついずれも末端の
間の６〜炭素鎖を与えるもので、それにより複合体部分
４６にファイバー１２から対応する距離だけ離す。同様
に適当な結合及びスペーサーの材質は免疫検定と親和性
クロマトグラフィの両方の技術において周知である。

好ましい実施例において、ファイバー１２は指示番号４
６Ｇで示されるような結合済みの結合箇所を有する複合
体部分が設けられておシ、この部分は拮抗的免疫検定の
ために一部において標識された補体５０が付加される。

かくしである実施例において複合体部分４６は抗体であ
シ、標識された抗原またはハプテンを予め包含させてフ
ァイバー１２のコーティングに付加させることがなされ
る。標識された成分５０の各々は所定の量の発蛍光団５
２を備え、それによって標識となる。標識に関係する將
定の蛍光性化合物はフルオレセイン、テトラメチルロー
ダミン、希土類キレート化合物等である。蛍光性標識を
蛋白質に連結させる方法は周知であｐ、市販の蛍光性化
合物の多くは蛋白質との連結のための基を有する。拮抗
的免疫検定については結合箇所４４の固定部分にアルフ
ミン等の免疫的に不活性な蛋白ｇ２設けるのが好ましい
。

ファイバー１２の活性領域はまた一定量の免疫的に不活
性な蛍光性物質５７でコーティングされている。蛍光性
物質５７は試料または試薬に対し反応性がないが試料の
懸濁相に溶解するように選択される。かくして血液全体
に関する検定について　蛍光枇物勿ζ７け泪白唇ｆ報Ｉ
Ｆ爾姓萌ＺＧ／血清に溶解するように選択される。さら
に蛍光性物質５７は標識された補体５０に付着された蛍
光性標識が発するのとは異なる波長で蛍光を発するよう
に選択されている。それからまた蛍光性物質５７は蛍光
性標識を抑制しあるいはこれに抑制さ゛れないように選
択、される。かくして放射の抑制を避けるために１回の
検定に用いられる蛍光性物質の各々は他の蛍光性物質の
放出ピークの近くに吸収ピークをもたないことを基本に
選択される（すなわち蛍光性物質５７及び標識された補
体の標識はそれぞれ他方の蛍光放射帯に重なる励起帯付
もたないことを基本に選択される）。

蛍光性物質５７に用いられる物質にはローダミンＢ（Ｃ
，、Ｉ。４４５１７０　）、アクリジン・オレンジ（Ｃ
０■、／１６．４６００５）、硫酸ベルベリン（ＱＩ。

４７５１６０）、メチレン・ブルー（Ｃ０■、／１６５
２０１５）、チオニン（Ｃ０工、／ｌ６５２０００）、
ピレン、アストラゾン・オレンジＲ１種々のシアニン（
３，３’ヨウ化ジエチルオキサジカルボシアニン等）、
キナクリン、臭化エチジウム及びその他のものが多くあ
る。蛍光性物質５７は容易に観測されるのに十分な量た
け、たたし自己吸収音生ずるほどの量ではないように予
め包含される。これらの場合に蛍光性物質５７は予期さ
れる容積の試料の懸濁流体成分中に完全に溶解するであ
ろう。

目標として、また物質及び試料による変化に従って、蛍
光による検定の技術者に理解されるように、蛍光性物質
５７は典型的にはファイバー１２の活性領域３０と毛細
管１４の近接する壁部との間の空間にある純粋な流体の
容積中に約１０−９ないし１０−６モル溶解度をなすよ
うに予め包含されよう。

蛍光性物質５７は水素結合等によりファイバー１２に弱
く付着している。

コーティングは以下のように吸着現象を用いて一定した
表面成分を有するように形成され得る。

適当な試薬の濃度で形成されたコーティングの溶液につ
いて、適当な表面結合基４４で活性化されたファイハー
ヲ単に没入させることによシ表面の単層の化学的に結合
した蛋白質が生ずるであろう。

例えばこの層の活性蛋白質に対する免疫グロノリンの比
率はそれらの溶液中での比率（に一致はしないが）によ
って与えられよう。免疫グロブリンの活性箇所を標識さ
れた抗原でどのように部分的に充填してももちろん溶液
中のレベルに維持されよう。

浸漬させた後にファイバーはコーティング溶液から取外
される。接着する液体層による付着する試薬の同伴ケ防
ぐため、それからファイバーか蒸発の生ずるより前に迅
速に洗浄される。蛋白質の層は共有結合しているのでこ
の過程で除去されないであろう。１層より多くの蛋白質
の結合を防ぐために、二重作用のある試薬が蛋白質の正
味包含葉ヲ変えることがあってはならす（これはコーテ
ィング溶液のｐＨを調整することによって、制御するこ
とが可能である）、またスは−サーの腕が長過ぎてはな
らない。

キット１０は蛍光光度計５９　（第４図）と共に用いる
こと？意図している。蛍光光度計５９は光源６０、ビー
ム・スプリッター６２、結像光学系６４、フィルター６
６Ａ、６６Ｂ及び６６Ｇ、検出器６７Ａ、６７Ｂ及び６
７Ｇ、参照光検出器６８、比率増幅器７０Ａ、７０Ｂ及
び７０Ｃ，及びディスプレー７２からなる。

光源６０は試薬の両方の成分において蛍光を励起させる
ように、蛍光性物質５７及び標識として用いられる発蛍
光団に基づいて選択された、適当な周波数の光学的放射
を与える。光源６０は蛍光ケ最犬にするように選択され
た狭い波長帯だけにこの放射音発生させるのが好ましい
。それゆえ光源６０は典型的には好ましいタングステン
−ハロゲン・ランプ及びこれに結合した電源供給部のほ
かに帯域フィルターを含む。あるいは光源６０は水銀ラ
ンプ、フラッシュ・ランプ、あるいはレーザーのような
他の光＃を備えるようにしてもよいことが理解されよう
。光源６０は葦たファイバーの開口数に対応する入射角
より大きな入射角で光線が端面に入射しないようにして
光学系が光源の開口全端面２４上に結像させることがで
きるように光学系６４孕適当な傾斜角度のビームで照射
するための適当なビーム成形開口及Ｏ・光学系分合むこ
とが当業者に理解されよう。

光源６０と光学系６４との間にビーム・スプリッター６
２が挿入される。ビーム・スプリッター６２はいくつか
の同様な放射ビームをある位置から他のいくつかの位置
に種々反射させ透過させることができる多くの周知の光
学系のいずれでもよい。カぐシてビーム・スプリッター
６２は半透鏡あるいは同様な部分ケ備えたものであり、
また光源６０から光学系６４に、光学系６４からフィル
ター６６Ｇに向けて高い周波数（短い波長）の蛍光励起
放射を投射し、また光学系６４からフィルター６６Ａ及
び６６８に向けて低い周波数（長い波長）の放射全投射
するように設定しである。ビーム・スプリッター６２は
さらに周知の手段により光学６０から参照光検出器６８
に向けて選択された周波数の放射を投射する形態になっ
ている。

光学系６４は光源のビーム成形開口の像で端面がちょう
ど一杯になるようにファイバー１２の端面２４上に光源
６０を結像させるように選択され、光線の最大入射角は
ファイバーの開口数に対応ずる角度以下であるように選
択される。光学系６４はまたファイバーの開口数にわた
って端面２４を出るほぼ全ての放射を集め端面音光検出
器６６Ａ１６６Ｂ１及び６６Ｃにおいて結像させるよう
に選択されている。ファイバー１２の適正な位置全設定
する補助として、蛍光光度計５９はストッパ］６の嵌め
輪状の突出部２１を受ける大きさであって端面２４を光
学系６４に対して適切に位置決めするように配置された
開口板６５のような位置決め手段を設けるのが好ましい
。

検出器６７Ａ及び６７Ｂは光検出器ケ有し、その各々は
それぞれビーム・スプリッター６２とフィルター６６Ａ
及び６６Ｂを通じて光学系６４により検出器に向けて投
射式れるファイバー１２の端面２４の像を受けるように
記動されている。ビーム・スプリッター６２とそれぞれ
の検出器６７Ａ及び６７Ｂとの間にあるフィルター６６
Ａ及び６６Ｂはそれぞれ対応する光検出器上に入射する
放射全標識された補体５０の蛍光性標識及び蛍光性物質
５７の放出ピーク値に制限してそれぞれ他て例えば標識
がフルオレセインであって蛍光性物質５７が臭化エチジ
ウムであれば、フィルター６６Ａは大体５２０ｒＬｍの
波長（フルオレセインの蛍光のピークに対応する）の放
射帯を通過させ大体５８０ないし７００　ｎ’ｍの帯域
（臭化エチジウムの蛍光ピークに対応する）を排除する
ように選択されている。このような蛍光性物質の組合せ
に関して、５２０ｎｍの放射を反射させ５８０ないし７
００７Ｌｍの帯域を透過させるグイクロイック・ビーム
・スプリッターが用いられよう。フィルター６６Ｂの透
過−排除帯域はフィルター６６Ａの帯域の逆になるよう
に選択されるのが好ましい。その組果光学系６２で集光
される蛍光性標識からの放射が検出器６７Ａに入射し、
蛍光性物質５７による蛍光が検出器６７Ｂに入射する。

検出器６７Ａ及び６７Ｂはそれぞれ標識及び蛍光性物質
５７の蛍光ピークの領域に最大の感度を有するように選
択された光電増倍管（周知のように検出器の視野を端面
２４に限定するための視野光学系及び適当な電源を設け
である）を有する。

検出器６７Ａ及び６７Ｂはさらに帯域フィルターを設け
た光源６０に対応する遮断フィルターを設けるのが好ま
しい。

フィルター６６０及び検出器６７Ｇはまたファイバー１
２の端面２４から出る放射によって照射され、光学系６
４により集光され、ビーム・スプリッター６２によシ透
過されるように配置されている。フィルター６６’Ｃは
帯域フィルターを設けた光源６０の透過帯内にあるこれ
に入射する放射だけを検出器６７Ｃに透過させるように
選択され、検出器６’７　Ｃはこの放射に対して最大の
感度を有するように選択されている。検出器６７Ｃ！′
ｉまた必要に応じて電源供給部と、その視野をファイバ
ー１２の端面２４に限定するための視野制限絞り（図示
せず）とが設けられている。

参照光検出器６８はフォトダイオードであるのが好まし
いが、ビーム・スプリッター６２を透過する光源６０か
らの放射な遮ぎるように配置されている。参照光検出器
６８はビーム・スフリフ　ター６２によって透過される
光源６０のス啄りトル領域におけるピーク感度に関して
選択され、その視野を光源に制限するための適当な視野
絞９及び光学系を有する。

比率増幅器７０Ａ、７０Ｂ、及び７０Ｃはそれぞれ１対
の入力信号の比率に比例した出力信号を与えるいくつか
の周知の電子的手段のいずれかであシ、参照光検出器に
対するそれぞれの検出器の出力の比率に比例した信号を
与えるように参照光検出器６８の出力とそれぞれ検出器
６７Ａ、６７Ｂ、及び６７Ｇとに連結されている。例え
ば各々の比率増幅器は個々の検出器６６からの出力勿増
幅し、参照光検出器６８からの出力に反比例するゲイン
を有する可変ゲイン増幅器でもよい。

比率増幅器７０Ａ、７０Ｂ、及び７０Ｇの出力はディス
プレー７２に連結されその入力となる。

ディスブーレーア２は３つの電気的信号の各々に比例し
た視覚的信号を発生させるいくつかの装置のいずれかで
ちゃ、例えば１組のメーターまたはディジタル・ディス
プレー、マルチトレース型のストリップチャート記録計
等でもよい。

キット１０は種々の相が分離している試料で用いること
もできることがわかるけれども、主として懸濁液と共に
用いること全意図している。ここで用いている「懸濁液
」という用語は相互に混合しているが他方に対して溶解
していない２種類またはそれ以上の物理的に区別された
機械的に分離可能な部分（いわゆる系の「相」）を有す
る一様でない物理化学的系全意味している。以下に明ら
かになるように懸濁相（連続的あるいは外側の相あるい
は分散媒としても知られる）は本発明の装置の作動の少
なくとも一部分の間流体でなければならないけれども、
懸濁液の種々の相は同じ状態でも異なる状態でもよい（
すなわち気体、液体、あるいは固体）。

作動時にキット１０は検定ずべき試料中に浸漬される。

通孔２３により毛細管１４の端部が一度試料中に浸漬さ
れると毛管作用によってこれか充満する（提案されてい
る管の直径について充満させるためにファイバー分傾斜
させて保持するのが有利であろう）。

かぐして毛細管１４が溶液中に浸漬されると一定量の試
料がこれに引込まれて完全に充満できるようになろう。

実際に充満した毛細管が必要とされるのではなく、液体
がファイバー１２の活性領域３０全体螢カバーするだけ
で十分である。この状態は毛細管１４の壁部全通して試
料がファイバーの上側の非活性化コーティング３２をカ
バーするのを観測することによって検証されよう。従っ
て毛細管の長さとそれが完全に充満するのをイ′＾密に
制御することは必要でない。

ファイバー１２が一度試料中に浸漬されると、蛍光性物
質５７は試料の懸濁流体相中に浴解し始め、拡散により
ファイバー１２の活性領域３０と毛細管１４の近接する
壁部との間にある懸濁相合体に一様な濃度になろうとす
る傾向がある。同時に試料内の対象となる免疫的に反応
性のある部分と標識された補体５０とがファイバーから
離れて、またファイバーに向かって拡散してゆく。懸濁
相内で蛍光性物質５７の一様な濃度に達する速度は蛍光
性物質の大きさ、温度、及び試料の粘性による。これら
のパラメータの代表的な値に関し、活性領域３０の数百
μ以内の一様な濃度が１５分程度の持続時間で達せられ
よう。ファイバー１２に固定した免疫反応体の間の平衡
化に同程度の時間が必要である。（第３図は平衡に達す
る前の状態に対応する。ファイバー１２への蛍光性物質
５７の包含は中間の試料との平衡時に約半分の蛍光性物
質が溶解しているようにするのが好ましい。）このよう
な持続時間内に蛍光性物質５７が懸濁相に一様に溶解す
る試料の全容積（と対象となる免疫反応性部分で排除さ
れた懸濁相の容積と）は活性領域３０の長さだけのファ
イバー１２と毛細管１４との間にある容積にほぼ対応す
る。活性領域の大きな長さ対直径の比により必要な最少
の持続時間を適度に越える持続時間に蛍光性物質５７が
分散するだけの量の試料の長さが活性領域３０の長さに
非常に近くなっているようになる。

対象と々る場合において、免疫的に関係する部分のない
浮遊体７４（第３図）が試料４３中に懸濁している。所
望のデータベースの容積は１種類またはそれ以上の）懸
濁相の浮遊体７４の取囲む懸濁流体相の容積に対応する
。血液全体の場合浮遊体７４は試料の全容積の５０％ま
たはそれ以上を含む細胞（主として直径約７，５μの二
重凹形の円板状エリトロサイト）であシ、また＠濁流体
（この場合血清）はこれに対応して残９の容積を含む。

浮遊体７４に対し反応性がなく溶解しないように選択さ
れた（あるいは細胞の場合、少なくとも細胞膜と反応し
たりこれに透過した９しないように選択された）蛍光性
物質５７は単に懸濁流体相とともに分散している。予め
決定された量の蛍光性物質５７が活性領域３０とこれに
近接する毛細管１４の内壁とによってほぼ決定される容
積内にある懸濁流体相全体に一様に分散できるようにな
っているので、蛍光性物質の酸度は懸濁流体相の容積に
ついての量になる。

かくして蛍光性物質５７の一度と、それゆえ（消失を考
えないで〕蛍光性物質による懸濁流体の単位容積当シの
利用可能な蛍光の量は蛍光性物質が分散している懸濁相
の全容積とは逆に変化し、ファイバー１２及び毛細管１
４の形状とディスポーザブル１０内に予め包含された蛍
光性物質の量とによって設定される懸濁相の浮遊体７４
がない場合に対応する最小値と、これらのパラメータ及
び懸濁相の特定の浮遊体の場合に達せられる最密状態に
よって設定される最大値と？有する。推奨される濃度に
おいて、蛍光性物質５７の自然消失は無視できる程度で
ある。従って既知の量の懸濁流体相の蛍光測定によシ検
定芒れる懸濁相の全容積に関する量が与えられる。

持続時間後にキット１０が蛍光光度計５９内に置かれ、
ストッパ１６がファイバー１２の端面２４を蛍光光度計
の光学系に対して適当な位置に設定するように協働する
。発蛍光団５２及び蛍光性物質５７に蛍光を励起させる
ように選択された波長の放射が、ファイバーの開口数で
決定される円錐角内でファイバー１２の端面２４を照射
するように、ビーム・スプリッター６２及び光学系６４
を介して、光源６０によって供給される。その後にこの
放射は臨界角（第３図に光線５４で示される）またはそ
れ以上の角度でファイバー１２内に伝わシ、ファイバー
の縦方向に沿って内面全反射して倍加する。その結果フ
ァイバーに近接する試料４３中にエバネセント波が生ず
る。

前述の関連米国出願箱４０６，３２４号及び第４１０；
３４０号に示されるように、ファイバーに付着した部分
４６に標識された成分５０及び標識されない成分５４ケ
拮抗的に結合させることにより標識されない成分に対す
る標識された成分の相対的濃度に比例した蛍光標識され
た複合体４６Ｃが生ずる。エバネセント波で励起すると
ファイバー１２に非常に近接している標識された初会体
４６Ｇが蛍光を発する。放出された蛍光の一部がファイ
バー内に通シ抜け、第３図に例えば光線５６で示される
ように臨界角を越える行路に沿ってファイバー内に伝わ
る。この全反射した放出蛍光の多くは端面２４において
ファイバーから出るが、ここで光学系６４により集光さ
扛、ビーム・スプリッター６２及びフィルター６６Ａ〒
介して検出器６７Ａに投射される。フィルター６６Ａは
標識された複合体４６０の蛍光ピークの波長帯に対応す
る放射だけが検出器６７Ａに透過するようにし、検出器
６７Ａの方はこの蛍光の強度に比例した電気的信号を与
える。ビーム・スプリッター６２は捷た光源６０からの
幾分かの放射が参照光検出器６８を照射するようにし、
参照光検出器６８は光源の強度に比例した電気的信号を
与える。

これら２つの電気的信号は比率増幅器７０Ａにより光源
の強度変化についての補正を行なった固定した標識され
た物質の蛍光強度に比例した電気的出力信号を発生させ
るような比率にされ、ディスプレー７２で表示される。

同様にしてエバネセント波はファイバー１２に非常に近
接した蛍光性物質５７０部分の蛍光を励起させる。ファ
イバー１２内に通シ抜けて戻り端面２４から出るこの蛍
光の部分は光学系６４、ビーム・スプリッター６２、及
びフィルター６６Ｂを介して検出器６７Ｂに入射する。

検出器６７Ｂからの信号と参照光検出器６８との比をと
る比率増幅器７０Ｂは光源強度の変化について補正ケ行
なったファイバー１２に近接する蛍光性物質５７の部分
による蛍光に比例した信号を与える。この信号もまたデ
ィスプレー７２で表示される。

エバネセント波及び蛍光の通シ抜けによって設定される
、観測される蛍光領域の大きさは、ファイバー１２の活
性領域３００大きさとともに、懸濁流体相の一定した容
積、一定した形状の浮遊体の占めることができるこの容
積の割合を制限する層の厚さを設定するものである。例
えばファイバー１２の表面に接触するように分布した７
５μの　球の、容積で約５０％の濃度を考えよう。この
ような状態で、各々２２０μ３０球が平均的に約４４０
μ　の懸濁流体で取囲まれている。この容積比は六方形
でなく立方形に載架することにより容易になされ、また
ファイバーの表面において球形の浮遊体との各々の（微
小な）接触点について約５６μ２の懸濁流体があること
になろう。例えばファイバーの１００ＯＡの表面の範囲
内に各々の球形の浮遊体は約Ｏ１１μ３のの容積ケ有し
、また各浮遊体について約５５μｓの懸濁流体があるだ
ろう。このような場合推定される一定容積の懸濁流体に
おける蛍光性の々い浮遊体を抽出することにより観測さ
れる蛍光の減少を考えないことで検定される懸濁流体の
全容積の評価に無視し得る程度の誤差が生ずる。実際に
数百Ａ程度の半分の厚さを有する観測される蛍光領域が
得られよう。それゆえ本来それ以上の容積測定精度が得
られるかもしれない。しかしながら実際には対象となる
浮遊体について生じ易い塑性流動のために上記の例で示
される精度は得られないであろう。

有効な蛍光励起領域における吸収損失の補正全行なうた
めに、ファイバー１２に近接する試料の吸収量が減衰全
反射によって観測される。試料４３に吸収されるエバネ
セント波の強度の部分はファイバー内の全反射した放射
の強度の同様な減小となる。ファイバー内で端面２４か
ら端面２６の方へ伝わる放射はミラー・コーティング２
８で反射され、（より少量の反射及び吸収の損失分が）
端面２６に戻る。光学系６４はビーム・スプリッター６
２及びフィルター６６Ｇ＊介してこの放射を検出器６７
Ｇに結像させる。フィルター６６Ｇは検出器６７Ｃによ
って観測されるスペクトル域を光源の帯域フィルターの
スペクトル域に制限する。カクシて検出器６７Ｇはファ
イバー１２の二重通過捷たは系内のどこかで損失されな
い光源６０による放射を観測する。検出器６７Ｃの電気
的出力は比率増幅器７０Ｇにより参照光検出器６８の出
力との比がとられて、系の透過度に比例した光源の変化
を補正した出力となる。この信号もまたディスプレー７
２で表示される。既知の系の損失で較正された透過度は
試料４３による吸収についての量である。これらの損失
の割合は試料中の蛍光性物質による励起放射の吸収によ
るが、対象となる濃度についてこのような損失は小さい
。

カくシてエバネセント波内での工１）　＋−ロザイトの
よ一部な高い吸収性の浮遊体７４は減衰全反射によって
容易に観測され計量されよう。

本発明はこれまで説明した装置に限定されるものでなく
、既に概略的に示した実験上のプロトコルに限定される
ものでもない。かくして毛細管１４内の試料は毛細管全
試別から取去った直後に毛管作用で保持されるであろう
が、試料の自由表面での蒸発により実際に毛細管内の試
料が減少するであろう。従って試料分集収した直後に毛
細管を非蛍光性のマスチックで密封するのがよいであろ
う。あるいは毛細管１１４におけるキラ）１１．０（第
２図）の指示番号９０で概略的に示されるように端部の
圧搾を行なうことにより試料が急速に蒸発しないように
保峻されよう。圧搾部９０はファイバー１２の下側の不
活性領域３２に対する領域に限定され、典型的にはファ
イバーの直径より約１００μ大きい最小の内径か与えら
れる（すなわち好ましい実施例の２００μのファイバー
について圧搾部６０の最小内径Ｂ杓３ｏｏμである）。

その他の全ての点でキット１１０はキット１．０と同様
となろう。

！、た試薬の、特に蛍光性物質５７の一部は毛細管内に
充填された粉末の形とすることもできるのが理解されよ
う（このような実施例では毛細管１１４の構造自体が推
奨される）。しかしながら蛍光性物質５７は寸たファイ
バーまたは毛細管１４の内壁に試薬のコーティング１３
０としてコーティングすることもできよう（第２図に示
される）。

また緩衝剤、凝固防止剤等のような他の試薬を毛細管１
４内に充填し、あるいはファイバーまたは毛細管にコー
ティングしてもよいことが理解されよう。

さらにファイバーの直径はその長さの方向に一定である
ばかりでなく、デイスポーザズル毎にも一定でなければ
ならないことがわかるであろう。

他方試料の全量はテスト毎に一定であるが、試薬の量は
変化するであろう。この精度の必要性は標識された抗原
を試薬ののコーティング１３０（第２図）として毛細管
の内壁にコーティングすることによって避けられよう。

このことはファイバーだけでなく毛細管に対する直径一
定の必要性分縮減させることになるであろうが、これは
毛細管の直径の増加によって試薬の量たけでなく試料の
愈も増加し、またファイバーについては反射の回数の減
少によって結合箇所の数に生ずる増加が補償される（照
射の総量がファイバーの最小直径に整合されているとし
て）からである。

またファイバー１２及び毛細管１４は正円の筒体とは異
なるものでもよく、例えは毛細間隔を有する１対の平行
な平板でもよいことが理解されよう。

さらにまた本発明の装置及び方法は免疫検定に限られる
ものではなく、懸濁液の相の相対的容積についての補正
が必要でこのような容積の追加測定が望まれるような他
の検定にも用いられることが理解されよう。実際に前述
のように本発明の方法及び装置はまた単に懸濁液の相の
相対的容積ケ計量するために１種類だけの試薬（溶解性
の蛍光性物質５７）とともに用いること葡意図している
。

かくして懸濁液が血液全体であれば、細胞の容積または
へマドクリットを計量するために血清に溶解する蛍光性
物質が用いられよう。このように用いる場合、ファイバ
ー１２の活性領域３０に通常固定した抗原または抗体の
部分４６が設けられるのではなく、またキット１０が標
識された補体５０分包むこともないであろう。また単に
懸濁液の相の相対的容積ケ計量するために標識された補
体５０の標識の蛍光のピークとなる領域に対応するチャ
ンネル（フィルター６６Ａ、検出器６７Ａ１及び比率増
幅器７０Ａ）が設けられていない単純化された蛍光光度
計５９が用いられることが理解されよう。

ここに説明した本発明の範囲から逸脱せずに前述の方法
及び装置に以上のような、さらにまた他の変化を加える
ことができるので、これまでの説明に含まれ添付の図面
に示されている全ての事項は例示的なものとして解すべ
きであシ、限定的な意味に解してはならないものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の好ましい実施例をなす免疫検定
のディスポーザブルの縦方向断面図である。 第２図は本発明の免疫検定キットの他の実施例の、第１
図と同様な図である。 第３図は本発明の実施の際の典型的な免疫化学反応ケ示
す第１（または２）図のキットの一部の様式化した図で
ある。 第４図は本発明の免疫検定キットとともに用いるための
例示的な蛍光光度計の部分的概略図及びブロック・ダイ
アダラムである。 １〇−検定装置 −１２−ファイバー（光学的素子） １４−毛細管 １６−ストッパ（位置決め手段） ４３−試料　５７−蛍光性物質 ５９−蛍光光度計　６０−光源 Ｈθ／　Ｆ／θ２ Ｆ／６３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、懸濁流体の第１の容積の限度を決定するための手段
   と、 上記懸濁流体の内のある特定の流体相に溶解性でちゃ、
   そのようにｄ解した際には光学的に励起されると蛍光放
   射を発することができる予め設定された量の蛍光性物質
   を上記第１の容積内に混入させるための手段と、 上記第１の容積内において、主として上記虐濁流体の内
   の１つだけの相に限定され、上記蛍光性物質が光学的に
   励起され観測されるだけの第２の容積の限度を決定する
   ための手段とからなることを特徴とする懸濁流体の検定
   に用いるための装置。 ２、第１の所定の帯域の励起放射に応じて第１の周波数
   帯にわたる蛍光放射を放出することができる蛍光性標識
   を備えた抗原−抗体の複合体を含む懸濁流体の試料の免
   疫検定に用いるための装置において、 上記懸濁流体の試料の内の第１の容積の限度を決定する
   ための手段と、 上記懸濁流体の試料のある特定の流体相に溶解性であシ
   、溶解した際に第２の所定の帯域の励起放射によって励
   起されると第２の周波数帯にわたって蛍光放射を放出す
   ることができる予め設定された量の蛍光性物質を上記第
   １の容積内に混入させるための手段と、 上記第１の容積内において、主として上記懸濁流体の１
   つだけの相に限定され、上記第１及び第２の帯域の蛍光
   が励起され観測されるだけの第２の容積の限度全決定す
   るための手段とからなることを特徴とする上記装置。 ３、上記第１の容積の限度全決定するための手段がさら
   に（ｃＬ）上記第１及び第２の９１定の励起放射帯域の
   放射と、上記第１及び第２の周波数帯域の放射とに対し
   て透過性の光学的素子と、（Ａ＋該素子を毛細管の大き
   さの離れた状態で少なくとも部分的に収容する大きさの
   長形の収容手段と、（Ｃ）上記素子を上記収容手段との
   上記能れた状態で位置決めするための手段と分有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲２に記載の装置。 ４、上記光学的素子が光ファイバーであり、上記長形収
   容手段が毛細管であり、また上記予め設定された量の蛍
   光性物質を与えるたト〈段が上記毛細管の内壁の少なく
   とも一部に施された溶解性の試薬のコーティングである
   ことを特徴とする特許請求の範囲３に記載の装置。 ５　蛍光性物質の蛍光に対して透過性であ、！ｌｌｌま
   た懸濁流体の試料の特定の流体相に溶解性上記蛍光性物
   質の蛍光を励起させることができる励起放射に対して透
   過性である光学的素子ケ用いる懸濁流体の検定のための
   方法において、上記光学的素子の既知の範囲全検定され
   る流体試料中に浸漬させ、 上記既知の範囲が上記流体試料の既知の厚さの薄い層で
   完全にカバーきれるように上記光学的素子の浸漬全制御
   し、 予め設定された量の上記蛍光性物質を上記既知の範囲及
   び上記既知の厚さによって設定される容積の上記流体試
   料中に混入させ、 上記蛍光性物質を上記容積内に分布させる拡散過程に必
   要な時間を越える時間だけ上記光学的素子全上記容積の
   流体試料中に維持し、上記特定の流体相中に溶解した上
   記蛍光性物質の蛍光をエバネセント波によって励起させ
   るように上記光学的素子に放射を照射し、上記蛍光の強
   度を測定する ステップからなることを特徴とする上記方法。 ６、上記懸濁流体の個々の相が上記容積中に上記放射の
   エバネセント波を形成するように実質的に異なる別個の
   透過度を示すような放射で上記光学的素子を照射し、 減衰した全反射で上記懸濁流体試料による上記放射の吸
   収を測定する ステップをさらに含むこと葡特徴とする特許請求の範囲
   ５に記載の方法。 ７、上記吸収は上記懸濁流体の個々の相の１つがほぼ透
   明であり上記懸濁流体の他の相が吸収性となる周波数を
   含む周波数に対応する周波数のものであることを特徴と
   する特許請求の範囲６に記載の方法。 ８、懸濁流体試料中の検定される抗原−抗体複合体の一
   成分として含まれる蛍光性標識の蛍光全励起させること
   ができる励起放射に対して透過性の光学的素子を用い、
   該光学素子が上記懸濁流体試料の特定の流体相に俗解性
   の第２の蛍光性物質の蛍光を励起させることができる励
   起放射に対しても透過性であり、また上記標識及び上記
   第２の蛍光性物質に対しても透過性で６Ｃ１その表面の
   既知の範囲に付着された上記抗原−抗体複合体の選択さ
   れた部分分有するようにした免疫検定のための方法にお
   いて、 上記複合体全形成するように検定される懸濁流体試料中
   に上記光学的素子全浸漬させ、上記既知の範囲が既知の
   厚さの薄い層の上記試料で完全にカバーされるように上
   記光学的素子の浸漬ｒ制御し、 上記既知の範囲及び既知の厚さによって設定される容積
   の上記懸濁流体試料中に予め設定された量の上記第２の
   蛍光性物質ヶ混入させ、拡散過程に必要な時間を越える
   時間だけ上記浸漬゛された光学的素子全維持して上記容
   積の懸濁流体試料を排除し、 上記素子に付着した上記複合体の標識と上記特定の流体
   相に溶解した上記第２の蛍光性物質との蛍光をエバネセ
   ント波で励起させるように上記励起放射で上記光学的素
   子を照射し、上記蛍光の相対的強度を測定する ステップからなることを特徴とする上記方法。 ９、上記懸濁流体の個々の相が上記容積内に上記放射の
   エバネセント波を形成するようなかなりの吸収な示す周
   波数帯域の放射で上記光学的素子を照射し、 上記懸濁流体試料による上記放射の吸収音減衰した全反
   射で測定する ステップ倉さらに含むと・と全特徴とする特許請求の範
   囲８に記載の免疫検定の方法。 １０　上記周波数帯域が上記懸濁流体の個々の相の１つ
   がほぼ透明であるような周波数に対応し、上記懸濁流体
   の他の相が吸収性であるような周波数を含むことを特徴
   とする特許Ｊ青水の範囲９に記載の方法。