JPH04501612A - 光学的分析方法、そこで使用するための装置、及びアッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■」 本発明は、エバネッセント信号の光分析法及びこのような方法を行なうための装 置に関する。

特に本発明は、リガンド（ｌｉｇａｎｄ）／特異なパインディングパートナ（Ｓ ｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｔｎｄｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ）アッセイ方法、特にイムノ アッセイ（ｔｍ■ｕｎｏａｓｓａｙ　免疫分析法）信号を検出する方法及びその ための装置に関する。

従来から少量の試料の取り扱い及び計量のための分析装置、及び光分析法でのこ のような装置の使用が種々開示されている。

例えば米国特許第３９３９３５０号では、単純な内部全反射及びプリズム表面に 固定される材料とのエバネッセント波の相互作用を含む方法による、固体透明プ リズム表面に固定される螢光材料の光学的測定が説明されている。

ＢＰ−Ａ−７５３５３では、ファイバ内を軸方向に伝達する光による幾何級数的 に減衰する（エバネッセント）外部放射及びそれのコーティングとの相互作用に ついて言及している。

なかんず＜　ＨＰ−Ａ−１７０３７６では、化学検査装置の一部である導波ガイ ドから出て来る螢光の光分析法が説明されており、ＥＰ−Ａ−１７１１４８では ある化学検査装置、すなわち螢光毛管充填装置（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ　ｃａ ｐｉｌｌａｒｙ　ｆｉｌｌ　ｄｅｖｆｃｅ）及びその製作方法が説明されている 。

ＥＰ−Ａ−１７１１４８に説明されているように、螢光毛管充填装置（以″ＦＦ ＣＦＤと称す。）は、例えばガラスのような透明材料を二個狭い間隔で離して構 成するのが代表的である。一つの板（プレート）は、先導波ガイドとして働き、 この装置で行なわれる検査に適した固定化された試薬を運ぶ。イムノアッセイに 使用するためには、例えば固定化された試薬は検出しようとする抗原の抗体であ れば良く、プレートの一つは螢光染料でラベルが付けられた抗原を備える分解性 試薬を運ぶ、標本をＦＣＦＤの一方の端に置くと、標本は毛管現象の作用により すきまに引き込まれ、試薬を分解する。競争アッセイにおいては、螢光のラベル 付けがされた抗原は、導波ガイドに固定された限定された数の抗体結合量をめぐ って標本抗原と競争する。毛管の間隔は狭い（典型的には１００ミクロンメート ル）ため、一般的に反応は５分間以下という短時間で競争する。

サンドウィッチ型分析では、導波ガイドは検出しようとするりガントに対する特 異なパインディングパートナを運び、プレートの一つは螢光染料でラベル付けさ れた別の特異なパインディングパートナを備える分解性試薬を運ぶ。抗原のサン ドウィッチ型分析では、標本抗原は螢光ラベルが付けられた抗体と導波ガイドに 固定された抗体のサンドウィッチ型合成物を形成する。このようにして合成の形 成により導波ガイドに非直接的に接した螢光ラベルが付けられた抗体の量は、標 本内の抗原の濃度の関数になる。

以下において使用される「抗原」という言葉には、抗原の種類（例えば、蛋白質 、細菌、細菌片、細胞、細胞片及びつイルス）及び適当な条件下で抗原になる付 着体（ハブテン）の両方が含まれるものとする。

ＦＣＦＤを分析に使用する時には、エバネッセント波結合は分離又は清浄工程の 必要がない、ラベル付けされた試薬が適当な波長の光源により光学的に励起され る時には、液相内の発螢光団と境界の発螢光団の両方から、導波ガイドに直接的 又は非直接的に螢光放射が起きる。螢光放射が起きる媒体の光学的特性は、界面 発螢光団から出る螢光の大部分はこの導波ガイドの反対側の縁から垂直に対して 所定角度αより小さい角度で出てくるが、液相内の発螢光団から出る螢光は垂直 に対して実質的にすべてα（−π／２〈α〈π／２）より大きな角度でこの導波 ガイドの縁から出てくる。αΦ値は、空洞内の液相と導波ガイド材料の屈折率及 び波長によって決まり、近似的に次式で表わされる。

ｆｆ２；ａｒｃｓｉｎ　（ｎｚ”　ｎ　＋”）　””但し、ｎｌは液相の屈折率 を表わし、ｎ２は固体導波ガイドの屈折率を表わす、このような理想的な条件下 では、導波ガイドの縁から出る螢光の角度識別は異なる放射信号を分別するのに 充分である。

これまでの議論は、前に定義したαの大きさと比較される大きさの垂直に対する 角度を参照して導かれるが、これらの角度は垂直から正方向又は負方向のいずれ にずれたものでも良いということを理解しておく必要がある。

しかしながら実際には螢光放射の単純な角度識別を利用した分析の感度は、いく つかの実験的要因により制限される。

特に励起波長の光及び光フィルタ（代表的にはコロイドガラス）から全方向に出 る二次螢光から充分にフィルタリングできないこと、及び検出器上に螢光放射を 集光するのに使用されるレンズの収差を含む要因による。

ところが本出願人らは、上記のような分析技術が、過度のフィルタリング又は高 コストで複雑なレンズシステムを必要とせずに、螢光放射又は類似の燐光又は冷 光放射の効果的角度識別を行なうようにこの導波ガイドの縁に近接して配置され た替りの付加的光学構造を使用することにより行なえることを見い出した。

このような本発明の一つの態様によれば、螢光、燐光又は冷光の特性を有し、標 本は一部分が液相内にあり、一部分が界面にあり、隣接する固体表面に直接又は 非直接的に固定されている検査標本の光学的分析方法が提供され、（ｆ）この固 体表面として、（少なくとも分析に使用される放射の波長では）透明である固体 の光学的導波ガイドの表面を準備する工程、（ｉｉ）この固体表面に固定される 標本材料からの光で、この導波ガイドを通過して伝わり、この導波ガイドの光軸 からの角度が次の式のαより小さい角度で導波ガイドから出てくる光を測定する 工程、 α−ａｒｃｓｉｎ　（ｎｚ”　ｎ　１”）　””但し、ｎ２は導波ガイドの材料 の屈折率であり、ｎ、は隣接する液体の屈折率であり、（ｔｔｉ）この先軸から １α１以上離れた角度でこの導波ガイドから出るすべての光を、実質的に測定か ら除外する工程を備える方法において、光学的構造は屈折率ｎ４の透明材料層の 間に挟まれた屈折率ｎ、の透明材料層を備え、この透明材料層はこの導波ガイド の縁から出る実質的にすべてのエバネッセント結合光は屈折率ｎ、のこの層に入 るように、この導波ガイドの縁に近接して配置されているのが特徴である。〔屈 折率ｎ、とｎ４の材料は、次式のように選ばれる。

ｎ　３！　ｎ　、　！夕ｎｚ！　、、ｔそして屈折率ｎ４の材料層は、屈折率ｎ 、の層から屈折率ｎ４の層へ入った光の大部分を屈折率ｎ、のこの層へ戻さない ように働く、〕 本発明の好適な実施例では、屈折率ｎ４の材料層の外側表面だけは光吸収層で覆 われており、層を通過する光は光吸収材料と屈折率ｎ４の材料との境界でほとん ど減衰されてしまう、一般的にこのような境界での減衰は、境界に当る光の少な くとも８０％が吸収されるようになっている。以下の記述では他の実施例を説明 する。

上記の説明から屈折率ｎ、はｎ、より大きく、これに対応してｎ、はｎ４より大 きいことを理解しておく必要がある。

しかしながら実際的な便宜との理由のため、光学的構造の屈折率ｎ４の材料層の 外側表面は実質的に平行であるが、これは木質的なことではない。そして光学的 構造は、色々な幾何的形状を取ることができ、例えば不等辺四角形の断面をなす 。

他の態様では、本発明は上記の光学的分析方法を実行するのに適した装置を含む 、この装置は、（ｉ）検査物体の位置に配置され、螢光、燐光又は冷光特性を有 する標本材料を収容するのに適したスライド又はセルのような検査物体で、この 検査物体は導波ガイドとして働く例えばシート又はファイバの透明な固体形状で 、その表面には標本材料が固体形状に接触する溶液又は液体分散（ｌｉｑｕｉｄ 　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）から固定されることができる検査物体、（Ｈ）これま で定義した光学的構造１で、使用する場合には、検査物体が検査物体位置にある 時にこの光学的構造は検査物体の透明な固体形状に光学的に結合され、透明な固 体形状を伝わる光がこの光学的形状により捕捉されるように配置されている光学 的構造を備えている。

例えばこの形状の光学的縁での変型の結果透明な固体形状から出る光信号内に含 まれる情報の劣化を最小にするため、この形状は光学的構造に屈折率一致技術に より光学的に結合されることが望ましい。

すなわち光学的導波ガイドの光学的縁から出る光の散乱を減少させるため、この 光学的縁は別の光学要素をそれ自体が成すか又は別の光学要素と密接に接触する 屈折率−散物質と密接に接触するようになっている。

「屈折率−散物質」は、導波ガイド材料の屈折率に近似した屈折率を有する物質 を意味し、例えば導波ガイドの屈折率の差が２０％までの屈折率を有する物質を 意味する。

光学的縁と屈折率−散物質との間の密接な接触は、例えば液体又はゲルである屈 折率−散物質を選択するか、又は実質的に透明な固体を予備的に使用して、次に 固定するか又は固化する前に、光学的縁の表面に柔軟に形成することにより実現 される。適当な屈折率一致物質の例としてはセダー油、カナダバルサム、シリコ ーン、エタノール、ペンタノール、フェニルアミン、ベンゼン、グリセリン、パ ラフィン油、テレピン油、シリコーンゲル、及びシランエラストマ、適当なエポ キシ及びアクリレートから選ばれた光学的接合剤又は接着剤のようなプラスチッ クがある。

検査物体は、例えばＢＰ−Ａ−１７１１４８で説明された一般的な形式の装置で ある。

もし必要ならば、検査物体（ｉ）と光学的構造（ｔｉ　）は、複合構造を形成す るように一体に組み合されても良い。

この装置は、更に以下のものを一個以上備える。その一つは、実際の使用におい て光学的構造に光学的に結合される光検出器であり、この光学的構造内を伝わる 光が出射された後にこの光検出器により捕捉される。そして使用の際に光で検査 物体を照明できるように配置された光源を備える（例えば導波ガイド内の光の主 たる伝達方向に対して横切る角度、例えば９０°やその前後の角度である光であ る。）。検査物体からの光が、検査物体の透明な固定形状及び光学的構造の両方 の中へ入りそして通過するようになっている。そして内部反射全体が光検出器へ 入るようになっている。そしてこの方法で使用される光の波長を通過させること ができる（光学的構造に密接に接触するように固定されている）光学フィルタ、 及び光検出器から出る電気信号を所望の方法で分析するためのマイクロプロセッ サ又は類似の処理システムを備えている。

本発明は、以下の記述において特に螢光に関連して更に説明されるが、同様の考 え方が燐光又は冷光にも適用できる。

本発明は、導波ガイドの検査物体の部分から出る光の角度分布に基づいており、 これは溶液内の螢光の量及びこの導波ガイドの表面で吸収される量により決まる 。導波ガイドに適した材料は技術的に既知であり（例えばＥＰ−Ａ−１７０３７ ６及びＢＰ−Ａ−１７１１４８参照）、特にガラス、二酸化硅素（シリカ）及び プラスチック材料が含まれる。この場合は、導波ガイドに隣接した液体内の材料 からの光は、導波ガイドの光軸に対し＼てかなり大きな角度で導波ガイドから出 る。ここでこの液体は水の屈折率に近い屈折率を有し、導波ガイドの屈折率より 小さい屈折率である。導波ガイドの表面に結び付けられた螢光、燐光又は冷光分 子は、既知のエバネッセント波現象により古典的幾何光学では「起きない」とさ れている角度に更に光を放出する（すなわち導波ガイドと標本の界面での臨界角 より大きな角度である。）。

ガラス製の導波ガイドと水溶液、そして５１０ｎｍの波長である螢光の場合には 、角度αは次式で得られる。

ｃｒ”ａｒｃｓｉｎ　（ｎ、”−ｎ、”）　””ここではほぼ±４７°である。

このようにして吸収層からの光は、より広い角度範囲以上で導波ガイドから出る この光の発生により液体から発生する光と区別することができる。このより広い 角度範囲には、約４７″以下の角度だけ導波ガイドの軸から離れた角度も含まれ る。

本発明の方法の光学的構造は、実際の使用における識別を向上させるようにして いる。これは表面に固定されている螢光体から発生ずるエバネッセント的に組み 合わされたすべての光を、大きな角度で検査物体の導波ガイドから出てくる放射 を取り除くように実質的に導くことにより行なわれる。この光学的構造は、この 検査物体の導波ガイドの端に隣接して置くことができ、これにより螢光放射のロ スを最小にできる。

螢光の角度識別は、光学的構造の層を適切に選択した屈折率の材料で構成するこ とにより達成される。

本発明をより理解するために付属の図面を参照する。

第１図は、分析方法のための従来技術の配置を概略的に示す図であり、この配置 はＢＰ−Ａ−１７０３７６に示されているものである。

第２（ａ）図は、概略の断面図により、これまで説明した検査物体とこれまで説 明した光学的構造の一実施例とを、螢光の角度識別できるようにいかに光学的に 組み合せるかを示している。第２（ｂ）図は、光学的構造の他の実施例を示して いる。

第３図は、本発明に基づいた他の光学的構造を示す図であり、第３（ａ）図は横 断面を示し、第３（ｂ）図は縦断面を示す。

第４図は、本発明に基づいて作られた光学的構造を詳細に示す図である。

第５図は、本発明に基づいて行なわれた分析（アッセイ）の結果を示すグラフで ある。

第１図では、標本液体１は検査物体２の中に含まれており、この場合は螢光毛管 充填装置である。一連の検査を行なう間、標本液体内の螢光は検査物体の導波ガ イド３の表面の薄膜材料（図示せず）に固定される。標本液体１は、材料層４と 導波ガイド３の間の容量内に含まれる。第１図に示される実施例では光源５によ り照明が行なわれ、その出力光はレンズ６゜７を使用して集光され、積層したフ ィルタ８により適切な励起波長の光になるようにフィルタをかけられる。導波ガ イド３には縁９があり、この縁は実質的になめらかで長手方向に対して垂直であ る。液体１からと表面層からの光は、導波ガイドを複数回内部反射して伝達し、 縁９より出る。液体標本から発生して直接装置から出る光は、開口を有するマス ク１１により移送される。光検出器１０は、縁９から出る光を受けるように配置 されており、ここで受ける光は導波ガイドの長軸から以前に定義した角度α以下 で広がる光である。これは遮光により行なわれ、例えば所定の角度以上の光を集 めて光検出器に集光する１個以上の凸レンズ１２　、１３と一緒に遮光スクリー ン１５を使用する。縁９から出る光は、フィルタ１４によりフィルタがかけられ 、励起波長の光は検出器１０に届かないようにされる。

第１図は装置の配置を概略的に示す図であることを強調しておく、実際にはこの 従来技術の配置では、効率的な検出のために４５°のプリズム（図示せず）を光 学的な検出手順の最初の要素として縁９に接触させて用いるのが好ましい。

第２図は、本発明がいかにして表面に固定されている螢光体から発生ずる光と標 本液体内の螢光体から発生する光との識別を向上させているかを示しており、光 学系は非常に簡単なものになっている、第１図に示すように、屈折率ｎ、の標本 液体２１は、屈折率ｎ２の固体透明材料の層２３と層２２の内部に含まれ、層２ ３は導波ガイドとして働くのに適している。光学的構造２４は導波ガイドの縁２ ５に近接して配置されており、導波ガイドの縁２５に当る実質的にすべての光は 、端の開口２６を介して光学的構造内に含まれる屈折率ｎ３の固体材料層２７に 入る。一般的に層２７の厚みは最適な光学的な結合のための層２３の厚み以上で あることが必要である。

特定の条件下では、光学的構造２４の端３１と３２の上の不透明なコーティング ３０を延ばして、開口を光学的縁２５と同じ大きさかそれより小さくすることが 望ましいこともある。

層２７の材料は一般的にｎ２より大きな屈折率ｎ、であるが、これは本質的なこ とではない。層２７に適した材料には、例えば光学ガラス、シリカ、リン酸ガラ ス及び結晶スチレンのような重合材料が含まれる。いくつかの実施例では、層２ ７は液体であることが望ましく、適当な手段（例えば端を強固な透明材料の薄層 にする。）により光学的構造２４の中に作られる。

層２７のいずれの側にも透明な固体材料の層２８と２９があり、両方の層は通常 は屈折率ｎ４であり、その外側表面はこの実施例では光吸収コーティング３０で コートされている。もしくは層２８及び／又は２９は適当な手段により光学的構 造２４に作られた液体であっても良く、液体とそれを規定する手段との界面での 内部全反射が生じないようになっている。

図示の実施例では、光学的構造の長軸に実質的に平行である光学的構造の外側表 面はコーティング３０で実質的に全体がコートされる必要があることが必須であ り、この理由を以下に説明する。また必須ではないが、コーティング３０は層２ ８と２９の端３１と３２を覆うように延びていることが望ましい。もしくは実際 の使用では光学的構造の端３１と３２を覆うように物理的開口を使うこともでき る。光学的構造の外側表面が長袖に対して平行であることは絶対に必要なことで はない、したがって例えば第２（ｂ）図に示すように、光学的構造は断面が台形 であるように作られても良い。

更にこれは必須のことではないが、コーティング３０はＪｉ２８と２９の端３７ と３９を覆うように延びていることも望ましい。もしくは実際の使用では光学的 構造の端３７と３９を覆うように物理的開口が使用できる。

層２８と２９に適した材料には、シリカ、フッ化マグネシウム、フッ化すチウム 、光学ガラス（例えばＢＩ３又はクラウンガラス）、リン酸ガラス、重合材料（ 例えばアクリル又はシリコン）及び液体が含まれる。適当な材料（例えばリン酸 ガラス）では、層２８と２９は必要ならばスピンコーティングにより作られる０ 層２８と２９の厚みは、２ミクロン以上であることが必要である。

層２７　、２８及び２９の材料の選択は、本発明の方法を成功させるのに重要で ある。実際に標本液体２１から生じる光３６から、表面３３に固定された螢光体 から発生する光３５を角度識別するには、屈折率ｎ、とｎ４を適切に選ぶことが 必要である。一般的にこれらの関係は次式の通りである。

ｎ　、　ｔ　ｎ　４を夕ｎ　ｔｔ　ｎ　、　２しかしながらある条件下では、（ ｎ　、　ｔ　ｎ　、　ｔ　）の値は上記の式より小さい方が望ましいこともある 。これにより端２５から出て、光学的構造を介して光検出器により集められる光 、特に以前に定義したαに近い角度で出る光を減少させる効果がある。

光吸収コーティング３０として適した材料には、黒ペンキ、熱又は赤外放射によ り光学的に修正できるシリコンペンキ、染料等があり、これらはスクリーン印刷 又はもし可能であればスピンコーティング又はスプレィのような従来からの方法 により作られる。これらの材料は少なくも分析に含まれる波長の光を減衰又は吸 収する。コーティング３０の最小厚みは、３ミクロンが代表値である。光学的構 造２４は、第１図の要素１１から１５の役割と同一の働きをするが、使用する上 でははるかに便利である。更にプリズムを導波ガイドの光学的縁に接して配置し た従来技術の配置に比べて、本発明ではこれまで定義してきた光学的構造を、こ の縁に接触させる必要がない。

数ミリメートルのすき間（これから説明する例１に述べられた装置を使用する時 のすき間）は、検出感度の大きな低下を生じることはない。

他の実施例では、光学的構造の層２８と２９の外側表面は、層２８と２９に屈折 する光が光学的構造２４から散乱するように、荒らされていても良い。このよう な実施例では、層２８と２９の外側表面は、層２８と２９に屈折して入る光の実 質的にすべてを光学的構造２４から散乱するように荒らされていることが望まし い。このような場合、必須ではないが既に説明した光学的構造２４にコーティン グ３０を施すことが望ましい。他の実施例では、層２８と２９に屈折して入った 光は、層の外側表面に適当な回折格子を形成することにより、光学的構造２４か ら散乱される。

更に他の実施例では、層２８と２９の厚みは層２８と２９内を伝搬する光が実質 的にｉ！２７に再び入らないように充分に大きくても良い。このような実施例で は、層２８と２９は充分に厚く、そこを伝搬する光が再び層２７に入らないこと が望ましい。この場合層２８及び／又は２９の厚みｈは次式で与えられる。

ｈ＞　１／　２　・ｄ　Ｃｎａ”　１　）　””但し、ｄは光学的構造の長さで あり、ｎ４はこれまでの説明で定義したものである。このような場合には、必須 のことではないが、更に既に説明した光学的構造２４にコーティング３０を施す ことが望ましい。

光学フィルタ（例えばコロイドガラス）を任意に光学的構造２４の端２６に組み 合せても良い。もし光学的フィルタが光学的構造２４と一体にされるならば（第 ４図に示される特定の実施例にあるように）、それは層２７と同−又はそれ以上 の屈折率である材料で作られることが望ましい、適当な屈折率のフィルタガラス がない時には、フィルタ２０は第２（ｂ）図の実施例に示されるように層２７の 端２６に接していれば良い０本発明の方法による光学系により、このフィルタ内 で発生し光検出器に送られるいかなる二次螢光も最小になる。いずれにしろ光学 的フィルタは光学的構造と端３８で一体化される。

もし検出光学系において、例えば装置内で発注する偽せの螢光及び／又は燐光を 減少させるような干渉フィルタの存在が望ましいならば、適当な多層フィルタが 光学的構造２４の表面２６及び／又は表面３８上に置かれる。これは例えば良く 知られている真空蒸着技術の手段により作られる。いずれにしろあらかじめ作ら れた干渉フィルタは、光学的構造の表面２６及び／又は表面３８に光学的に一体 化祐倍れれば良い。

第３（ａ）図は、本発明で使用される光学的構造の円柱変形の横断面を示す。屈 折率ｎ、の材料の円柱層４０は、屈折率ｎ４の材料の同軸層４１により囲まれて いる。既に説明したように、層４１の外側表面ば通光な不透明材料でコートされ ている。

第３（ｂ）図は、この変形の長手方向の断面を示し、これは第２図に示した構造 に一致している。

第３（ａ）図及び第３（ｂ）図に示したような円柱構造は、例えば米国特許４４ ４７５４６号に示されたような円筒のバイオセンサ（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）と 組み合せて使用すると効果的である。

使用する時には、例えば光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｓｕｌｔｉｐｌｉｅｒｔｕｂ ｅ）のようなこれまで説明した光検出器は、螢光を出す光学的構造の端に近接し て置かれ、レンズを付加する必要無しにこの光学的構造から出る光を直接検出す る。このような配置は、反射による信号の損失を最小限にする。しかしながら必 要ならば従来通りにレンズを付加して使用しても良い。

他の配置では、適当な光検出器（例えばシリコンフォト検出器）を、光学的構造 ２４の端表面３８に、光学的に一体化する。

上記のことに関する説明は、特に螢光毛管充填装置（ＦＣＦＤ’　Ｓ）を含むイ ムノアッセイを参照して行なわれる。しかしこの発明は、特にエバネッセント信 号を含む導波ガイドから出る光信号の角度識別を含む他の方法及び装置にも適用 できると考えられる。

本発明の方法は、特に抗原又は抗体の分析、すなわちイムノアッセイに適用可能 である。しかしながら本発明は、抗体又は抗原の分析に限定はされない０本発明 の方法と関連して分析されるリガンドの例を、次の表１に示す、これと−緒に各 偶での適当な特異なパインディングパートナも示す。

表１ 配位子　特異なパインディングパートナ抗原　特異な抗体 抗体　抗原 ホルモン　ホルモン受容体 ホルモン受容体　ホルモン ポリヌクレオチド鎖　相補的ポリヌクレオチド鎖アビジン　ビオチン ビオチン　アビジ′ たん白質Ａ　免疫グロブリン 免疫グロブリン　たん白質Ａ 酵素　酵素補因子（基質）又は阻害体 酵素補因子（基質）　酵素 又は阻害体 レクチン　特異な含水炭素 レクチンの特異な　レクチン 含水炭素 本発明の方法は、非常に広い適用性を有するが、特にホルモンの分析に関連して 使用される。このホルモンにはペプチドホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン （ＴＳＨ）　、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣ Ｇ）　、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）　、インシュリン及びプロラクチン）又は 非ペプチドホルモン（例えばコルチゾル、エストラジオール、プロゲステロン及 びテストステロンのようなステロイドホルモン、又はチロキシン（Ｔ４）及びト リョードチロニンのようなチロイドホルモン）、たん白ｆ（例えば発がん性抗原 （ＣＥＡ）及びアルファフェトたん白質（ＡＦＰ）　）、薬品（例えばジゴキシ ン）、砂糖、トキシン、ビタミン、たん白質、更にインフルエンザ、バラインフ ルエンザ、アデノウィルス、肝炎ウィルス、呼吸ウィルス及びエイズウィルスの ようなウィルス、又は微生物が含まれる。

本発明を説明するため以下に例を示すが、これに限定されるものではない。

肛 ヒト　゛　１゛ホルモンの　・　−梶 ｌ祈公材且皇爽！ （ｉ）叉−常光Ｍλ豚威 第４図は、第２図と第３図に示された形式の光学的構造を詳細に示す図であり、 本発明に基づいて次のように使用するように作られている。ソリール（Ｓｏｕｒ ｉｅｌ）８８９／　６１光学ガラスの板から、３０．０閤Ｘ１５．Ｏｍ、Ｘ３． Ｏ閣の大きさの片４６を従来技術を使って切り出す。ガラスの表面をすべて磨い た後、再び従来技術を使用して、二個のシリカ片４７．４Ｂに接着される。

シリカ片４７．４８は、通常の技術を使って切り出して磨いたものである。層を 接着するのに使用した接着剤は、レンズ接着用光学接着剤（屈折率１５５）であ る。フィルタガラス（ＯＧ５１５コロイドガラス）の片４９は、正確に所定の大 きさく１５．０■×３．０ｍＸ３．Ｏｍ）に切断されており、前記と同一の接着 剤を使用して光学的構造に接着される。最後に、光学的構造のすべての露出シリ カ表面（しかし光学ガラス又はフィルタガラスのいずれの表面でもない、）は、 黒色不透明コーティング（図示せず）がスプレィ式に塗られる。

（ｊ）フルオレセイン　イソチアシアン　（ＦＩＴＣ）に　入る　ｈｃｃ　Ｏ量 Ｆ！ＴＣ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌ＄ｄ、＋製英国 ）２００■と異なる抗原決定基を特定するｈＣＧに対する第２モノクロナール抗 体５■を、０．２Ｍナトリウム重炭酸緩衝液（ｐＨ９，０）　１．４ｄ中で混ぜ 合せる。混合液は、室温で１８時間放置され、その間にＦＩＴＣのモノクロナー ル抗体への結合が起きる０次に混合液は、セファデックスＧ−５０スーパフアイ ン（商品名）上でのゲル濾過により精製される。

（ｉｉｉ）　ｈＣＧ　’　ｒｉの。

第一の国際基準（ｆｉｒｓｔ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃ ｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（７５１５３７）に対して計量されたｈＣＧのフ リーズトドライ調整を、イタリア国のミラノのＢｉｏｄａｔａ　ＳｐＡから得る 。この標本は、馬の血清（Ｓｅｒｏｎｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ、、 英国）で希釈されて、ｈＣＧの基準として必要な範囲になるようにされる。

（ｉｖ）ｈｃ　゛　で　れる 本発明に基づく分析のためには、第１図のラベル１から１０に対応する構成要素 が使用される。検査物体２は、ＢＰ−Ａ−１７１１４８に開示された形式の螢光 毛管充填装置であり、その導波ガイド部分３の内側表面上には、従来の方法によ りｈＣＧに対するモノクロナール抗体が固定されている。光源５はハイマンキセ ノンフラッシュランプ（Ｈｅｉｎｎ＋ａｎｎ　ｘｅｎｏｎ　ｆｌａｓｈ　ｌａｍ ｐ）である、積層フィルタ８は三個のフィルタで構成されており、それぞれＢＧ ７シＥｆ７ト（Ｓｃｂｏｔｔ）ガラスフィルタ（Ｅａｌｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒ。

０ｐｔｉｃｓ　ＵＫ　Ｌｔｄ、、　Ｗａｔｆｏｒｄ英国）、４５０　４８０ｎ＠ ＋のＦＩＴＣバンドパス干渉フィルタ（Ｏｐｔｏｓｅｔｒｉｃｓ　Ｌｔｄ、、英 国）及び４７５ｎｓの単色干渉フィルタ（Ｃｏｓ＋ａｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ　Ｌｔｄ、＋ケンブリッジ、英国）である。

前記の項（ｉ）で作られた光学的構造は、導波ガイドの縁９に近接して配置され る（第２図参照）、光検出器１０は、浜松フォトニクス社製Ｒ９３１Ａ光電子増 倍管（Ｈａｋｕｔｏ　ＵＫ　Ｌｔｄ、）である。

参考のために、第１図に番号１１から１５で示した構成要素を使用した従来の分 析も行なった。この場合に使用したフィルタ１４は、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ） ＯＧ５１５の５１５ｎ＋＋コロイドガラスフイルタである。

ゲＪＵ引去 αｈＣＧ−ＦＩＴＣ結合を各ｈＣＧ標準に加えて、０．５ｉの検査溶液を得る。

結合濃度は、１■／ｄである。検査セルが選らばれ、それぞれに異なる検査溶液 が満たされる。光検出器からの信号は、湿気のある２０゛Ｃの環境で２０分間の 潜伏期の後から記録される。

第５図は、これまで説明した光学的構造を含む装置を使用して行った分析結果を 示すグラフであり、比較のために第１図に模式的に示した装置を使用した従来の 分析結果を示す。

本発明に基づいて行なわれた分析は、従来技術より明らかに良い精度を表わして いる（９．０％に比べて５．１％である。）。

ＦＩ６．５ ｈＣＧ濃／ｉ　ｆｍｌＵ／ｍｌ１ 国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．螢光、燐光又は冷光特性を有し、標本が部分的に液相内にあり且つ部分的に 隣接する固体表面に直接又は非直接に固定されている検査標本の光学的分析方法 であって、（ｉ）（少なくとも分析に含まれる放射の波長では）透明な固体の光 学的導波ガイドの表面を、前記固体表面として備える工程、 （ｉｉ）前記固体表面に固定された標本材料から発生して前に 記導波ガイドを通って伝搬した後に前記導波ガイドから出る光のうち前記導波ガ イド材料の屈折率をｎ２とし、隣接する液体の屈折率をｎ１とすると、前記導波 ガイドの光軸からα■ａｒｃｓｉｎ（ｎ２２−ｎ１２）１／２で表わされる角度 α末端の広がり角で出る光を測定する工程、及び （ｉｉｉ）前記光軸から前記αの絶対値以上の広がり角度で前記導波ガイドから 出るすべての光を、実質的に前記測定値より除く工程を備えた光学的分析方法に おいて、屈折率ｎ４の透明材料層の間に直接挟まれた屈折率ｎ３の透明材料層を 備えた、〔屈折率ｎ３及びｎ４の材料は、ｎ３２−ｎ４２■ｎ２２−ｎ１２の関 係を満すように選択され、屈折率ｎ４の材料層は屈折率ｎ３の層から入ってきた 光の大部分が再び屈折率ｎ３の前記層に再び戻って入らないように働く〕光学的 構造が、前記導波ガイドの縁に近接して配置され、前記導波ガイドの縁から出る エバネッセントに関連する光は実質的にすべて、屈折率ｎ３の前記層に入るよう になっていることを特徴とする光学的分析方法。
2. ２．屈折率ｎ４の材料層の屈折率ｎ３の材料層に接触していない表面のうちすく なくとも一個の表面には、光吸収材料がコートされている請求項の１に記載の光 学的分析方法。
3. ３．屈折率ｎ４の材料層と光吸収材料のコーティングとの界面に当る光のうち少 なくとも８０％は吸収されるようになっている請求項の２に記載の光学的分析方 法。
4. ４．屈折率ｎ４の材料層の屈折率ｎ３の材料層に接触していない表面のうちすく なくとも一個の表面は、この表面に当る光が光学的構造の外へ散乱されるように 荒されている請求項の１に記載の光学的分析方法。
5. ５．前記表面には光吸収材料がコートされている請求項の４に記載の光学的分析 方法。
6. ６．屈折率ｎ３の透明材料層は円柱であり、屈折率ｎ４の透明材料層はこれを囲 む同心円状の円筒である請求項の１に記載の光学的分析方法。
7. ７．屈折率ｎ４の各材料層の厚さｈは、ｄを光学的構造の長さとすると、ｈ＞１ ／２・ｄ（ｎ４２−１）１／２で与えられる請求項の１に記載の光学的分析方法 。
8. ８．請求項の１から７のいずれか１項に記載された方法で使用するための装置で あって、 （ｉ）螢光、燐光又は冷光特性を有する標本材料を保持するのに使用され、導波 ガイドとして働く透明な固体の本体を備え、この本体の表面には本体に接触する 溶液又は液体分散（ｌｉｑｎｉｄｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）から標本材料が固定さ れ、所定の位置に配置される検査物体、及び （ｉｉ）使用に際して、検査物体が検査物体位置にある時に、検査物体の透明な 固体の本体に光学的に結合され、透明な固体の本体内を伝搬する光を受けること が可能な請求項の１に記載の光学的構造を備える装置。
9. ９．検査物体は、毛管現象により標本液体を引き込める程充分に小さい空洞又は 複数の空洞を有する特異反応の標本収集及び検査装置であって、空洞の表面は装 置内で行なう検査に適した固定される試薬を運び、この表面は光移送の導波ガイ ドとして働く透明な固体板の表面であり、この板は実質的に光学的になめらかで 板に対して直角である縁を有する請求項の８に記載の装置。
10. １０．検査物体及び光学的構造は、一体のユニットを形成するように組み合され ている請求項の８又は９に記載の装置。
11. １１．光学的構造は、光学的構造及び透明な固体の本体に強固に接触している屈 折率合せ物質を介して、検査物体の透明な固体の本体に光学的に結合されている 請求項の８から１０のいずれか１項に記載の装置。
12. １２．螢光、燐光又は冷光特性を有する検査標本であって、部分的には液相内に あって且つ部分的には直接的又は非直接的に隣接する固体の表面に固定され、請 求項の１から７のいずれか１項に記載の光学的分析方法のためのものである検査 標本のアッセイ方法。
13. １３．前記検査物体は、抗原又は抗体を備える請求項の１２に記載の方法。
14. １４．アッセイ方法において、請求項の８から１１のいずれか１項に記載の装置 を使用すること。