JPH0750109B2 - 検定の方法及び装置 - Google Patents

検定の方法及び装置

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JPH0750109B2
JPH0750109B2 JP59121664A JP12166484A JPH0750109B2 JP H0750109 B2 JPH0750109 B2 JP H0750109B2 JP 59121664 A JP59121664 A JP 59121664A JP 12166484 A JP12166484 A JP 12166484A JP H0750109 B2 JPH0750109 B2 JP H0750109B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は化学的及び生化学的検定に関し、より詳細に
は、懸濁流体の少なくとも１つの成分相の、与えられた
試料の容積に相対的な容積を各成分相を互いに物理的に
分離せずに計量できる検定に関する。
懸濁流体の検定において頻繁に生ずる問題は全容積に対
する１ないしそれ以上の成分相の容積を決定することで
ある。かくして例えば牛乳の検定において乳脂の含有率
を決定するのが望ましいことが多くある。他の例として
全血の検定において細胞容積率〔一般的に赤血球沈殿容
積（PCV）またはヘマトクリットとして表わされる〕を
決定することが望ましいことが多くある。このような相
対的容積は普通懸濁液の成分相が遠心分離等により物理
的に分離された後に決定される。このような分離のステ
ップは懸濁液の成分相の計量に対する典型的な準備ステ
ップであるばかりでなく、一般的に他の検定に対する準
備ステップでもある。かくして再び血液の検定を考える
と、多くの場合、血清試料を必要とし、血液は最初に血
清から約50％の細胞容積を分離させるように遠心分離さ
れる。その結果、全血を使用するには、細胞容積につい
ての修正をして、全血でのデータを、臨床データの血清
にもとづくデータに関連させる必要がある。他の懸濁液
の成分相の検定に関しても同様に考えられる。
本発明による特殊な検定に免疫検定がある。１種類また
はそれ以上の試薬と試料のアルコットを種々反応させて
抗原−抗体あるいは同様な複合体を形成し、複合体のあ
らかじめ決められた部分の存在と力価について試料を検
定することは周知である。このような検定の典型的なも
のとして、特定の抗体がそれに特有な抗原の量を測定す
るために用いられる（あるいはその逆の場合の）検定が
ある。しかしながらこの手法は抗原とともにハプテン
（ホルモン、アルカロイド、ステロイド等を含む）を、
また完全な抗体とともに抗体断片（すなわちFab）を定
量するように拡張されてきており、この広い意味で本発
明も理解するべきである。
周知のように高感度の免疫検定は複合体の標識された成
分が試薬に加えられ、標識された非複合体の試薬が複合
体の試薬から分離され、それから複合体（あるいは非複
合体の試薬）は標識を観測することにより定量されるト
レーサーの手法を用いている。免疫検定の試薬の標識成
分には放射性同位体と蛍光性マーカーとの両方が用いら
れており、標識はそれぞれガンマ線カウンターまたは蛍
光光度計で観測されている。しかしながら本発明は蛍光
による検定だけを意図している。
非複合体である標識の部分を複合体から分離させること
は、複合体の成分のうちの所定の１成分をその成分の複
合体形成時の反応性を低下させないようにして固相体
（試験管の内壁、ガラスまたは重合体のビーズ等のよう
な）に固定させることにより通常なされている。例えば
免疫グロブリンＧ（IgG）のような抗体はフェニル・ジ
イソシアナート等の二重作用の試薬を用いて３−アミノ
プロピル・トリメトキシ・シラン等のシリル化合物によ
ってガラス等の固相体に結合してもよい。次いで、固定
した成分を含んで形成されたいかなる複合体も管からの
流体のアスピレーションまたはデカンテーションによ
り、あるいは粒子状ベッドを通して流体を溶離させるこ
とにより、溶液中に残っている非反応性の相補的対応成
分（以下、相補的対応成分とは、抗原に対して抗体、抗
体に対して抗原という、抗原抗体反応における対応する
成分を意味する）から物理的に分離されよう。あるいは
例えば関連米国特許出願第406,324号（シリアル・ナン
バー、1982年８月９日出願）及び第410,340号（1982年
８月23日出願）に示されているように、蛍光の励起及び
観測を固相体に接した極めて薄い層に制限しそれによっ
て固定した標識された成分を光学的手段で溶液中に残る
成分から実際に分離させるために全反射蛍光（TRF）及
び蛍光の通り抜け（tunnelling）を用いてもよい。
前述の方法は多くの免疫処法に適用できる。例えば拮抗
的免疫検定において試薬は複合体の固定した成分（この
場合抗体）に対する既知の量の標識された相補的対応成
分（抗原等）からなる。試薬は定量されるべき標識され
ない相補的対応成分を含む一定の量の試薬と混合され
る。標識された相補的対応成分も標識されない補体もそ
の相対的濃度に比例して複合体の固定した成分に結合す
る。設定した時間だけ接続させると流体の試料と試薬と
が分離する。固体相に固定された複合体はそれから標識
の蛍光を励起させるように選択された波長の放射で照射
され、蛍光が測定されている。固定した複合体の蛍光の
強度は、検定されている標識されない相補的対応成分の
濃度に反比例する。
あるいは定量すべき部分にある量の類似体（すなわち免
疫的に同様に反応する物質）を固定しこの試料を既知の
量の標識された相補的対応成分と反応させることにより
検定を行なってもよい。標識された相補的対応成分は試
料中の未知の量の部分と固定した類似体との療法との複
合体となる。また固定した複合体の蛍光の強度は定量さ
れる（遊離した）部分の濃度に反比例する。固定した成
分に対する多価の相補的対応成分に関し、いわゆる「サ
ンドイッチ」免疫検定を行なってもよく、このとき加え
られた相補的対応成分はさらに、上記固定した成分の標
識された類似体と反応する。かくして二価の抗原は固定
した抗体と結合し、次いで、標識された蛍光性の抗体と
結合して、抗体−抗原−標識された抗体というサンドイ
ッチを形成し、これは未反応の標識された抗体から分離
されよう。このようにして形成された固定した複合体の
蛍光の強度は、定量される成分の濃度に正比例する。
生体流体の蛍光による検定において多くの問題が生ず
る。例えば赤血球は吸収性が高い。従って従来技術の血
液が蛍光による検定は典型的には試料を遠心分離させ、
上澄みの血清を検定している。典型的な遠心分離法は15
〜30分もかかり、検定の結果が迅速に要求されるような
ある種の臨床処法（いわゆる「スタット」処法）に反す
る時間となる。このような場合、現在の微量抽出法及び
遠心分離法で実際に１分以下で血清の抽出が可能になる
が、このような遠心分離法は今でも全ての臨床研究室で
実施できるのではなく、どの場合にも血清抽出は、どの
ような手段でも追加のステップとなり、従って人的誤り
を招く可能性の原因となる。さらに血清抽出の手段は迅
速な検定が望まれる全ての場所（自動車事故現場、家庭
での介護等）において実施できるわけではない。
前述の米国特許出願第406,324号及び第410,340号に示さ
れているような、極めて薄い層の試料の抽出による全反
射蛍光による検定の方法で光学的に高い密度の試料の検
定が可能になる。本来これで全血の蛍光による検定が可
能になるであろうが、一般に血清の試料について臨床実
験がなされており、その結果実験データの容認された部
分に全血の検定を関連させるには試料中の血清の容積の
計量が必要となっている。集収された試料がまた典型的
に懸濁している物質（例えば唾液の場合流体容積）に対
する懸濁された物質（たとえば唾液の場合泡容積）の未
知の比率をもった分散系である唾液等のような他の体液
について同様の考察がなされる。
発明の目的 従って懸濁流体の成分相の相対的容積を分離的な相の分
離を行なうことを必要とせずに計量するための方法及び
装置を提供することが本発明の１つの目的である。
測定の前に試料から懸濁された相を分離する必要のない
蛍光による免疫検定の方法及び装置を提供することが本
発明の他の目的である。
また試料中の関連部分（たとえば血清）の相対的容積の
測定を補償する装置だけで全血、唾液等免疫検定を行な
うことも本発明の目的である。
発明の簡単な説明 これらおよび他の目的は、懸濁された相がそのサイズと
形状の故に実質的に排除されている多相懸濁液の観察さ
れる細小な容積を、内部全蛍光を用いて計量する本発明
の装置と方法によって達成される。観測される容積を含
む既知の容積の試料内に混入された既知の量の蛍光性物
質の蛍光を観測することにより、懸濁されたあるいは懸
濁している相の容積の計量が可能になる。
本発明の装置は、 懸濁流体の検定を使用するための装置であって： 該懸濁流体を入れるべき第１の限定された空間； 上記第１の限定された空間の中にある、エバネセント波
による光学的励起に反応性のあらかじめ決められた量の
蛍光物質であって、上記懸濁流体の１つの相にのみ可溶
性である蛍光物質；および 上記第１の限定された空間の１部である第２の限定され
た空間であって、上記蛍光物質とともに上記１つの相の
実質的にすべてを含んでいる空間 からなる装置である。
ここで、「第１の限定された空間」とは、内部の光学的
素子と流体を閉じ込めた外壁とによって取り囲まれた領
域である。光学的素子の例は光ファイバーであり、外壁
の例は毛細管である（第１図および第２図参照）。
「第２の限定された空間」とは、第１の限定された空間
の中の、蛍光物質を溶解した相および／または蛍光物質
を欠く相を含む、実際に試料が占める領域である。
免疫検定に用いた好ましい実施例において、単層の抗原
−抗体の複合体の成分（例えば抗体）が固定されたほぼ
軸方向に配置された光ファイバーを有するある長さの精
密な直径を有する毛細管からなるディスポーザブルが用
いられている。ディスポーザブルはまた不活性の希釈剤
と、固定した成分（例えば蛍光性標識のある抗原）に対
する予め包含された既知の量の標識された相補的対応成
分と、例えば標識とは異なる波長で蛍光を発する既知の
量の第２の蛍光性物質とを備えている。第２の蛍光性物
質は試料の成分に対して非反応性であるが試料の関連部
分（例えば全血の血清部分あるいは唾液の内の液体部
分）の予期される容積に完全に溶解するように選択され
包含されている。第２の蛍光性物質はまた少なくとも標
識された成分及びその相補的対応成分と同じ大きさの拡
張率を有するように選択されている。
好ましい作用形態において、ファイバーが対象となる試
料中に没入され、第２の蛍光性物質と標識された成分及
びその相補的対応成分との両方がファイバーと毛細管壁
との間の容積全体に拡散するのに十分な時間だけ留まっ
ているようにされる。蛍光性物質が拡散する試料の全容
積はとりわけファイバーと毛細管との形状によって決定
される。第２の蛍光性物質の量が予め設定されているの
で、試料中の懸濁流体部分における第２の蛍光性物質の
濃度は流体の容積についての量になり、容積に反比例す
る。
両方の蛍光性物質の観測は全反射蛍光によってなされ、
ファイバーの端部はファイバーの開口数の範囲内で照射
され観測される。エバネセント波の範囲内の蛍光性物質
の部分だけが蛍光を発し、この内ファイバー内に通り抜
けるものだけが観測される。その結果蛍光性の標識（フ
ァイバーに固定されたものと流体中に懸濁しているもの
との両方）か、第２の漸次変化する蛍光性物質（すでに
完全に懸濁流体中に溶解している）かについて観測され
るものは全て数百Åのファイバーの範囲内にある。部分
的にはファイバーに近接した薄い領域に蛍光の観測を制
限することにより主として試料中の流体部分について観
測がなされるようになり、ファイバーの近くに懸濁され
た相（例えば血液の細胞あるいは泡）の容積が懸濁され
た相の形状によって部分的に制限される。
適当な濾光によって、標識及び溶解した蛍光性物質によ
る蛍光信号が個々に処理され、標識による信号は試料の
全容積内の免疫的に反応する部分の滴定量を示し、第２
の蛍光性物質による信号はこの物質の濃度の１次的な量
を示し、またそれゆえ懸濁流体の全容積を示す。ファイ
バーに近接した流体中に懸濁している吸収性の粒子によ
るどのような減衰の量をも示してそれにより試料の濃度
の決定に対する２次的修正を可能にするために、蛍光の
励起波長における減衰した全反射によって試料を観測す
る保護チャンネルを用いてもよい。
本発明の目的及び特徴をより十分に理解するために添付
の図面と併せて以下の詳細な説明を参照すべきである。
図において同じ指示番号は同じ部分に関するものであ
る。
用語に関して、本発明の装置についての詳細な説明にお
いて装置の部分を「上方」部分及び「下方」部分と称す
る点に注意を要する。これは全く便宜的なもので、説明
を図面における概略表示に関連させるためになされてい
る。この装置はいかなる位置または方向にあっても作用
し得ることがわかるはずであり、そのようにすることは
本発明の範囲内の事項である。
さらに図面に示されているのは概略的なものであって、
実際の大きさや比率を示すことは意図していないことが
わかるであろう。
詳細な説明 本発明は1982年８月９日付の本出願人の関連米国出願第
406,324号に示されているような蛍光放射の通り抜けと
結合した全反射蛍光によって作動するものであり、装置
の作動の光学的形態についてのさらに詳細な点について
はこれを参照するとよい。
後述のように本発明は他の検定とは独自に実施され、そ
れによって懸濁流体の成分相の相対的容積を単に計量す
るものであるが、ある種の他の検定と併せて利点を生ず
ることもあろう。この場合このような組合せた装置及び
方法は明らかな結合の利点（すなわち１つだけの装置及
び手順でいくつかの項目の計量を行なうこと）を生ずる
ばかりでなく、他の検定に通常必要な手順を単純化する
ためにも用いられよう。生体流体の免疫検定はこの例で
あるが、これはこのような流体が一般的に懸濁液であ
り、ほとんどの検定方法において免疫検定への準備とし
て懸濁液の種々の成分相の分離を必要とするからであ
る。このために本発明の好ましい実施例は免疫検定と組
合せたものであり、ここでの本発明の説明はこのような
実施例に関してである。ここで用いているディスポーザ
ブルは本出願人に権利譲渡された1982年８月23日付の関
連米国特許出願第410,340号に示されているものと同様
であり、その基本的な構造及び作用についてのさらに詳
細な点についてはこれを参照するとよい。
第１図を参照すると本発明の趣旨によって形成された免
疫検定キット10の縦方向の断面図が示されている。キッ
ト10は光ファイバー12、毛細管14、ストッパ16を含む。
ファイバー12はファイバーの軸の回りにほぼ回転対称な
設定された立体角の範囲内でファイバーの端部に入射す
る光放射を多数回の内面反射でその全長に伝えるように
した長形のほぼ円筒形で光学的に透明な本体である。フ
ァイバー光学の技術において周知のように、ファイバー
に入射しその中を伝わる放射についてのファイバーの軸
に関する最大受容角Ｂはファイバー及び周囲の媒体の屈
折率によって設定される。最初に屈折率n0の媒体中を伝
わり入射面以外は屈折率n2の物質で囲まれた屈折率n1の
ファイバーに入射する放射について最大受容角は式 N.A.＝n0 sinB＝（n1 2−n2 2）1/2 （１） から得られ、ここでN.A.はファイバーのいわゆる開口数
である。限定的でない例として、ファイバー12は検定さ
れる流体試料の屈折率（典型的には1.33近く屈折率を有
する水溶液あるいは1.35近くの屈折率を有する血清試
料）よりも大きな屈折率を有するように選択され、また
流体に対して比較的不溶性で反応性がないように選択さ
れた、ガラス、水晶、ホリプロピレン、ポリアミン、ナ
イロン等いくつかの光学的に透明な材質のいずれでもよ
い。ファイバーの直径は200μがよいことが知られてい
るが、他の大きさのものも用いられよう。多くの検定で
長さ25mmのファイバーで十分であると思われるが、しか
しながらファイバーの長さは行なわれる検定に適合され
得ることがわかるであろう。
毛細管14は光学的に透明な管で、その構成材質も検定さ
れる流体に対し比較的不溶性で反応性のないように選択
されるのが好ましい。かくして毛細管14はガラス、水
晶、ポリプロピレン、ポリオレフィン等の材質で形成さ
れるのが好ましい。好ましい実施例において、毛細管14
はファイバー12の直径より数百μ大きい内径を有する正
円筒形の孔をなしている（例えば200μのファイバーの
直径では毛細管14は約800μの内径を有するであろ
う。） ストッパ16は毛細管14の端部内に嵌合してファイバー12
の端部18を毛細管内にほぼ同軸に支持するような形状及
び大きさである。さらにストッパ16は以下に説明するよ
うに蛍光光度計にキット10を設置するための硬い設置面
を備えている。このためストッパ16は毛細管14の外径と
同程度の外径を有するフランジ20と、中心の孔22と同軸
の中心に配設された嵌め輪状の突出部21とが設けられて
いる。孔22はストッパ16を貫通しており、ファイバー12
の端部18を取付ける寸法になっている。好ましい実施例
においてストッパ16はファイバー12の回りの適所に成形
され、ストッパはシロキサン等の低い屈折率の材質で形
成されるのが好ましい。ストッパ16はさらに毛細管14の
内側と連通する１つまたはそれ以上の通孔23が設けられ
ている。
ファイバー12は端部18以外のファイバーのほぼ全部を毛
細管の内側に露出させるようにストッパ16を貫通してこ
れに支持され、端部18の端面24が毛細管の外側の孔22の
端部に妨げられず重なり合うようになる。端面24は平面
状でファイバー12の軸に垂直に配置されるのが好まし
い。端面24はまた高度に透明で、これに入射する光を散
乱させようとする汚れがないのが好ましい。このために
は溶融水晶のファイバーを劈開して十分な光学的面が与
えられることが知られているけれども端面24を光学的に
研磨してもよい。端面24と反射側のファイバーの端面26
も平坦に研磨されるか劈開され、さらにファイバーの軸
にほぼ垂直に配設されたミラー・コーティング28が施さ
れ、それによってファイバー内に捕捉された放射がファ
イバーを二重に通過するようになる。ファイバー12、毛
細管14、及びストッパ16の全体的な大きさはファイバー
の下側の端面26が毛細管内に確実にあるように選択され
る。
放射がただ１回通過するのでよければミラー・コーティ
ング28を施す必要がないことがわかるであろう。しかし
ながらこのような実施例では、装置の作動についての以
下の説明から明らかなように、試料の容積をエバネセン
ト波によって決定される領域に限定するために、端面26
を不透明にするか、毛細管14の外側に配置するか、ある
いは測定時に流体試料に接しないように他の形に配置す
ることが必要である。
キット10として組立てる前にファイバー12は後述のよう
に検定が行なわれる円筒面の領域30を活性化するコーテ
ィングが施される。好ましい実施例において、活性化さ
れる領域30はファイバーの両方の端部上に延びる、例え
ば低い光学的指数のシリコンからなる化学的及び光学的
に不活性なコーティング32によってファイバー12の内の
所定の長さに制限されている。しかしながら活性化され
る領域30の大きさは他の手段で制御されてもよく（例え
ばコーティングの際にファイバーをマスキングすること
によって）、ファイバー12の全長を活性化し毛細管14内
にあるファイバーの長さを慎重に制御することもできる
ことがわかるであろう。
ここで第３図に移ると検定すべき試料43を充填したファ
イバー12の活性化領域30内におけるキット10の縦方向断
面の部分がかなり様式化されて示されている。
領域30内のファイバー12の表面に多数の結合箇所44が設
けられ、このうちのいくつかに対象となる抗体−抗原複
合体の部分が結合している。（ここで用いる「抗体−抗
原複合体の部分」という用語はこのような複合体の免疫
反応性部分に関するもので、完全な抗原とともにハプテ
ンを、また完全な抗体とともに抗原反応性の抗体部分
〔Fab〕を含む。結合箇所44はまた複合体の相補的対応
成分の部分の反応性（例えば親和力、指向性）にそれ程
影響を与えずに複合体部分46を固定するように選択され
ている。好ましい実施例においてファイバー12はガラス
または水晶からなり、結合箇所44は３−アミノプロピル
トリメトキシラーネ等のシリル化合物等の反応性基であ
り、複合体部分46は免疫グロブリンＧ（IgG）等の抗体
である。前述のようにこの特定の固相体の結合に関して
結合箇所44及び複合体部分46は抗体のカルボキシル末端
によって結合し、それによって抗体の抗原反応性のアミ
ノ末端を遊離させる。ファイバー12のガラス面を形成
し、これにシリル化合物を付加し、シリル結合により抗
体をガラスに結合させる方法はウイートール（Weetall,
米国特許第3,652,761号）によって開示されているが、
ここにはカルボキシル、アミノ、及び他の抗体または抗
原（またはそれらの断片）の反応性基が種々の無機材質
に共有結合するような方法及び他のシリル化合物につい
ての開示もなされている。抗原または抗体を重合体に固
定するための広範な技術も存在することがわかるはずで
あり、また抗原または抗体の結合箇所44は重合体のファ
イバーにも設けられることが当業者に理解されよう。か
くして例えばファイバー12がナイロン（ポリアミド）か
らなるものであれば、結合は重合体の官能基に結合した
水素に適当な基を置換した形になろう。
結合箇所44はまた周知のように抗体−抗原の結合過程の
立体障害が最少にするのに十分なファイバー12と複合体
部分46との間隔ができるようにするためのスペーサー基
を備えてもよいことわかるはずである。例えばペプチド
結合によりファイバー12に結合しそれぞれ蛋白質部分46
のカルボキシルまたはアミノ末端に共有結合するための
遊離したアミノ基及びカルボキシル基を与える1,6のジ
アミノヘキサンまたは６アミノヘキサン酸の場合のよう
に、結合箇所44はポリエチレン鎖を含むことがある。こ
れらの結合材質のいずれも末端の間の６−炭素鎖を与え
るもので、それにより複合体部分46をファイバー12から
対応する距離だけ離す。同様に適当な結合及びスペーサ
ーの材質は免疫検定と親和性クロマトグラフィーの両方
の技術において周知である。
好ましい実施例において、ファイバー12は指示番号46C
で示されるような結合済みの結合箇所を有する複合体部
分が設けられており、この部分は拮抗的免疫検定のため
に一部において標識された相補的対応成分50が付加され
る。かくしてある実施例において複合体部分46は抗体で
あり、標識された抗原またはハプテンを予め包含させて
ファイバー12のコーティングに付加させることがなされ
る。標識された成分50の各々は所定の量の発蛍光団52を
備え、それによって標識となる。標識に関係する特定の
蛍光性化合物はフルオレセイン、テトラメチルローダミ
ン、希土類キレート化合物等である。蛍光性標識を蛋白
質に連結させる方法は周知であり、市販の蛍光性化合物
の多くは蛋白質との連結のための基を有する。拮抗的免
疫検定については結合箇所44の固定部分にアルブミン等
の免疫的に不活性な蛋白質を設けるのが好ましい。
ファイバー12の活性領域はまた一定量の免疫的に不活性
な蛍光性物質57でコーティングされている。蛍光性物質
57は試料または試薬に対し反応性がないが試料の懸濁し
ている相に溶解するように選択される。かくして全血に
関する検定について、蛍光性物質57は蛋白質に対し反応
性がなく血清に溶解するように選択される。さらに蛍光
性物質57は標識された相補的対応成分50に付着された蛍
光性標識52が発するのとは異なる波長で蛍光を発するよ
うに選択されている。それからまた蛍光性物質57は蛍光
性標識を抑制しあるいはこれに抑制されないように選択
される。かくして放射の抑制を避けるために１回の検定
に用いられる蛍光性物質の各々は他の蛍光性物質の放出
ピークの近くに吸収ピークをもたないことに基本に選択
される（すなわち蛍光性物質57及び標識された相補的対
応成分の標識52はそれぞれ他方の蛍光放射帯に重なる励
起帯をもたないことを基本に選択される）。
蛍光性物質57に用いられる物質にはローダミンＢ（C.I.
No.45170）、アクリジン・オレンジ（C.I.No.46005）、
硫酸ベルベリン（C.I.No.75160）、メチレン・ブルー
（C.I.No.52015）、チオニン（C.I.No.52000）、ピレ
ン、アストラゾン、オレンジＲ、種々のシアニン（3,
3′ヨウ化ジエチルオキサジカルボシアニン等）、キナ
クリン、臭化エチジウム及びその他のものが多くある。
蛍光性物質57は容易に観測されるのに十分な量だけ、た
だし自己吸収を生ずるほどの量ではないように予め包含
される。これらの場合に蛍光性物質57は予測される容積
の試料の懸濁流体成分中に完全に離解するであろう。目
標として、また物質及び試料による変化に従って、蛍光
による検定の技術者に理解されるように、蛍光性物質57
は典型的にはファイバー12の活性領域30と毛細管14の近
接する壁部との間の空間にある純粋な流体の容積中に約
10-9ないし10-6モル溶解度をなすように予め包含されよ
う。蛍光性物質57は水素結合等によりファイバー12に弱
く付着している。
コーティングは以下のように吸着現象を用いて一定した
表面成分を有するように形成され得る。適当な試薬の濃
度で形成されたコーティングの溶液について、適当な表
面結合基44で活性化されたファイバーを単に没入させる
ことにより表面の単層の化学的に結合した蛋白質が生ず
るであろう。例えばこの層の活性蛋白質に対する免疫グ
ロブリンの比率はそれらの溶液中での比率（に一致はし
ないが）によって与えられよう。免疫グロブリンの活性
箇所を標識された抗原でどのように部分的に充填しても
もちろん溶液中のレベルに維持されよう。
浸漬させた後にファイバーはコーティング溶液から取外
される。接着する液体層による付着する試薬の同伴を防
ぐため、蒸発の生ずるより前に迅速にファイバーを洗浄
する。蛋白質の層は共有結合しているのでこの過程で除
去されないであろう。１層より多くの蛋白質の結合を防
ぐために、二重作用のある試薬が蛋白質の正味包含量を
変えることがあってはならず（これはコーティング溶液
のpHを調整することによって、制御することが可能であ
る）、またスペーサの腕が長過ぎてはならない。
キット10は蛍光光度計59（第４図）と共に用いることを
意図している。蛍光光度計59は光源60、ビーム・スプリ
ッター62、結像光学系64、フィルター66A、66B及び66
C、検出器67A、67B及び67C、参照光検出器68、比率増幅
器70A、70B及び70C、及びディスプレイ72からなる。
光源60は試薬の両方の成分において蛍光を励起させるよ
うに、蛍光性物質57及び標識として用いられる発蛍光団
に基づいて選択された、適当な周波数の光学的放射を与
える。光源60は蛍光を最大にするように選択された狭い
波長帯だけにこの放射を発生させるのが好ましい。それ
ゆえ光源60は典型的には好ましいタングステン−ハロゲ
ン・ランプ及びこれに結合した電源供給部のほかに帯域
フィルターを含む。あるいは光源60は水銀ランプ、フラ
ッシュ・ランプ、あるいはレーザーのような他の光源を
備えるようにしてもよいことが理解されよう。光源60は
またファイバーの開口数に対応する入射角より大きな入
射角で光線が端面に入射しないようにして光学系が光源
の開口を端面24上に結像させることができるように光学
系64を適当な傾斜角度のビームで照射するための適当な
ビーム成形開口及び光学系を含むことが当業者に理解さ
れよう。
光源60と光学系64との間にビーム・スプリッター62が挿
入される。ビーム・スプリッター62はいくつかの同様な
放射ビームをある位置から他のいくつかの位置に種々反
射させ透過させることができる多くの周知の光学系のい
ずれでもよい。かくしてビーム・スプリッター62は半透
鏡あるいは同様な部分を備えたものであり、また光源60
から光学系64に、光学系64からフィルター66Cに向けて
高い周波数（短い波長）の蛍光励起放射を投射し、また
光学系64からフィルター66A及び66Bに向けて低い周波数
（長い波長）の放射を投射するように設定してある。ビ
ーム・スプリッター62はさらに周知の手段により光学60
から参照光検出器68に向けて選択された周波数の放射を
投射する形態になっている。
光学系64は光源のビーム成形開口の像で端面がちょうど
一杯になるようにファイバー12の端面24上に光源60を結
像させるように選択され、光線の最大入射角はファイバ
ーの開口数に対応する角度以下であるように選択され
る。光学系64はまたファイバーの開口数にわたって端面
24を出るほぼ全ての放射を集め端面を光検出器66A、66
B、及び66Cにおいて結像させるように選択されている。
ファイバー12の適正な位置を設定する補助として、蛍光
光度計59はストッパ16の嵌め輪状の突出部21を受ける大
きさであって端面24を光学系64に対して適切に位置決め
するように配置された開口板65のような位置決め手段を
設けることが好ましい。
検出器67A及び67Bは光検出器を有し、その各々はそれぞ
れビーム・スプリッター62とフィルター66A及び66Bを通
じて光学系64により検出器に向けて投射されるファイバ
ー12の端面24の像を受けるように配置されている。ビー
ム・スプリッター62とそれぞれの検出器67A及び67Bとの
間にあるフィルター66A及び66Bはそれぞれ対応する光検
出器上に入射する放射を標識された相補的対応成分50の
蛍光性標識52及び蛍光性物質57の放出ピーク値に制限し
てそれぞれ他方の物質の蛍光を遮ぎるように選択されて
いる。かくして例えば標識がフルオレセインであって蛍
光物質57が臭化エチジウムであれば、フィルター66Aは
大体520nmの波長（フルオレセインの蛍光のビークに対
応する）の放射帯を通過させ大体580ないし700nmの帯域
（臭化エチジウムの蛍光ピークに対応する）を排除する
ように選択されている。このような蛍光性物質の組合せ
に関して、520nmの放射を反射させ580ないし700nmの帯
域を透過させるダイクロイック・ビーム・スプリッター
が用いられよう。フィルター66Bの透過−排除帯域はフ
ィルター66Aの帯域の逆になるように選択されるのが好
ましい。その結果光学系62で集光される蛍光性標識から
の放射が検出器67Aに入射し、蛍光性物質57による蛍光
が検出器67Bに入射する。
検出器67A及び67Bはそれぞれ標識及び蛍光性物質57の蛍
光ピークの領域に最大の感度を有するように選択された
光電増倍管（周知のように検出器の視野を端面24に限定
するための視野光学系及び適当な電源を設けてある）を
有する。検出器67A及び67Bはさらに帯域フィルターを設
けた光源60に対応する遮断フィルターを設けるのが好ま
しい。
フィルター66C及び検出器67Cはまたファイバー12の端面
24から出る放射によって照射され、光学系64により集光
され、ビーム・スプリッター62により透過されるように
配置されている。フィルター66Cは帯域フィルターを設
けた光源60の透過帯内にあるこれに入射する放射だけを
検出器67Cに透過させるように選択され、検出器67Cはこ
の放射に対して最大の感度を有するように選択されてい
る。検出器67Cはまた必要に応じて電源供給部と、その
視野をファイバー12の端面24に限定するための視野制限
絞り（図示せず）とが設けられている。
参照光検出器68はフォトダイオードであるのが好ましい
が、ビーム・スプリッター62を透過する光源60からの放
射を遮ぎるように配置されている。参照光検出器68はビ
ーム・スプリッター62によって透過される光源60のスペ
クトル領域におけるピーク感度に関して選択され、その
視野を光源に制限するための適当な視野絞り及び光学系
を有する。
比率増幅器70A、70B、及び70Cはそれぞれ１対の入力信
号を比率に比例した出力信号を与えるいくつかの周知の
電子的手段のいずれかであり、参照光検出器に対するそ
れぞれの検出器の出力の比率に比例した信号を与えるよ
うに参照光検出器68の出力とそれぞれ検出器67A、67B、
及び67Cとに連結されている。例えば各々の比率増幅器
は個々の検出器66からの出力を増幅し、参照光検出器68
からの出力に反比例するゲインを有する可変ゲイン増幅
器でもよい。
比率増幅器70A、70B、及び70Cの出力はディスプレイー7
2に連結されその入力となる。ディスプレイーン72は３
つの電気的信号の各々に比例した視覚的信号を発生させ
るいくつかの装置のいずれかであり、例えば１組のメー
ターまたはディジタル・ディスプレー、マルチトレース
型のストリップチャート記録計等でもよい。
キット10は種々の相が分離している試料で用いることも
できることがわかるけれども、主として懸濁液と共に用
いることを意図している。ここで用いている「懸濁液」
という用語は相互に混合しているが他方に対して溶解し
ていない２種類またはそれ以上の物理的に区別された機
械的に分離可能な部分（いわゆる系の「相」）を有する
一様でない分離化学的系を意味している。以下に明らか
になるように懸濁している相（連続的あるいは外側の相
あるいは分散媒としても知られる）は本発明の装置の作
動の少なくとも一部分の間流体でなければならないけれ
ども、懸濁液の種々の相は同じ状態でも異なる状態でも
よい（すなわち気体、液体、あるいは固体）。
作動時にキット10は検定すべき試料中に浸漬される。通
孔23により毛細管14の端部が一度試料中に浸漬されると
毛管作用によってこれが充填する（提案されている管の
直径について充満させるためにファイバーを傾斜させて
保持するのが有利であろう）。
かくして毛細管14が溶液中に浸漬されると一定量の試料
がこれに引込まれて完全に充満できるようになろう。実
際に充満した毛細管が必要とされるのではなく、液体が
ファイバー12の活性領域30全体をカバーするだけで十分
である。この状態は毛細管14の壁部を通して試料がファ
イバーの上側の非活性化コーティング32をカバーするの
を観測することによって検証されよう。従って毛細管の
長さとそれが完全に充満するのを精密に制御することは
必要でない。
ファイバー12が一度試料中に浸漬されると、蛍光性物質
57は試料の懸濁流体相中に溶解し始め、拡散によりファ
イバー12の活性領域30と毛細管14の近接する壁部との間
にある懸濁している相全体に一様な濃度になろうとする
傾向がある。同時に試料内の対象となる免疫的に反応性
のある部分と標識された相補的対応成分50とがファイバ
ーから離れて、またファイバーに向かって拡散してゆ
く。懸濁している相内で蛍光性物質57の一様な濃度に達
する速度は蛍光性物質の大きさ、温度、及び試料の粘性
による。これらのパラメータの代表的な値に関し、活性
領域30の数百μ以内の一様な濃度が15分程度の持続時間
で達せられよう。ファイバー12に固定した免疫反応体の
間の平衡化に同程度の時間が必要である。（第３図は平
衡に達する前の状態に対応する。ファイバー12への蛍光
性物質57の付加は中間の試料との平衡時に約半分の蛍光
性物質が溶解しているようにするのが好ましい。）この
ような持続時間内に蛍光性物質57が懸濁している相に一
様に溶解する試料の全容積（と対象となる免疫反応性部
分で排除された懸濁している相の容積と）は活性領域30
の長さだけのファイバー12と毛細管14との間にある容積
にほぼ対応する。活性領域の大きな長さ対直径の比によ
り必要な最少の持続時間を適度に越える持続時間に蛍光
性物質57が分散するだけの量の試料の長さが活性領域30
の長さに非常に近くなっているようになる。
重要な点であるが、免疫的に関係する部分のない浮遊体
74（第３図）が試料43中に懸濁しているので、上記試料
の全容積は対象となる試料の容積と等しくない。所望の
データベースの容積は１種類以上の懸濁している相の浮
遊体74の取囲む懸濁流体相の容積に対応する。全血の場
合浮遊体74は試料の全容積の50％またはそれ以上を含む
細胞（主として直径約7.5μの二重凹形の円板状赤血
球）であり、また懸濁流体（この場合血清）はこれに対
応して残りの容積を含む。浮遊体74に対し反応性がなく
溶解しないように選択された（あるいは細胞の場合、少
なくとも細胞膜と反応したりこれに透過したりしないよ
うに選択された）蛍光性物質57は単に懸濁流体相ととも
に分散している。予め決定された量の蛍光性物質57が活
性領域30とこれに近接する毛細管14の内壁とによってほ
ぼ決定される容積内にある懸濁流体相全体に一様に分散
できるようになっているので、蛍光性物質の濃度は懸濁
流体相の容積についての量になる。
かくして蛍光性物質57の濃度と、それゆえ（消失を考え
ないで）蛍光性物質による懸濁流体の単位容積当りの利
用可能な蛍光の量は蛍光性物質が分散している懸濁して
いる相の全容積とは反比例し、ファイバーー12及び毛細
管14の形状とディスポーザブル10内に予め包含された蛍
光性物質の量とによって設定される懸濁している相の浮
遊体74がない場合に対応する最小値と、これらのパラメ
ータ及び懸濁している相の特定の浮遊体の場合に達せら
れる最密状態によって設定される最大値とを有する。推
奨される濃度において、蛍光性物質57の自然消失は無視
できる程度である。従って既知の量の懸濁流体相の蛍光
測定により検定される懸濁している相の全容積に関する
量が与えられる。
持続時間後にキット10が蛍光光度計59内に置かれ、スト
ッパ16がファイバー12の端面24を蛍光光度計の光学系に
対して適当な位置に設定するように協働する。発蛍光団
52及び蛍光性物質57に蛍光を励起させるように選択され
た波長の放射が、ファイバーの開口数で決定される円錐
角内でファイバー12の端面24を照射するように、ビーム
・スプリッター62及び光学系64を介して、光源60によっ
て供給される。その後にこの放射は臨界角（第３図に光
線54に示される）またはそれ以上の角度でファイバー12
内に伝わり、ファイバーの縦方向に沿って内面全反射し
て倍加する。その結果ファイバーに近接する試料43中に
エバネセント波が生ずる。
前述の関連米国出願第406,324号及び第410,340号に示さ
れるように、ファイバーに付着した部分46に対して、そ
の相補的対応成分である、標識された成分50及び標識さ
れない成分54を拮抗的に結合させることにより標識され
ない成分に対する標識された成分の相対的濃度に比例し
た蛍光標識された複合体46Cが生ずる。エバネセント波
で励起するとファイバー12に非常に近接している標識さ
れた複合体46Cが蛍光を発する。放出された蛍光の一部
がファイバー内に通り抜け、第３図に例えば光線56で示
されるように臨界角を越える行路に沿ってファイバー内
に伝わる。この全反射した放出蛍光の多くは端面24にお
いてファイバーから出るが、ここで光学系64により集光
され、ビーム・スプリッター62及びフィルター66Aを介
して検出器67Aに投射される。フィルター66Aは標識され
た複合体46Cの蛍光ピークの波長帯に対応する放射だけ
が検出機67Aに透過するようにし、検出機67Aの方はこの
蛍光の強度に比例した電気的信号を与える。ビーム・ス
プリッター62はまた光源60からの幾分かの放射が参照光
検出器68を照射するように、参照光検出器68は光源の強
度に比例した電気的信号を与える。これら２つの電気的
信号は比率増幅器70Aにより光源の強度変化についての
補正を行なった固定した標識された物質の蛍光強度に比
例した電気的出力信号を発生させるような比率にされ、
ディスプレイー72で表示される。
同様にしてエバネセント波はファイバー12に非常に近接
した蛍光性物質57の部分の蛍光を励起させる。ファイバ
ー12内に通り抜けて戻り端面24から出るこの蛍光の部分
は光学系64、ビーム・スプリッター62、及びフィルター
66Bを介して検出器67Bに入射する。検出器67Bからの信
号と参照光検出器68との比をとる比率増幅器70Bは光源
強度の変化について補正を行なったファイバー12に近接
する蛍光性物質57の部分による蛍光に比例した信号を与
える。この信号もまたディスプレー72で表示される。
エバネセント波及び蛍光の通り抜けによって設定され
る、観測される蛍光領域の大きさは、ファイバー12の活
性領域30の大きさとともに、懸濁流体相の一定した容
積、一定した形状の浮遊体の占めることができるこの容
積の割合を制限する層の厚さを設定するものである。例
えば、ファイバー12の表面に接触するように分布した7.
5μの球の約50容量％の濃度を考えよう。このような状
態では、各々220μ３の球が平均的に約440μ３の懸濁流
体で取囲まれている。この容積比は六角形でなく立方形
に載架することにより容易になされ、またファイバーの
表面において球形の浮遊体との各々の（微小な）接触点
について約56μ２の懸濁流体があることになろう。例え
はファイバーの1000Åの表面の範囲内に各々の球形の浮
遊体は約0.13の容積を有し、また各浮遊体について約5.
5μ３の懸濁流体があるだろう。このような場合推定さ
れる一定容積の懸濁流体における蛍光性のない浮遊体を
抽出することにより観測される蛍光の減少を考えないこ
とで検定される懸濁流体の全容積の評価に無視し得る程
度の誤差が生ずる。実際に数百Å程度の半分の厚さを有
する観測される蛍光領域が得られよう。それゆえ本来そ
れ以上の容積測定精度が得られるかもしれない。しかし
ながら実際には対象となる浮遊体について生じ易い塑性
流動のために上記の例で示される精度は得られないであ
ろう。
有効な蛍光励起領域における吸収損失の補正を行なうた
めに、ファイバー12に近接する試料の吸収量が減衰全反
射によって観測される。試料43に吸収されるエバネセン
ト波の強度の部分はファイバー内の全反射した放射の強
度の同様な減小となる。ファイバー内で端面24から端面
26の方へ伝わる放射はミラー・コーティング28で反射さ
れ、（より少量の反射及び吸収の損失分が）端面26に戻
る。光学系64はビーム・スプリッター62及びフィルター
66Cを介してこの放射を検出器67Cに結像させる。フィル
ター66Cは検出器67Cによって観測されるスペクトル域を
光源の帯域フィルターのスペクトル域に制限する。かく
して検出器67Cはファイバー12の二重通過または系内の
どこかで損失されない光源60による放射を観測する。検
出器67Cの電気的出力は比率増幅器70Cにより参照光検出
器68の出力との比がとられて、系の透過度に比例した光
源の変化を補正した出力となる。この信号もまたディス
プレー72で表示される。既知の系の損失で較正された透
過度は試料43による吸収についての量である。これらの
損失の割合は試料中の蛍光正物質による励起放射の吸収
によるが、対象となる濃度についてこのような損失は小
さい。かくしてエバネセント波内での赤血球のような高
い吸収性の浮遊体74は減衰全反射によって容易に観測さ
れ計量されよう。
本発明はこれまで説明した装置に限定されるものでな
く、既に概略的に示した実験上のプロトコルに限定され
るものでもない。かくして毛細管14内の試料は毛細管を
試料から取去った直後に毛管作用で保持されるであろう
が、試料の自由表面での蒸発により実際に毛細管内の試
料が減少するであろう。従って試料を集収した直後に毛
細管を非蛍光性のマスチックで密閉するのがよいであろ
う。あるいは毛細管114におけるキット110（第２図）の
指示番号90で概略的に示されるように端部の圧搾を行な
うことにより試料が急速に蒸発しないように保護されよ
う。圧搾部90はファイバー12の下側の不活性領域32に対
する領域に限定され、典型的にはファイバーの直径より
約100μ大きい最小の内径が与えられる（すなわち好ま
しい実施例の200μのファイバーについて圧搾部60の最
小内径は約300μである）。その他の全ての点でキット1
10はキット10と同様となろう。
また試薬の、特に蛍光性物質57の一部は毛細管内に充填
された粉末の形とすることもできるのが理解されよう
（このような実施例では毛細管114の構造自体が推奨さ
れる）。しかしながら蛍光性物質57はまたファイバーま
たは毛細管14の内壁に試薬のコーティング130としてコ
ーティングすることもできよう（第２図に示される）。
また緩衝剤、凝固防止剤等のような他の試薬を毛細管14
内に充填し、あるいはファイバーまたは毛細管にコーテ
ィングしてもよいことが理解されよう。
さらにファイバーの直径はその長さの方向に一定である
ばかりでなく、ディスポーザブル毎にも一定でなければ
ならないことがわかるであろう。他方試料の全量はテス
ト毎に一定であるが、試薬の量は変化するであろう。こ
の精度の必要性は標識された抗原を試薬のコーティング
130（第２図）として毛細管の内壁にコーティングする
ことによって避けられよう。このことはファイバーだけ
でなく毛細管に対する直径一定の必要性を縮減させるこ
とになるであろうが、これは毛細管の直径の増加によっ
て試薬の量だけでなく試料の量も増加し、またファイバ
ーについては反射の回数の減少によって結合箇所の数に
生ずる増加が補償される（照射の総量がファイバーの最
小直径に整合されているとして）からである。
またファイバー12及び毛細管14は正円の筒体とは異なる
ものでもよく、例えば毛細間隔を有する１対の平行な平
板でもよいことが理解されよう。
さらにまた本発明の装置及び方法は免疫検定に限られる
ものではなく、懸濁液の相の相対的容積についての補正
が必要でこのような容積の追加測定が望まれるような他
の検定にも用いられることが理解されよう。実際に前述
のように本発明の方法及び装置はまた単に懸濁液の相の
相対的容積を計量するために１種類だけの試薬（溶解性
の蛍光性物質57）とともに用いることを意図している。
かくして懸濁液が全血であれば、細胞の容積またはヘマ
トクリットを計量するために血清に溶解する蛍光性物質
が用いられよう。このように用いる場合、ファイバー12
の活性領域30に通常固定した抗原または抗体の部分46が
設けられるのではなく、またキット10が標識された相補
的対応成分50を包むこともないであろう。また単に懸濁
液の相の相対的容積を計量するために標識された相補的
対応成分50の標識の蛍光のピークとなる領域に対応する
チャンネル（フィルター66A、検出器67A、及び比率増幅
器70A）が設けられていない単純化された蛍光光度計59
が用いられることが理解されよう。
ここに説明した本発明の範囲から逸脱せずに前述の方法
及び装置に以上のような、さらにまた他の変化を加える
ことができるので、これまでの説明に含まれ添付の図面
に示されている全ての例示的なものとして解すべきであ
り、限定的な意味に解してはならないものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の装置の好ましい実施例をなす免疫検定
のディスポーザブルの縦方向断面図である。 第２図は本発明の免疫検定キットの他の実施例の、第１
図と同様な図である。 第３図は本発明の実施の際の典型的な免疫化学反応を示
す第１（または２）図のキットの一部の様式化した図で
ある。 第４図は本発明の免疫検定キットとともに用いるための
例示的な蛍光光度計の部分的概略図及びブロック・ダイ
アグラムである。 10……検定装置、12……ファイバー（光学的素子）、14
……毛細管 16……ストッパ（位置決め手段） 30……活性化領域（コーティング） 32……非活性領域（コーティング） 43……試料、57……蛍光性物質 59……蛍光光度計、60……光源
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイロン ジエイ・ブロツク アメリカ合衆国ニユーハンプシヤー州 03073，ノース・サレム，ノース・メイ ン・ストリート334 (56)参考文献 特表 昭56−501297（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】懸濁流体の検定に使用するための装置であ
    って： 該懸濁流体を入れるべき第１の限定された空間； 上記第１の限定された空間の中にある、エバネセント波
    による光学的励起に反応性のあらかじめ決められた量の
    蛍光物質であって、上記懸濁流体の１つの相にのみ可溶
    性である蛍光物質；および 上記第１の限定された空間の１部である第２の限定され
    た空間であって、上記蛍光物質とともに上記１つの相の
    実質的にすべてを含んでいる空間からなる装置。
  2. 【請求項２】蛍光物質が、第１の所定の帯域の励起放射
    に応じて第１の周波数帯にわたる蛍光を発することがで
    き、該蛍光物質は上記懸濁流体の１つの相に溶解した際
    に第２の所定の帯域の励起放射によって励起されると第
    ２の周波数帯にわたる蛍光を発することができる特許請
    求の範囲第１項の装置。
  3. 【請求項３】懸濁流体が上記蛍光物質を含む抗原−抗体
    の複合体を含有する特許請求の範囲第２項の装置。
  4. 【請求項４】上記第１の限定された空間の中に、ａ上記
    第１及び第２の所定の励起放射帯域の放射と、上記第１
    及び第２の周波数帯域の放射とに対して透過性の光学的
    素子と、ｂ該素子を毛管管の大きさの離れた状態で少な
    くとも部分的に収容する大きさの長形の収容手段と、ｃ
    上記素子を上記収容手段との上記離れた状態で位置決め
    するための手段とを有することを特徴とする特許請求の
    範囲第２項に記載の装置。
  5. 【請求項５】上記光学的素子が光ファイバーであり、上
    記長形収容手段が毛細管であり、またあらかじめ決めら
    れた量の蛍光性物質が上記毛細管の内壁の少なくとも一
    部に施された溶解性の試薬のコーティングであることを
    特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の装置。
  6. 【請求項６】蛍光性物質の蛍光に対して透過性であり、
    また懸濁流体の試料の特定の流体相に溶解性の上記蛍光
    性物質の蛍光を励起させることができる励起放射に対し
    ても透過性である光学的素子を用いる懸濁流体の検定の
    ための方法において、 上記光学的素子の既知の領域を、検定される流体試料中
    に浸漬させ、 上記既知の領域が上記流体試料の既知の厚さの薄い層で
    完全にカバーされるように上記光学的素子の浸漬を制御
    し、 予め決められた量の上記蛍光性物質を上記既知の領域及
    び上記既知の厚さによって設定される容積の上記流体試
    料中に混入させ、上記蛍光性物質を上記容積内に分布さ
    せる拡散過程に必要な時間を越える時間だけ上記光学的
    素子を上記容積の流体試料中に維持し、 上記特定の流体相中に溶解した上記蛍光性物質をエバネ
    セント波によって励起して蛍光を発するように上記光学
    的素子からの光を照射し、 上記蛍光の強度を測定する ステップからなることを特徴とする上記方法。
  7. 【請求項７】上記懸濁流体の個々の相が上記容積中に下
    記放射のエバネセント波を形成するように実質的に異な
    る別個の透過度を示すような放射で上記光学的素子を照
    射し、減衰した全反射で、上記懸濁流体試料による上記
    放射の吸収を測定する ステップをさらに含むことを特徴とする特許請求の範囲
    第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】上記吸収は、上記懸濁流体の個々の相の１
    つがほぼ透明でありかつ上記懸濁流体の他の相が吸収性
    となる周波数を含む、周波数に対応する周波数帯のもの
    であることを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】懸濁流体試料中の検定される抗原−抗体複
    合体の一成分として含まれる蛍光性標識の蛍光を励起さ
    せることができる励起放射に対して透過性の光学的素子
    を用い、該光学素子が、上記懸濁流体試料の特定の流体
    相に溶解性の第２の蛍光性物質の蛍光を励起させること
    ができる励起放射に対しても透過性であり、また上記標
    識及び上記第２の蛍光性物質の蛍光に対しても透過性で
    あり、その表面の既知の領域に付着された上記抗原−抗
    体複合体の選択された部分を有するようにした免疫検定
    のための方法において、 上記複合体を形成するように検定される懸濁流体試料中
    に上記光学的素子を浸漬させ、 上記既知の領域が既知の厚さの薄い層の上記試料で完全
    にカバーされるように上記光学的素子の浸漬を制御し、 上記既知の領域及び既知の厚さによって設定される容積
    の上記懸濁流体試料中に予め設定された量の上記第２の
    蛍光性物質を混入させ、 拡散過程に必要な時間を越える時間だけ上記浸漬された
    光学的素子を維持して上記容積の懸濁流体試料を排除
    し、 上記素子に付着した上記複合体の標識の蛍光と上記特定
    の流体相に溶解した上記第２の蛍光性物質の蛍光とをエ
    バネセント波で励起させるように上記励起放射で上記光
    学的素子を照射し、 上記蛍光の相対的強度を測定する ステップからなることを特徴とする上記方法。
  10. 【請求項１０】上記懸濁流体の個々の相が上記容積内に
    上記放射のエバネセント波を形成するような、かなりの
    吸収を示す周波数帯域の放射で上記光学的素子を照射
    し、上記懸濁流体試料による上記放射の吸収を減衰した
    全反射で測定する ステップをさらに含むことを特徴とする特許請求の範囲
    第９項に記載の免疫検定の方法。
  11. 【請求項１１】上記周波数帯域が上記懸濁流体の個々の
    相の１つがほぼ透明であるような周波数に対応し、上記
    懸濁流体の他の相が吸収性であるような周波数を含むこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第10項に記載の方法。
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