JPH01304346A - 蛍光または光散乱の検知装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背県 発明の分野 本発明は、液体サンプル中の分析対象の存否に関連する
蛍光または光散乱を検出するための装置および方法に関
する。とくに、本発明は、液体サンプルの容量とは独立
の有限の検査容積を決定できるＪ：うに光ファイバーの
空間的配置が整えられた複式光フアイバープローブに関
Ｊる。各光ファイバーが可視光線を伝達するどきには、
一定の空間的配置を有づる第一および第二の光ファイバ
ーから発散する２つの光錐の交差として検査容量を可視
化することかできる。検査容積のサイズは、好ましくは
１０−”ｃｍ３未満の検出容積を作り出す、２本の光フ
ァイバーの空間的方向および光学パラメーターによって
決定される。本発明は、血液型判定のような臨床検査的
応用にとくに有用である。

技術状態 液体メジウム中に懸濁された０、０５〜１００ミクロン
の範囲の細胞または他の粒子は、その液体を流動させて
検出容積を与えるような微細流または微小滴を作成し、
その粒子によって散乱されるレイリーおよびラマン光散
乱を含めた光線またはたとえば蛍光による粒子からの放
出光をモニタリングづることによって個々に検出されて
きた。

小容積からの光散乱の基本的原理は流動細胞計測計に使
用されている。粒子の検出に光散乱および蛍光を用いた
装置は市販されている。

１９８５年１２月１９日に公告されｌこｐ　ｃ−ｒ特許
出願公告Ｗ０　８５１０５６８０号には、液流を限定す
るために用いられる開孔板−におよびその周囲に配置さ
れた多重光ファイバーを包含する、流動細胞８１測３１
用の光学システムが記載されている。

Ｂｒ１ｇｇ５　（米国特許箱４．５６４．５９８１は、
小容量に局限されない粒子の検出の原理について述べて
いる。その記載によれば、小容積の検出は、大量の懸濁
液にきわめて狭いたとえば１０〜１００ミクロンの光線
を照射し、液体中に浸漬した光ファイバーを通して送達
し、ファイバーの先端で散乱した光をビームスプリッタ
−を通してファイバーを逆行させて集めることによって
達成される。

粒子の照射と放射光の収集に同じファイバーを用いるこ
とから、この方法は一般に、放射光が蛍光の場合のよう
に波長シフトしているときのみ有用である。これらの条
件下では、ファイバーの内部散乱は濾光されで除かれ、
シグナルの検出が可能になる。しかしながら、蛍光を検
出する場合でも、バックグランド散乱により感度は制限
される。原理的には多波長でのモニタリングを行うこと
ができるが、多数のスプリッターを使用Ｕ゛ねばならず
、これがシステムの価格および複雑さを増大させる。

他にも、粒子からの散乱光および放射光を検出、測定す
るだめのデバイスおよび装置が報告されている。英国特
許箱１，５０６，０１７号には、大物体（通常は径５＝
２０ｍのオーダーの球体）のサンプル被覆表面へ電磁波
を伝達し、そこからの電磁波を受ける２本の光ファイバ
ーを包含づる蛍光測定システムが記載されている。光フ
ァイバーはたがいに３０度未溝の小ざな角度で配置づる
のが好ましい。これらのファイバーは液体゛サンプル中
の容積を決定するために用いられるのではなく、事象の
存否が検査されるのみである。

１９８４年１１月２日出願の日本特許出願箱８４２３０
３０６＠　（１９８６８１′−５月２８日公告第６１１
１００３３号）には粒子の凝集を測定するための複数個
の光ファイバーの使用が記載されている。

前述の米国特許箱４，５６４．５９８号（Ｂｒｉｇｇｓ
）には、液体サンプル中の蛍光シグナルを測定するため
の、投射線の供給と励起シグナルの受信の両者を行う単
一の光ファイバーを有する光フアイバープローブが記載
されている。米国特許箱４，５３７，８６１号（Ｅｌｉ
ｎｇｓら）には、標識、結合リガンドーアンヂリガンド
複合体を予め定められた空間バタン中に定着させ、つい
でバックグランドシグナルに対するシグナルレベルを検
−〇　− 出するために走査できるイムノアッセイ法が記載されて
いる。１９８６年３月２６日に公告されたヨーロッパ特
許公告第０１７５５４５号（１９８５年１１月１１日出
願、出願箱８５３０６４５０゜９号）には、電磁シグナ
ルの強度を、揺動の平均持続に比べて持続の短いノンゼ
ロ区間にわたって自己相関する粒子の検出方法が記載さ
れている。

粒子の検出方法について述べているその他の文書として
は、米国特許箱４．４２１．８６０号（Ｅｌｉｎｇｓら
）および米国特許箱４，５６０，８８１号（Ｂｒ１（］
（１３）ならびにそれらに記述および掲載された参考文
献を挙げることができる。

発明の要約 本発明は、たとえば分析対象（たとえば粒子または他の
光散乱もしくは蛍光源）のような光学的事象発生要素の
存在によって生じる電磁波の揺動（たとえば蛍光または
光散乱）または温度変化による蛍光揺動のような光学的
事象（すなわち光ファイバーによって観察できる事象）
を液体中で検出する装置および方法を提供するものであ
って、本発明によれば液体の流動または必要な限定形状
もしくは容量への制限を行わず、同時にバックグランド
散乱を著しく低下させ、また多波長の照０４線を同時に
もしくは順次検査する方法が提供される。

本発明は、液体サンプル中への浸漬に適合した複式光フ
アイバープローブであって、入射電磁線（たとえば光線
）を誘導するように配置した第一の光ファイバーと、入
射電磁線から生じる散乱または発散電磁線（たとえば散
乱光または蛍光）を受ｃノで誘導するように配置された
第二の光ファイバーからなり、第一の光ファイバーと第
一の光ファイバーは光学的に結合されて、液体サンプル
の総容量とは独立に液体１ノンプル中の有限の検査容積
を決定づるように配置されたプローブを意図するもので
ある。決定される検査容積は１０−”ｃｍ３未満である
ことが好ましく、１０−”ｃｍ３未満であることがとく
に好ましい。検査容積は、２本の光ファイバーの末端を
、ファイバーに光源を照射したときの各光ファイバーの
先組を交差させることにより決定される検査容積を形成
するように、ファイバー／液体界面に空間的に配置する
ことにＪ：って形成される。光ファイバーは、第一の光
ファイバーから発散する光線は検査容積内に光学的事象
発生要素が存在しない場合には第一の光ファイバーから
の光線は実質的に第二の光ファイバーに入射しないよう
な第二の光ファイバーに対する相対角で投射されるよう
に、配置される。光ファイバーの中心縦軸は通常、交差
位置で約４０〜１４０度、好ましくは約４０〜８０度、
とくに好ましくは約６０±５度の範囲の夾角を形成して
交差するように配置される。夾角のほかに、各ファイバ
ーの液体／ファイバー界面における縦軸間の距離、ファ
イバーの同一平面度、ならびに各ファイバーのコア直径
および開口数は、検査容積の所望のサイズを決定できる
ように選択される。

本発明の複式ファイバープローブは、光ファイバーと液
体の界面における反射が補正ファクターにならず、キュ
ベツト壁からの反射によるバックグランドが最小限にな
る点でとくに有利である。

さらに、光ファイバーの物理的および光学的パラメター
、づ゛なわち開口数、コア直径および分離距離、ならび
に配置角度を適当に選択することにＪ：つて、検査容積
のサイズを問題のシステムに調整することができる。し
かも、散乱シグナルおよび蛍光シグナル、または２つの
蛍光シグナルを、出力ファイバーにおいて、ビームスプ
リッタ−および２セツトのフィルター、２個のフィルタ
ーをもつフィルターホイールまたはデマルチブレキリ゛
−の補助にＪ：り検出することができる。

図面の簡単な記述 第１図は、本発明の複式ファイバー光学的プローブを用
いた検出装置の全体を模式的に示した図である。

第２図は、本発明の複式ファイバー光学的プローブの断
面図である。

第３図は、第２図の複式ファイバー光学的プローブの末
端図である。

第４Δ図は、光ファイバーを好ましい空間的配置に保持
するためのプローブ挿入体の半分の正面図である。

第４Ｂ図は、第４Ａ図のプローブ挿入体の半分の側面図
である。

第５Ａ図は、光ファイバーを好ましい空間的配置に保持
するだめのプローブ挿入体の他の半分の正面図である。

第５Ｂ図は、第５Δ図のプローブ挿入体の半分の側面図
である。

第６図は、複式ファイバー光学的プローブの光ファイバ
ーの光学的結合を示す一装置と検査容積を例示する図で
ある。

第７図は、光ファイバーが非平面状の場合のシステムの
幾何的配置を例示する図である。

発明の詳細な記述 以上および以下の記述における「検査容積」の語は、定
められた方向性と物理的性質を有する第一およσ第二の
光ファイバーによって決定される空間容積を意味する。

この場合、一方の光ファイバーから発散される電磁放射
線（たとえば光線）にＪｚつで生じる電磁性（たとえば
光学的）事象（たとえば蛍光または光散乱）が第二の光
ファイバーによって検知される。検査容積は、各光ファ
イバーが可視光線を伝達する場合、定められた空間的配
置を有する第一および第二の光ファイバーから発散する
２つの光錐の交差として可視化することができる。「光
学的結合Ｊとは、一方の光ファイバーから発散される電
磁放射線（たとえば光線）によって生じる光学的事象（
たとえば蛍光または光散乱）が、光学的事象発生要素の
非存在下には第一の光ファイバーから発散する光線は第
二の光ファイバーには実質的に入射しないことを条件に
、第二の光ファイバーによって検知されるような環境を
意味する。すなわち、この場合、２つの光ファイバーは
［光学的に結合された」と考える。

第１図〜第５図を参照しながら説明すると、本発明の複
式ファイバープローブ１０は、電磁放射線（たとえば光
）源１６からの電磁放射線を伝達するだめの入力光ファ
イバー１２、おＪｚびついで収集された放射ｒＡ＜たと
えば散乱光または蛍光）を検知′ａ１８に伝達づ−るた
めの出力光ファイバー１４を利用する。放射線ｆｆ１１
６は、単一波長でも多重波長でもよく、慣用の方式によ
り必要に応じ適当に濾過してもよい。通常、２００〜１
５００ｎｍ、好ましくは４．００〜９００　ｎｍの波長
が使用できる。特定の波長によっては、所望のレーザー
が使用でき、ヘリウム／ネオンレーザ−が適当であるこ
とが明らかにされている。プローブ１０自体は、光ファ
イバー１２および光ファイバー１４がその中に配置され
る型取りしたプローブ挿入体４０を取囲む硬いシリンダ
ー状鞘部（たとえばステンレス管）２１から一般に構成
される、細長いプローブケース２０からなる。光ファイ
バー１２および１４はその外部、円周面上を慣用法で被
覆しく被覆は示されていない）、末端面２２および２４
で終結し、この面は通常高度に磨き上げる。

光ファイバー１２４３よび１４の末端は、挿入体４０に
にす、空間的、角度的に定められた配置に固定される。

通常、挿入体４０は２個の半シリンダー状の三方部分４
１および４９として塑造される。慣用の塑造月料が使用
できる。

一方の挿入体三方部分４１は、その底面に形成された湾
部４５（好ましくはＶ型の）とその表面に角度をもって
配置される溝部４４を有する下方部分４４をもつＪ：う
に形成される。溝部４４は面４２内に、その内部に置い
たとき光ファイバー１２および１４の縦軸が所望の角度
で交差するように、たがいに適当な角度で形成される。

挿入体三方部分４１の上方部分４３は、挿入体三方部分
４１と４９を合体させるときその配列を容易にするため
、挿入体の第二の半分４９上の咬合部に適合する孔部４
６および４８を形成させる。孔部４８の周囲のシリンダ
ー状突出部４７は完成された挿入体組立部においてスペ
ーサー手段として与えられる。

第二の挿入体三方部分４９は、その底面に溝部５２（好
ましくはＶ型の）を有する下方部分５０をもつように形
成される。挿入体三方部分４１と４９を合体させて完成
された挿入体組立部を形成させると、溝部５２は溝部４
５と一列になる。部分５０は、部分４２と相補性で完成
された挿入体組立部内では部分４２と直接隣接して、フ
ァイバー１２および１４を定められた空間的配置に捕捉
し、溝部４５と５４内に形成される液体／ファイバー界
面を与える。部分５１上には、挿入体組立部分４１内の
孔部４６おＪ：び４８とそれぞれ咬合するように配置さ
れた要素５３および５４が形成される。フランジ５５は
要素５４を取巻き、突出部４７と協同して挿入体４０の
完成された組立体内の正確な空間的配置を与える。

プローブ１ｏの製造時には、光ファイバー１２および１
４それぞれの発散および収集端の表面２２および２４は
高度に磨ぎ上げ、両末端は溝部４４内に位置させ、その
場所に通常は紫外線硬化エポキシで固定する。ついで、
鞘部２１を挿入体の周囲に配置し、エポキシで埋め戻し
硬化させると完成された一体の組立品が得られ、この内
部には光フアイバー面２２および２４が所望の様式で空
間的に配置される、。

全ブ］〕−ブシスデムの部分として、光ファイバ−１２
の入力端３０は、たとえば慣用の１個または２個以上の
レンズによって与えられる集束集団により、それ自体が
光源１６から受りて伝達した光を受取る。光ファイバー
１２は光を末端面２２からさらにプローブが挿入されて
いる液体ザンブル容指中に伝達、誘導する。検査容積内
に光散乱または蛍光のいずれかで出現づる粒子または溶
液から生じる光は出力光ファイバー１４によって末端面
２４で受けられ、その光ファイバーを介して伝達、誘導
され、そのファイバー１４の出力端３８に達する。発散
される出力光は通常、フィルター手段３６によって伝達
され、光電子増倍管３４による内蔵検知器３２内に受信
される３、慣用のシステム（たとえば高ゲインＥＭＩ光
電子増イ８管）が使用できる。フィルター手段３６は単
一もしくは多重帯域濾波器、または各種ビームスプリッ
タ−からなり、蛍光または散乱放射線を適当にモニタリ
ングする。このように発生し受信されたシグナルをつい
で慣用方法に従って処理する。

第６図を参照しながら説明すると、一般に■で指示され
る検査容積（図中には実線で二次元に表示）は、光ファ
イバー１２および１４それぞれの末端面２２および２４
から、両光ファイバーを活動させた（すなわち、光を両
ファイバーに伝達させた）場合に発散される各光錐の交
差容積によって可視化できる。検査容積のサイズは、入
力および出力光ファイバー１２および１４の液体／ファ
イバー界面における角度θおよび分離距離ｄ、ならびに
各ファイバーのコア直径（Ｄ）およびその開口数（Ｎ、
Ａ、）から決定される。第６図において、一般に角θは
２つのファイバーの開口数のアークサインの含ｉｔ　Ｊ
：り大ぎくなければならない。

この場合、開口数は、ファイバ一端に入射またはそこか
ら成用できる最頂光線の最大光錐の頂角αのサインに、
コアの頂点が存在するメジウムの屈折率を乗じた値であ
る。角θがこの合＠４と等しいかまたはそれより小さい
と、最外部の光線は、有限のまたは限定された容積を決
定することができない。しかしながら、角θは、一方の
ファイバーの光線が他のファイバーに入射できないよう
に１８０度から２つの開口数のアークサインの合計を差
引いた値よりも小さくな【プればならない。ｔ４ｉ純な
例として、光ファイバーが同じ光学的および物理学的性
質を有し、２つのファイバーの縦１１１１の交差点から
各ファイバー面の距離が等しいＪ：うに配置されること
が想定できる。検査容積■の妥当な評価は、角θが開口
数のアークサインの合計よりも比較的に大きい場合、次
の計算式で与えられる。

ａ−ａｒｃｓｉｎ（Ｎ、八、）　　である。

式中、Ｎ、Ａ、は開口数 りはファイバーコアの直径 ｄは縦軸間の液体／ファイバー界面における距離 θはファイバーの縦軸の液体／ファイバー界面にする交
差の夾角 である。この概算された検査容積は、第６図中に点線で
二次元に表示しである。

現時点での好ましい態様においては、光ファイバー１２
および１４は、コア直径５０ミクロン、被覆直径１２５
ミクロン、開口数０．２２の５０／１２５全シリカステ
ップ−インデックスファイバーから形成される。角θお
よび距１１１ｄはそれぞれ６０度および２００ミクロン
とするのが好ましい。６０度の方向は、たとえば凝集検
定で起こるにうな集塊が大きく高度に蛍光性である場合
に、限られた数の大きい、きわめて明るい粒子の、多数
のより小さい明るさのより低い粒子の存在下にお（プる
検出を容易にする検出容積を提供する。さらに、好まし
い配置においては、ファイバーは実質的に同一表面上に
ある。この複式ファイバープローブにＪｚって定められ
る検出容積は１０−５ｃｍ”未満、好ましくは１０−６
ｃｍ３未満である。

以下の表には、適当な様々のプローブ配置を例示する。

各場合とも、光ファイバーは同一表面にある。表に掲げ
られた容積は上述の式から決定される。いずれの場合も
、検査容積は、揺動分析またはパルス高分析で測定して
検査容積内に常に１個の粒子が見出されるまで検査容積
を通過する粒子の濃度を上昇させることにより測定でき
る。検査容積はこの粒子濃度の逆数である。・一般に、
検査容積■が小さいほど、大きい粒子濃度が測定できる
。

第７図を参照しながら説明すると、プローブ２０内に位
置するファイバー末端２２および２４の空間的関係は、
各ファイバー末端と縦軸が通過Ｊる一対の平行平面を作
ることによって決定できる。

この場合、平面間の距離をｈ１ファイバー間の稜角（線
０１ＰとＰＰ’　で決定される面と線ｏ２ｐ’　とＰＰ
’で決定される面の間の角Ｏ′　Ｐ′０２によって定め
られる）をθとする。

光ファイバーの末端が同一平面上にあるときくすなわち
、ｈ−Ｏ）、稜角は交差するファイバーの縦軸の間の夾
角となる。ここでの記述においては、ファイバー末端は
実質的に同一平面上にあるので、稜角と夾角は実質的に
同じであると一般に想定される。一般に、有限の重複容
積を与える最小θはアークサインＡとアークサインＢの
和より大である（ＡおよびＢは２つのファイバーの開口
数）。

好ましくはｈ＝ｏであり、０は４０〜１４０度、好まし
くは４０〜１２０度、とくに好ましくは４０〜８０度、
通常は約６０度である。

ｈ＝ｏのときには、光ファイバーをたがいにはば接触さ
せて、距離ＯＰおよび０２Ｐ′をできす るだり小ざくＪることが好ましい。重複容積の基準に合
致するならば、距１．０１Ｐおよび０２Ｐ′の高値も容
認される。ｈがＯでない場合には、光釦の至適な重複は
達成されず、その結果、一方のファイバーからの発散さ
れた入射光の強度の伯のファイバーによる収集は至適に
はならない。この感度の低下による不利益を償うものは
、この配置によって重複容積のリイズの選択ににり大き
な融通性が付与されることである。すなわち、ｈを増大
させれば、交差する光釦の重複容積を任意の所望の値に
まで小さくすることができる。この容積がＯになってし
まうほどｈを大きくしてはならないことは自明である。

実際上は、一方では容積の低下と他方では光収集の低下
の結果としてのシグナル強度の喪失との間の妥協が行わ
れることになる。さらに、ｈを大ぎくして小容積を限定
させた場合、容積は、両ファイバーの受容角度に対して
異常に敏感になる。後者は液体の屈折率で変動すること
から、このように構築されたプローブは屈折率に著しく
敏感になる。

ＯＰおよび０２Ｐ’の値も同様に、プローブ組立ての容
易性および再現性ならびに光収集効率のような実際的な
配慮によって決定される。一般に、ＯＰおよび０２Ｐ′
が大きくなると、重複容積は増大する。したがつて、Ｏ
ｌＰおよび０２　Ｐ’の最小値の選択が好ましいことに
なる。

光を伝達する各ファイバーの部分であるファイバーのコ
ア直径は１０〜２００ミクロンの範囲であり、好ましく
は２５〜７５ミク［１ンである。］ア直径は同一でも異
なっていてもよいが、同一とするのがとくに好ましく、
通常、光収集効率を損うことなく重複容積を減少させる
ために、コア直径よりも受容角を最小にすることが望ま
しい。］アサイズが異なる場合には、励起光ファイバー
のコアの方が小さいことが好ましい。光ファイバーの空
気中での開口数はＯ，ＯＳ〜０．７、あるいは０．０９
〜０．７を使用できる。ここに述べたタイプの適用では
、０．１１〜０．２４の開ｌ］数が使用でき、０．２２
が好ましい。角θは約４０〜１４０度とすることかでき
る。臨床的応用には、４０〜８０度が適当で、通常は５
５〜６５度が用いられ、６０度が好ましい、９０度また
はそれ以上の角度は、単純に蛍光粒子を数えるかまたは
任意の蛍光粒子を検出するより均一な検査容積を創製す
るのに適している。光ファイバーのファイバー／液体界
面における縦軸間の分離距離は通常、約０．０５〜１．
ＯＯｍの範囲で、好ましくは０．２ｍｍである。

一般に、本発明のプローブは、第一の光ファイバーのプ
ローブに対して遠位端を光に暴露して照射し、第二の光
ファイバーの近位端もしくはプローブ端によって集めた
散乱光もしくは蛍光を第二のファイバーの遠位端におい
て光子検知器によってモニタリングして使用する。粒子
の検出には、プローブ組立部を分析すべき液体サンプル
中に浸漬し、液体に対して移動させると、検査容積によ
って定められる小容積が多数、連続的に検査できる。照
射ファイバー１２の内部に生じた光散乱のこの方法での
検出ではその大部分が検出から排除され、それに応じて
バックグランドシグナルは低下し、感度は上昇する。慣
用の光散乱または蛍光のいずれかによる粒子の検出は、
たとえば慣用のパルス高分析または時間相関法によって
、散乱または発散光の変動をモニタリングすることによ
り行われる。

ある場合には、同一サンプルから蛍光およびレイリー散
乱の両者を測定することが望ましい。これを連続的に行
うことが必要な場合には、上述のシステムが使用できる
。同時測定が要求される場合には、出力ファイバー１４
の遠位端でレイリー散乱を測定し、蛍光は、スプリッタ
ーを用いて入力ファイバー１２を逆行する散乱光を集め
て測定することができる。たとえば、米国特許箱４，５
６Ｃ５９８号に記載されているような手段を使用するこ
とができる。他の慣用方法も同様に使用することができ
る。

上述の装置は事象発生要素（たとえば分析対象）の含有
が疑われる受光体の照射に使用すると、このような要素
の照射から生じるシグナルは、バラフグランド照射線に
比べて高められた様式で検出、測定できる。選択される
要素は、問題の測定システムに応じて、様々の実体とす
ることができる。

たとえば、要素は入射放射線に応じて蛍光または弾性光
散乱を発生する粒子であってもよい。入射放射線を吸収
し、粒子の存在が発散された全電磁シグナルの基礎値か
らの負の変動によって検出されるような粒子であっても
よい。その他の要素または対象の例としては、ある特性
を有しそれによって、その特定の特性をもたない同一の
実体よりも大きなシグナルの発散を生じる実体を挙げる
ことができる（たとえば、ある異常を有し、それがその
異常をもたない同一細胞よりも大きいまたは強力なシグ
ナルの発散を生じる細胞）。

本発明は、分析対象の量が観察される蛍光変動のパタン
に影響づるようなサンプル中の分析対象の定量にとくに
応用できる。分析対象は、リガンドとその相対する受容
体からなる特異的結合対の−ｉであってもよい。入力お
よび出力光ファイバー（ま、それぞれ、サンプル容量の
一部分の照射およびサンプル容量からの蛍光の受光に使
用される。

単一容量についである時間その容積内への粒子の出入を
観察することにより、もしくは同時にあるいは連続的に
複数個の容積を走査することにより、または両者を組合
せて、多数個の容積について観察が行われる。このよう
にして、蛍光に一定レベルからの予め決定された差を示
す容積の観察される割合を求めると、メジウム中の分析
対象の量と関連づけることができる。

蛍光の変動は、粒子と連続メジウムとの様々の組合せか
ら生じる。たとえば、その組合せには、非蛍光溶液中に
一定強度の蛍光を発する粒子、非蛍光溶液中に強度の変
化する蛍光を発する粒子、蛍光溶液中に蛍光を生じない
粒子、蛍光溶液中に蛍光を発生する粒子が包含される。

さらに蛍光の変動は、粒子の凝集、非蛍光粒子の蛍光粒
子への変化、蛍光粒子の非蛍光粒子への変化によって起
こるものでもよい。粒子は、いずれも天然もしくは合成
のポリマーからなるものでもよく、ウィル粒子およびｌ
ｌｌ１胞たとえば血球および細菌のような天然粒子でも
よい。粒子径は０．０５〜１００ミクロンの範囲で変動
してよいが、一般に合成粒子の場合は直径的０．１〜１
０ミクロンである。

上述の方法は蛍光検定法に採用することにより、多数の
プロトコールおよび試薬が使用できる。１群のプロトコ
ールでは、蛍光粒子の測定が包含される１、この群はさ
らに同一水準の蛍光を維持する粒子に分割される。すな
わち、基本的に２つの粒子集団、蛍光性または非蛍光性
粒が存在し、あるレベル以上の蛍光が陽性または陰性の
結果として定義される。本発明は、蛍光分子が直接抗体
くへｂ）に接合し、これがついで細胞に直接結合するプ
ロトコールにとくに右利なことが明らかにされている。

蛍光粒子の不均一集団は多くの方法で発生させることが
できる。たとえば、粒子の集合または凝集させることが
できる。分析対象は多価の結合部位を有する受容体また
は抗体であってもよい。蛍光粒子はリガンドと接合でき
るから、多価受容体は粒子どの間の架橋として働く。こ
の方法では、メジウム中に存在する分析対象の量が大き
いほど、生成する集合体の数は多くなる。問題の粒子は
ついで、２個以上または３個以上の粒子の集合ネイＩ子
として選択できる。さらに、適当な電子装置によって集
合のサイズが決定でき、また粒子の総数のみでなく、各
集団の粒子数も数えることができる。

集合のサイズが増大するとともに集合粒子の蛍光も増加
するが、集合中の粒子数の増加と直線関係にはない。

不均一集団が生成する第二の方法では、非蛍光分子があ
って、蛍光分子をメジウム中の分析対象の量または粒子
上の結合部位の数に比例して、その粒子に結合させるも
のである。たとえば、アンチリガンドに結合した蛍光分
子を使用することができる。リガンドは非蛍光粒子に結
合していてもよい。蛍光体接合アンチリガンドを分析対
象含有サンプルと合づると、分析対象がアンチリガンド
の結合部位を満たし、残った結合部位はサンプル中の分
析対象の量に関連する。リガンド接合粒子をメジウムに
添加すると、残りの蛍光接合受容体が粒子に結合し、蛍
光の異なる粒子のある分布が与えられる。

第三の方法も、集合体の使用で例示できる。この方法で
は、非蛍光粒子を使用し、連続相に蛍光をもたゼる。す
なわち、サンプル容量中に集合体が存在すると、観察さ
れる蛍光は実質的に低下する。これらの粒子は非蛍光性
であると同時に、励起された蛍光に対して不透明である
。しかって、集合体は影を作り、集合体の容積より実質
的に大きい容量で蛍光の検出を阻止する。

蛍光粒子の不均一集団を得る第四の方法は非蛍光粒子を
蛍光タグで標識するものである。たとえば、非蛍光粒子
は、細胞表面上に複数個の抗原をもつ細胞であってもよ
く、各抗原が多数存在する。

特定の表面抗原に対する蛍光標識を用いると、特定のセ
ットの非蛍光細胞が蛍光性になる。このような細胞の存
在の検出は、細胞同定、たとえば赤血球（ＲＢＣ）の分
類および型判定の方法になる。

たとえば、Ａ、８．０系では、蛍光タグを抗−へ抗体に
接合させた場合、サンプルがＡ型またはＡＢ型の△抗原
を含有寸れば結合が起こり、分析対象がＢ型またはＯ型
面液を含むときより、細胞の蛍光は著しく増大する。ま
た、細胞は、ヨーロッパ特許公告箱１７６．２５２号（
１９８６年４月２日公告）に記載されているような蛍光
性、細胞結合性染料を用いて標識することもできる。

抗体のほかに、ある種のレクチンがＲ８０表面抗原に様
々の程疫結合し、蛍光分析に使用するのに便利な受容体
であることも知られている。

通常は蛍光のレベルにある分布が存在するが、細胞表面
上の利用可能な結合を実質的に飽和してしまうのが適当
な場合もある。この場合には、非蛍光性細胞と実質的に
均一な蛍光をもつ細胞とほぼ２種の集団しか存在しない
。

現時点では好ましくはないが、赤血球（ＲＢＣ）の型判
定、または赤血球（ＲＢＣ）抗原もしくはそれに対する
抗体の同定に際して、ＲＢＣを、検知可能なシグナルを
与える蛍光粒子を用いる検定における蛍光消光体として
利用づ°ることもできる。

ＲＢＣ抗原に結合する物質、通常は抗体またはレクヂン
〈以下、受容体と呼ぶ）を蛍光粒子に抱合させる。粒子
抱合体の溶液を、適当な緩衝液中で、赤血球ｌｃとえば
全血と混合する。受容体に対して特異的な結合部位また
は決定部位を有する抗原がＲＢＣ上に存在すると、接合
粒子は蛍光消光体として作用するＲＢＣに結合する。

ＲＢＣ抗原に対する抗体の存在の決定も可能である。３
種の異なる方法を使用できる。第一の方法では、蛍光標
識抗体を血漿または血清中の抗体と、既知の群の試験Ｒ
ＢＣ上の抗原部位を競合さＵ゛る。特定の抗原に対する
サンプル中の抗体が増加するほど、観察される細胞上の
蛍光は減少する。

また、試験ＲＢＣを蛍光染色し、血清と混合したときに
特異的な抗体が存在すれば、蛍光性細胞が凝集するよう
にしてもよい。第三の方法では、蛍光性ビーズを問題の
表面抗原と接合させ、サンプル中に存在する抗体は、既
知の型のＲＢＣと蛍光粒子と接合した抗原との間の架橋
として働く。この場合、蛍光の低下は抗体の存在を指示
する。

蛍光物質には高い吸光係数が望ましく、１０゜０ＯＯｃ
メ１Ｍ−１を大幅に越えること、好ましくは１００　、
　ＯＯ０ｃｍ−１Ｍ−１以」二でなければならない。

また、蛍光物質は、高い量子効率を有するものでなけれ
ばならない。０．３〜１．０が好ましい。

さらに、蛍光物質は、好ましくは２０ｎｍ以上、さらに
好ましくは３０ｎｍ以上の大ぎなストークスシフ１へを
有することが望ましい。すなわち、蛍光物質は、最大吸
光と最大発光の間の波長に実質的な幅もしくは差をもつ
ことが好ましい。

多くの望ましい性質を有する１群の蛍光物質としてはキ
サンチン染料があり、これには３，６−シヒドロキシー
９−フェニルキサントヒトロールから誘導されるフルオ
レセインならびに３，６−ジアミツー９−フェニルキサ
ンチンから誘導させるロザミンおよびローダミンが包含
される。ローダミンおよびフルオレセインは９−０−カ
ルボキシフェニル基を有し、９−０−カルボキシーフェ
ニルキザンテンの誘導体である。

これらの化合物は、フェニル基上に置換基があるもの、
ないものとして市販されている。

他の群の蛍光化合物としては、αもしくはβ位、通常は
α位にアミン基をもつナフチルアミンがある。ナフチル
アミン化合物には、１−ジメチルアミノナフチル−５−
スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネ
ート、および２−ｐ−トルイジニルー６−ナフタレンス
ルホネートが包含される。興味のある他の蛍光物質とし
ては、クマリンたとえばウンベリフェロンおよび希土類
キレ−１〜たとえばＴｂ、Ｆｕ等がある。蛍光物質に関
しては、Ｂｒａｎｄら：＾ｎｎ、ＲｅＶ、ＢＩＯｃｈｅ
ｍ、、　４１　：８４３〜８６８　（１９７２）および
５ｔｒｙａｒ　：５ｃｉｅｎｃｅ、１６２：５２６（１
９６８）に記載されている。さらに、他の群の蛍光物質
としては、前述のヨーロッパ特許出願公告第１７６．２
５２号に記載されているスフアレー１〜染料がある。

適当な粒子を標準方法を用いて蛍光物質と合して蛍光ビ
ーズまたはマイクロスフイアを得る。蛍光粒子は市販さ
れている。蛍光ビーズの大きさおよび組成は広範囲に変
動させることができる。ビーズは通常、不活性材料で作
られ、複数の蛍光発先回官能性を包含する。ビーズは、
各ビーズあたりのシグナルが大きくなるように、十分な
濃度の蛍光官能性をもたせる。ビーズには様々な有機ポ
リマー、たとえばボリスヂレン、ポリメタクリレート等
もしくは無機ポリマーたとえばガラス、またはそれらの
配合物が使用できる。特定のポリマー材料の選択は、主
として便宜上の問題である。

蛍光ビーズに共有結合ま１＝は非共有結合によって接合
される受容体は、特定のＲ８０表面抗原、またはこのよ
うなＲ８０表面抗原もしくは興味ある他の抗原の決定部
位を有する抗原に対し特異的にまたは差別的に結合する
、モノクローナル抗体を含めた抗体またはレクチンであ
る。

受容体は、文献に詳細に記載されている標準方法を用い
て、蛍光ビーズに吸着させる。また、受容体は慣用技術
によって、共有結合させることもできる。

本発明の装置を使用する散乱光および蛍光の連続または
同時測定により、分析対象の存在に伴う第一の事象（た
とえば凝集）ｄ３よび第一の事象の検出を妨害でさる妨
害要素に伴う第二の事象（たとえば凝集の不存在）の検
出により、液体サンプル中にその存在が疑われる分析対
象の存在の簡便な方法での検出が可能になる。他の応用
には、細胞分類（二車蛍光標識１１１胞によるような）
、エアゾルの検出および測定、トレー→ノーーフローコ
ントロール等があり、この場合、ビームスプリッタ−ま
たは多重出力ファイバーの使用により、多重の割出波長
を利用できる。

本発明は、同等の多重ファイバープローブ、たとえば３
本の光ファイバーを有する三ファイバー光学プローブを
も包含する。この場合、第三の光ファイバーは、３個の
すべてのファイバーが共通の検査容積を有するように、
複式ファイバープローブの■溝の頂部に導入する。この
三ファイバープローブは、本明細書に述べた様式で、２
本の光ファイバーに関連するそれぞれ特定の波長に対す
るフィルターを有する２個の検知器単位および第三のフ
ィルターに関する光源を用いて使用できる。

本発明の複式ファイバープローブは、分析対象と多分妨
害物質の含有が疑われる液体４ノンプル中の分析対象の
存否を、分析対象に対する蛍光標識受容体の添加によっ
て決定する方法に有用である。

次に、サンプルと受容体の混合物をたとえば洗浄等で処
理して、存在が疑われる妨害物質を除去Ｊる。ついで、
処理したザンブル／受容体Ｕ合物を事象誘起物質（たと
えば擬集試薬）で処理し、照射する。発散波長における
蛍光シグナルおよび入射波長における散乱シグナルを測
定し、それぞれのバックグランド値と比較する。分析対
象陽性で妨害物質ははじめから含まないかサンプルの効
果的な処理で除去されている場合には、蛍光粒子シグナ
ル高はバックグランドから上Ｗし、分析対象の存在を指
示する。分析対象陰性Ｉナンプルでは、蛍光粒子高はバ
ックグランドと実質的に同一で、光散乱粒子シグナル高
はバックグランドに対しで上昇する。不適切に処理され
た４ノーンプル（すなわち、妨害物質が効果的に除去さ
れていないサンプル）は、蛍光粒子シグナル高のバック
グランド以上への上背が４丁り、光散乱シグナル高はバ
ラフグランドに比べて低下することにより明らかにされ
る。

以下の実施例においては、複式ファイバープローブは水
門Ｉｌｌ書に記載した方法により、コア直径５０ミクロ
ン、被覆直径１２５ミクロン、開口数０．２２の５０／
１２５全シリカ−インデックスファイバーから作成した
。角θおよび距１１ｔ　ｄはそれぞれ６０度および２０
０ミクロンで、ファイバーは同−平面−りにある。

例１ 複式ファイバープローブの感度を、蛍光染料２−（ｐ−
ジエチルアミノ−ｍ−ヒドロキシフェニル）−１−（４
−ジエチルイム上ニオ−２−ヒト［１ギシー２，５−シ
クロへキザジエニリデン）−３−オキソ−１−シクロブ
チル−ト＜ＤＥＡＳ）の１０””Ｍβ−シフロブキス１
〜リン中の各種溶液に対する蛍光応答の測定によって明
らかにする。

平均蛍光　　　染料濃度（Ｍ） ２Ｘ１０−９− ２４　　　　　　４、　Ｘ　１０−９ ３３　　　　　５Ｘ１０’ 平均蛍光　　　染料濃度（Ｍ） ５９　　　　　９Ｘ１０’ ６５　　　　　１Ｘ１０’ １５１　　　　　　２．５Ｘ１０’ １８０　　　　　３Ｘ１０”８ ２２７　　　　　４、Ｘ１Ｏ−８ ２８１５，５Ｘ１０−８ ３２９　　　　　７Ｘ１０’ 蛍光応答は染料レベルの上昇にＪ：つて上背することが
明らかである。

例２ 以下の実施例は、本発明の複式ファイバープローブの、
蛍光対象（すなわち粒子）の様々な集団の検出への応用
を例示する。小ラテックスビーズ″　（０，７１ミクロ
ン）の集団は１×蛍光でスフアレイン染！１　（ＤＩ＝
ＡＳ）により染色し、大ラテックスビーズ（１，１ミク
ロン）の集団は同様にして４Ｘ蛍光で染色したくすなわ
ち、大ビーズの蛍光は小ビーズの蛍光の約４倍である）
。

ピーク高にお【Ｊる事象数対蛍光のサンプル分布を決定
するためにはピーク高検知器を用いた。分布を解析して
、各蛍光レベルでの事象数の合計×そのレベルと蛍光７
Ｊツ］〜オフレベルの間の蛍光の差（分布の平均蛍光［
ａＶ］の倍数での集合）である指数（すなわち凝集指数
）を求めた。どのカットオフでの凝集指数の差も大ビー
ズの存在による蛍光レベルの増大を示す。

代表的な結果を以下に示す。

組成物１　：　　２．５Ｘ１０”個／ｄの０．７１ミク
ロン染色ラテックスビーズ含右等張緩衝液 凝集指数 ａｖ＊１．９　　３３８　　２７３ ａｖ＊２．０　　２０８　　１５３ ａＶ”２．１　　２０８　　１５３ ａｖ　２．２　　１２５　　８６ 組成物２：　　２．４×１０６個／ｍｌの０．７１ミク
ロン染色ラデツクスビーズと、０．１５×１０６個／ｍ
ｆ！の１．１ミクロン染色ラテックスビーズを含有づる
等張緩衝液 凝集指数 カットオフ　　　　１回目　　　２回目ａｖ＊１．７　
　２０１２　　２１４５ａｖ＊１．９　　１２２１　　
１３６８ａｖ”　２．０　　　９５０　　１０９５ａｖ
　　２．１　　９５０　　１０９５ａｖ　　２．２　　
　７３９　　　８８５組成物１に比較して組成物２の大
きな凝集指数は大ビーズの検出を示している。

計 例３に記載した複式ファイバープローブと方法を用いて
、以下のプロトコールに従い、白液型判定への複式ファ
イバープローブの利用を例示する。

各種検定用のプロ］へコールは次のとおりである。

プロ１−コール■：　αＡ、αＢ先行対照染色金血（５
０μＭ　　ＤＥＡＳ、９５％　ＤＭＳｏ、５％ｌ−１２
０）１０μｌを試薬（抗−△：緩衝食塩水中Ｃｅ１ｌｔ
ｅｃｈ細胞系３Ｄ３．１１０＊／ｍｅ）１０μｌと約２
．５分間混合し、ついで緩衝食塩溶液５００μｍで希釈
する。生成した溶液の蛍光は例３に記載したと同様にし
で読み取る。

プロ１〜］−ルＩＩ：Ａ１細胞、Ｂ細胞非染色全面５０
μｍを、場合に応じて、染色（テトラブチルスフアレー
１〜；ジメチルホルムアミド中１１０’μＭ、緩衝食塩
水、２％プルロニクス環境中３０％赤血球懸濁液を１ｄ
あたり７５μｍ）Ａ１またはＢｌ胞と約２．５分間混合
し、−４６一 ついで緩衝食塩水５０μｌで希釈する。ηコ成した　・
溶液の蛍光は例３に記載したと同様にして読み取る。

プロト］−ルＩＩＩ：Ｒｈ、Ｒｈ対照 染色（ＤＥＡＳ）全面１０μｌを試薬（Ｒｈ＋０．９■
／ｒｄ　　ＩｇＧ［還元およびアルキル化］、２％ＰＶ
Ｐ、２％ＢＳＡ、１〜リス緩衝液中；Ｒｈ対照＋ＩＣＩ
Ｇを除くほかは同じ）１０μ夕を加え、２．５分間混合
し、ついで約１００μｌの緩衝食塩水で希釈する。さら
に約４０秒間混合したのら、等張緩衝食塩水４５０μｌ
を加え、生成した溶液は例３に記載したと同様にして読
み取る。

Ａ陰性およびＢ陽性サンプルについての結果を以下にま
とめる。αＡ、αＢ　ａ３　Ｊ：び先行対照でのカット
オフは平均蛍光の１．７倍、Ａ１細胞およびＢ細胞につ
いては平均蛍光の２倍、ＲｈおよびＲｈ対照については
平均蛍光の１．８倍とする。

先行 α八　　　αＢ　対照　Ａ１細胞　Ｂ細胞　　Ｒｈ対照
　　ＲｈＡ陰性　５８６７　　　　０　　０　　　０　
　１２１５８　　　０　　　１４Ｂ陽性１５　　１２２
９６　　　　　１４０　　１１２４８　　　１５　　７
１１９０８以上、本発明を図面を参照しながら説明しだ
が、例および現時点で好ましい態様は、本発明を例示す
るものであって、いかなる意味においても本発明の特許
請求の範囲を限定するものではない。以上述べた方法お
よび装置の様々な修飾および変化が可能なことは本技術
分野の熟練者には自明であろうが、これらは特許請求の
範囲に包含されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の複式ファイバー光学的プローブを用
いた検出装置の全体像を模式的に示した図である。 第２図は、本発明の複式ファイバー光学的プローブの断
面図である。 第３図は、本発明の複式ファイバー光学的プロ−ブの末
端の図面である。 第４Ａ図及び第４Ｂ図は、光ファイバーを好ましい空間
的配置に保持するだめのプローブ挿入体を三方したとき
の一方の、△：正面図、Ｂ：側面図である。 第５Ａ図及び第５Ｂ図は、第４図の挿入体を三方したと
きの使方の、Δ：正面図、Ｂ：側面図である。 第６図は、本発明の複式ファイバー光学的プローブの光
ファイバーの光学的結合を示す一装置と、検査容積を例
示する図面である。 第７図は、光ファイバーが非同−平面上に置かれた場合
のシステムの幾何的配置を例示する図である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）プローブを液体サンプル中に浸漬したときの上記
   液体中の光学的事象を定量するため、液体サンプル中へ
   の浸漬に適合した光学的プローブであつて、入射光を誘
   導するように配置した第一の光ファイバーと上記入射光
   から生じる光線を受けて誘導するように配置した第二の
   光ファイバーからなり、第一の光ファイバーと第二の光
   ファイバーは光学的に結合されて液体サンプルの容量と
   は独立に有限の検査容積を決定するように配置され、上
   記第一の光ファイバーから発散する光線は、上記検査容
   積内に光学的事象発生要素が存在しない場合には第一の
   光ファイバーからの光線は実質的に第二の光ファイバー
   に入射しないような第二の光ファイバーに対する相対角
   度で投射されることを特徴とする光学的プローブ
2. （２）３本のすべての光ファイバーが共通の検査容積を
   もつように第三の光ファイバーからなる特許請求の範囲
   第１項に記載の光学的プローブ
3. （３）検査容積は約１０＾−＾５ｃｍ＾３未満である特
   許請求の範囲第１項に記載の光学的プローブ
4. （４）第一および第二の光ファイバーは、約４０°〜１
   ４０°の稜角で交差する縦軸を有する特許請求の範囲第
   １項または第３項のいずれかに記載の光学的プローブ
5. （５）稜角は約６０±５°である特許請求の範囲第４項
   に記載の光学的プローブ
6. （６）第一および第二のプローブの縦軸の間の、ファイ
   バーの射出面における距離は約０．０５〜１．００ｍｍ
   である特許請求の範囲第４項に記載の光学的プローブ
7. （７）分析対象の含有が疑われる液体サンプル中の分析
   対象の定量方法において、上記液体サンプル中に、第一
   の入力端と第一の出力端を有する第一の光ファイバーお
   よび第二の入力端と第二の出力端を有する第二の光ファ
   イバーからなり、第一の光ファイバーと第二の光ファイ
   バーは予め定められた物理的および光学的性質を有し、
   第一の出力端と第二の入力端は分析対象が存在する場合
   にのみ第一の光ファイバーと第二の光ファイバーが光学
   的に結合されて液体サンプルの容量とは独立の検査容積
   を決定するように予め定められた角度方向を有するファ
   イバー製光学的プローブを浸漬し、第一の光ファイバー
   の第一の入力端を光源と組合せて上記検査容積を照射し
   、この検査容積の照射によつて生じた検査容積からの光
   線を第二の光ファイバーの第二の入力端で収集すること
   を特徴とする方法
8. （８）光源は２００〜１５００ｎｍの波長を包含する特
   許請求の範囲第７項に記載の方法
9. （９）第一および第二の光ファイバーは、約１０＾−＾
   ５ｃｍ＾３未満の検査容積を決定する特許請求の範囲第
   ７項または第８項のいずれかに記載の方法
10. （１０）第一端とその第一端に連携する第一縦軸を有す
    る第一の光ファイバーおよび第二端とその第二端に連携
    する第二縦軸を有する第二の光ファイバーからなり、第
    一および第二の光ファイバーは約１０〜２００ミクロン
    のコア直径を有し、これらのファイバーの縦軸間の第一
    および第二端における距離は約０．０５〜１．００ｍｍ
    であり、それらの縦軸によつて形成される稜角は空気中
    における上記ファイバーの開口数のアークサインの合計
    より大きく、１８０°と上記アークサインの合計の差よ
    り小さくなるように空間的に配置されているファイバー
    製光学的プローブ集合体
11. （１１）空気中における各ファイバーの開口数は約０．
    ０８〜０．７であり、稜角は約４０〜１４０度である特
    許請求の範囲第１０項に記載の集合体
12. （１２）第一および第二の縦軸は実質的に同一平面上に
    ある特許請求の範囲第１０項または第１１項のいずれか
    に記載の集合体
13. （１３）稜角は約５５〜６５度である特許請求の範囲第
    １２項に記載の集合体
14. （１４）第一の側面と第一端側面を有し、第一の側面は
    光ファイバーの末端を受けるそれぞれ配置された第一お
    よび第二の交差溝を包含する第一の半シリンダー部、な
    らびに第二の側面と、第一および第二の溝の内部に位置
    させた場合光ファイバーの末端面が露出するように配置
    された第三の溝をその内部にもつ第二端側面とを有し、
    上記第一の半シリンダー部と咬合するように配置された
    第二の半シリンダー部からなる複式ファイバー光学的プ
    ローブの支持体
15. （１５）第二端側面は第三の溝と一列になるように配置
    された第四の溝を有する特許請求の範囲第１４項に記載
    の支持体
16. （１６）第一および第二の半シリンダー部は、第一およ
    び第二の半シリンダー部を配列し一体の集合体を形成さ
    せるための共同の配列手段をその上部に有する特許請求
    の範囲第１５項に記載の支持体
17. （１７）液体サンプル中の分析対象を少なくとも２本の
    、角度をもつて配置された光ファイバーを用いて定量す
    る検定法において、上記光ファイバーを上記液体サンプ
    ル中に浸漬し、上記光ファイバーを光学的に結合させる
    ことにより、液体サンプル中の有限の検査容積を決定す
    ることを特徴とする改良方法
18. （１８）検査容積は約１０＾−＾５ｃｍ＾３未満である
    特許請求の範囲１７項に記載の改良方法