JP2571971B2 - 分析方法及びキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は分析技術及び該技術を実行するための手段に
関する。特に、より優れた信号対雑音比及び感度を提供
する分析技術の改良に関する。

螢光分析、例えば分析の一つの構成要素が導波管のイ
ンターフェースに固定された螢光免疫分析では、表面
（要求される信号）に結合されてラベル付けされた別の
分析試料からの螢光放射と、好ましくない雑音信号を与
える溶液内に依然存在する上記別の試料からの螢光放射
との識別に関する問題を生じさせる。

これら２つの結合及び非結合試料群の間の差が大きけ
ればそれだけ分析の信号対雑音比及び感度が向上するこ
とになる。

以下に述べる本発明は、固定された検出試料Ｙ′例え
ば抗体の上或いは近くの試料Ｘに結合された発螢光団
と、場合によっては導波管上あるいは固定されたフィル
ム支持体内に固定された染料との間の共鳴エネルギ移動
工程（Forster Energy Transfer）と組合せた光学導波
管の消失性フィールド特性を利用するものである。ここ
で導波管の消失性フィールドとは、導波管に光が伝播さ
れた時にその伝播に基づき該導波管の外側に発生するゼ
ロでない電磁フィールドを言い、このフィールドの強さ
は、従来周知のように導波管及びその周囲間のインター
フェースからの距離が増すにつれて指数的に減衰する。

エネルギの移動により達成される型の均質分析におけ
る結合試料及び自由試料間の識別は、分子の大きさのレ
ベルでしか効果的に行なわれない。従ってこの識別は、
複合体が形成される時にだけ可能となる。

公知となっている消失性導波管の分析は、消失性波の
浸透が分子寸法を超えると無視できるものとなるため、
複合体上のラベルのみ励起するという推測に基づいてい
る。しかし、実際にはこの推測は単純化し過ぎたもので
あり、かかる分析の感度は期待したものよりも低いもの
でしかない。

本発明の一つの側面によれば、 （Ａ）以下の要素（ａ）〜（ｄ）を同時に、或いは所望
の順序で温置する工程と； （ａ） サンプル； （ｂ） 第１エネルギ受容体にラベル付けされた試料X; （ｃ） 光学導波管の表面に直接或いは間接的に固定さ
れた試料Y; （ｄ） 前記光学導波管の表面に直接或いは間接的に固
定された第２エネルギ受容体； 前記試料Ｘ及びＹの一方が前記サンプルにおける配位
子に対して特定の結合パートナを有し、また他方の配位
子アナログ或いは配位子の特定の結合パートナを有し、
前記第１及び第２エネルギ受容体の一方は、他方の電子
放出スペクトルと重複した電子発光スペクトルの供与体
発螢光団を有し、 （Ｂ）前記供与体発螢光団を励起するのに適した波長の
電子放射をもって前記光学導波管を放射する工程と、 （Ｃ）前記第１及び第２エネルギ受容体間或いは第２及
び第１エネルギ受容体間のそれぞれで共鳴エネルギの移
動が直接或いは間接的に起こるのかどうかを検知する工
程とより成り、 前記放射工程（Ｂ）は導波管に沿った電磁放射伝播に
より生じる消失性フィールドによるものであり、及び／
或いは検知工程（Ｃ）は、前記第１エネルギ受容体の螢
光或いはもしあれば第２エネルギ受容体の螢光の導波管
と結合する消失性フィールドを利用してなる、サンプル
における配位子の分析方法 が提供される。斯かる構成によれば、試料Ｙと第２エネ
ルギ受容体は両方共光学導波管の表面に固定（即ち不動
化）されているため、分析の間、２つのエネルギ受容体
間の距離を非常に短くすることができ、従ってその両エ
ネルギ受容体間でのエネルギの移動を効果的に行わせる
ことができる。また、第２エネルギ受容体の導波管表面
への不動化は比較的簡単な、上手く確立された実験に基
づく技法により達成することができ、こわれ易い（例え
ば「熱に敏感」な）分子を第２エネルギ受容体として使
用することも可能である。

また本発明の他の側面によれば、前記第２エネルギ受
容体は、光学導波管の表面に前記試料Ｙを介して固定し
てもよく、この場合には、試料Ｘ及びＹの特定の結合
（サンドイッチ分析の場合には試料配位子を介して）
と、導波管の表面に対する試料Ｘの不特定の結合とを識
別できる利点もあり、エネルギの移動は２つのエネルギ
受容体がきわめて接近している時に最も効果があること
から、斯かる構成によれば、特定的に結合された試料Ｘ
に向けてより強くウエイトをかけられた信号が発せられ
る。

更に本発明の他の側面によれば、前記（Ａ）の工程に
おいて、前記要素（ａ）〜（ｄ）と共に次の（ｅ）の要
素、即ち「前記第１或いは第２受容体と同じ或いは異な
り、光学導波管の表面上或いは内部に直接或いは間接的
に固定された少なくとも１つの別のエネルギ受容体」を
同時に、或いは所望の順序で温置してもよく、また前記
検知（Ｃ）の工程において、前記共鳴エネルギの移動の
程度或いはその確率またはその両方を検知してもよい。

ここで用いられる「配位子アナログ」という用語は分
析下での配位下と同じ特定の結合パートナの同じ結合位
置と複合できる種類を意味し、特に、分析中の配位子の
公知となっている分量はその範囲内に含まれる。

ここで用いられている「エネルギ受容体」という用語
は例えば染料或いは発螢光団等の電子エネルギを吸収で
きる化合物を示す。典型的なエネルギ受容体としては例
えば、コマリン、フルオレセイン、ルシファーイエロ
ー、ローダミン科、フィコビリプロテイン及びエドプシ
ンが含まれ、またエネルギ受容体の特定の例としてはフ
ルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミンＢ、ロ
ーダミン6G、ローダミン123、Ｒ−フルオレセイン、Ｃ
−フィコシアニン、アロフィコシアニン、フルオレンス
カミン（fluorescamine）、ルシファーイエローVS及び
ルシファーイエローCHが含まれる。上述のように、第１
及び第２エネルギ受容体の一方は、供与体発螢光団であ
る。また他方は受容体発螢光団或いは受容体染料であっ
ても良い。適切な波長の電磁放射による供与体発螢光団
の励起及び試料Ｘ及びＹ間の直接或いは間接的な複合体
がエネルギ受容体間の直接或いは間接的な共鳴エネルギ
の移動を促進するように、エネルギ受容体は選択され
る。従って、第１及び第２エネルギ受容体がそれぞれ供
与体発螢光団と受容体染料或いは受容体染料と供与体発
螢光団を有するとき、供与体発螢光団の螢光は消光し、
また第１及び第２エネルギ受容体がそれぞれ供与体発螢
光団と受容体発螢光団、或いは受容体発螢光団と供与体
発螢光団を有する時、供与体発螢光団は消光し、受容体
発螢光団は螢光する（しかし、受容体発螢光団の螢光に
は非常に低い効果しかない）。

例示することだけを目的として、本発明における供与
体発螢光団及び受容体発螢光団として用いるのに適した
一対の代表的な化合物を下の表１に列挙する。

〔表1.〕 供与体発螢光団 対応する受容体発螢光団フルオレセイン イソチオシアネ-ト ローダミンＢ Ｒ−フィコエリトリン アロフィコシアニン フルオレセイン イソチオシアネ-ト Ｒ−フィコエリトリン ローダミンＢ アロフィコシアニン フルオレスカミン ルシファーイエローVS Ｃ−フィコシアニン Ｒ−フィコエリトリン 少なくとも１つの新たなエネルギ受容体が構成要素
（ｅ）として存在すれば、２つ以上の共鳴エネルギ移動
工程が生じるかも知れない。従って、例えば第１エネル
ギ受容体が受容体染料であり、第２エネルギ受容体が供
与体発螢光団であり、そして受容体発螢光団が化合物
（ｅ）として存在すれば、試料Ｘ及びＹ間の複合体の形
成は供与体発螢光団及び受容体染料間の共鳴エネルギ移
動を促進して、受容体染料は構成要素（ｅ）として存在
する供与体発螢光団及び受容体発螢光団の両方から放射
される螢光を消光する。

第１及び第２エネルギ受容体間或いはその逆で、共鳴
エネルギ移動が生じているかどうかを検知することで、
供与体発螢光団の螢光及び／或いはもしあれば受容体発
螢光団の螢光が消光するかまたはその両方を検知するこ
とが可能であろう。１つ或いはそれ以上の新たなエネル
ギ受容体が化合物（ｅ）として存在すれば、１つ或いは
それ以上の化合物の消光或いは螢光、またはその両方が
検知されるかも知れない。従って、例えば第１エネルギ
受容体が受容体染料であり、第２エネルギ受容体が供与
体発螢光団であり、また受容体発螢光団が化合物（ｅ）
として存在すれば、供与体或いは受容体発螢光団または
その両方の螢光の消光が検知できるであろう。

試料Ｘ及びＹの一方が配位子アナログを有し、また他
方が配位子に対して特定の結合パートナを有していれ
ば、試料Ｘ及びＹ間の複合体形成は直接起こる。代わり
に、試料Ｘ及びＹの両方が配位子に対して特定の結合パ
ートナを有していれば、試料Ｘ及びＹ間の複合物形成は
配位子（サンプル内にある場合）を介して間接的に起こ
る。

試料Ｙは光学導波管の表面に直接的にでもまた間接的
にでも固定できることを理解されたい。例えば、試料Ｙ
が抗体であれば、、間接的な固定はそれ自体が光学導波
管の表面に結合された試料Ｙに対する抗種類抗体により
達成される。

このように光学導波管の表面への固定は抗体−抗原或
いは抗体−パプチン内の免疫学的結合、或いは蛋白質及
び配位子間、例えばアビディン及びビチオン間等の非免
疫学的結合により生じる。

光学的導波管に適した材料として例えばガラス（例え
ばパルブロック（permabloc）ガラス或いはクラウンガ
ラス）、合成樹脂（例えばアクリル或いはポリスチレ
ン）、シリカ及び石英が挙げられるが、原則として少な
くとも分析に含まれる波長の放射を透き通す適切な屈折
率の材料を使用して良い。

放射工程（Ｂ）及び検知工程（Ｃ）の両方共消失性フ
ィールド結合を用いるのが好ましい。

共鳴エネルギ移動及び消失性結合の２つの技術を組合
せることにより幾つかの利点が得られる。

1.消失性波の指数の減少を伴う共鳴移動の距離に依存す
るインバースシックススパワー（inverse sixth powe
r）の渦巻きが導波管に近い励磁範囲の局部化を抑制す
る。

2.励起する電磁放射及び放射された光間のストークス・
シフトの頻度は供与体発螢光団またもしあれば受容体発
螢光団を適切に選択することにより増加し、これにより
信号を更に効果的に濾過する。

3.信号対雑音比は向上する。受容対発螢光団が存在する
と、導波管の表面に受容体を固定することにより供与体
の背景に直面する受容体発螢光団信号の測定が促進され
る。移動通路の数は導波管上或いは内に新たな供与体或
いは受容体を固定することにより増やすことができる。

4.ストークス・シフトは別の発螢光団の種類を協働固定
してより長い波長で放出することで更に増やすことがで
き、これにより移動工程のチェーンが生じる。このよう
な移動工程のチェーン及び移動通路の数の増加は従来の
均質分析には効果的に組込むことはできない。

5.固定された発螢光団を適切に配列すれば、発螢光団の
チェーンに沿った移動は更に効果的なものになろう。そ
のような配列は発螢光団の固定と組合せた液体水晶及び
ラングムイアーブロジェット（Langmuir−Blodett）膜
の沈殿物により達成される。

上述した光学導波管は「導波管センサー」という名称
の、本願と同じ出願日を有する同時係属出願（EP−Ａ−
0363467）に記載されているような格子状の配列に選択
的に盛り込んでも良い。上記移動技術にかかる格子状配
列を組合せて用いることにより導波管センサ装置自体の
内に放出されて励起している放射の分離及び濾過を行う
ことができ、外部のモノクロメータ或いは濾過機が不要
となる。

欧州特願公開第171148号公報に記載され請求されてい
る型の装置は分析される試験サンプルを本発明の方法に
持ち込むのに優れているかも知れない。

放出された放射は例えば１つ或いはそれ以上の光電子
増倍管等の従来の手段により検知される前に、望むので
あれば濾過或いは視準またはその両方を行っても良い。

本発明の別の側面によれば、上記試料Ｘ（ｉ）と；表
面に上記試料Ｙが直接或いは間接的に固定されると共
に、上部に少なくとももう１つの上記エネルギ受容体が
直接或いは間接的に固定された導波管（ii）と；よりな
る、上記分析方法を実施するためのキットが提供され
る。この場合、前記もう１つのエネルギ受容体は試料Ｙ
を介して前記光学導波管の上部に固定してもよい。

配位子としての抗原について、試料Ｘ及びＹのそれぞ
れが抗体、即ち、サンドイッチ型免疫分析よりなるとい
う状況で本発明を以下に詳述する。しかし、本発明は例
えば試料Ｘ及びＹの一方が抗体よりなり、他方が配位子
アナログよりなるコンペティション型の免疫分析にも適
用できる。

更に、本発明は抗体或いは抗原の分析に限定されるも
のではない。本発明の方法により分析できる配位子の例
は、各ケースごとにおける適切な特定の結合パートナの
表示と共に下の第２表に示されている。

〔表2.〕 配位子 特定の結合パートナ 抗原 特定の抗体 抗体 抗原 ホルモン ホルモン受容体 ホルモン受容体 ホルモン ポリヌクレオチド 補足ポリヌクレオチド ストライド ストライド アビディン ビオチン ビオチン アビディン プロテインＡ 免疫グロブリン 免疫グロブリン プロテインＡ 酵素 酵素共同因子（基質） 或いは反応抑制剤 酵素共同因子（基質） 酵素 或いは反応抑制剤 レクチン 特定の炭水化物 レクチンの特定の レクチン 炭水化物 本発明方法には非常に広く応用性があるが、特に、ペ
プチドホルモン（例えば甲状腺刺激ホルモン（TSH）、
黄体形成ホルモン（LH）、人体絨毛膜生殖腺刺激ホルモ
ン（hCG）、小胞刺激ホルモン（FSH）、インシュリン及
びプロラクチェン）を含むホルモン、或いはノンペブチ
ドホルモン（例えばコーチソン、エストラジオール、プ
ロゲステロン及びテストステロン、或いは甲状腺ホルモ
ンチロキシン（T4）及びトリイオドチロニン（triiodot
hyronine）等の甲状腺ホルモン）、プロテイン（例えば
癌胎児抗原（CEA）及びアルファフェトプロティン（alp
hafetoprotein）（AFP））、薬剤（例えばジゴキシ
ン）、糖、毒素、ビタミン、インフルエンザ等のウィル
ス、パラインフルエンザ、アデノ、肝炎、呼吸器官の及
びエイズウィルス或いは微生物を分析するのに使用でき
る。

ここで用いられている試料としての「抗体」という用
語はその範囲に以下の点を含むものと理解されたい； （ａ） 例えば羊、うさぎ、やぎ或いはねずみ等の従来
から使用されている動物から得られる例えばIgG、LgM等
の免疫グロブリンの種々のクラス或いはサブクラスの全
て、 （ｂ） モノクロナル抗体 （ｃ） 抗体の完全な微粒子或いは「断片」、モノクロ
ナル或いはポリクロナル（polyclonal）、前記断片とは
抗体の結合領域、即ちFc部（例えばFab、Fab′、Ｆ（a
b′）_２のない断片、或いは完全な抗体内の重量チェー
ンの構成要素を連結するディスルフィデボンズ（disulp
hide bonds）の減少した分裂により得られるいわゆる
「半−微粒子」断片を有するものである。抗体の断片の
作成方法は本技術分野で良く知られているのでここでは
説明しない。

ここで使用されている「抗原」という用語は永久的な
抗原種類（例えばプロテイン、バクテリア、バクテリア
断片、細胞、細胞断片及びウィルス）、及び適切な条件
下で抗原にされるハプチンの両方を含むものと理解され
たい。

本発明をより理解するために、添付図面を参照された
い。第１〜10図は本発明による種々の分析形式を示し、
第11図は本発明方法を実行するのに適した装置の構成を
示している。

図示されている実施例において、フォースター（Fors
ter）のエネルギ移動は励起された「供与体」発螢光団
（Ｄ）から「受容体」発螢光団（Ａ）に向って行われ
る。供与体発螢光団は分析複合体が固定されている導波
管内に案内される光の消失性フィールドにより励起され
るか或いは導波管の上または下からの光により直接励起
される。

螢光の放出は供与体発螢光団及び受容体発螢光団の両
方またはどちら一方により集められる。螢光放出は導波
管モードに結合されるか、または（供与体発螢光団が光
の消失性フィールドにより励起された時）検出前に導波
管を横切って移動される。

第１図は上に試料Ｙとしての抗体４が固定された光学
導波管の表面２を示しており、該抗体は受容体発螢光団
とラベル付けされている。供与体発螢光団（Ｄ）とラベ
ル付けされている第２抗体６は試料Ｘとして存在する。

分析の間、サンプル中の抗原（即ち、配位子）はＡと
ラベル付けされた抗体４及びＤとラベル付けされた抗体
６の両方の結合位置に結合され、これにより「サンドイ
ッチ複合体」を形成する。供与体発螢光団は付随的な放
射の吸収により電子的に励起される。そしてフォースタ
ーエネルギ移動10は供与体発螢光団Ｄ及び受容体発螢光
団Ａ間で生じ、これにより受容体発螢光団が電子的に励
起され、供与体発螢光団は不活性されてその螢光能力を
失う。分析の間、両発螢光団のいずれかまたは両方から
の螢光を測定しても良い。

第２図に示される本発明の別の実施例において、固定
された試料Ｙは抗体のFab残片12である。かかる断片を
使用することで供与体及び受容体発螢光団間の距離が短
縮され、従ってエネルギ移動がより効果的になる。

この実施例では、受容体発螢光団14は光学導波管の表
面に固定される。

第３図は第１図に示されている状態の逆を示してい
る。固定された抗体22（試料Ｙ）は供与体発螢光団
（Ｄ）とラベル付けされ、試料Ｘは受容体発螢光団
（Ａ）とラベル付けされた第２抗体24よりなる。

受容体発螢光団の螢光の分量収率が非常に低い場合、
螢光受容体からの放出のゼロ強さからの増加を検出する
ものも供与体発螢光団の放出の消失を検出するのが好ま
しい。受容体染料は受容体発螢光団の制限されたケース
を提供するのでその螢光分量収率は無視できる程低い。

第４図は受容体発螢光団（Ａ）及びそれと同じ種類に
ラベル付けされた抗体34が固定された導波管の表面を示
している。この構成は、供与体及び受容体間の距離を短
縮すること及び移動通路の数を増やすことにより供与体
発螢光団（Ｄ）からのエネルギ移動の効率を高める。

第５図は、第４図に示されている受容体発螢光団とラ
ベル付けされた固定された抗体40及び固定された受容体
発螢光団に加え、重合体層42も導波管の表面に固定され
ている。この重合体層も受容体発螢光団とラベル付けし
ても良く、またこれは供与体及び受容体発螢光団間の平
均的な距離を短縮する役目を果たす。重合体を適切に選
択すれば導波管の表面に対する抗体46とラベル付けされ
た供与体発螢光団の非特定結合を減少する。かかる非特
定結合は望ましくない雑音信号を発生する。

代わりに、第６図に示されるように受容体発螢光団を
導波管の表面内に吸収し、固定（即ち不動化）された抗
体をラベル付けするのに使用しても良い。これは上部導
波管インターフェースを通る移動行為の螢光放出の損失
を回避する。

第７図は供与体及び受容体発螢光団の位置が逆になっ
ている点を除き第４図と同様の実施例を示している。

第８図は受容体発螢光団を加えると共にそれらを整列
させる固定された分子マトリックスを示している。これ
は視準及び検出機構により集められた効果を向上させる
ために受容体発螢光団の側面の角度を変える役目を果た
す。供与体及び受容体の効果的な励起は第９図に示され
るように整列される。

第10図に示される本発明の更に別の実施例では、例え
ば染料（A2）を螢光しないエネルギ受容体とラベル付け
された抗体52の結合は供与体発螢光団（Ｄ）から受容体
発螢光団（A1）へのエネルギ移動を減少させる。これは
A1の消滅とエネルギ移動工程により導入された改良され
たストークスシフトとを組合せる。

第４〜10図に示される各実施例は、重合体の上或いは
整列マトリックス内の導波管の表面での２つ以上の供与
体或いは受容体種類を共同固定することにより、励起及
び放出波長間の向上したストークスシフトが達成され
る。整列マトリックス自体が螢光体であっても良い。一
つの螢光体種類から他の螢光体種類へ連続して移動する
ことにより高揚される。

第11図は本発明による分析を実行するのに適した実験
用の装置を示す。分析に適した波長の放射が光源62から
発生され、従来の機構のレンズにより視準した後、前記
放射はストリット63及びフィルタ64を通過する。そこで
生じた放射ビーム65はチョッパ66により接断され、その
後ビームスリッタ67により細長く切り開かれ、ビームの
反射された部分（レフェレンスビーム）は中性濃度フィ
ルタ69を介して光電子増倍管68内に入り、ビームの移動
した部分は半同筒状のプリズム70を介して透明で指標が
合致した液体或いは接着剤によりプリズムに固着された
導波管71に入る。この例では、サンプル液は例えば毛細
管充填装置（例えば欧州特願公開第171148号公報を参照
されたい）に見られるような、導波管71及び上部板72間
の毛細管の穴の中に流れる。プリズム70からの光は２つ
以上の適切なフィルタ74を通過した後２つ以上の光電子
増倍管73により検出される。光電子増倍管68,73及びチ
ョッパ66はロックインアンプ75により統合されている。
光電子増倍管からの信号は所望する通り処理及び出力し
ても良い。

限定しない以下の例は本発明を説明するものである。

例１ 人間の絨毛膜ゴナドトロピン（hCG）の分析 この分析では、螢光によりラベル付けされた抗体はア
ナライト（analyte）配位子（hCG）と、螢光とラベル付
けされ導波管に連結された第２抗体とのサンドイッチ複
合体の形成結果として結合体となる。

初期材料の調整 （ｉ）アビディンにより被覆した導波管の製造 10×20×1.1mmのガラス導波管は標準的なガラススク
ライビング技術を用いてパーマブロックガラス（Pilkin
gton Glass Ltd.,Helens.英国）から切り離された。ガ
ラスは洗剤及び超音波振動によって完全に洗浄された
後、シラン（８％３−グリシドキシプロピルトリメトキ
シシラン）（Fluka,Glissop,英国））と共にpH3.5で２
時間活性化された。その後ガラスは洗浄され、標準的な
技術を用いてアビディンをガラスの表面に結合（例えば
イシクラ外によるJournal of Immunoassay 4,209−237
（1983）を参照されたい）するために適切なクロス−リ
ンキング薬剤（例えば、SMCC、コハクアミディル（succ
inindy14−（Ｎ−マレイミドメチル（Maleimidomethy
l）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Pierce,Lu
ton,英国）或いはグルタミルアルデヒド）が使用され
た。その後ガラススライドは10％のサッカローズ溶液と
0.1％のカゼインで回転被覆され、使用するまで４℃の
乾燥状態で保管された。

（ii）ビオチン/R−フィコエリトリン／抗hCG抗体の調
整 モノクロナル抗hCG抗体はNature256,495−497（197
5）のMilstein及びKohlerの方法によりねずみの腹水か
ら得られた。個々の腫細胞の輪郭は抗原決定基を区別す
るために抗体を生み出すものを識別すべく仕切られた。
hCGに対する最も高い類似性を有する抗体は分析に使用
するために選択された。1.48mgのＲ−フィコエリトリン
は標準的な方法（Guesdon et al,J Histo chem.Cytoche
m27.1131（1979）を参照されたい）を有して0.34mgのＮ
−ヒドロキシ−サクシニミド（Succinimido）ビオチン
エステル（Sigma,Poole,英国）と混ぜられた。そこで得
られたフィコエリトリンとビオチンの結合体はpH0.9の
ソジウム重炭酸塩バファ0.2Mを使ったPharmacia PD10コ
ラムを用いて浄化された。抗体Ａは２−イミノチオレン
（iminothiolane）により活性化され、そしてフィコエ
リトリンとビオチンとの結合体を同量混ぜられ、４℃で
一晩置かれた。前記結合体はNaCl（0.1M）、MgCl₂（10
^-3M）、ZnCl₂（10^-3M）及び１％のNAN₃を含むトリエタ
ノールアミンバファ（0.1M,pH7.3）と溶離されたTSK300
0SWGコラム上で浄化され、最も高い分子の高さの部分が
集められる。

（iii）アロフィコチアニン（allophycocyanin）／抗体
hCG抗体の調整 抗体Ｂ（異なる抗原の決定基に対して特定の、hCGに
対する第２モノクロナル抗体）はStryer et alによる米
国特許4,542,104（1985）に略述べられている方法の後
にアロフィコチアンと結合された。

（iv）hCG標準溶液の調節 最初の国際参照標本（75−537）に対して基準化され
たhCGのフリーズドライ標本はBiodata SpA.Milanイタリ
アから得られた。このサンプルは馬の血清（Serono Dia
gnostics,Woking,英国）の中で所望の濃度に薄められ
た。

光学的測定装置 本発明による分析を行うに適した光学装置は添付の第
11図に示される。光源62は150Wのキセノンアークランプ
であり、励起フイルタ64は485nm（60nmのバンド幅）の
中心波長を有し、検出フィルタは580nm（70nmのバンド
幅）の中心波長を有する。これらのフィルタはＲ−フィ
コエリトリンが関係する分析に適している。アロフィコ
チアニンのためのロングパスコレクタは645nmのカット
オンを有している。

Hakuto to R 928光学電子増倍管（Hakuto,Waltham Cr
oss米国）はフォトディテクタ68,73として使用され、ま
たEG及びG5207（PAR,Precton米国）ロックイン増幅器75
が使用される。ガラス導波管71はサンプルが毛細運動に
より導波管の表面にわたって流れるように充分に小さな
寸法の細胞に取付けても良い。

分析処理 上記初期材料及び装置を使用したサンドイッチ分析を
以下のように行う； アビディンにより被覆された導波管はビオチン/R−フ
ィコエリトリン／抗hCG抗体の溶液に共に温置される。
供与体発螢光団とラベル付けされた抗体Ａはアビディン
及びビオチンの相互の高い親和力の結果として導波管の
表面に固定される。導波管はその後分析中の抗原（hC
G）及び決まった量のアロフィコチアニン（受容体発螢
光団）とラベル付けされた抗体Ｂを含むサンプルと温置
される。導波管は供与体発螢光団を励起するのに適した
波長、即ち、Ｒ−フィコエリトリン用の485nmぐらいの
放射により照らされる。この照明は平衡が達成された
後、或いは平衡が達成される過程のいずれかで行われ
る。供与体発螢光団から放射される光の強さはＲ−フィ
コエリトリン用の580nmぐらいで測定される。サンドイ
ッチ複合体を形成した結果、580nmの螢光強さはhCGの集
中機能として減少する。ゼロ或いはhCGの公知の量を含
む最終的なサンプル溶液と比較して目盛り付けが行われ
る。

上述のように、コンペティション型の分析も本発明方
法により実行できる。それらの場合の処理は同様であ
る。

hCGのコンペティション分析 供与体発螢光団（Ｒ−フィコエリトリン）とラベル付
けされた抗体は上述した方法によりアビディン及びビオ
チンの相互作用を用いて導波管の表面に固定される。受
容体発螢光団（アルフィコチアニン）はhCG分子と結合
される。導波管はその後hCG及び決められた公知の量の
アルフィコチアニンとhCGとの結合体を含む液体サンプ
ルと共に温置される。供与体発螢光団は適切な波長の光
を与えることにより励起され、供与体発螢光団の螢光の
衰弱が測定される。供与体発螢光団による螢光はサンプ
ル中のhCGの量を減らすことで減少する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アシュワァース，ロバート ヘドル イギリス エヌ ダブリュ ３ １ エ ヌ ティー ロンドン ハムステッド ダウンシャー ヒル 18 (56)参考文献 特開 昭62−49244（ＪＰ，Ａ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（Ａ）以下の要素（ａ）〜（ｄ）を同時
   に、或いは所望の順序で温置する工程と； （ａ） サンプル； （ｂ） 第１エネルギ受容体にラベル付けされた試料X; （ｃ） 光学導波管の表面に直接或いは間接的に固定さ
   れた試料Y; （ｄ） 前記光学導波管の表面に直接或いは間接的に固
   定された第２エネルギ受容体； 前記試料Ｘ及びＹの一方が前記サンプルにおける配位子
   に対して特定の結合パートナを有し、また他方の配位子
   アナログ或いは配位子の特定の結合パートナを有し、前
   記第１及び第２エネルギ受容体の一方は、他方の電子放
   出スペクトルと重複した電子発光スペクトルの供与体発
   螢光団を有し、 （Ｂ）前記供与体発螢光団を励起するのに適した波長の
   電子放射をもって前記光学導波管を放射する工程と、 （Ｃ）前記第１及び第２エネルギ受容体間或いは第２及
   び第１エネルギ受容体間のそれぞれで共鳴エネルギの移
   動が直接或いは間接的に起こるのかどうかを検知する工
   程とより成り、 前記放射工程（Ｂ）は導波管に沿った電磁放射伝播によ
   り生じる消失性フィールドによるものであり、及び／或
   いは検知工程（Ｃ）は前記第１エネルギ受容体の螢光或
   いはもしあれば第２エネルギ受容体の螢光の導波管と結
   合する消失性フィールドを利用してなる、サンプルにお
   ける配位子の分析方法。
2. 【請求項２】前記第２エネルギ受容体は、光学導波管の
   表面に前記試料Ｙを介して固定されてなる、サンプルに
   おける配位子の分析方法。
3. 【請求項３】前記（Ａ）の工程において、前記要素
   （ａ）〜（ｄ）と共に次の（ｅ）の要素、即ち「前記第
   １或いは第２受容体と同じ或いは異なり、光学導波管の
   表面上或いは内部に直接或いは間接的に固定された少な
   くとも１つの別のエネルギ受容体」を同時に、或いは所
   望の順序で温置してなる、サンプルにおける配位子の分
   析方法。
4. 【請求項４】前記検知（Ｃ）の工程において、前記共鳴
   エネルギの移動の程度或いはその確率またはその両方を
   検知してなる、サンプルにおける配位子の分析方法。
5. 【請求項５】前記第１エネルギ受容体は供与体発螢光団
   よりなり、前記第２エネルギ受容体は受容体染料或いは
   受容体発螢光団よりなる、請求項〜の何れかに記載
   の方法。
6. 【請求項６】前記第１エネルギ受容体は受容体染料或い
   は受容体発螢光団よりなり、前記第２エネルギ受容体は
   供与体発螢光団よりなる、請求項〜の何れかに記載
   の方法。
7. 【請求項７】受容体発螢光団が前記要素（ｅ）として存
   在してなる、請求項に記載の方法。
8. 【請求項８】前記放射工程（Ｂ）は光学的導波管に沿っ
   て伝播する電磁放射と共同した消失性フィールドを利用
   してなる、請求項〜の何れかに記載の方法。
9. 【請求項９】前記エネルギ受容体の１つは受容体発螢光
   団よりなり、前記検知工程（Ｃ）は前記受容体発螢光団
   により前記導波管に放出される螢光と結合する消失性フ
   ィールドを利用してなる、請求項〜の何れかに記載
   の方法。
10. 【請求項１０】前記エネルギ発螢光団はフィコビリプロ
    テイン、コマリン、フルオレセイン、ローダミン、ルシ
    ファーイエロー、エリトロシンまたはそれらの誘導体よ
    りなるグループから選択される、請求項〜の何れか
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記光学導波管はガラス或いはシリカ製
    である、請求項又はに記載の方法。
12. 【請求項１２】第１エネルギ受容体とラベル付けされた
    試料Ｘ（ｉ）と、表面に試料Ｙが直接或いは間接的に固
    定されると共に、上部に少なくとももう１つのエネルギ
    受容体が直接或いは間接的に固定された光学導波管（i
    i）とよりなり、 前記試料X,Y及び前記エネルギ受容体は請求項又は
    に限定されているものである、請求項又はに記載の
    方法に使用するためのキット。
13. 【請求項１３】前記もう１つのエネルギ受容体が試料Ｙ
    を介して前記光学導波管の上部に固定されてなる、請求
    項に記載のキット。