JPS61191965A - 液状分析物中の種のパラメ−タ−を光学的に確認する方法および装置 - Google Patents
液状分析物中の種のパラメ−タ−を光学的に確認する方法および装置Info
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- JPS61191965A JPS61191965A JP60276144A JP27614485A JPS61191965A JP S61191965 A JPS61191965 A JP S61191965A JP 60276144 A JP60276144 A JP 60276144A JP 27614485 A JP27614485 A JP 27614485A JP S61191965 A JPS61191965 A JP S61191965A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は液状分析物（ａｎａｌｙｔｅ）中のパラメータ
ーを確認する方法、例えば、その中に溶解した種を決定
する方法に関する。
ーを確認する方法、例えば、その中に溶解した種を決定
する方法に関する。
〔従来の技術と発明が解決しようとする問題点〕この方
法は既知の技術に関し、ここで完全に反射した光の信号
を運ぶ光学的導波路（ｗａｖｅｇｕｉｄ・）は分析物と
接触し、そして前記信号のエバネッセント波成分は固体
と液体との界面において分析物と、その内部の種に固有
のあるパラメーターに対して応答性であるような方法で
相互作用する。例えば、このようなパラメーターについ
ての情報は、導波路内の入射信号の反射点における入射
信号の視線エネルギーの一部の吸収に関し、あるいはこ
′のような種に特徴的な蛍光信号の連続的生成を伴う
前記視線エネルギーによるある蛍光発生体（ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｒｅ）の励起に関係づけることができる。
法は既知の技術に関し、ここで完全に反射した光の信号
を運ぶ光学的導波路（ｗａｖｅｇｕｉｄ・）は分析物と
接触し、そして前記信号のエバネッセント波成分は固体
と液体との界面において分析物と、その内部の種に固有
のあるパラメーターに対して応答性であるような方法で
相互作用する。例えば、このようなパラメーターについ
ての情報は、導波路内の入射信号の反射点における入射
信号の視線エネルギーの一部の吸収に関し、あるいはこ
′のような種に特徴的な蛍光信号の連続的生成を伴う
前記視線エネルギーによるある蛍光発生体（ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｒｅ）の励起に関係づけることができる。
一般に、相互作用は入射光の二ノ４ネ、セント波成分が
分析物中に浸透する深さに対応する区域に限定され、こ
の深さは導波路の表面から出発して数十〜数百ナノメー
トルの範囲である。
分析物中に浸透する深さに対応する区域に限定され、こ
の深さは導波路の表面から出発して数十〜数百ナノメー
トルの範囲である。
前述の相互作用は全体の溶液中のあるツクラメ−ターに
ついて情報を提供することが一般に知られている〔ハー
プ４ （Ｈａｒｄｙ）、米国特許４，０５０，８９５号
〕が、最近発表された研究が示すように、エバネッセン
ト波成分と分析物との相互作用（あるいはむしろ、その
エネルギーの実質的な部分の分析物中への漏れ）が導波
路の表面と結合した問題の化合物の単一層←般に単分子
層）を含むように限定されるとき、改良された結果（す
なわち、すぐれた感度および精度）が得られる。換言す
ると、非常に有用な分析技術は、研究すべき分析物との
接触前に１導波路上に前記分析物の種に対して特異性の
反応成分を取り付け、その後、それを前記分析物中に浸
漬させることに基づくことができることが最近発見され
た。これらの条件下で、問題の種は前記反応成分と結合
し、そして導波路の表面に複合体（ｃｏｍｐｌ・Ｘ）の
層を形成し、問題の種のその層中の濃度（すなわち、相
互作用の区域における前記層の実際の密度）は時間とと
もに非常に急速に増加し、そして導波路内を移動する光
との相互作用は増加しかつその出力に訃ける応答は強く
なるであろう〔クロニ、り（ＫＲＯＮＩＫ）およびリト
ル（ＬＩＴＴＬ］ｉ：） 、米国特許３，９３９，３５
０号〕。
ついて情報を提供することが一般に知られている〔ハー
プ４ （Ｈａｒｄｙ）、米国特許４，０５０，８９５号
〕が、最近発表された研究が示すように、エバネッセン
ト波成分と分析物との相互作用（あるいはむしろ、その
エネルギーの実質的な部分の分析物中への漏れ）が導波
路の表面と結合した問題の化合物の単一層←般に単分子
層）を含むように限定されるとき、改良された結果（す
なわち、すぐれた感度および精度）が得られる。換言す
ると、非常に有用な分析技術は、研究すべき分析物との
接触前に１導波路上に前記分析物の種に対して特異性の
反応成分を取り付け、その後、それを前記分析物中に浸
漬させることに基づくことができることが最近発見され
た。これらの条件下で、問題の種は前記反応成分と結合
し、そして導波路の表面に複合体（ｃｏｍｐｌ・Ｘ）の
層を形成し、問題の種のその層中の濃度（すなわち、相
互作用の区域における前記層の実際の密度）は時間とと
もに非常に急速に増加し、そして導波路内を移動する光
との相互作用は増加しかつその出力に訃ける応答は強く
なるであろう〔クロニ、り（ＫＲＯＮＩＫ）およびリト
ル（ＬＩＴＴＬ］ｉ：） 、米国特許３，９３９，３５
０号〕。
導波路の表面上の問題の生成物の非常に薄い層の形成を
含むこのような型の分析において、光の信号と溶液の本
体との相互作用は妨害（パックグラウンドの雑音）と考
えられておシ、そしてそれをできるだけ多く最小とする
試みがなされてきた。
含むこのような型の分析において、光の信号と溶液の本
体との相互作用は妨害（パックグラウンドの雑音）と考
えられておシ、そしてそれをできるだけ多く最小とする
試みがなされてきた。
例えば、エバネッセント成分と導波路の表面上に付着し
た単分子層との最大の相互作用および全体の溶液との最
小の相互作用の間の妥協的条件は、導波路／分析物の界
面における導波路の材料の外側の前記エバネッセント成
分の浸透深さを制御することによって達成できる。この
ような制御は、溶液の屈折率（−、）に関して適当な屈
折率（ｎりをもつ導波路を選択し、セして導波装置内の
全体の反射角ならびに入射光の波長を適切に選ぶことに
よって実施できる（これを実施できる理由およびこのよ
うな選択を行う方法については後に詳述する）。例えば
、欧州特許出願（Ｅｐ、Ａ）７５３ｓ３号において、こ
の浸透深さは問題の前記層の厚さに合致するように、あ
るいはそれを超えるように最適化できることが開示され
ている。
た単分子層との最大の相互作用および全体の溶液との最
小の相互作用の間の妥協的条件は、導波路／分析物の界
面における導波路の材料の外側の前記エバネッセント成
分の浸透深さを制御することによって達成できる。この
ような制御は、溶液の屈折率（−、）に関して適当な屈
折率（ｎりをもつ導波路を選択し、セして導波装置内の
全体の反射角ならびに入射光の波長を適切に選ぶことに
よって実施できる（これを実施できる理由およびこのよ
うな選択を行う方法については後に詳述する）。例えば
、欧州特許出願（Ｅｐ、Ａ）７５３ｓ３号において、こ
の浸透深さは問題の前記層の厚さに合致するように、あ
るいはそれを超えるように最適化できることが開示され
ている。
〔問題点を解決するための手段および作用効果〕しかし
ながら、このアプローチは常に最も望ましいということ
はないことが予期せざることには今回発見された。事実
、問題の層の厚さに相当する距離を明確に越えるエバネ
ッセント波成分の浸透は、問題の前記層中に特定的に含
まれるもの以外の分析物のパラメーター、例えば、分析
物中に溶解した種についての分析結果を同時に得るとき
、きわめて有用であシうることか発見された。したがっ
て、この発見は特許請求の範囲第１項に記載される新規
な分析法の１つの面に導いた。その上、この方法は、ま
た、導波路が運ぶ光と分析物との有用な相互作用が導波
路の１つよ）多い特定の区域（すなわち、この区域上の
単一層の被膜または全体の溶液との相互作用、あるいは
全体溶液および被膜の両者の同時の相互作用が起こる区
域）を含むことができ、すなわち、前記導波路の２つま
たはいくつかの明確に異る区域を含むことができるとい
うことを認識した後、それ以上の面に拡張された。例え
ば、１つの区域において、相互作用は全体の溶液と起こ
ル、そして他のあるいはさらに多い光学的に分離された
区域において、相互作用は問題の１つまたはいくつかの
層と起こるであろう。特許請求の範囲第１項は、本発明
のこの方法の完全な範囲を実際に要約している。
ながら、このアプローチは常に最も望ましいということ
はないことが予期せざることには今回発見された。事実
、問題の層の厚さに相当する距離を明確に越えるエバネ
ッセント波成分の浸透は、問題の前記層中に特定的に含
まれるもの以外の分析物のパラメーター、例えば、分析
物中に溶解した種についての分析結果を同時に得るとき
、きわめて有用であシうることか発見された。したがっ
て、この発見は特許請求の範囲第１項に記載される新規
な分析法の１つの面に導いた。その上、この方法は、ま
た、導波路が運ぶ光と分析物との有用な相互作用が導波
路の１つよ）多い特定の区域（すなわち、この区域上の
単一層の被膜または全体の溶液との相互作用、あるいは
全体溶液および被膜の両者の同時の相互作用が起こる区
域）を含むことができ、すなわち、前記導波路の２つま
たはいくつかの明確に異る区域を含むことができるとい
うことを認識した後、それ以上の面に拡張された。例え
ば、１つの区域において、相互作用は全体の溶液と起こ
ル、そして他のあるいはさらに多い光学的に分離された
区域において、相互作用は問題の１つまたはいくつかの
層と起こるであろう。特許請求の範囲第１項は、本発明
のこの方法の完全な範囲を実際に要約している。
本発明の方法において、導波路内を案内される光と分析
物との任意の型の相互作用を考えることができる。こう
して、この相互作用は信号の一部の吸収から生ずること
ができ、次いで出力は出力エネルギーの減少であり、導
波路の出力に位置する収集および検出手段により集めら
れる。あるいは、問題の種（分析物本体中に位置するか
あるいは導波路の表面上の問題の被膜中に位置するかに
かかわらず）が入射信号による励起下に蛍光を発生でき
る場合、相互作用は蛍光を生成することができる。これ
は例えば蛍光型のアッセイの場合であり、ここで導波装
置の表面上に形成しつつある複合体中の相手の１つは、
前記複合体の形成下に蛍光を誘発する蛍光体の群からな
る。他の方法において、有用な応答は照明された導波路
の底面上に構成された大きい分子の凝集体くよる入射光
の散乱から生ずることもできる。
物との任意の型の相互作用を考えることができる。こう
して、この相互作用は信号の一部の吸収から生ずること
ができ、次いで出力は出力エネルギーの減少であり、導
波路の出力に位置する収集および検出手段により集めら
れる。あるいは、問題の種（分析物本体中に位置するか
あるいは導波路の表面上の問題の被膜中に位置するかに
かかわらず）が入射信号による励起下に蛍光を発生でき
る場合、相互作用は蛍光を生成することができる。これ
は例えば蛍光型のアッセイの場合であり、ここで導波装
置の表面上に形成しつつある複合体中の相手の１つは、
前記複合体の形成下に蛍光を誘発する蛍光体の群からな
る。他の方法において、有用な応答は照明された導波路
の底面上に構成された大きい分子の凝集体くよる入射光
の散乱から生ずることもできる。
本発明の方法を実施するために１例えば、光学繊維の形
あるいは分析物中に溶解した１つの第１種に対して特異
性の試薬で被覆され九ガラスまたはｆラスチ、りのスラ
イドの形の導波路を使用することができ、ここで分析物
は他のあるいはそれ以上の問題の種をさらに含有する。
あるいは分析物中に溶解した１つの第１種に対して特異
性の試薬で被覆され九ガラスまたはｆラスチ、りのスラ
イドの形の導波路を使用することができ、ここで分析物
は他のあるいはそれ以上の問題の種をさらに含有する。
後に詳述する実施例において、この第１種は他のヘモグ
ロビンまたは血液の因子をも含有する血液の試料中の特
定のヘモグロビン化合物であることができる。こうして
、この場合において、導波路は第１種に対して特異的の
抗体を取９付けて有し、そして、照明された導波路を血
液試料と接触させ、かつ導波路内の光を、溶液本体およ
び導波路の表面上に形成する複合体の単分子層（抗体お
よび第１種を含む）と、同時に、効果的にかつ信号発生
的に相互作用させるための測定条件（後に詳述する）を
準備すると、信号が導波路の出口に得られ、この信号は
励起信号と塊状で相互作用した合計のヘモグロビン（ま
たは他の血液因子）と複合体の形成に参加した前記第１
種とを同時に表わす。
ロビンまたは血液の因子をも含有する血液の試料中の特
定のヘモグロビン化合物であることができる。こうして
、この場合において、導波路は第１種に対して特異的の
抗体を取９付けて有し、そして、照明された導波路を血
液試料と接触させ、かつ導波路内の光を、溶液本体およ
び導波路の表面上に形成する複合体の単分子層（抗体お
よび第１種を含む）と、同時に、効果的にかつ信号発生
的に相互作用させるための測定条件（後に詳述する）を
準備すると、信号が導波路の出口に得られ、この信号は
励起信号と塊状で相互作用した合計のヘモグロビン（ま
たは他の血液因子）と複合体の形成に参加した前記第１
種とを同時に表わす。
この場合において、導波路の出口における信号は２つの
独立の効果を表わし、そして簡単な手段により解読する
ことができる。なぜなら、全体のヘモグロビンに対する
応答は導波路の端から集められる信号出力の即時の部分
的励起に相当しくこれは実際には前述のパックグラウン
ドの雑音である）一方薄層に対する応答は抗体および決
定すべき第１の特異的種の前記複合体層の、遅い反応で
ある、形成による時間依存性の信号であるからである。
独立の効果を表わし、そして簡単な手段により解読する
ことができる。なぜなら、全体のヘモグロビンに対する
応答は導波路の端から集められる信号出力の即時の部分
的励起に相当しくこれは実際には前述のパックグラウン
ドの雑音である）一方薄層に対する応答は抗体および決
定すべき第１の特異的種の前記複合体層の、遅い反応で
ある、形成による時間依存性の信号であるからである。
そうでなければ、分析物中の２つの特定の因子（例えば
、存在するなかでも因子１および因子２）を決定しなく
てはならない場合、２つの独立に働く光学的区域をもつ
導波路を選択することが好ましく、各区域は決定すべき
前記因子の１つに対して特異的な１つの試薬（抗体）を
有する。このような場合において、導波路の出力に集め
られた２つの応答信号（これは導波路が別の出力をすで
にもたない場合に当てはまる）は（−）相依存性または
伽）周波数依存性である。
、存在するなかでも因子１および因子２）を決定しなく
てはならない場合、２つの独立に働く光学的区域をもつ
導波路を選択することが好ましく、各区域は決定すべき
前記因子の１つに対して特異的な１つの試薬（抗体）を
有する。このような場合において、導波路の出力に集め
られた２つの応答信号（これは導波路が別の出力をすで
にもたない場合に当てはまる）は（−）相依存性または
伽）周波数依存性である。
場合（、）は２つの独立の光学的素子をもつ導波路によ
り例示され、このような素子の例は分析用キエペットの
２つの対向する壁であり、前記壁は全反射信号のために
光伝導性であり、そして各々は内部が２つの前述の反応
成分の１つで被覆されてお夛、各々は分析物中の決定す
べき２つの因子（因子１および因子２）の１つに対して
特異性である。この場合において、２つの素子は順番に
照明され（交互に加えられる）々ルス）、加えるモード
は対応する信号を適切に分離しかつ独立に表示するため
に、検出および処理の末端において、同期化の目的でも
使用される。
り例示され、このような素子の例は分析用キエペットの
２つの対向する壁であり、前記壁は全反射信号のために
光伝導性であり、そして各々は内部が２つの前述の反応
成分の１つで被覆されてお夛、各々は分析物中の決定す
べき２つの因子（因子１および因子２）の１つに対して
特異性である。この場合において、２つの素子は順番に
照明され（交互に加えられる）々ルス）、加えるモード
は対応する信号を適切に分離しかつ独立に表示するため
に、検出および処理の末端において、同期化の目的でも
使用される。
場合（ｂ）は、導波路の同一の光路（すなわち、光学的
に分離されていない）上の２つの物理学的に分離された
区域を含むが、簡単なキュペラ）において２つの異る波
長であるいは２つの異る波長における吸収で応答する導
波路の構造によ〕例示することができる（これは、例え
ば、吸収波長において、吸収に応答する１つの区域およ
び蛍光の応答、すなわち、吸収波長と異る励起波長の信
号、を提供する区域を設けることによって実施できる）
。
に分離されていない）上の２つの物理学的に分離された
区域を含むが、簡単なキュペラ）において２つの異る波
長であるいは２つの異る波長における吸収で応答する導
波路の構造によ〕例示することができる（これは、例え
ば、吸収波長において、吸収に応答する１つの区域およ
び蛍光の応答、すなわち、吸収波長と異る励起波長の信
号、を提供する区域を設けることによって実施できる）
。
この場合において、２つの波長をもつ信号から成る出力
の成分を通常の手段（帯域通過フィルタ一または二色ビ
ームスグリツタ−）により個々の信号に分離する手段を
もつ検出装置を準備する。このような場合は、例えば、
次のようにして生じさせることができる。すなわち、導
波路の第１区域に、分析すべき因子Ｉ６１に対して特異
性の第１試薬を取り付け、この反応生成物の層は光吸収
性であ）、そして導波路の第２区域に、因子＆２に対し
て特異性の第２試薬を取り付け、前記第２試薬と因子／
Ｉ６２の反応生成物は入射光による励起下に蛍光性であ
る。
の成分を通常の手段（帯域通過フィルタ一または二色ビ
ームスグリツタ−）により個々の信号に分離する手段を
もつ検出装置を準備する。このような場合は、例えば、
次のようにして生じさせることができる。すなわち、導
波路の第１区域に、分析すべき因子Ｉ６１に対して特異
性の第１試薬を取り付け、この反応生成物の層は光吸収
性であ）、そして導波路の第２区域に、因子＆２に対し
て特異性の第２試薬を取り付け、前記第２試薬と因子／
Ｉ６２の反応生成物は入射光による励起下に蛍光性であ
る。
もちろん、場合（ｂ）は場合（荀の構造の変形、すなわ
ち、別々に照明される導波路の一方が吸収に対して応答
性であり、他方が蛍光応答性である変形、により例示す
ることもできる。
ち、別々に照明される導波路の一方が吸収に対して応答
性であり、他方が蛍光応答性である変形、により例示す
ることもできる。
本発明の実際的面を、実際の分析の場合を参照して説明
する。第１の場合は血液の分析に関し、さらに詳しくは
、血液試料中のヘモグロビンおよび他のヘモグロビン因
子、例えば、グリコシル化ヘモグロビン（これは、必要
に応じて、この試料中の合計のヘモグロビンに関係づけ
られる）の直接決定に関する。
する。第１の場合は血液の分析に関し、さらに詳しくは
、血液試料中のヘモグロビンおよび他のヘモグロビン因
子、例えば、グリコシル化ヘモグロビン（これは、必要
に応じて、この試料中の合計のヘモグロビンに関係づけ
られる）の直接決定に関する。
グリコモル化ヘモグロ′ビン（ＨｂＡ、、Ａ１．および
Ａｌａ）は、糖尿病患者の診断および監視における重要
な因子である。合計のへモグ四ビン（すなわチ、ＨｂＡ
ｏ１グリコシル化されていないヘモグロビン＋（）ｆｂ
Ａ、） ）に関するＨｂＡ、（ｌの含量（これは合計の
グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ、）の約８０チであ
る）の決定はこの病気に関してとくに重要である。
Ａｌａ）は、糖尿病患者の診断および監視における重要
な因子である。合計のへモグ四ビン（すなわチ、ＨｂＡ
ｏ１グリコシル化されていないヘモグロビン＋（）ｆｂ
Ａ、） ）に関するＨｂＡ、（ｌの含量（これは合計の
グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ、）の約８０チであ
る）の決定はこの病気に関してとくに重要である。
ヘモグロビンＡ、ｃはＨｂＡｏのそれと同一のアミノ酸
構造をもつグリコヘモグロビンである；重要な差は励Ａ
１ｅのベータ鎖中のＮ−末端バリンに対して２，３−ジ
ホスホグリセレートデケット（ｐｏｅｋ＠ｔ）中に結合
された１−アミノ−１−Ｆ”オキシ−フルクトースの存
在である。ＨｂＡ、ｃへのＨｂＡ。の修飾は連続の非酵
素的後翻訳プロセスであり、その速度は血液のグルコー
ス濃度の関数である。グリコシル化は２工程プロセスと
して起こる。第１に、グルコースの開いたアルデヒドの
形態は凸のベーター鎖の末端アミノ基と反応してシック
塩基を形成する。第２に、シック塩基は次いでアマトリ
（ＡＭＡＤＯＲＩ ）転位を行りてＨｂＡｌｃを形成す
る。中間体のシック塩基は不安定でｈ 、！１） 、ｌ
１ｂｋ、ｃの安定なケトアミンよ）も６０倍大きい解離
する（遊離の糖およびタン／４’り質に）傾向をもつ。
構造をもつグリコヘモグロビンである；重要な差は励Ａ
１ｅのベータ鎖中のＮ−末端バリンに対して２，３−ジ
ホスホグリセレートデケット（ｐｏｅｋ＠ｔ）中に結合
された１−アミノ−１−Ｆ”オキシ−フルクトースの存
在である。ＨｂＡ、ｃへのＨｂＡ。の修飾は連続の非酵
素的後翻訳プロセスであり、その速度は血液のグルコー
ス濃度の関数である。グリコシル化は２工程プロセスと
して起こる。第１に、グルコースの開いたアルデヒドの
形態は凸のベーター鎖の末端アミノ基と反応してシック
塩基を形成する。第２に、シック塩基は次いでアマトリ
（ＡＭＡＤＯＲＩ ）転位を行りてＨｂＡｌｃを形成す
る。中間体のシック塩基は不安定でｈ 、！１） 、ｌ
１ｂｋ、ｃの安定なケトアミンよ）も６０倍大きい解離
する（遊離の糖およびタン／４’り質に）傾向をもつ。
血液のグルコースの小部分のみが開いたアルデヒドの形
態であり（はぼ０．００１１）かつケトアミンの形成速
度は遅い（が効果的に不可逆的である）ので、ＨｂＡ、
。の形成は長期間の血液グルコースの濃度の指示である
。入間の赤血球の１２０日の寿命にわたシ、グリコモル
化勤分子の数は平均の血液グルコース濃度に対して比例
して増加する。平均の血漿グルコースとＨｂＡ、。濃度
との間の関係は独特であり、単一のＨｂＡ、 ｃの測定
は先行する６〜８週にわたシ血液グルコースの遡及的評
価である。
態であり（はぼ０．００１１）かつケトアミンの形成速
度は遅い（が効果的に不可逆的である）ので、ＨｂＡ、
。の形成は長期間の血液グルコースの濃度の指示である
。入間の赤血球の１２０日の寿命にわたシ、グリコモル
化勤分子の数は平均の血液グルコース濃度に対して比例
して増加する。平均の血漿グルコースとＨｂＡ、。濃度
との間の関係は独特であり、単一のＨｂＡ、 ｃの測定
は先行する６〜８週にわたシ血液グルコースの遡及的評
価である。
ｍ燻１ ｅの測定は炭水化物の代謝の病気、ことに真性
糖尿病の監視における非常に有用な道具であることが一
般に認められている。糖尿病は高い長期間の糖レベルを
有し、これはそれらのＨｂＡ、ｃレベルに反映する。正
常の大人はＨ′ｂＡ、ｃとして合計のヘモグロビンの約
３〜６Ｌｓを有し、これに対し未熟および成熟の初期の
糖尿病は１（ｂＡ、ｃとして６〜１５チである。Ｈ′ｂ
Ａ、ｃ濃度の同様な増加は、遺伝的におよび化学的に誘
導した糖尿病ともつマウスおよび膵切除したイヌにおい
て認められた。
糖尿病の監視における非常に有用な道具であることが一
般に認められている。糖尿病は高い長期間の糖レベルを
有し、これはそれらのＨｂＡ、ｃレベルに反映する。正
常の大人はＨ′ｂＡ、ｃとして合計のヘモグロビンの約
３〜６Ｌｓを有し、これに対し未熟および成熟の初期の
糖尿病は１（ｂＡ、ｃとして６〜１５チである。Ｈ′ｂ
Ａ、ｃ濃度の同様な増加は、遺伝的におよび化学的に誘
導した糖尿病ともつマウスおよび膵切除したイヌにおい
て認められた。
血液中のグリコシル化’Ｋｂ 、ＨｂＡ、を決定するた
めに存在するいくつかの方法のうちで、とくにＨｂＡ、
。の測定は糖尿病の処置を監視するためく選択される方
法と現存なってきた（Ｌ、ジ、パノビ。
めに存在するいくつかの方法のうちで、とくにＨｂＡ、
。の測定は糖尿病の処置を監視するためく選択される方
法と現存なってきた（Ｌ、ジ、パノビ。
り（ＪＯＶＡＮＯＶＩＣ）ら、アメリカン・ジャーナル
・オツ・メディシン（Ａｍ＠ｒｉｃａｎ Ｊ、 ｏｆ
Ｍｅｄｉａｌｎｅ）（１９８１） ７０，３３１ ：
ＤＪ、−ｆ−ルドステイン（ＧＯＬＩ） ５ＴＥＩＮ
）ら、糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）（１９８２）３１．
７０： Ｋ、Ｈ，ガッ？イ（ＱＡＪＩＢＯｒ）ら、ジャ
ーナル・オツ・クリニカル・エンドクリノロシー−アン
ド・メタぎリズＡ （Ｊ、 ｏｆ Ｃｌ１ｎｌｃａｌ
Ｉｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄ Ｍ＠ｔａｂｏｌｉ
ａｍ （１９７７） ４４ｅ ８５９： Ｂ、 ｆ−
ネン（ＧＯＮＥＮ）ら、ダイアベトロシア（０１ｍｂ＠
ｔｏｌｏｇｉｍ）（１９７８）１５，１ ： Ｃ，Ｍ
、ペタークン（ｐｍ袷ＯＮ） 、糖尿病（Ｄｉａｂ＠ｔ
ｅｓ）（１９８２）３１−Ｉ Ｅ。また、次の特許も有
用に述べている：米国特許４，２４７，５５３号；英国
特許１，５８０，３１８号；米国特許４，２２２．８３
６ ：米国特許４．３７２．７４７号；米国特許４，２
００，４３５号；米国特許４，３４１，６３５号。これ
らの方法はグリコシル化されていない励からグリコシル
化批を分離するために用いられる機構により容易に分類
できる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーが初期
に用いられ、そしてなお最も普通の方法である（ Ｈ，
Ｇ。
・オツ・メディシン（Ａｍ＠ｒｉｃａｎ Ｊ、 ｏｆ
Ｍｅｄｉａｌｎｅ）（１９８１） ７０，３３１ ：
ＤＪ、−ｆ−ルドステイン（ＧＯＬＩ） ５ＴＥＩＮ
）ら、糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）（１９８２）３１．
７０： Ｋ、Ｈ，ガッ？イ（ＱＡＪＩＢＯｒ）ら、ジャ
ーナル・オツ・クリニカル・エンドクリノロシー−アン
ド・メタぎリズＡ （Ｊ、 ｏｆ Ｃｌ１ｎｌｃａｌ
Ｉｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄ Ｍ＠ｔａｂｏｌｉ
ａｍ （１９７７） ４４ｅ ８５９： Ｂ、 ｆ−
ネン（ＧＯＮＥＮ）ら、ダイアベトロシア（０１ｍｂ＠
ｔｏｌｏｇｉｍ）（１９７８）１５，１ ： Ｃ，Ｍ
、ペタークン（ｐｍ袷ＯＮ） 、糖尿病（Ｄｉａｂ＠ｔ
ｅｓ）（１９８２）３１−Ｉ Ｅ。また、次の特許も有
用に述べている：米国特許４，２４７，５５３号；英国
特許１，５８０，３１８号；米国特許４，２２２．８３
６ ：米国特許４．３７２．７４７号；米国特許４，２
００，４３５号；米国特許４，３４１，６３５号。これ
らの方法はグリコシル化されていない励からグリコシル
化批を分離するために用いられる機構により容易に分類
できる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーが初期
に用いられ、そしてなお最も普通の方法である（ Ｈ，
Ｇ。
クンケル（ＫＵＮＫＥＬ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）（１９５５）１２２、２８８ ）、このようなイ
オン交換技術はＨｂＡ、ｃを特定的に測定する現在唯一
の利用可能な方法であるが、ある数の制限をもち、それ
らのうちで温度および−の感受性は最も重要である。ま
た、イオン交換は障害にさらされる。なぜなら、不安定
客グリコシル化Ｈｂ（７’レー批Ａ１．）をアッセイ前
に除去しなくてはならず、そして胎児Ｈｂ（Ｋｌボ）お
よび錐状赤血球Ｈｂ（ＨｂＳ）は結果を妨害するからで
ある。
ｃｅ）（１９５５）１２２、２８８ ）、このようなイ
オン交換技術はＨｂＡ、ｃを特定的に測定する現在唯一
の利用可能な方法であるが、ある数の制限をもち、それ
らのうちで温度および−の感受性は最も重要である。ま
た、イオン交換は障害にさらされる。なぜなら、不安定
客グリコシル化Ｈｂ（７’レー批Ａ１．）をアッセイ前
に除去しなくてはならず、そして胎児Ｈｂ（Ｋｌボ）お
よび錐状赤血球Ｈｂ（ＨｂＳ）は結果を妨害するからで
ある。
他の技術は寒天ｒルミ気泳動〔Ｌ。メナード（ｍ）ら、
クリニカル・ケミストリー（Ｃ１１ｎｉａａｌＣｈ＠ｍ
１ｓｔｒｙ）（１９８０）２６．１５９８）、等電収束
（ｌｓｏ＠ｌ＠ａｔｒｉａ ｆｏｃｕｓｉｎｇ） （Ｋ
、Ｍ、スノクイサー（ＳＰＩＣＫＲ）ら、糖尿病（Ｄ１
ｍｂ＠ｔ＊＠）（１９７Ｂ） ２７ 、３８４：ｌ、比
色法、例えば、チオバルビッル酸を用いる（Ｒ。
クリニカル・ケミストリー（Ｃ１１ｎｉａａｌＣｈ＠ｍ
１ｓｔｒｙ）（１９８０）２６．１５９８）、等電収束
（ｌｓｏ＠ｌ＠ａｔｒｉａ ｆｏｃｕｓｉｎｇ） （Ｋ
、Ｍ、スノクイサー（ＳＰＩＣＫＲ）ら、糖尿病（Ｄ１
ｍｂ＠ｔ＊＠）（１９７Ｂ） ２７ 、３８４：ｌ、比
色法、例えば、チオバルビッル酸を用いる（Ｒ。
フルキガ−（ＦＬＵＫＩＧＫＲ）ら、ＦＥＢＳレターズ
（Ｌｅｔｔｅｒｓ）（１９７６） ７１ 、３５６ ）
および親和性クロマトグラフ４− （Ｖ、 ｆ−リオチ
ス（ＢＯＵＲＩＯＴＩＳ）ら、グイベトロシア（Ｄｉａ
ｂ＠ｔｏｌｏｇ１ｍ）（１９８１） ２１．５７９）を
包含する。唯一の型の放射線免疫検定法が報告されてお
）〔Ｊ、ジャピド（ＪＡＶＩＤ）ら、プリティシ・ジャ
ーナＡ／１１オブ・ヘマトロジ−（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ
、 ｏｆＨａｅｍａｔｏｌＯｇｙ）（１９７８） ３８
．３２９］これは遅く（作業に３日以上を要する）そし
て技術的に複雑で１、放射線標識ＨｂＡ、ｃの調製を必
要とする。先行技術の方法は価値を有するが、急速な結
果（約１５分以内）をもたらし、熟練を必要とせずかつ
日常の基準で実施に経費がかからない方法がなお要求さ
れている。現在の技術の方法は遅く（典凰的には結果を
得るために１時間以上）、技術的に複雑であシ（５回以
上のピペット操作の工程を必要とする）そして実験室の
環境外に実施に適さない。さらに、現在の方法は合計の
ヘモグロビンをグリコシル化因子と別に確認することを
必要とし、そして両方の分析データを実質的に一緒に確
認しかつ遅滞なく相互に関係づけることが可能でちるこ
とが望ましいであろう。
（Ｌｅｔｔｅｒｓ）（１９７６） ７１ 、３５６ ）
および親和性クロマトグラフ４− （Ｖ、 ｆ−リオチ
ス（ＢＯＵＲＩＯＴＩＳ）ら、グイベトロシア（Ｄｉａ
ｂ＠ｔｏｌｏｇ１ｍ）（１９８１） ２１．５７９）を
包含する。唯一の型の放射線免疫検定法が報告されてお
）〔Ｊ、ジャピド（ＪＡＶＩＤ）ら、プリティシ・ジャ
ーナＡ／１１オブ・ヘマトロジ−（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ
、 ｏｆＨａｅｍａｔｏｌＯｇｙ）（１９７８） ３８
．３２９］これは遅く（作業に３日以上を要する）そし
て技術的に複雑で１、放射線標識ＨｂＡ、ｃの調製を必
要とする。先行技術の方法は価値を有するが、急速な結
果（約１５分以内）をもたらし、熟練を必要とせずかつ
日常の基準で実施に経費がかからない方法がなお要求さ
れている。現在の技術の方法は遅く（典凰的には結果を
得るために１時間以上）、技術的に複雑であシ（５回以
上のピペット操作の工程を必要とする）そして実験室の
環境外に実施に適さない。さらに、現在の方法は合計の
ヘモグロビンをグリコシル化因子と別に確認することを
必要とし、そして両方の分析データを実質的に一緒に確
認しかつ遅滞なく相互に関係づけることが可能でちるこ
とが望ましいであろう。
特許請求の範囲第９項に要約されているような、本発明
の方法は、先行技術の方法の欠点を排除し、そして、必
要に応じて、合計のヘモグロビンに対してグリコシル化
因子または他のヘモグロビン因子の百分率を直接間づけ
るという利点をさらに提供する。
の方法は、先行技術の方法の欠点を排除し、そして、必
要に応じて、合計のヘモグロビンに対してグリコシル化
因子または他のヘモグロビン因子の百分率を直接間づけ
るという利点をさらに提供する。
本発明の方法によると、（Ｈｂ）Ａ１＠＊Ａ１Ｂまたは
Ａｌｂのような種のいずれかに対して特異性の抗体が純
粋な形態で入手できるとき、このような種を別々に決定
することができる。あるいは、特異性が低い抗体を用い
るとき、本発明の方法は２糧以上の血液因子、すなわち
、例えば合計の卯に関してすべてのグリコシル化ら、を
同時に決定することができる。もちろん、この方法は、
また、複合体形成反応における因子に対して特異性の対
応する試薬（例えば、ＨｂＦ、Ｈｂ８または他のヒトヘ
モグロビン変異種）が入手できる場合、上に述べた以外
の血液因子の決定を提供する。
Ａｌｂのような種のいずれかに対して特異性の抗体が純
粋な形態で入手できるとき、このような種を別々に決定
することができる。あるいは、特異性が低い抗体を用い
るとき、本発明の方法は２糧以上の血液因子、すなわち
、例えば合計の卯に関してすべてのグリコシル化ら、を
同時に決定することができる。もちろん、この方法は、
また、複合体形成反応における因子に対して特異性の対
応する試薬（例えば、ＨｂＦ、Ｈｂ８または他のヒトヘ
モグロビン変異種）が入手できる場合、上に述べた以外
の血液因子の決定を提供する。
本発明は、先行技術に属するこのような特異的に反応性
の複合体種（モノクローナルまたはポリクローナル抗体
）を得ることあるいは調製することに関しないが、本発
明に従い分析すべき試料と接触させる活性導波路の調製
において、被覆物質としてそれらを使用することに関す
る。
の複合体種（モノクローナルまたはポリクローナル抗体
）を得ることあるいは調製することに関しないが、本発
明に従い分析すべき試料と接触させる活性導波路の調製
において、被覆物質としてそれらを使用することに関す
る。
本発明の方法において使用する導波路は多くの種類のも
のであることができ、そしていくつかは選択した反応性
抗体で導波路を被覆する方法と一緒に係属中の欧州特許
出願（ＥＰ−Ａ） ７５３５３号に開示されている。
のであることができ、そしていくつかは選択した反応性
抗体で導波路を被覆する方法と一緒に係属中の欧州特許
出願（ＥＰ−Ａ） ７５３５３号に開示されている。
本発明の場合において、分析用キュベツトの構成員とし
て含まれた板様または繊維の光導波路を使用することが
好ましく、導波路の被覆された表面を、血液試料がいっ
たんキュベツト中に注入されたならば、それと接触させ
る。
て含まれた板様または繊維の光導波路を使用することが
好ましく、導波路の被覆された表面を、血液試料がいっ
たんキュベツト中に注入されたならば、それと接触させ
る。
ここで使用する光学技術は、前述のように、主として光
の吸収に関する。すなわち、導波路内を伝送される波の
エバネッセント成分は、第１に周囲の液体中の分子と相
互作用しくエバネッセント成分の浸透深さは抗体被膜の
厚さを多少越え、これは瞬間的応答を提供する）そして
、第２に、筋−抗体の複合体と相互作用し、この複合体
は、決定すべき血液因子と導波路の表面上に前もって被
覆された特異的複合体部分との反応のため、導波路上に
追加の層の形態で蓄積し始める。エパネ。
の吸収に関する。すなわち、導波路内を伝送される波の
エバネッセント成分は、第１に周囲の液体中の分子と相
互作用しくエバネッセント成分の浸透深さは抗体被膜の
厚さを多少越え、これは瞬間的応答を提供する）そして
、第２に、筋−抗体の複合体と相互作用し、この複合体
は、決定すべき血液因子と導波路の表面上に前もって被
覆された特異的複合体部分との反応のため、導波路上に
追加の層の形態で蓄積し始める。エパネ。
セント光成分の相互作用の深さは複合体の層の厚さに実
質的に限定されないが、前記蓄積に対する光学的応答は
血液自体のため全体の吸収に対して独立であり、そして
２つの効果は一方または他方の効果から生ずる信号を解
読するために複雑な技術を用いないで容易に区別できる
ことが、驚くべきことには発見された。
質的に限定されないが、前記蓄積に対する光学的応答は
血液自体のため全体の吸収に対して独立であり、そして
２つの効果は一方または他方の効果から生ずる信号を解
読するために複雑な技術を用いないで容易に区別できる
ことが、驚くべきことには発見された。
励誘導体はその化学的状態に依存して特性吸収スイクト
ルを有する。それゆえ、任意の吸収測定技術を本発明の
実施において等しく使用できる［： Ｉ、、 テント！
７ （ＴＥＮＴＯＲＩ） ラ、ヘモグロビン、エンジモ
ロジーにおける方法において（Ｈ＠ｍｏｇｌｏｂｉｎ
＃１ｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）（１９８１）、 ｖａｌｅ ７５゜７０７−７３２、
アカデミ、り・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ＠ｍｓ）
、ニューヨーク〕。シアノメトヘモグロビン法および
、好ましくは４００〜５ＱＱｎｍ、とくに４００〜４２
０ｎｍおよび５５０〜６００ｎｍの範囲における、単一
または多波長吸収測定アッセイが包含される。また、油
分子による吸収が酸素の飽和度に対して独立であるアイ
ソベスティック点法（ｉｓｏｂ＠５ｔｉｅ ｐｏｌｎｔ
ｍ＠ｔｈｏｄ）が包含される。
ルを有する。それゆえ、任意の吸収測定技術を本発明の
実施において等しく使用できる［： Ｉ、、 テント！
７ （ＴＥＮＴＯＲＩ） ラ、ヘモグロビン、エンジモ
ロジーにおける方法において（Ｈ＠ｍｏｇｌｏｂｉｎ
＃１ｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）（１９８１）、 ｖａｌｅ ７５゜７０７−７３２、
アカデミ、り・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ＠ｍｓ）
、ニューヨーク〕。シアノメトヘモグロビン法および
、好ましくは４００〜５ＱＱｎｍ、とくに４００〜４２
０ｎｍおよび５５０〜６００ｎｍの範囲における、単一
または多波長吸収測定アッセイが包含される。また、油
分子による吸収が酸素の飽和度に対して独立であるアイ
ソベスティック点法（ｉｓｏｂ＠５ｔｉｅ ｐｏｌｎｔ
ｍ＠ｔｈｏｄ）が包含される。
本発明およびその例示的な面を、添付図面を参照しなが
ら説明する。
ら説明する。
前述のように、光線１が角度θで２つの透明な媒質ｎ１
およびｎ！の間の界面に衝突するとき（第１ａ図）（大
きい屈折率をもつ媒質ｎ１（ｎｌ〉ｎ、）から衝突）、
全内面反射が起こり［：Ｎ、Ｊ。
およびｎ！の間の界面に衝突するとき（第１ａ図）（大
きい屈折率をもつ媒質ｎ１（ｎｌ〉ｎ、）から衝突）、
全内面反射が起こり［：Ｎ、Ｊ。
ハリツク（ＨＡＲＲＩＣＫ） 、インターナル・リフレ
キシ四ン・スペクトロスコピー（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒ
＠ｆｌｅｘｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ウィリ
ー拳インターサイエンス（Ｗｌｌａｙ Ｉｎｔｅｒ＋５
ｃｉｅｎｃｅ） 、ニー−ヨーク（１９６７）、この時
の反射角θは次の方程式により与えられる臨界角と呼ば
れるある角度θ。より大きい：θ ”ｇｔｎ−’ （ｎ
ｚ／ ｎｌ ） Ｉ反射光線は数字２で示
されている。この場合において、エノ々ネッセント波は
反射表面を越えて屈折率１１１の希薄な媒質の中に波長
のほぼ一部分の距離（ｄ、）だけ浸透する。マクスウェ
ルの方程式に従い、反射表面に対して垂直の定常正弦波
が密の媒質中に確立される（第１ｂ図）。非吸収性の希
薄媒質中へのエネルギーの流れは存在しないが、その媒
質中には消散性（エバネッセント）の非伝搬性場３が存
在し、その電場の振幅（Ｅ）は表面の界面において最大
であシ（Ｅｏ ）そして次の方程式に従い表面からの距
離＜−＞で指数関数的に減衰する： Ｅ ＝ Ｅ ６−ｅｒｘｐ （−ｚ／ｄｐ）
２電場の振幅が表面におけるその値の・ｘｐ（−１）に
低下するために要する距離として定義された、浸透の深
さくｄ、）は、次により与えられる：λ／ｎ １ ｄ、＝＝。・１９−（ｎｌ／。１）・）・４ 。
キシ四ン・スペクトロスコピー（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒ
＠ｆｌｅｘｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ウィリ
ー拳インターサイエンス（Ｗｌｌａｙ Ｉｎｔｅｒ＋５
ｃｉｅｎｃｅ） 、ニー−ヨーク（１９６７）、この時
の反射角θは次の方程式により与えられる臨界角と呼ば
れるある角度θ。より大きい：θ ”ｇｔｎ−’ （ｎ
ｚ／ ｎｌ ） Ｉ反射光線は数字２で示
されている。この場合において、エノ々ネッセント波は
反射表面を越えて屈折率１１１の希薄な媒質の中に波長
のほぼ一部分の距離（ｄ、）だけ浸透する。マクスウェ
ルの方程式に従い、反射表面に対して垂直の定常正弦波
が密の媒質中に確立される（第１ｂ図）。非吸収性の希
薄媒質中へのエネルギーの流れは存在しないが、その媒
質中には消散性（エバネッセント）の非伝搬性場３が存
在し、その電場の振幅（Ｅ）は表面の界面において最大
であシ（Ｅｏ ）そして次の方程式に従い表面からの距
離＜−＞で指数関数的に減衰する： Ｅ ＝ Ｅ ６−ｅｒｘｐ （−ｚ／ｄｐ）
２電場の振幅が表面におけるその値の・ｘｐ（−１）に
低下するために要する距離として定義された、浸透の深
さくｄ、）は、次により与えられる：λ／ｎ １ ｄ、＝＝。・１９−（ｎｌ／。１）・）・４ 。
９０°から出発して、θがθ。Ｋ近づくにつれて、ｄ、
は無限に大きくなシ、そして固定した角度において、屈
折率が合致すると増加する（すなわち、ｎ！／ｎ１→１
）。また、ｄ、は波長に比例するので、波長が長くなる
と大きくなる。
は無限に大きくなシ、そして固定した角度において、屈
折率が合致すると増加する（すなわち、ｎ！／ｎ１→１
）。また、ｄ、は波長に比例するので、波長が長くなる
と大きくなる。
こうして、透明な導波路の屈折率ｎ１、入射角および波
長を適当に選択することにより、ｄｐを選択して、界面
に近接しであるいはそれから所定の距離において主とし
て物質４と、前記距離を越えてわずかに物質５と、ある
いは応答比を変化されて、４および５の両者と、の光学
的相互作用を制御することができる。そして、これは本
発明の重要な因子の１つであり、すなわち、前記ノ臂ラ
メ−ター（ｎｌ、θおよびλ）の適当に選択して、分析
物中の２つの独立のノ４２メーターを、同時に、測定す
るために最適な条件を得ることを確立することである。
長を適当に選択することにより、ｄｐを選択して、界面
に近接しであるいはそれから所定の距離において主とし
て物質４と、前記距離を越えてわずかに物質５と、ある
いは応答比を変化されて、４および５の両者と、の光学
的相互作用を制御することができる。そして、これは本
発明の重要な因子の１つであり、すなわち、前記ノ臂ラ
メ−ター（ｎｌ、θおよびλ）の適当に選択して、分析
物中の２つの独立のノ４２メーターを、同時に、測定す
るために最適な条件を得ることを確立することである。
本発明の実施態様において、密の媒質を石英の顕微鏡ス
ライド（ｎｌ＝１．５４）で構成することができ、そし
て希薄な媒質は水性血液試料（ｎ、中１．３４）であり
、そしてθを制御可能に変更させ、これによりλが選択
された可視波長であるとき、最適な応答が得られるまで
、ｄ、を約２０〜３００ ｕｒｎの間で変化させること
ができる。もちろん、導波路のために他の材料を１．５
４以外の屈折率で使用できる。
ライド（ｎｌ＝１．５４）で構成することができ、そし
て希薄な媒質は水性血液試料（ｎ、中１．３４）であり
、そしてθを制御可能に変更させ、これによりλが選択
された可視波長であるとき、最適な応答が得られるまで
、ｄ、を約２０〜３００ ｕｒｎの間で変化させること
ができる。もちろん、導波路のために他の材料を１．５
４以外の屈折率で使用できる。
単一の反射システムを使用できるが、エパネ。
セント波の原理を多重内部反射と組み合わせることによ
り感度を増大（検出の限界を減少）することができる。
り感度を増大（検出の限界を減少）することができる。
反射の数（Ｎ）は導波路の長さくＬ）および厚さくＴ）
および入射角（θ）の関数である： Ｎ −Ｌ ／ Ｔ −ａｓθ ４笑験のい
くつかにおいて使用した顕微鏡スライドの導波路は３６
．０活性長さ、１１１１１の厚さを有し、そして入射角
は約６０°〜７５°で変化した。こうして、明確な光線
のための１つの側における反射の数はほぼ６であった。
および入射角（θ）の関数である： Ｎ −Ｌ ／ Ｔ −ａｓθ ４笑験のい
くつかにおいて使用した顕微鏡スライドの導波路は３６
．０活性長さ、１１１１１の厚さを有し、そして入射角
は約６０°〜７５°で変化した。こうして、明確な光線
のための１つの側における反射の数はほぼ６であった。
同様に、繊維の光導波路を用いる他の実施態様において
、この装置は６４．０活性長さ、０．６．０厚さを有し
そして、同一の入射角度で、明確な光線の反射の合計の
数は約３０〜４００間で変化した。
、この装置は６４．０活性長さ、０．６．０厚さを有し
そして、同一の入射角度で、明確な光線の反射の合計の
数は約３０〜４００間で変化した。
前述のように、本発明の方法はまた消散（エバネッセン
ト）効果に頼る。導波路と液体との界面において発生す
る蛍光の放射を、また、導波路の出力において監視する
ことができる。相互関係の理論により予測されかつ単分
子層〔カルテダリア（Ｃ朋ぬＧＬＩＡ）およびマンデル
（ＭＡＮＤ肌）、ジャーナル・オフ・オプチカル・ソサ
イアティー・オフ・アメリカ（Ｊ、 ０ｐｔｉｃａｌ
Ｓｏｔ、 ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ） ６３ ＋４７９
（１９７２） ）および単分散法〔リー（１）ら、ア
プライド・オフチクス（ＡｐｐＨｅｄ Ｏｐｔｌｃｍ）
１８ ＋８６２ （１９７２））の両者において染料
分子を用いて立証されたように、導波路／液体の界面に
おける蛍光放射をエバネッセント波として処理できる。
ト）効果に頼る。導波路と液体との界面において発生す
る蛍光の放射を、また、導波路の出力において監視する
ことができる。相互関係の理論により予測されかつ単分
子層〔カルテダリア（Ｃ朋ぬＧＬＩＡ）およびマンデル
（ＭＡＮＤ肌）、ジャーナル・オフ・オプチカル・ソサ
イアティー・オフ・アメリカ（Ｊ、 ０ｐｔｉｃａｌ
Ｓｏｔ、 ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ） ６３ ＋４７９
（１９７２） ）および単分散法〔リー（１）ら、ア
プライド・オフチクス（ＡｐｐＨｅｄ Ｏｐｔｌｃｍ）
１８ ＋８６２ （１９７２））の両者において染料
分子を用いて立証されたように、導波路／液体の界面に
おける蛍光放射をエバネッセント波として処理できる。
事実、エバネッセント波による蛍光の励起は、エバネッ
セント波の特性をもつ蛍光放射を生成し、こうして蛍光
の内部で反射する光線を発生する。この形の蛍光放射の
方向は、主としてそれぞれの屈折率の比の関数であう、
そして光子の放射が多分臨界角（θＣ）に近い「好まし
い」角度の分布を有するという主要な特性（上のＣＡＲ
ＮＡＧＬＩＡの文献を参照）を有する。
セント波の特性をもつ蛍光放射を生成し、こうして蛍光
の内部で反射する光線を発生する。この形の蛍光放射の
方向は、主としてそれぞれの屈折率の比の関数であう、
そして光子の放射が多分臨界角（θＣ）に近い「好まし
い」角度の分布を有するという主要な特性（上のＣＡＲ
ＮＡＧＬＩＡの文献を参照）を有する。
実際には、このことは蛍光を励起光と同一の光学的平面
において導波路の出力において監視可能であることを意
味する。理論的には、これは小さい角度の範凹内に蛍光
放射の強さを集中させるという利点を有する；また、こ
れらの蛍光の光子は溶液の本体を通過せず、こうして主
要な光学的妨害（例えば、吸収、散乱）にさらされない
。
において導波路の出力において監視可能であることを意
味する。理論的には、これは小さい角度の範凹内に蛍光
放射の強さを集中させるという利点を有する；また、こ
れらの蛍光の光子は溶液の本体を通過せず、こうして主
要な光学的妨害（例えば、吸収、散乱）にさらされない
。
この技術は欧州特許出願（ＥＰ−Ａ） ７５３５３中で
詳述されている。
詳述されている。
本発明を例示する蛍光の測定のため、励起波長’Ｆｆ
４９ Ｑ ｎｍで選択し、そして光検出素子の前にカッ
ト・オフ・フィルターを配置することにより、蛍光放射
（５１０ｎｍより大きい波長）を導波路の出力においズ
測定した（ｋＶ８，５：３２０ｎｍにおいて５０チの透
過率；ショット・グラス・ワークス（ＳＣＨＴＴ ＧＬ
ＡＳＳ ％％０ＲＫＳ） 、 ？インツ、ドイツ〕。
４９ Ｑ ｎｍで選択し、そして光検出素子の前にカッ
ト・オフ・フィルターを配置することにより、蛍光放射
（５１０ｎｍより大きい波長）を導波路の出力においズ
測定した（ｋＶ８，５：３２０ｎｍにおいて５０チの透
過率；ショット・グラス・ワークス（ＳＣＨＴＴ ＧＬ
ＡＳＳ ％％０ＲＫＳ） 、 ？インツ、ドイツ〕。
２ｔたはそれより多いパラメーターを同時に決定できる
蛍光技術、例えば、多分折物導波システムは、臨床的診
断の分野において、例えば、甲状腺ホルモンＴ４および
Ｔ３、ゴナドトロピン■およびＦＳＨ、腫瘍遺伝標識Ａ
ＦＰおよびＧスの同時測定、また臨床微生物学において
用いられる細胞表面の抗原の決定の全範囲において、多
くの用途をもつ。
蛍光技術、例えば、多分折物導波システムは、臨床的診
断の分野において、例えば、甲状腺ホルモンＴ４および
Ｔ３、ゴナドトロピン■およびＦＳＨ、腫瘍遺伝標識Ａ
ＦＰおよびＧスの同時測定、また臨床微生物学において
用いられる細胞表面の抗原の決定の全範囲において、多
くの用途をもつ。
用いた装置の１つの実施態様は第２図に概略的に表わさ
れており、ここにおいてブロック線図として主要な構成
成分が示されている。これらの成分は、モノクロメータ
−９、光源６、導波路８をもつ流れセルフ、および光電
子増倍管検出器１０、プリアンプ１１、マイクロプロセ
ッサ−の光源制御システム１２、マイクロコンピュータ
−１３、プリンター１４およびメモリー（フロッピーデ
ィスク）１５を含むデータ獲得および処理用マイクロコ
ンピュータ−を有する電子工学装置からなる。
れており、ここにおいてブロック線図として主要な構成
成分が示されている。これらの成分は、モノクロメータ
−９、光源６、導波路８をもつ流れセルフ、および光電
子増倍管検出器１０、プリアンプ１１、マイクロプロセ
ッサ−の光源制御システム１２、マイクロコンピュータ
−１３、プリンター１４およびメモリー（フロッピーデ
ィスク）１５を含むデータ獲得および処理用マイクロコ
ンピュータ−を有する電子工学装置からなる。
この場合における光源６はキセノン閃光ラング（ｌｃ、
Ｇ、 ＆ Ｇ、 ５ａｌｏｎ、 ＭＡ）であり、そして
モノクロメータ−は凹形ポロダラム格子（Ｊｏｂ、１ｎ
−Ｙｕｏｎ。
Ｇ、 ＆ Ｇ、 ５ａｌｏｎ、 ＭＡ）であり、そして
モノクロメータ−は凹形ポロダラム格子（Ｊｏｂ、１ｎ
−Ｙｕｏｎ。
Ｐａｒｉｓ、 Ｆｒａｎｃｅ ）を備えて５ａｍの分解
能を可能とした。閃光ランプの作動をマイクロコンピュ
ータ−１２により制御した。試料を入口１８からセルフ
に注入するため、プログラミング可能な自動ビベ、）
（Ｍｉａｒｏｌｍｂ−Ｐ： ハミルトンーｆナゾズ（Ｈ
ａｒｎｉｌｔｏｎ ｌ１ｏｎａｄｕｚ） ＡＧ、 ｄｅ
ナノズ、スイス〕を好適に使用した。光学的成分は、さ
らに、２枚の鏡Ｍ１およびＭ、と２つのプリズム１６お
よび１７を含んだ。検出器１０の光電子増倍管（Ｒ９２
８；東京、浜松）を導波路の出力に配置して、光の強さ
の変化を直接監視した。光電子増倍管からの信号を増幅
’Ｌ（１１）、閃光時間の間積分しく１２）そして標準
の１２−ビットのアナログ／ディジタル変換＠（図示せ
ず）によりディジタルのフォーマットに変換した。会社
内で開発したマイクロコンピュータ−１２は急速な信号
の平均化を実施し、そしてすべてのデータをマイクロコ
ンピュータ−内に配置された光ダイオード１９と参照す
ることにより閃光ランプの強さの変動について調節した
。
能を可能とした。閃光ランプの作動をマイクロコンピュ
ータ−１２により制御した。試料を入口１８からセルフ
に注入するため、プログラミング可能な自動ビベ、）
（Ｍｉａｒｏｌｍｂ−Ｐ： ハミルトンーｆナゾズ（Ｈ
ａｒｎｉｌｔｏｎ ｌ１ｏｎａｄｕｚ） ＡＧ、 ｄｅ
ナノズ、スイス〕を好適に使用した。光学的成分は、さ
らに、２枚の鏡Ｍ１およびＭ、と２つのプリズム１６お
よび１７を含んだ。検出器１０の光電子増倍管（Ｒ９２
８；東京、浜松）を導波路の出力に配置して、光の強さ
の変化を直接監視した。光電子増倍管からの信号を増幅
’Ｌ（１１）、閃光時間の間積分しく１２）そして標準
の１２−ビットのアナログ／ディジタル変換＠（図示せ
ず）によりディジタルのフォーマットに変換した。会社
内で開発したマイクロコンピュータ−１２は急速な信号
の平均化を実施し、そしてすべてのデータをマイクロコ
ンピュータ−内に配置された光ダイオード１９と参照す
ることにより閃光ランプの強さの変動について調節した
。
信号ヲマイクロコンピューター１３、好ましくはＡＰＰ
ＬＥ ＩＩ型に、表示および記憶のため、伝送した。
ＬＥ ＩＩ型に、表示および記憶のため、伝送した。
導波路の２つの異る実施態様を使用した：１つの実施態
様として第２図に示す分析用セルまたはキュペットを、
顕微鏡のスライドの導波システムに基づく。図解された
システムは流れセルフを示し、その底は実際に顕微鏡の
スライド８である。緊密性をガスケット２０により確保
する；スライド８を２つの四分円形シリカのプリズム１
６および１７、好ましくはへラエウス（Ｈｅｒａ＠ｕｓ
）製のものを屈折率が合致する油とともに使用して、直
接の光学的接触で配置した。屈折率が合致する油は特別
にみがかれた、光学的に平らな導波路の面の必要性を排
除した。プリズムは入射光の角度θ（第１ａ図参照）の
調節を容易としかつシール用ガスケット２０との光の接
触を回避するように設計した。
様として第２図に示す分析用セルまたはキュペットを、
顕微鏡のスライドの導波システムに基づく。図解された
システムは流れセルフを示し、その底は実際に顕微鏡の
スライド８である。緊密性をガスケット２０により確保
する；スライド８を２つの四分円形シリカのプリズム１
６および１７、好ましくはへラエウス（Ｈｅｒａ＠ｕｓ
）製のものを屈折率が合致する油とともに使用して、直
接の光学的接触で配置した。屈折率が合致する油は特別
にみがかれた、光学的に平らな導波路の面の必要性を排
除した。プリズムは入射光の角度θ（第１ａ図参照）の
調節を容易としかつシール用ガスケット２０との光の接
触を回避するように設計した。
流れセルは、アルミニウム合金から機械加工により作シ
、光路に沿った急速な泡不含層状流れを可能とする規準
を満足した。その設計は、また、急速かつ精確な分離お
よび再配置を保証した。アルミニウム合金を選択したが
、他の合金、例えば、真ちゅうも適する。なぜなら、そ
れは食塩溶液との反応性をもたず、そしてつや消しの黒
色に陽極酸化して迷う光の作用を回避した後、低い光学
的反射性をもつからである。ガスケット２０は厚さ０、
５ ｍの医学的等級のシリコーンゴムであり、そして２
ｋｇ ／ ｃｍ２の一定の密封圧力下で水密性である
。入口１８および出口２１を含めて、合計のセル容量は
１．８１１１であり、導波路の真上の容量は０．６６ｍ
（５３Ｘ２５Ｘ０．５ｍ）であり、そして光路より上の
容量は０．２９ｍ（３６Ｘ １６ Ｘｏ、５ｍ）でらり
た。
、光路に沿った急速な泡不含層状流れを可能とする規準
を満足した。その設計は、また、急速かつ精確な分離お
よび再配置を保証した。アルミニウム合金を選択したが
、他の合金、例えば、真ちゅうも適する。なぜなら、そ
れは食塩溶液との反応性をもたず、そしてつや消しの黒
色に陽極酸化して迷う光の作用を回避した後、低い光学
的反射性をもつからである。ガスケット２０は厚さ０、
５ ｍの医学的等級のシリコーンゴムであり、そして２
ｋｇ ／ ｃｍ２の一定の密封圧力下で水密性である
。入口１８および出口２１を含めて、合計のセル容量は
１．８１１１であり、導波路の真上の容量は０．６６ｍ
（５３Ｘ２５Ｘ０．５ｍ）であり、そして光路より上の
容量は０．２９ｍ（３６Ｘ １６ Ｘｏ、５ｍ）でらり
た。
第２実施態様（第３図参照）は光学繊維のシステムに基
づく。繊維の導波路３１は、まず標準の伝送光学繊維を
１２０ｆｉの片に切り、次いでシリコーンとテトラフル
オロエチレンとのり２．ドを除去して１２０ ｔｒｙ２
の光学的に活性な区域を露出することによりて作った。
づく。繊維の導波路３１は、まず標準の伝送光学繊維を
１２０ｆｉの片に切り、次いでシリコーンとテトラフル
オロエチレンとのり２．ドを除去して１２０ ｔｒｙ２
の光学的に活性な区域を露出することによりて作った。
繊維の末端をみがき、そして支持および保護のために特
別に作られたステンレス鋼の末端取付け３２および３３
（７Ｘ３■内径）内に保持した。繊維の流れセル３４は
開口端の石英管（内径４Ｗａｓ長さ８０ｇ）でラシ、試
料のそう人および取り出しのための入口３５および出口
３６の管が付加されていた。繊維をシリコーンゴムの栓
３７．３８をもつ流れセル内の所定位置に配置した。光
源３９からの光をレンズ４０．４１で繊維の端上に６８
°の平均口径角で集束しかつ濾過した（第１図参照）：
繊維の出口において、光はレンズ４２によ）光電子増倍
管４３上に再集束した。
別に作られたステンレス鋼の末端取付け３２および３３
（７Ｘ３■内径）内に保持した。繊維の流れセル３４は
開口端の石英管（内径４Ｗａｓ長さ８０ｇ）でラシ、試
料のそう人および取り出しのための入口３５および出口
３６の管が付加されていた。繊維をシリコーンゴムの栓
３７．３８をもつ流れセル内の所定位置に配置した。光
源３９からの光をレンズ４０．４１で繊維の端上に６８
°の平均口径角で集束しかつ濾過した（第１図参照）：
繊維の出口において、光はレンズ４２によ）光電子増倍
管４３上に再集束した。
必須の光学的構成成分が第４ａ図に概略的に示されてい
る装置は、二重の導波セル５０からな〕、その主要な壁
５１および５２は源５３から発生する励起信号を輸送す
る２つの独立に付勢される素子を構成し、そして内側の
壁は裸であるか、遮断されているか、あるいは特異性反
応成分で被覆されてお夛、セル５０内に含有されている
分析物の溶液と接触している。キュベツトの特別に造形
された光伝導性壁は、通常の手段により、例えば、透明
なグラスチ、り、例えばルーサイトで成形することによ
多形成することができる。これらの壁は屈折率が同一で
あるかあるいは異る材料から作ることができる。
る装置は、二重の導波セル５０からな〕、その主要な壁
５１および５２は源５３から発生する励起信号を輸送す
る２つの独立に付勢される素子を構成し、そして内側の
壁は裸であるか、遮断されているか、あるいは特異性反
応成分で被覆されてお夛、セル５０内に含有されている
分析物の溶液と接触している。キュベツトの特別に造形
された光伝導性壁は、通常の手段により、例えば、透明
なグラスチ、り、例えばルーサイトで成形することによ
多形成することができる。これらの壁は屈折率が同一で
あるかあるいは異る材料から作ることができる。
源５３から発生する光線５４は、交互に、回転チ、ツバ
ー鏡５７ ａ ＃ ｂ ｉｃ：よ多光線５５および５６
に分割される。第４ａ図において、との鏡５７は２つの
位置で表わされており、１つの凍結された位置は数字５
７ｍに相当し、そして他の位置（第１位置に対してほぼ
直角である）は数字５７ｂＫ相当する。容易に理解され
るように、鏡５７の位置に依存して、光線５４は光線５
５に反射されるか、あるいは光線５６に伝搬される。こ
うして、源５３からの光はそれぞれ鏡５８ａ、ｂ、ｅお
よび５９ａ、ｂおよびＣの一系列の１つにより、二重導
波セル５０の位置５１および５２に′５ｅｆｆｉに注入
される。次いで、導波装置の部分からのそれぞれ出力光
６０および６１は検出器６２上に集められる。
ー鏡５７ ａ ＃ ｂ ｉｃ：よ多光線５５および５６
に分割される。第４ａ図において、との鏡５７は２つの
位置で表わされており、１つの凍結された位置は数字５
７ｍに相当し、そして他の位置（第１位置に対してほぼ
直角である）は数字５７ｂＫ相当する。容易に理解され
るように、鏡５７の位置に依存して、光線５４は光線５
５に反射されるか、あるいは光線５６に伝搬される。こ
うして、源５３からの光はそれぞれ鏡５８ａ、ｂ、ｅお
よび５９ａ、ｂおよびＣの一系列の１つにより、二重導
波セル５０の位置５１および５２に′５ｅｆｆｉに注入
される。次いで、導波装置の部分からのそれぞれ出力光
６０および６１は検出器６２上に集められる。
この実施態様の残シの構成成分は、技術的に知られてお
シかつ第２図の実施態様に関連して開示した対応する構
成成分と同一であるので、図示されていない。
シかつ第２図の実施態様に関連して開示した対応する構
成成分と同一であるので、図示されていない。
他の実施態様（第４ｂ図参照）において、この装置は前
の実施態様のセルと同一の二重導波セルフ０からなり、
すなわち、壁７１および７２を有し、これらの壁は理解
されるよりに同様に導波路の２つの独立の素子として作
用しかつ操作される。
の実施態様のセルと同一の二重導波セルフ０からなり、
すなわち、壁７１および７２を有し、これらの壁は理解
されるよりに同様に導波路の２つの独立の素子として作
用しかつ操作される。
この装置は光源７３を含み、その出力はそれぞれ導波素
子７１および７２の入口側にレンズおよび鏡（鏡は数字
７４および７５で示されている）により各側に集束され
る。窓の穴７７をもつチョッパーディスク７６は、交互
に励起光を素子７１および７２に分配する作用をする。
子７１および７２の入口側にレンズおよび鏡（鏡は数字
７４および７５で示されている）により各側に集束され
る。窓の穴７７をもつチョッパーディスク７６は、交互
に励起光を素子７１および７２に分配する作用をする。
次いで、導波路からの出力信号は鏡７９および８０によ
り検出器７８へ向けられる。
り検出器７８へ向けられる。
第４１図および第４ｂ図に描かれている両者の実施態様
において、導波素子の一方（５１，７１）は分析物中の
測定すべき１つの成分に対して特異性の抗体で複合化反
応（前述した）Ｋより被覆されているが、第２素子（５
２，７２）は被覆されないｉｔである。ここで、被覆さ
れないは抗体をもたない表面を意味する。しかしながら
、この表面上のタンパク質吸着部位は通常この表面にタ
ンパク質（例えば、ＢＳＡ）を吸着させることにより遮
断されている。したがって分析の間、被覆されない区域
の出力に集められる信号は励起光線と分析物の本体との
相互作用を反映する。すなわち、それは試料中の合計の
ヘモグロビンについての所望の情報を提供する。しかし
ながら、同時に、導波路の被覆された側から出る信号は
、セルのこの側の内表面上に被覆された特異的反応成分
により結合されつつある成分についての要求する情報を
提供する。これはこの出願の実施例４を参照して詳述さ
れている。ここでは次のように述べることで十分であろ
う。すなわち、この種類の導波システム（二重型）は、
導波路の別々の区域から２つの型の情報を集め（すなわ
ち、前の実施態様におけるような重ねられた現象はもは
や存在しない）これにより決定においていっそうすぐれ
た精度を得ることができる。
において、導波素子の一方（５１，７１）は分析物中の
測定すべき１つの成分に対して特異性の抗体で複合化反
応（前述した）Ｋより被覆されているが、第２素子（５
２，７２）は被覆されないｉｔである。ここで、被覆さ
れないは抗体をもたない表面を意味する。しかしながら
、この表面上のタンパク質吸着部位は通常この表面にタ
ンパク質（例えば、ＢＳＡ）を吸着させることにより遮
断されている。したがって分析の間、被覆されない区域
の出力に集められる信号は励起光線と分析物の本体との
相互作用を反映する。すなわち、それは試料中の合計の
ヘモグロビンについての所望の情報を提供する。しかし
ながら、同時に、導波路の被覆された側から出る信号は
、セルのこの側の内表面上に被覆された特異的反応成分
により結合されつつある成分についての要求する情報を
提供する。これはこの出願の実施例４を参照して詳述さ
れている。ここでは次のように述べることで十分であろ
う。すなわち、この種類の導波システム（二重型）は、
導波路の別々の区域から２つの型の情報を集め（すなわ
ち、前の実施態様におけるような重ねられた現象はもは
や存在しない）これにより決定においていっそうすぐれ
た精度を得ることができる。
変形の実施態様は第４Ｃ図に表わされている。
この変形において、前述のセル５０および７０と同一の
全体的構成の二重の導波セル９０を使用し、ここで差異
は末端９１ａおよび９２ｍが実際に、例えば鏡を用いる
金属化（銀）ＩＣより、反射性とされていることである
。したがって、導波光伝導性素子のそれぞれ他端９１ｂ
および９２ｂは同時に入力端および出力端として作用す
る。これは２つの光源９３および９４により提供される
励起光線の通路で例示され、これらはそれぞれ交差ビー
ムスグリツタ−９５および９６の後に端９１ｂおよび９
２ｂへ向けられる。こうして、端９１ｂおよび９２ｂＫ
入る光は導波素子を通してまず前方に、次いで端９１ｍ
および９２ｍで反射された後後方に移動する。この構成
により、励起光の分析物との相互作用の能力は前に開示
した実施態様に比較して実際に２倍となる。この変形は
、さらに、検出器９７を含み、この検出器９７は９１ｂ
および９２ｂから出て、そしてビームスプリッタ−９５
および９６および三角形の鏡９８によりそれらに向けら
れる後方への信号を集める。源９３および９４は交互に
同期化されるので、導波装置の端９１ｂおよび９２ｂか
ら出る信号パルスは検出器９７に同時に到達しない。
全体的構成の二重の導波セル９０を使用し、ここで差異
は末端９１ａおよび９２ｍが実際に、例えば鏡を用いる
金属化（銀）ＩＣより、反射性とされていることである
。したがって、導波光伝導性素子のそれぞれ他端９１ｂ
および９２ｂは同時に入力端および出力端として作用す
る。これは２つの光源９３および９４により提供される
励起光線の通路で例示され、これらはそれぞれ交差ビー
ムスグリツタ−９５および９６の後に端９１ｂおよび９
２ｂへ向けられる。こうして、端９１ｂおよび９２ｂＫ
入る光は導波素子を通してまず前方に、次いで端９１ｍ
および９２ｍで反射された後後方に移動する。この構成
により、励起光の分析物との相互作用の能力は前に開示
した実施態様に比較して実際に２倍となる。この変形は
、さらに、検出器９７を含み、この検出器９７は９１ｂ
および９２ｂから出て、そしてビームスプリッタ−９５
および９６および三角形の鏡９８によりそれらに向けら
れる後方への信号を集める。源９３および９４は交互に
同期化されるので、導波装置の端９１ｂおよび９２ｂか
ら出る信号パルスは検出器９７に同時に到達しない。
第５図は、前に開示したような二重導波型のセル内の分
析の間に起こる現象を、分子レベルで図解する略図であ
る。第５図において、５１および５２で示す区域は、例
えば、第４ａ図に描かれた導波素子５１および５２に相
当する。区域５１および５２の間の中間区域は、分析媒
質を概略的に表わし、種がその中に溶解しており、そし
て反応成分または檻は素子５１および５２の内壁上に取
り付けられている。素子５１は１０１で示す）ＩｂＡ１
ｃ実在物に対して特異性の抗体１００をその上に付着
してすることが描かれている。これらのＨｂＡ、。
析の間に起こる現象を、分子レベルで図解する略図であ
る。第５図において、５１および５２で示す区域は、例
えば、第４ａ図に描かれた導波素子５１および５２に相
当する。区域５１および５２の間の中間区域は、分析媒
質を概略的に表わし、種がその中に溶解しており、そし
て反応成分または檻は素子５１および５２の内壁上に取
り付けられている。素子５１は１０１で示す）ＩｂＡ１
ｃ実在物に対して特異性の抗体１００をその上に付着
してすることが描かれている。これらのＨｂＡ、。
分子のあるものは特異的抗体１００と複合化した後の状
態で示されており、他のものはまだ遊離の状態である。
態で示されており、他のものはまだ遊離の状態である。
他方の表面（すなわち、素子５２の表面）は遮断剤１０
２（例えば、ウシ血清アルブミン）で被覆されており、
この遮断剤は溶液中の他の種、例えば、ＨｂＡｏｌ ０
３および任意の型の他のタン・４り質１０４に対する裸
の壁の存在しうる親和性を最小とすることを意図してい
る。
２（例えば、ウシ血清アルブミン）で被覆されており、
この遮断剤は溶液中の他の種、例えば、ＨｂＡｏｌ ０
３および任意の型の他のタン・４り質１０４に対する裸
の壁の存在しうる親和性を最小とすることを意図してい
る。
こうして、分析の間、表面５２に対する筋の特異的結合
は防止され（あるいは少なくとも強く最小とされ）、こ
うして５２中を移動する信号のエバネッセント波成分と
分析物との相互作用によル、表面上に付着した遮断性被
膜の深さを越えた深さにおいて、全体のヘモグロビンを
測定することが可能となる。
は防止され（あるいは少なくとも強く最小とされ）、こ
うして５２中を移動する信号のエバネッセント波成分と
分析物との相互作用によル、表面上に付着した遮断性被
膜の深さを越えた深さにおいて、全体のヘモグロビンを
測定することが可能となる。
これと対照的に、表面５１上でその上に被覆された抗体
分子１００と分析物溶液中のＨｂＡｌｃ（ＡＣ）との間
の複合化反応が起こる。この反応は急速ではない。した
がって、導波路のその素子中を移動する光成分との連続
的な対応する相互作用とともに、複合体の層が漸進的に
表面５１上に蓄積する。
分子１００と分析物溶液中のＨｂＡｌｃ（ＡＣ）との間
の複合化反応が起こる。この反応は急速ではない。した
がって、導波路のその素子中を移動する光成分との連続
的な対応する相互作用とともに、複合体の層が漸進的に
表面５１上に蓄積する。
これにより、第６図に描かれたＡｔたはＢ型の応答曲線
が得られる（下の実施例を参照）。
が得られる（下の実施例を参照）。
試駿を実際に実施するために、顕微鏡のスライドを濃硫
酸および蒸留水、エタノールおよびアセトン中に１標準
のスライド着色ガラス器具を用いて、連続的に浸漬する
ことにより清浄にした。繊維をエタノール中で超音波処
理により清浄にし、そしてガラス棒上に支持し、種々の
抗体溶液中に浸漬した。抗体は導波装置の表面に物理的
に吸着されるか、あるいは共有結合した。吸着は清浄さ
れた導波路を抗体の溶液（５１ｆ９のタンパク質／ｍｌ
の０．０５モル／ｌのトリス（Ｔｒｉｓ）Ｈｅｃ緩衝液
、−７，０）と−緒に１時間インキュベージ、ンするこ
とによって実施した。吸着しないタン・ぐり質を食塩溶
液（Ｓａｌｌｎ・）で洗浄除去し、そして残勺のタン・
臂り質結合性部位を抗体被覆した導波路をウシ血清アル
ブミン（トリス緩衝液中１．０重量％）とともにインキ
ュページ、ンすることによって遮断した。この結合法は
酸性水性シラン化環境においてアミノプロピルトリエト
キシシラＡＰＴＳ （固定化生化学物質および親和性ク
ロマドグ２フイー（Ｉｒｍ＋ｏｂｉｌｌｚａｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒｓＬｐｈｙ）＋ Ｒ，Ｂ、ダンロ、ゾ（
Ｄｕｎｌｏｐ）、プレナム・プレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒ
ｅｓｍ） をニー Ｂ−／ ｔ１９１−２１２ページ
〕を含むライ−トール（Ｗｅｅｔａｌ１）の方法と本質
的に同一であった。〔固定化酵素、抗原、抗体およびベ
グチドニ調製およびクロマトグラフ４− （Ｉｍｍｏｂ
ｉ１１ｚ＠ｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、 Ａｎｔ１ｇ＊ｎｓ＋
Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｐｅｐｔｌｄｅ ： Ｐｒ
＊ｐａｒｏｔｉｏｎ ａｎｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ） 、エンジモロジ−（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
。
酸および蒸留水、エタノールおよびアセトン中に１標準
のスライド着色ガラス器具を用いて、連続的に浸漬する
ことにより清浄にした。繊維をエタノール中で超音波処
理により清浄にし、そしてガラス棒上に支持し、種々の
抗体溶液中に浸漬した。抗体は導波装置の表面に物理的
に吸着されるか、あるいは共有結合した。吸着は清浄さ
れた導波路を抗体の溶液（５１ｆ９のタンパク質／ｍｌ
の０．０５モル／ｌのトリス（Ｔｒｉｓ）Ｈｅｃ緩衝液
、−７，０）と−緒に１時間インキュベージ、ンするこ
とによって実施した。吸着しないタン・ぐり質を食塩溶
液（Ｓａｌｌｎ・）で洗浄除去し、そして残勺のタン・
臂り質結合性部位を抗体被覆した導波路をウシ血清アル
ブミン（トリス緩衝液中１．０重量％）とともにインキ
ュページ、ンすることによって遮断した。この結合法は
酸性水性シラン化環境においてアミノプロピルトリエト
キシシラＡＰＴＳ （固定化生化学物質および親和性ク
ロマドグ２フイー（Ｉｒｍ＋ｏｂｉｌｌｚａｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒｓＬｐｈｙ）＋ Ｒ，Ｂ、ダンロ、ゾ（
Ｄｕｎｌｏｐ）、プレナム・プレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒ
ｅｓｍ） をニー Ｂ−／ ｔ１９１−２１２ページ
〕を含むライ−トール（Ｗｅｅｔａｌ１）の方法と本質
的に同一であった。〔固定化酵素、抗原、抗体およびベ
グチドニ調製およびクロマトグラフ４− （Ｉｍｍｏｂ
ｉ１１ｚ＠ｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、 Ａｎｔ１ｇ＊ｎｓ＋
Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｐｅｐｔｌｄｅ ： Ｐｒ
＊ｐａｒｏｔｉｏｎ ａｎｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ） 、エンジモロジ−（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
。
Ｈ，Ａ、ウートール（Ｗｅｅｔａｌ１） 、−ｒ−セル
・デツカ−・インコーホレーテッド（Ｍａｒｅ＠ｌ Ｄ
＠ｋｋ＠ｒ Ｉｎａ、）ニューヨーク１９７５．１−４
８ページ〕。
・デツカ−・インコーホレーテッド（Ｍａｒｅ＠ｌ Ｄ
＠ｋｋ＠ｒ Ｉｎａ、）ニューヨーク１９７５．１−４
８ページ〕。
一般に１導波路をＡＰＴＳ （ｏ、４モル／ｌ ）とＳ
Ｏ℃において３時間反応させた。次いでスライドまたは
キュベツトの壁を１２０℃におよび繊維を１００℃に２
時間加熱し、次いでリン酸塩緩衝液（０，１モル／／、
ｐ）１６．８）中のグルタルアルデヒド溶液（０８５モ
ル／１）中でそれらを周囲温度において９０分間ソーキ
ングした。この「活性化された」導波路を、次いで抗血
清Ａｂ（５〜のタンパク質／Ｍのリン酸塩緩衝液）と４
℃において２４時間反応させた。抗体が結合した導波路
をリン酸塩緩衝液中で洗浄した後、等侵食塩溶液（０，
１４モル／１１ナトリウムアジドを含有する、８ミリモ
ル／り中で４℃において保存した。結合の前および後に
タンノ母り質の測定〔アナリティヵル・バイオケミスト
リー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｅｈ＊ｍ、） ５１．６５４
−６５５（１９７３）］は、タンパク質の吸収が石英１
５！２につきほぼ１μｍであることを示した。
Ｏ℃において３時間反応させた。次いでスライドまたは
キュベツトの壁を１２０℃におよび繊維を１００℃に２
時間加熱し、次いでリン酸塩緩衝液（０，１モル／／、
ｐ）１６．８）中のグルタルアルデヒド溶液（０８５モ
ル／１）中でそれらを周囲温度において９０分間ソーキ
ングした。この「活性化された」導波路を、次いで抗血
清Ａｂ（５〜のタンパク質／Ｍのリン酸塩緩衝液）と４
℃において２４時間反応させた。抗体が結合した導波路
をリン酸塩緩衝液中で洗浄した後、等侵食塩溶液（０，
１４モル／１１ナトリウムアジドを含有する、８ミリモ
ル／り中で４℃において保存した。結合の前および後に
タンノ母り質の測定〔アナリティヵル・バイオケミスト
リー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｅｈ＊ｍ、） ５１．６５４
−６５５（１９７３）］は、タンパク質の吸収が石英１
５！２につきほぼ１μｍであることを示した。
次の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１
次の２つの光学的現象を明らかにするため：１）エバネ
ッセント波成分と全体のヘモグロビンとの相互作用 ＋＋）エバネッセント波成分と形成しつつあるＡ（／Ａ
ｂ複合体との相互作用） 使用した装置は第２図の実施態様のそれであった。
ッセント波成分と全体のヘモグロビンとの相互作用 ＋＋）エバネッセント波成分と形成しつつあるＡ（／Ａ
ｂ複合体との相互作用） 使用した装置は第２図の実施態様のそれであった。
既知のヘモグロビン溶液を用いる標準の調製。
ｎ製されたヘモグロビンＡ（ＨｂＡ） ヲセルパ・フェ
インバイオケミカ（ＳＥＲ■ＦＥｉＩＮＢｒ田■とＣＡ
、ハイデルベルグ、ｍ）から入手した。クシ血清アルラ
ミン（ＢＳＡ）をシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳＩ
ＧＭＡＣＨＩＮＩＣＡＬ Ｃｏ、 、Ｓｔ、 Ｌｏａｆ
ｓ、 Ｆｉ［）、 ＵＳＡ）から入手した。
インバイオケミカ（ＳＥＲ■ＦＥｉＩＮＢｒ田■とＣＡ
、ハイデルベルグ、ｍ）から入手した。クシ血清アルラ
ミン（ＢＳＡ）をシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳＩ
ＧＭＡＣＨＩＮＩＣＡＬ Ｃｏ、 、Ｓｔ、 Ｌｏａｆ
ｓ、 Ｆｉ［）、 ＵＳＡ）から入手した。
緩衝液および溶媒のすべての化学物質は、メルク（ＭＩ
ｉｍＣＫ＊ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、 ＦＲＧまたはＢＤ
Ｈ，Ｐｏｏｌｓ、Ｄｏｒｓｅｔ。
ｉｍＣＫ＊ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、 ＦＲＧまたはＢＤ
Ｈ，Ｐｏｏｌｓ、Ｄｏｒｓｅｔ。
［）から入手した分析級または試薬級のものであった。
ヒトＨ′ｂＡに対するウサギ抗血清はＤＡＫＯ（ＤＭＤ
、 Ｃｏｐｅｎｈａ（ａｎ、 Ｄｅｎｍａｒｋ）から購
入した。
、 Ｃｏｐｅｎｈａ（ａｎ、 Ｄｅｎｍａｒｋ）から購
入した。
導波路はヘラエウス・クアルズシュメルズ（ＨＥＲＡＥ
ＵＳ ＱＵＡＲＺＳＣＨＭＥＩＺＥ ＧｍｂＨ，Ｈａｎ
ａｎ、 ＦＲＧ ）から入手した溶融シリカの顕微鏡ス
ライド（Ｓｕｐｒａｓｉｌ ７５． ＯｇＸ ２５ ｍ
Ｘ １ ｔａｎ ）であった。
ＵＳ ＱＵＡＲＺＳＣＨＭＥＩＺＥ ＧｍｂＨ，Ｈａｎ
ａｎ、 ＦＲＧ ）から入手した溶融シリカの顕微鏡ス
ライド（Ｓｕｐｒａｓｉｌ ７５． ＯｇＸ ２５ ｍ
Ｘ １ ｔａｎ ）であった。
スライドを連続的に濃硫酸、蒸留水、エタノールおよび
アセトン中に浸漬（各１０分）することによって清浄し
た。清浄なスライドをリン酸塩緩衝化食塩溶液（ＰＢＳ
； ０．１モル／ｊリン酸塩、−７，４，０９％（ｗ
／ｖ）ＮａＣｔ）中の５倍希釈の抗ＨｂＡの溶液中で１
時間インキュベーションすることによって、抗体を表面
に被覆した。蒸留水中ですすいだ後、残）のタン／４り
質結合成部位をＰＢＳ中の１ ’１６ （ｖ／ｖ）のＥ
ｆ９Ａとともに１時間インキュページ璽ンすることによ
って遮断した。次いで、スライドを蒸留水中ですすぎ、
使用するまで、４℃において等侵食塩溶液中で保存した
。
アセトン中に浸漬（各１０分）することによって清浄し
た。清浄なスライドをリン酸塩緩衝化食塩溶液（ＰＢＳ
； ０．１モル／ｊリン酸塩、−７，４，０９％（ｗ
／ｖ）ＮａＣｔ）中の５倍希釈の抗ＨｂＡの溶液中で１
時間インキュベーションすることによって、抗体を表面
に被覆した。蒸留水中ですすいだ後、残）のタン／４り
質結合成部位をＰＢＳ中の１ ’１６ （ｖ／ｖ）のＥ
ｆ９Ａとともに１時間インキュページ璽ンすることによ
って遮断した。次いで、スライドを蒸留水中ですすぎ、
使用するまで、４℃において等侵食塩溶液中で保存した
。
スライドを第２図に示す、第１実施態様に、光がスライ
ド中に異る角度θで結合するような方法で、しりかシ固
定した。流れセルフを表面に０．５■のシラスティック
ガスケット２０を介して固定し、そしてセルを通してア
ッセイ緩衝液（ＰＢＳ−）−ｓ、 ｏ ％ （ｗ／ｖ）
のＢＳＡ ）を送入することによって気泡を系からノや
一ノした。標準の励溶液（１，０゜０．５ 、０．１
、０．０５ダ／１１ｔ１）をアッセイ緩衝液中で構成し
て、５１ｎ９の合計タンパク質／ ｍｌの最終タンパク
質濃度にした。
ド中に異る角度θで結合するような方法で、しりかシ固
定した。流れセルフを表面に０．５■のシラスティック
ガスケット２０を介して固定し、そしてセルを通してア
ッセイ緩衝液（ＰＢＳ−）−ｓ、 ｏ ％ （ｗ／ｖ）
のＢＳＡ ）を送入することによって気泡を系からノや
一ノした。標準の励溶液（１，０゜０．５ 、０．１
、０．０５ダ／１１ｔ１）をアッセイ緩衝液中で構成し
て、５１ｎ９の合計タンパク質／ ｍｌの最終タンパク
質濃度にした。
アッセイ手順は３．５ Ｋｔの標準ゐ溶液をセルの中に
、基線信号の確立後、注入することによりて開始した。
、基線信号の確立後、注入することによりて開始した。
入力光線の波長は４１０℃ｍにおいてモノクロメータ−
を調節することによって選択し、そして反応を４１０ｎ
ｍにおける強度の減少により監視した。角度θをまず６
６°（臨界角）より上でランダムに選択した。約６７°
の値を下に報告する試験において使用した。
を調節することによって選択し、そして反応を４１０ｎ
ｍにおける強度の減少により監視した。角度θをまず６
６°（臨界角）より上でランダムに選択した。約６７°
の値を下に報告する試験において使用した。
連続的に抗体被覆したスライドを使用し、１．０（曲線
Ａ）および０．１１１９／ｍ（曲線Ｂ）の励標準を用い
て得られた抗体結合曲線を第６図に示す。
Ａ）および０．１１１９／ｍ（曲線Ｂ）の励標準を用い
て得られた抗体結合曲線を第６図に示す。
基線の確立後、標準を１．において注入し、そして伝送
の直ちに低下（ｒ、、ｘ、） （任意の単位）をゆつく
シであるが、なお速い結合事象により追跡し、この事象
は次の１０分にわたって続いた。初期の低下はエバネッ
セント波のり、範囲内で光学的に吸収性の遊離ヘモグロ
ビンのためであった（第１図参照）。この早い段階にお
いて、複合体は形成し始ることに注意されたい；シ九が
りて、エバネッセント波成分は初期のＡｂ被被膜きわめ
て有意に越えて延長し、そして本体の溶液と自由に相互
作用する。時間ｔ！における速度におよび大きさ、それ
ぞれ、Ｍ、およびＭ、の信号の引き続く遅い変化は、表
面における筋の抗体結合のためであった。
の直ちに低下（ｒ、、ｘ、） （任意の単位）をゆつく
シであるが、なお速い結合事象により追跡し、この事象
は次の１０分にわたって続いた。初期の低下はエバネッ
セント波のり、範囲内で光学的に吸収性の遊離ヘモグロ
ビンのためであった（第１図参照）。この早い段階にお
いて、複合体は形成し始ることに注意されたい；シ九が
りて、エバネッセント波成分は初期のＡｂ被被膜きわめ
て有意に越えて延長し、そして本体の溶液と自由に相互
作用する。時間ｔ！における速度におよび大きさ、それ
ぞれ、Ｍ、およびＭ、の信号の引き続く遅い変化は、表
面における筋の抗体結合のためであった。
これはＡｂ被被膜用いない図示しない対照実験において
示された。
示された。
次いで、セルをアッセイ緩衝液で洗浄しく ｔｘ）−こ
れにより結合しない物質を除去した。信号の残シの絶対
的変化（ＷＡ、ＷＢ）を、下表に示すように投与量に関
係づける。
れにより結合しない物質を除去した。信号の残シの絶対
的変化（ＷＡ、ＷＢ）を、下表に示すように投与量に関
係づける。
投与量 １２
（―）
０．１ ＝４．６％ −４，３％ −４，３
％１．０ −１４．９％ −１２，５％ −１
３，７％標準曲線ＡおよびＢは、血液の未知の試料中の
ヘモグロビンの決定（ｄ＠ｔ＠ｒｍ１ｎａｔｉｏｎ）の
ための型（ｔ・呻１ａｔ・）として有用でありた。同様
に再現可能な情報を、未知の試料が一定時間ｔ−１後に
測定されるかぎり、測定値ＭＡおよびＭ、から収集する
ことができた。
％１．０ −１４．９％ −１２，５％ −１
３，７％標準曲線ＡおよびＢは、血液の未知の試料中の
ヘモグロビンの決定（ｄ＠ｔ＠ｒｍ１ｎａｔｉｏｎ）の
ための型（ｔ・呻１ａｔ・）として有用でありた。同様
に再現可能な情報を、未知の試料が一定時間ｔ−１後に
測定されるかぎり、測定値ＭＡおよびＭ、から収集する
ことができた。
実施例２
抗体被覆スライドを所定位置にし、励標準溶液を流れセ
ル中に注入した。１０分間反応させ九後、結合しない物
質をアッセイ緩衝液で洗浄除去した。
ル中に注入した。１０分間反応させ九後、結合しない物
質をアッセイ緩衝液で洗浄除去した。
結合した物質を４１０画における透過の減少により監視
した。光の入射角の効果を角度（θ）を６４°から７８
°の間で変化させて研究した。臨界角（０゜）は６６１
′である。結果を入射角に対して透過の減少％（＝感度
）としてプロ、トシた（第７図）。
した。光の入射角の効果を角度（θ）を６４°から７８
°の間で変化させて研究した。臨界角（０゜）は６６１
′である。結果を入射角に対して透過の減少％（＝感度
）としてプロ、トシた（第７図）。
これから理解できるように、Ｈｂの抗体結合のこの系の
測定は６６°〜７０’の間の角度で可能であり、６８°
付近において最適である。角度が大きくなるほどこの場
合浸透深さは小さくなり過ぎるが、このような角度は異
る糧類の分析系に適合することがあるであろう；角度が
小さくなると、反射が起こらなくなる。６６°〜６８°
の角度は適切さに劣る。
測定は６６°〜７０’の間の角度で可能であり、６８°
付近において最適である。角度が大きくなるほどこの場
合浸透深さは小さくなり過ぎるが、このような角度は異
る糧類の分析系に適合することがあるであろう；角度が
小さくなると、反射が起こらなくなる。６６°〜６８°
の角度は適切さに劣る。
なぜなら、光線がある角度で広がシ、光が部分的に反射
しかつ部分的に屈折し、後者の部分は系から失われるか
らである。
しかつ部分的に屈折し、後者の部分は系から失われるか
らである。
以下余白
実施例３
より繊細な標準曲線の作成励標準溶液を別の抗体被覆し
たスライドとともにインキュベーションし、そして最適
角度としてθ＝約６８°を用いて反応を監視した。透過
率チとして表わした結果は、抗与量一応答の関係を示す
： １．０ ８７．２ ０．５ ９４．０ ０．１ ９４．４ ０．０５ ９５．３ この系の最小検出は約０．１■／ｌｌ１ｌすなわち０．
１１／ｌである。正常の大人のＨｂＡ値は１３５〜１７
５みりでらシ、正常のＨｂＡ、。レベルは４〜９シｑで
あり、こうしてこの方法は適切な感度でＸＩＯ〜×１０
０の希釈で用いることができる。
たスライドとともにインキュベーションし、そして最適
角度としてθ＝約６８°を用いて反応を監視した。透過
率チとして表わした結果は、抗与量一応答の関係を示す
： １．０ ８７．２ ０．５ ９４．０ ０．１ ９４．４ ０．０５ ９５．３ この系の最小検出は約０．１■／ｌｌ１ｌすなわち０．
１１／ｌである。正常の大人のＨｂＡ値は１３５〜１７
５みりでらシ、正常のＨｂＡ、。レベルは４〜９シｑで
あり、こうしてこの方法は適切な感度でＸＩＯ〜×１０
０の希釈で用いることができる。
以下余白
実施例４
異質ヘモグロビンの存在下のヘモグロビンの測定
溶液の試料を、鳥類のヘモグロビン（ハト）に基づきか
つ測定すべきヒトヘモグロビンを変化する比率で含有す
るようにして調製した。両者のヘモグロビンの合計は通
に５ ｔｎｙ ／ｌｎｌであり、そしてヒトヘモグロビ
ンの比率を下表に記載する。第４ａ図および第４ｂ図に
示す型の二重導波路を使用し、表面の一方（例えば、５
１）をヒ）Ｈｂに対する抗体で被覆した。他方の表面（
５２）をウシ血清アルブミンで通常のように遮断した。
つ測定すべきヒトヘモグロビンを変化する比率で含有す
るようにして調製した。両者のヘモグロビンの合計は通
に５ ｔｎｙ ／ｌｎｌであり、そしてヒトヘモグロビ
ンの比率を下表に記載する。第４ａ図および第４ｂ図に
示す型の二重導波路を使用し、表面の一方（例えば、５
１）をヒ）Ｈｂに対する抗体で被覆した。他方の表面（
５２）をウシ血清アルブミンで通常のように遮断した。
測定を実施するとき、７５．３−の透過率に相当する鋭
い低下（Ｉ）すべての場合に測定された：次いで透過率
のそれ以上の低下（Ｍ）（実施何重および第６図を参照
）が１０分の間隔後に記録された。鳥類のヘモグロビン
のみを含有する試料の場合において、１０分の間隔の間
それ以上の変化は観測されなかった。結果を下に要約す
る。
い低下（Ｉ）すべての場合に測定された：次いで透過率
のそれ以上の低下（Ｍ）（実施何重および第６図を参照
）が１０分の間隔後に記録された。鳥類のヘモグロビン
のみを含有する試料の場合において、１０分の間隔の間
それ以上の変化は観測されなかった。結果を下に要約す
る。
以下介白
０ ７５．３ ０１
７４．９ ０．４２
７４．４ ０．９１０
７２．０ ３．３２０ ６８
．３ ７．０こうして、最初の初期の低下■に
ついて記録された値は存在する合計のヘモグロビンに関
係づけることができ、一方１０分の反応期間後に観測さ
れかつヒトヘモグロビン因子の表面５１上に被覆された
抗体への結合に相当する値（Ｍ）は試料゛のヒトヘモグ
ロビン含量および合計のヘモグロビンに対するその比に
関係づけることができる。この実施例において使用した
装置に結合した自動記録装置に上のデータを記録するこ
とにより、標準曲線をつくりた。その後、このような曲
線は鳥類ヘモグロビン中のヒトヘモグロビンの未知の混
合物の決定のための比較データとして使用した。
７４．９ ０．４２
７４．４ ０．９１０
７２．０ ３．３２０ ６８
．３ ７．０こうして、最初の初期の低下■に
ついて記録された値は存在する合計のヘモグロビンに関
係づけることができ、一方１０分の反応期間後に観測さ
れかつヒトヘモグロビン因子の表面５１上に被覆された
抗体への結合に相当する値（Ｍ）は試料゛のヒトヘモグ
ロビン含量および合計のヘモグロビンに対するその比に
関係づけることができる。この実施例において使用した
装置に結合した自動記録装置に上のデータを記録するこ
とにより、標準曲線をつくりた。その後、このような曲
線は鳥類ヘモグロビン中のヒトヘモグロビンの未知の混
合物の決定のための比較データとして使用した。
以下傘自
実施例５
ヘモグロビンの存在下のグリコシル化ヘモグロビン（）
ＩｂＡ１．）の測定 プールしヘパリン化した全血から、Ｂｌｏ−ＲＫＫ７０
樹脂〔）守イオーラド（Ｂ１０−ＲＡＤ）、す、チモン
ド、カル７オルニア州米国〕を使用するカチオン交換り
四マドグラフィー（Ｌ、Ａ、 ）ライベリ（ＴＲＩＶＥ
ＬＩ、Ｉ ）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・
オフ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ、 ｏ
ｆＭ＠ｄｉｃｉｎｅ） ２８４ （１９７１）、 ３５
３ ］により、標準のグリコシル化勤（］ＨｂＡ、ｃ）
を調製した。次いで、精製した’ＨｂＡ１ｃｆ使用して
、それを変化する既知量でグリコシル化ヘモグロビン不
合血液と再び組み合わせることによって、標準試料を調
製した。試料中の合計のヘモグロビンに関する）ｆｂＡ
、ａの濃度は１〜２０重量％の間で変化させ、そして合
計の凸濃度は１５ＯＮ程度でありた。
ＩｂＡ１．）の測定 プールしヘパリン化した全血から、Ｂｌｏ−ＲＫＫ７０
樹脂〔）守イオーラド（Ｂ１０−ＲＡＤ）、す、チモン
ド、カル７オルニア州米国〕を使用するカチオン交換り
四マドグラフィー（Ｌ、Ａ、 ）ライベリ（ＴＲＩＶＥ
ＬＩ、Ｉ ）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・
オフ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ、 ｏ
ｆＭ＠ｄｉｃｉｎｅ） ２８４ （１９７１）、 ３５
３ ］により、標準のグリコシル化勤（］ＨｂＡ、ｃ）
を調製した。次いで、精製した’ＨｂＡ１ｃｆ使用して
、それを変化する既知量でグリコシル化ヘモグロビン不
合血液と再び組み合わせることによって、標準試料を調
製した。試料中の合計のヘモグロビンに関する）ｆｂＡ
、ａの濃度は１〜２０重量％の間で変化させ、そして合
計の凸濃度は１５ＯＮ程度でありた。
第４ｂ図に図解するような二重導波路を含むキエペット
を有する分析装置を決定に使用した；キエペットの一方
の側の内表面をＨｂＡ、ｃに対して特異性の抗体で被覆
し、一方反対側の表面はそのままにしておいた。各セル
の含量（各橢準の連続的試験に新しいものを使用した）
は約１ｓｌＪであ夛、そして約０．９−のＰＢ８と一緒
に０． Ｉ ＷＬｌの測定すべき標準をピイットで入れ
九。第８図は１５分のインキュベーション時間（２０１
のＨｂＡ１ｃ試料を用いる）後に得られた滴点曲線の１
つを示し、上の曲線（はとんど平坦）は導波路の被覆さ
れない部分で記録されたものであり、そして下の曲線は
導波路の抗体で被覆された部分の応答を示す。
を有する分析装置を決定に使用した；キエペットの一方
の側の内表面をＨｂＡ、ｃに対して特異性の抗体で被覆
し、一方反対側の表面はそのままにしておいた。各セル
の含量（各橢準の連続的試験に新しいものを使用した）
は約１ｓｌＪであ夛、そして約０．９−のＰＢ８と一緒
に０． Ｉ ＷＬｌの測定すべき標準をピイットで入れ
九。第８図は１５分のインキュベーション時間（２０１
のＨｂＡ１ｃ試料を用いる）後に得られた滴点曲線の１
つを示し、上の曲線（はとんど平坦）は導波路の被覆さ
れない部分で記録されたものであり、そして下の曲線は
導波路の抗体で被覆された部分の応答を示す。
種々の標準の分析結果を下表にまた記載する。
０ ５６．１ ５５．８ ０．３１
５５．５ ５４．７ ０．８５
５５．７ ５０．２ ５．５１０
５８．０ ４９．２ ８．８２０ ５
４．９ ４２．４ １２．５ゼロ０ＨｂＡ、ｅ
の試料についての０．３％の差は、グリコシル化血液媒
質に対するＨ′ｂＡ、ｃ特異性の抗体のある程度の親和
性を示しうる。しかしながら、この因子は実際の分析条
件下で無視することができる。
５５．５ ５４．７ ０．８５
５５．７ ５０．２ ５．５１０
５８．０ ４９．２ ８．８２０ ５
４．９ ４２．４ １２．５ゼロ０ＨｂＡ、ｅ
の試料についての０．３％の差は、グリコシル化血液媒
質に対するＨ′ｂＡ、ｃ特異性の抗体のある程度の親和
性を示しうる。しかしながら、この因子は実際の分析条
件下で無視することができる。
導波路の被覆しない部分における透過率チは１つのセル
から他のセルにおいて一定ではなく、これはこの方法が
合計の筋の精確な決定のために適当ではないと思われる
ことに、また、注意すべきである。
から他のセルにおいて一定ではなく、これはこの方法が
合計の筋の精確な決定のために適当ではないと思われる
ことに、また、注意すべきである。
しかしながら、この場合において合計の筋を測定するこ
とは不必要であり、かつまた被覆されない側および被覆
された側からの信号を関係づけることは不必要である。
とは不必要であり、かつまた被覆されない側および被覆
された側からの信号を関係づけることは不必要である。
第２に、一連のキュベツトの各々がこの装置の初期の目
盛窓めを行なわないで絶対的測定値を完全に再現できる
ように、このようなキュベツトの手による製作を一定に
維持することは困難である。凝いなく、キュベツトが大
規模に工業的に成形により製作されるとき、この欠点は
克服される。
盛窓めを行なわないで絶対的測定値を完全に再現できる
ように、このようなキュベツトの手による製作を一定に
維持することは困難である。凝いなく、キュベツトが大
規模に工業的に成形により製作されるとき、この欠点は
克服される。
以下余白一
実施例６
蛍光型アッセイによるヒトＩｇＧ＞よびヒト血清アルブ
ミン（ＵＳＡ）の同時定量 前の実施例におけるような二重導波路を使用し、４９０
（２）の入射輻射を遮断しそして５２０両の蛍光信号を
通過させるカットオフフィルターを検出器７８の前に光
路中にそう入した。
ミン（ＵＳＡ）の同時定量 前の実施例におけるような二重導波路を使用し、４９０
（２）の入射輻射を遮断しそして５２０両の蛍光信号を
通過させるカットオフフィルターを検出器７８の前に光
路中にそう入した。
第２図に関連して開示した盤のモノクロメータ−（９）
により励起光を発生させた。
により励起光を発生させた。
二重導波路としてはたらくキュベツトの１つの表面（Ａ
）を、！−に対してヒツジでレイズ（ｒａｉｓ・）した
抗血清で被覆した。これは抗血清の希釈溶液を用いる通
常の手段に従って、吸着によル実施した（α−鎖特異性
”、 ８ＡＰＵ、 Ｃａｒｌｕｋｅ。
）を、！−に対してヒツジでレイズ（ｒａｉｓ・）した
抗血清で被覆した。これは抗血清の希釈溶液を用いる通
常の手段に従って、吸着によル実施した（α−鎖特異性
”、 ８ＡＰＵ、 Ｃａｒｌｕｋｅ。
ｇｅｏｔｌａｎｄ：容量１／４００の希釈）。キュベツ
トの対向する壁ＣＢ）を同じ技術に従いＵＳＡに対する
ヒツジ抗血清（１／１００容量の最終希釈、同一の入手
源）で被覆した。
トの対向する壁ＣＢ）を同じ技術に従いＵＳＡに対する
ヒツジ抗血清（１／１００容量の最終希釈、同一の入手
源）で被覆した。
次いで、混合した組み合わせ標準溶液をヒトＩｇＧ（Ｓ
ＥＲＶＡ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）およびＵＳＡ（
ＵＣＢ−ＢＩＯＰＲＯＤＵＣＴＳ、 Ｂｒｕｓｓｅｌｓ
、 Ｂｅｇｉｕｍ）を−緒に溶解することによって調製
した。標準媒質として使用した緩衝溶液は、リン酸塩緩
衝液であった：０．０５モル／ ｌ （ＰＨ７，４）
： ０．９ ’１４ ＯＮａＣ２（ｖ／ｖ） ；０．０
５％のＮａＮ３ （Ｗ／”） ”ツイーン２０ （ｆ９
ＩＧＭＡ） ０．１％（ｖ／ｖ）および２ ’ＩＳ （
ｖ／ｖ）の正常ヒツジ血清（ＳＡＰＶ）。
ＥＲＶＡ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）およびＵＳＡ（
ＵＣＢ−ＢＩＯＰＲＯＤＵＣＴＳ、 Ｂｒｕｓｓｅｌｓ
、 Ｂｅｇｉｕｍ）を−緒に溶解することによって調製
した。標準媒質として使用した緩衝溶液は、リン酸塩緩
衝液であった：０．０５モル／ ｌ （ＰＨ７，４）
： ０．９ ’１４ ＯＮａＣ２（ｖ／ｖ） ；０．０
５％のＮａＮ３ （Ｗ／”） ”ツイーン２０ （ｆ９
ＩＧＭＡ） ０．１％（ｖ／ｖ）および２ ’ＩＳ （
ｖ／ｖ）の正常ヒツジ血清（ＳＡＰＶ）。
この実験において開示する試験は、「サンドイッチ」型
のアセンを行うことに基づく。すなわち、キュベツトを
標準と接触させ、そしてインキュベーションを一定期間
実施して、表面（Ａ）および（Ｂ）Ｋ取り付けられたそ
れぞれの特異的抗体へ抗原を十分に結合させた。このイ
ンキュページ１フ時間は精確に測定した１０分の期間で
あり、その期間に全体の結合した抗原の量は標準中のそ
の濃度に比例した。ブランク（０チの抗原試薬）に対す
る試験を同じように実施した。
のアセンを行うことに基づく。すなわち、キュベツトを
標準と接触させ、そしてインキュベーションを一定期間
実施して、表面（Ａ）および（Ｂ）Ｋ取り付けられたそ
れぞれの特異的抗体へ抗原を十分に結合させた。このイ
ンキュページ１フ時間は精確に測定した１０分の期間で
あり、その期間に全体の結合した抗原の量は標準中のそ
の濃度に比例した。ブランク（０チの抗原試薬）に対す
る試験を同じように実施した。
その後、セルを空にし、結合しない物質のすべてを洗浄
除去し、そして導波装置の表面に取り付けられた抗原に
対する第２抗体の組み合わせた溶液を加えた。この組み
合わせた溶液は、フルオレセインで標識付けした１ ／
４０ （ｖ／ｖ）緩衝液希釈のウサギ抗Ｈ８Ａおよび
ウサギ抗ＩｇＧ （ＤａＩｙＭＵＮｏＧＬｏＢＵＬ工Ｎ
Ｓから入手した）を含有した（フルオレセインイソシア
ネー）、ＦＩＴＣを通常の手段に従い実際のマーカーと
して使用した）。
除去し、そして導波装置の表面に取り付けられた抗原に
対する第２抗体の組み合わせた溶液を加えた。この組み
合わせた溶液は、フルオレセインで標識付けした１ ／
４０ （ｖ／ｖ）緩衝液希釈のウサギ抗Ｈ８Ａおよび
ウサギ抗ＩｇＧ （ＤａＩｙＭＵＮｏＧＬｏＢＵＬ工Ｎ
Ｓから入手した）を含有した（フルオレセインイソシア
ネー）、ＦＩＴＣを通常の手段に従い実際のマーカーと
して使用した）。
蛍光標識付けした混合抗体溶液を加えると、瞬間的な蛍
光の上昇が導波装置の出力において観測され、次いで遅
い速度依存性信号が観測され（第９図参照）、所定期間
後のその高さは独立に取りた■（およびＵＳＡの標準濃
度に比例した。解読後、表面（Ａ）および（Ｂ）から生
ずる信号の成分を別々に表示し、そして結果を下表に記
載する。
光の上昇が導波装置の出力において観測され、次いで遅
い速度依存性信号が観測され（第９図参照）、所定期間
後のその高さは独立に取りた■（およびＵＳＡの標準濃
度に比例した。解読後、表面（Ａ）および（Ｂ）から生
ずる信号の成分を別々に表示し、そして結果を下表に記
載する。
０．１ １ ２ １．５ −１ ２ １１．０
２７ ２４ ２５ ４４ ４４ ４４１０．０
６４ ６１ ６２ ６０ ５６ ５８１００．０
１６０ １７０１６５ １４０１３５ １３７第９図
は、成分ＡおよびＢについて、１ｆｉｌ／１（破線）お
よび１０μ９／Ｉｔ （混合線）の標準の場合における
０〜１５分の状態をダラムで示す。実線はブランクを表
わす。
２７ ２４ ２５ ４４ ４４ ４４１０．０
６４ ６１ ６２ ６０ ５６ ５８１００．０
１６０ １７０１６５ １４０１３５ １３７第９図
は、成分ＡおよびＢについて、１ｆｉｌ／１（破線）お
よび１０μ９／Ｉｔ （混合線）の標準の場合における
０〜１５分の状態をダラムで示す。実線はブランクを表
わす。
上の実施例におけるように、未知の濃度でＩｇＧおよび
Ｈ８Ａを含む試料を同じように試験しかつ標準と比較す
ることにより確認した。
Ｈ８Ａを含む試料を同じように試験しかつ標準と比較す
ることにより確認した。
第１ａ図は、屈折率ｎ１の媒質（導波路）内の完全に反
射した光の伝搬を説明する線図であり、ｎｌは導波装置
が接触している他の媒質（分析物）の屈折率ｎｌより大
きい。 第１ｂ図は、第１ａ図に付随し、そして希薄な媒質（分
析物）中のエバネッセント波成分の浸透を概略的に表わ
す。 第２図は、本発明の方法を実施するための単一の導波路
の概略的配置図である。 第３図は、本発明の方法を実施するための装置の他の実
施態様の略配置図である。 第４ａ図は、二重導波セルを含む分析装置の他の実施態
様の細部の路上面図である。 第４ｂ図は、第４ａ図の実施態様の変形の略図である。 第４ｃ図は、なお他の実施態様の略図である。 第５図は、本発明の方法に従う分析の間に生ずる現象の
略表示である。 第６図は、本発明の１つの実施態様に従う分析を実施す
るときの応答曲線を示す線図である・第７図は、導波装
置を通して移動する多重反射光線の入射角θの関数とし
て、応答曲線の１つのパラメーターの変動を示す線図で
おる。 第８図は、ヘモグロビンの存在下のＨｂＡ、ｃの分析に
おける典型的な応答曲線の線図である。 第９図は、蛍光を含む他の型の分析を示す。 ｌ・・・光線、２・・・反射光線、４，５・・・物質、
６・・・光源、７・・・流れセル、８゛□・・・導波路
、９・・・モノクロメータ、１０・・・光電子増倍管、
１１・・・プリアンプ、１２・・・制御システム、１３
・・・マイクロコンピュータ−１１４・・・プリンタ、
１５・・・メモリー（フロ。 ピーディスク）、１６．１７・・・プリズム、１８・・
・入口、２０・・・シール用ガスケット、３１・・・導
波路、３４・・・流れセル、３５・・・入口、３６・・
・出口、３７゜３８・・・栓、３９・・・光源、４０，
４１．４２・・・レンズ、４３・・・光電子増倍管、５
０・・・導波セル、５１゜５２・・・壁（素子）、５３
・・・源、５４，５５．５６・・・光線、５７，５８，
５９・・・鏡、６０．６１・・・出力光、７０・・・二
重導波セル、７１．７２・・・導波素子、７３・・・光
源、７４．７５・・・鏡、７６・・・チ、ツノ々−ディ
スク、７７・・・窓、７８・・・検出器、７９゜８０・
・・鏡、９０・・・二重導波セル、９３，９４・・・光
源、９５．９６・・・交差ビームスグリツタ−１９７・
・・検出器、９８・・・プリズム、１００・・・抗体、
１０１・ＨｂＡ、ｅ、 １０２−”！１断剤、１０３
・ＨｂＡｏ。 １０４・・・タンノダク質。 以下余白 手続補正書（方式） 昭和６１年３月１λ日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２７６１４４号 ２、発明の名称 液状分析物中の種のパラメータ＝ｈ 光学的に確認する方法および装置 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 パテルメモリアルインスティチュート４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、
補正の対象 明細書 ７、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 浄書明細書 １通
射した光の伝搬を説明する線図であり、ｎｌは導波装置
が接触している他の媒質（分析物）の屈折率ｎｌより大
きい。 第１ｂ図は、第１ａ図に付随し、そして希薄な媒質（分
析物）中のエバネッセント波成分の浸透を概略的に表わ
す。 第２図は、本発明の方法を実施するための単一の導波路
の概略的配置図である。 第３図は、本発明の方法を実施するための装置の他の実
施態様の略配置図である。 第４ａ図は、二重導波セルを含む分析装置の他の実施態
様の細部の路上面図である。 第４ｂ図は、第４ａ図の実施態様の変形の略図である。 第４ｃ図は、なお他の実施態様の略図である。 第５図は、本発明の方法に従う分析の間に生ずる現象の
略表示である。 第６図は、本発明の１つの実施態様に従う分析を実施す
るときの応答曲線を示す線図である・第７図は、導波装
置を通して移動する多重反射光線の入射角θの関数とし
て、応答曲線の１つのパラメーターの変動を示す線図で
おる。 第８図は、ヘモグロビンの存在下のＨｂＡ、ｃの分析に
おける典型的な応答曲線の線図である。 第９図は、蛍光を含む他の型の分析を示す。 ｌ・・・光線、２・・・反射光線、４，５・・・物質、
６・・・光源、７・・・流れセル、８゛□・・・導波路
、９・・・モノクロメータ、１０・・・光電子増倍管、
１１・・・プリアンプ、１２・・・制御システム、１３
・・・マイクロコンピュータ−１１４・・・プリンタ、
１５・・・メモリー（フロ。 ピーディスク）、１６．１７・・・プリズム、１８・・
・入口、２０・・・シール用ガスケット、３１・・・導
波路、３４・・・流れセル、３５・・・入口、３６・・
・出口、３７゜３８・・・栓、３９・・・光源、４０，
４１．４２・・・レンズ、４３・・・光電子増倍管、５
０・・・導波セル、５１゜５２・・・壁（素子）、５３
・・・源、５４，５５．５６・・・光線、５７，５８，
５９・・・鏡、６０．６１・・・出力光、７０・・・二
重導波セル、７１．７２・・・導波素子、７３・・・光
源、７４．７５・・・鏡、７６・・・チ、ツノ々−ディ
スク、７７・・・窓、７８・・・検出器、７９゜８０・
・・鏡、９０・・・二重導波セル、９３，９４・・・光
源、９５．９６・・・交差ビームスグリツタ−１９７・
・・検出器、９８・・・プリズム、１００・・・抗体、
１０１・ＨｂＡ、ｅ、 １０２−”！１断剤、１０３
・ＨｂＡｏ。 １０４・・・タンノダク質。 以下余白 手続補正書（方式） 昭和６１年３月１λ日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２７６１４４号 ２、発明の名称 液状分析物中の種のパラメータ＝ｈ 光学的に確認する方法および装置 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 パテルメモリアルインスティチュート４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、
補正の対象 明細書 ７、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 浄書明細書 １通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、液状分析物におけるパラメーターを確認する方法、
例えば、溶液中の種を決定する方法であって、ここで内
部で反射する光の信号のエバネッセント成分が、前記分
析物と前記信号の導波路との界面において、前記種の１
つおよび前記導波路の表面に取り付けられた前記種の１
つに対して特異性の試薬から構成された複合体の層およ
び／または前記分析物の本体と相互作用し、こうして前
記パラメーターを表わす光エネルギーの出力の変化を提
供し、前記方法は前記出力エネルギーを集めそしてそれ
を光電子工学的に処理して前記パラメーターに対応する
読出しデータにすることを含み、 ａ）前記導波路内の前記光の信号の反射角を制御して、
前記エバネッセント波成分を前記複合体の層を越えて前
記溶液の本体中に浸透させ、前記浸透の深さは、前記複
合体の層および前記分析物の本体の両者に対して応答性
とし、こうして前記複合体の層中の第１種を表わすパラ
メーターならびに前記溶液中の第２種を表わすパラメー
ターについて処理可能な出力エネルギーを同時に提供す
るために十分であり、あるいは ｂ）前記導波路の２またはそれより多い区域を使用し、
１つの第１区域はそれに取り付けられた第１試薬を保持
して決定すべき第１種の複合体の層を提供し、これによ
り前記相互作用は前記複合体の層に対してのみ応答性で
あり、そして出力はこの第１種のパラメーターのみを表
わし、そして第２区域は、 （ｂ１）裸であるかあるいは遮断されており、これによ
り前記相互作用は前記分析物の本体に対して応答性であ
りかつその中に溶解した第２種のパラメーターを表わし
、あるいは （ｂ２）第２種に対して特異性の第２試薬で被覆されて
おり、こうして第２複合体の層を提供し、この層に対し
て前記相互作用は応答性であり、そして出力は他のパラ
メーターを表わし、後者のパラメーターは前記第２種に
関係し、 ｃ）混合された信号から成る出力を処理し、そしてそれ
を問題の各パラメーターに対して特異性の成分に分割し
、 ｄ）前記成分を別々のデータに表わし、そしてｅ）前記
表示されたデータを対応するパラメーターが知られてい
る標準溶液から得られた標準データと相互に関係づける
ことによって、前記パラメーターを確認する、 ことを特徴とする方法。 ２、前記導波路内の励起光を内部の多重反射により伝送
し、そしてこの信号と前記分析物との相互作用は蛍光の
ある程度の吸収、および／または、散乱および／または
発生を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記導波路は光学的スライドまたはフィルターから
成り、複合体の層が分析の間にその表面に形成し、こう
して前記第１種について時間依存性の応答を提供しかつ
前記第２種について即時の応答を提供する特許請求の範
囲第２項記載の方法。 ４、前記導波路の前記２つまたはそれより多い明確な区
域は同一の入射光の信号により付勢される特許請求の範
囲第２項記載の方法。 ５、前記導波路の前記２つまたはそれより多い明確な区
域の各々は別々に照明される導波路の素子を含む特許請
求の範囲第２項記載の方法。 ６、前記導波路は分析用キュベットにより構成されてお
り、その対向する壁は独立に別々に照明される素子とし
て作用する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、出力に集められた前記混合された信号は波長が同一
であるかあるいは異る成分からなる特許請求の範囲第３
〜５項のいずれかに記載の方法。 ８、前記明確な区域の照明は交互に実施される特許請求
の範囲第５項記載の方法。 ９、血液試料中の合計のヘモグロビン（Ｈｂ）および、
選択的に任意に、それ以上のヘモグロビン因子またはそ
の誘導体、例えば、グリコシル化ヘモグロビン（Ａｇ）
を前記合計のヘモグロビンに関して、実質的に同時に決
定する特許請求の範囲第１項記載の方法であって、この
方法は、次の工程；ａ）分析すべき試料の屈折率（ｎ＿
２）より大きい屈折率（ｎ＿１）の光学的導波システム
の表面の少なくとも一部を、複合化試薬（Ａｂ）の１ま
たは２以上の被膜で被覆し、前記被膜の各々は前記ヘモ
グロビンＡｇの因子またはその誘導体に対して特異性で
ありかつ前記Ａｇと反応したとき前記複合体の層を形成
することができる試薬であり、 ｂ）前記導波システムを入力端において光線で照明し、
そして出力端において出る光を集め、前記光線は前記導
波システムに沿つて角度θで多重内部反射機構により伝
送され、こうして前記光線の伝送に関連する消散光成分
の導波システムの外側の作用の有効範囲は前記複合体層
のそれを越え、ｃ）分析すべき前記血液試料および前記
照明された導波システムを一緒に接触させ、これにより
、一方において、前記導波システム内を移動する光の部
分は前記エバネッセント波成分と全体の試料のヘモグロ
ビンとの相互作用により最初に吸収され、これにより前
記出力端から出る光において瞬間的な鋭い低下（ I ）
が生じ、そして、他方において、前記血液試料中の決定
すべき前記グリコシル化ヘモグロビンまたは他の因子と
前記複合体層が連続的に蓄積している前記導波システム
上に被覆された対応するＡｂとの間に免疫型反応が発生
し、このような発生は前記出る光に比較的遅い変化を生
じさせ、前記比較的遅い変化は前記エバネッセント波成
分と形成しつつある前記複合体層との相互作用のためで
あり、 ｄ）前記出力端から集められる伝送光に対して起こる前
記急激な光学的吸収の低下（ I ）を観測、測定および
／または記録し、前記測定された低下は前記試料の合計
のヘモグロビンＨｂの濃度に定量的に関係づけられ、 ｅ）前記比較的遅い変化を観測、測定および／または記
録し、その大きさ（Ｍ）および速度（Ｋ）は前記試料中
のグリコシル化ヘモグロビンまたは他の因子Ａｇの量に
定量的に関係し、 ｆ）必要な計算を、例えば、電子工学的に、実施して、
ＩおよびＭまたはＫの値から得られた結果を前記試料中
のＨｂの濃度および／またはＡｇ対Ｈｂの比で表わす、 からなる方法。 １０、工程（ｄ）および（ｅ）の双方を、抗体Ａｂをそ
の上に被覆して有する導波路の区域における、入射光と
分析物との相互作用から得られる信号について実施する
特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、工程（ｄ）を抗体Ａｂで被覆されていない導波路
の部分における前記相互作用から得られる出力の成分に
ついて実施する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、二重型の導波路を使用し、その１つの部分は抗体
Ａｂで被覆されており、そしてその他の部分は抗体で被
覆されていない特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記他の部分は遮断性タンパク質で被覆されてい
て、導波路の被覆されていない表面区域へのヘモグロビ
ンの起こりうる付着を最小とされている特許請求の範囲
第１２項記載の方法。 １４、二重導波路として、分析用キュベットを使用する
ことを含み、前記導波路の主要な対向する壁は光伝送性
であり、そして血液試料の屈折率（ｎ＿２）より大きい
適当な屈折率（ｎ＿１）の透明材料から作られており、
この材料は導波路としてはたらく特許請求の範囲第１２
項記載の方法。 １５、血液試料中の合計のヘモグロビンを少なくとも１
種の他の特定のヘモグロビン因子と一緒に光学的手段に
より導波路を使用して同時に決定する装置であって、前
記導波路は決定すべき前記種と相互作用しかつ前記種を
表わす検出可能な応答を提供することができる光の信号
を運搬し、前記相互作用は前記導波路内を移動する光の
信号のエバネッセント波成分と前記試料の本体または複
合体との相互作用であり、前記複合体は前記因子と前記
導波路の被覆により取り付けられた前記因子に対して特
異性の試薬との結合から生じ、この装置は、 ａ）光線を発生しかつそれを前記導波路の適当な入力端
の中に入れる光源手段、 ｂ）前記導波路の出力から出る光の信号を集めかつ前記
相互作用を表わす電気信号を発生する光検出手段、 ｃ）前記電気信号を処理しかつ前記所望の決定に関する
適当な読出しを提供する計算手段、からなり、 前記特異性試薬の被膜は前記導波路の操作区域の一部の
みを含み、その残部は裸であるかあるいは遮断剤により
前記因子の結合に対して阻止性とされていること、およ
び前記導波路の前記試薬で被覆された区域は決定すべき
前記特異性因子に対して応答性とされており、これに対
して前記被覆されていないかあるいは遮断されている区
域は前記合計のヘモグロビンに対して応答性であること
を特徴とする装置。 １６、前記導波路は二重型構造を有しかつ前記光学信号
を同時にあるいは交互に運搬する２つの独立の光学的素
子からなり、前記素子の一方は反応成分で被覆されてお
り、そして他方は裸であるかあるいは遮断されている特
許請求の範囲第１５項記載の装置。 １６、導波路として、光学的セルまたはキュベットを使
用し、その２つの対向する壁は前記導波素子として作用
する特許請求の範囲第１６項記載の装置。 １７、前記光源手段は前記二重型導波路の２つの素子の
中に信号光を交互に注入するチョッパー手段からなる特
許請求の範囲第１７項記載の装置。 １８、前記チョッパー手段は回転鏡またはチョッパーデ
ィスクである特許請求の範囲第１８項記載の装置。 １９、前記光源手段は２つの独立の交互に閃光する光源
からなり、その出力は各々ビームスプリッティング手段
を経て前記素子の一方の光学的端へ収束され、そして前
記素子の他方の端は完全に反射性とされており、これに
より前記素子により運ばれる光の信号はその内部を前後
に移動する特許請求の範囲第１６項記載の装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP84810600A EP0184600B1 (en) | 1984-12-10 | 1984-12-10 | Method for optically ascertaining parameters of species in a liquid analyte |
| EP84810600.1 | 1984-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61191965A true JPS61191965A (ja) | 1986-08-26 |
| JP2603611B2 JP2603611B2 (ja) | 1997-04-23 |
Family
ID=8193057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60276144A Expired - Lifetime JP2603611B2 (ja) | 1984-12-10 | 1985-12-10 | 液状分析物中の種のパラメーターを光学的に確認する方法および装置 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4818710A (ja) |
| EP (1) | EP0184600B1 (ja) |
| JP (1) | JP2603611B2 (ja) |
| AU (1) | AU582604B2 (ja) |
| CA (1) | CA1272617A (ja) |
| DE (1) | DE3481644D1 (ja) |
Cited By (13)
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| JPH01221667A (ja) * | 1988-02-29 | 1989-09-05 | Daikin Ind Ltd | 免疫検査装置および免疫検査方法 |
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Families Citing this family (170)
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|---|---|---|---|---|
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