JP2525958B2 - 化学的試験方法において使用する装置 - Google Patents

化学的試験方法において使用する装置

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、化学的、生化学的または臨床的試験方法に
おいて使用する装置、それらの製造方法、および該装置
の使用方法に関する。
より詳しくは、本発明は、中でもイムノアッセイが重
要なグループを構成している特異的結合アッセイにおけ
る使用に適する装置に関する。
少量の試験試料の処理および測定のための様々な分析
装置が従来技術において記載されている。特に、EP-A-1
71148は、好都合に製造することができ且つ非常に少量
の液体試料を使った特異的結合アッセイに適当であるキ
ャピラリー充填セル装置を記載している。それらの装置
は、各々が毛管作用により試料液をキャビティ中に吸込
むことができる程十分に小さい寸法を有する1または複
数のキャビティを有し、ここで前記キャビティの表面
は、該装置中で実施される試験に適当な固定化試薬を担
持しており、そして前記表面は、光透過性導波管として
働くように改造され且つキャビティの壁を形成している
透明固体プレートの表面であり、前記プレートは、実質
上光学的に平滑であり(「光学縁」)そして該プレート
の水平面に対して例えば或る横断角で横断するが最も好
ましくは垂直である縁(エッジ)を有する。そのような
装置は、便利な試料の捕集および前記固定化試薬と試料
との反応生成物のその場での光学分析を可能にする。導
波プレートは、使用することになっている波長の輻射
線、例えば赤外、可視および/または紫外光に対して透
過性であるべきであり、そしてEP-A-171148に記載の装
置を使った1つの方法は、アッセイ方法およびアッセイ
しようとする試料に依存して異なるであろう程度に蛍光
物質が固定化試薬に結合するように準備し、次いで生成
した結合した蛍光物質の光学測定を行うものである。
EP-A-171148は、アッセイの幾つかの形式が、試薬含
有導波管表面の反対側のキャピラリーキャビティの壁が
光吸収性、不透明または反射性材料から作られているの
が適切であり得る可能性、即ち装置が第1図に描写され
下記に詳細に記載される構造を有する可能性を開示して
いる。
分析物溶液中の蛍光団と導波管表面に結合した蛍光団
から生じる蛍光の角度分布の相違は当業界において公知
である。理想条件下では、導波管の縁から出てくる蛍光
の角度識別は、他の発光シグナルを区別するのに十分で
あろう。しかしながら、実際には、装置中の様々な欠陥
が、溶液中の蛍光団からの蛍光を散乱させ、そして通常
はエバネッセント結合した蛍光に関係づけられる角度に
おいて光学縁から、即ち表面結合した蛍光団から出現さ
せ得る。
本発明者らは、驚くべきことに、試薬を有する導波管
表面と反対側のキャピラリーセルの壁はアッセイに関与
する波長の輻射線に対して透明な材料から形成されてい
るが、前記透明材料の1もしくは複数の外側表面、好ま
しくは少なくとも導波管に平行な表面に、不透明または
光吸収性材料の層が適用されるならば、第1図に描写さ
れた構造を含むEP-A-171148に記載の構造物を上回る有
意に改善された性能によって、この問題が解決できるこ
とを見出した。「不透明層」なる用語は、以後、そのよ
うな不透明または光吸収性材料の層を意味するのに用い
られる。
本発明の1つの観点によれば、特異的反応性試料捕集
および試験装置が提供され、該装置は、毛管作用により
試料液をキャビティ中に吸込むことができる程十分に小
さい寸法を有する1または複数のキャビティを有し、前
記1または複数のキャビティの1表面は、該装置中で実
施される試験に適当な固定化試薬を担持しており、前記
表面は、光透過性導波管として働くように改造された第
一の透明固体プレートの表面であり、前記プレートは、
実質上光学的に平滑であり且つ該プレートの平面に対し
て横断する縁を有し、前記装置は、前記導波管と反対側
の1または複数のキャビティの壁が第二の透明プレート
を含んで成ることを特徴とし、前記第二の透明プレート
が上記キャビティと反対側の且つ上記固定化試薬担持表
面と平行な外側表面上に光吸収性または不透明材料を担
持している。
上述した様に、第一の透明固体プレートは、該プレー
トの水平面に対して横断する縁を有する。前記縁は、任
意の横断角であることができるが、最も好ましくは垂直
である。
ある態様では、本発明は、試料液中に存在する分析物
の蛍光イムノアッセイまたは発光イムノアッセイに使用
される装置も提供する。該装置は、試験しようとする試
料液の一定量を捕集および保持するための平面キャピラ
リーセルを含んで成り、前記キャピラリーセルは、一方
の端にキャピラリーキャビティ中への試料液の進入を可
能にする第一の開口および他方の端には試料液で満たさ
れるにつれてキャピラリーキャビティからの空気の排出
を可能にする第二の開口を有するキャピラリーキャビテ
ィを限定している、向かい合わせに固定された内側表面
を提供するように、間に空隙を有する一緒に固定されそ
して2つの対辺に沿ってシールされた一対の平らで平行
な2枚のプレートを含んで成る。ここで、前記プレート
の一方は、導波管の水平面に対して横断し且つシールさ
れた辺に対して垂直である光学的に平滑な縁を有する光
透過性導波管であり、前記導波管は、使用中キャピラリ
ーキャビティ内部に捕集された試料液と接触するよう
に、内側表面の少なくとも一部分に、標識リガンドを直
接的または間接的に結合することのできる固定化試薬を
結合しており、前記固定化試薬と前記標識リガンドは、
該装置中で実施することになっている分析物についての
試験に適するものであり、標識リガンドは、使用時に捕
集された試料液と接触しそして試料液中に遊離されるよ
うに、前記装置内部に遊離できるように保持される。そ
して他方のプレートは、上記キャビティと反対側の且つ
上記固定化試薬結合表面と平行な外側表面上に、光吸収
性または不透明材料を担持している。
便宜上、光吸収性または不透明材料を担持している第
二の透明プレートの表面を、本明細書中では、前記プレ
ートの外側表面と称し、該プレートの反対表面を内側表
面と称する。
或る状況下では、前記外側表面に加えて、キャピラリ
ーキャビティ壁の内側表面の一部分のみ、即ち第二の透
明プレートの内側表面の一部分のみが、光吸収性または
不透明材料を担持しているならば、有利であり得ること
を本発明者らは発見した。
従って、本発明の更なる観点によれば、特異的反応性
試料捕集および試験装置を提供し、該装置は、毛管作用
により試料液をキャビティ中に吸込むことができる程十
分に小さい寸法を有する1または複数のキャビティを有
し、前記1または複数のキャビティの1表面は、該装置
中で実施される試験に適当な固定化試薬を担持してお
り、前記表面は、光透過性導波管として働くように改造
された第一の透明固定プレートの表面であり、前記プレ
ートは、実質上光学的に平滑であり且つ該プレートの平
面に対して横断する縁を有し、前記装置は、前記導波管
と反対側の1または複数のキャビティの壁が第二の透明
プレートを含んで成り、前記第二の透明プレートがその
外側表面上に光吸収性または不透明材料の層を担持して
おり、そして内側表面の一部分のみの上にも光吸収性ま
たは不透明材料の層を担持していることを特徴とする。
本発明の装置は、EP-A-171148に記載のものと大体同
じであるが該装置の適当な表面に光吸収性または不透明
層を適用する追加の特徴を有する方法により製造するこ
とができる。
本発明によれば、上述の特異的反応性試料捕集および
試験装置の製造方法が提供され、該方法は次の段階を含
んで成る。
(a)多数の該装置の部分を提供するであろうシート材
料の表面上に固定化された特異的反応性コーティングを
形成せしめ、 (b)前記コーティングされたシート材料と一緒になっ
て多数の装置の各々に、特異的反応性コーティングと接
触した時に毛管現象により一定容量の試料液を捕集およ
び保持するための毛管寸法のキャビティを提供する追加
の構造物の1または複数の表面上に光吸収性または不透
明層を形成せしめ、そして (c)各々が1または複数の試料捕集および試験装置を
提供する部分にシート材料を分割する。
この方法では、特異的反応性コーティングと外側の不
透明層が両方とも連続であるか、または或るパターン、
例えば不連続部分のパターンに、例えば二次元配列のパ
ッチとして、分割することができる。そのようなパッチ
が形成される場合、まず連続コーティングを形成せしめ
次いでその一部分を除去して所望のパターン、例えば不
連続部分の配列を残すことによるか、またはパッチの配
列(例えば、スクリーン印刷したもの)として、それら
を作製することができる。キャビティ壁の内側表面の一
部分が不透明層を担持すべき場合、製造中に適用される
適切な不透明層は、もちろん不連続層として適用される
だろう。
特異的反応性コーティングは、直接的または間接的の
いずれかでキャビティの表面上に固定化され得る。例え
ば、特異的反応性コーティングが抗体である時、それ自
体前記表面に結合している抗−種抗体を用いて間接固定
化を行うことができる。あるいは、抗体をビオチンと接
合せしめ、そして前記表面上に予め固定化されたアビジ
ンと複合体形成せしめることにより、固定化を行うこと
ができる。直接固定化は、適当な試薬(例えばアミノプ
ロピルトリメトキシシランのようなシラン化試薬)での
処理により前記表面を活性化させることによって行うこ
とができ、適当な架橋剤(例えばグルタルアルデヒド)
を使ってそれに抗体を共有結合させることができる。
従来技術の装置に関して既に述べたように、液体試料
中のリガンドについてのアッセイにおいて本発明の装置
を用いる1つの方法は、アッセイやアッセイされる試料
物質に応じて異なるであろう程度に蛍光物質が固定化試
薬に結合するように準備し、次いで生成した結合した蛍
光物質の光学測定を実施することである。
適当な蛍光物質は、典型的には、蛍光団で標識された
リガンド類似体またはアッセイ中に蛍光団で標識される
リガンド特異的結合相手のいずれかである、補助試薬を
含んで成る。アッセイを実施する時、試料を装置に導入
する前に、蛍光物質を既知量において液体試料中に導入
することができる。あるいは、例えば可溶性保湿剤コー
ティングを用いて、可溶性の遊離可能な形で装置内の表
面上に蛍光物質を予め固定化することができる。後者の
場合、装置中への試料液への導入が可溶性保湿剤コーテ
ィングを溶解し、それによって補助試薬が試料液中に分
散されるようになる。
或る態様において、本発明は、次の段階を含んで成る
上記方法を提供する: (a)装置中で実施される試験に適当な試薬を、光透過
性導波管として働くことができ且つ多数の装置の部分を
提供することができる透明なフラットシート材料の表面
上の一部に固定化し; (b)追加の構造物の1表面上に光吸収性または不透明
層を形成せしめ; (c)段階(b)の前または後に、多数の装置の各装置
に、2つの反対側に沿ってシールされ且つその内側表面
の少なくとも一部分上に固定化試薬を含有するキャピラ
リーキャビティを提供するように、間隙をあけて平行関
係において前記シート材料に前記追加の構造物を取り付
け、ここで前記キャピラリーキャビティは、前記固定化
試薬と接触すると毛管作用により一定容量の試料液を捕
集および保持するように改造されており;そして (d)組立てたシートを部分に分割し、各部分は、各装
置の透明シート材料がシートの平面に対して横断し且つ
シールされた側面に対して垂直である少なくとも1つの
光学的に平滑な縁を有するような、1または複数の試料
捕集および保持装置を提供する。
本明細書中で使用する「リガンド類似体」という用語
は、アッセイ中のリガンドと同じ特異的結合相手の同一
結合部位と複合体形成することができる種を言い、そし
て特に、アッセイ中の既知量のリガンドが範囲内に含ま
れる。
上記で定義した不透明層の適当な材料は、例えば、所
望により熱もしくは赤外線照射により硬化され得る黒色
塗料、シリコーン塗料、顔料、または適当な光学的およ
び他の物理的性質を有する他の任意の(好ましくは不活
性の)材料である。そのような材料は、少なくともアッ
セイに関与する波長において、光を減衰または吸収すべ
きである。材料の不透明層の厚さは、典型的に最小で3
ミクロンであろう。
本発明は蛍光に関して特定的に記載されるが、同様な
考察を燐光および発光に応用できることは理解されるで
あろう。
本発明のより良い理解のために、添付図面について言
及する。
第1図は、EP-A-171148において提案されたキャピラ
リー充填装置の変形の断面図である。
第2図〜第6図は、本発明の様々な態様に従ったキャ
ピラリー充填装置の断面図である。
第7図は、第5図において断面として示された本発明
のキャピラリー充填装置の平面図である。
第8図は、第2図の装置における溶液蛍光の減衰を概
略的に示す。
第9図は、第3図の装置における溶液蛍光の減衰を概
略的に示す。
第10図は、本発明に従ってアッセイを実施するのに適
当な簡易装置を概略的に示す。
第1図について説明する。描写された装置は、上層の
透明(例えばプラスチック、シリカまたはガラス)プレ
ート1と下層の透明プレート2を含んで成り、両プレー
トは、適当な接着剤の接着跡(図示せず)により1mm未
満離れた実質上平行関係において一緒に固定された厚さ
ほぼ1mmのプレートである。そのようにして形成された
セルキャビティ3は両端が外側に開かれており、そのた
め毛管作用によって一方の口に試料が吸込まれる時、他
方の口から空気が排出できる。この装置の下層プレート
2はプレート1よりも大きく、装置から遠方に伸びる区
画4を有する。使用時、プレート2の区画4は、1滴の
試料液を上に適用することができる滞留性プラットホー
ムとして働き、そのためこの液体は毛管作用によりセル
キャビティ3を満たすことができる。
キャピラリーセルの内側表面上に固定化されているの
は、装置を使用する予定の試験に関連した材料の層5で
ある。第1図では、層5はプレート2上に担持された材
料のパッチである。イムノアッセイの場合、層5は、例
えば関連の固定化抗体であることができる。重層または
隣接関係のいずれかにおいて、1より多くの層5が存在
してもよい。
セルの内側表面上の平面1上に担持されているのは、
光吸収性または不透明材料の層6であり、この材料は、
装置を使用する予定の試験の性質および使用する予定の
光の波長に適当なものである。
第2図は、本発明の態様に従ったキャピラリーセル装
置の線断面図を示す。この装置は、第1図に関連づける
と上層の透明プレート7と下層の透明プレート8を含ん
で成る。プレート8の表面上に反応層9が存在する。プ
レート7はその外側表面上に不透明層10を担持してい
る。
第3図は、本発明の別の態様に従ったキャピラリーセ
ル装置の線断面図を示す。プレート11と12は第1図およ
び第2図と同じ関係で存在し;反応性層13が上記と同様
に配置され得る。この態様では、プレート11は外側表面
上に不透明層14を担持しており、そしてその反対表面
(即ちセルキャビティの内側表面)の一部分のみに類似
または同一材料の層15を担持している。
第4図は、本発明の更なる態様に従ったキャピラリー
セル装置の線断面図を示す。第2図に示した態様と同様
に、上層プレート17の外側表面上に不透明層16が配置さ
れる。しかしながら、第4図に示される態様では、上層
と下層のプレート17と18は、各プレートが第1図に示し
た区画4と同様に滞留性プラットホームとして働くこと
ができるように片寄らせてある。
第5図は、本発明の別の態様に従ったキャピラリーセ
ル装置の線断面図を示す。同じく、上層プレート22の外
側表面上に不透明層21が配置される。しかしながら、こ
の場合では、上層と下層のプレートの末端が滞留性プラ
ットホームとならないように整列される。
第6図は、本発明の別の態様に従ってキャピラリーセ
ル装置の線断面図を示す。この態様は第2図に示したも
のの変形であり、上層の透明プレート24の内側表面上に
適当な蛍光物質を含む可溶性保湿剤材料の装置23を追加
の特徴として有する。
第7図は、第5図に示した装置の平面図を示す。不透
明層25は中央領域として示される。上層プレートと下層
プレートは、毛管寸法(例えば100ミクロン)の空隙を
作るために適当な直径のガラスバロチーニを含んだ適当
な接着剤の接着跡26と27により、所望の関係の位置に保
持される。
第8図は、第2図に記載の本発明の装置において溶液
中の蛍光団から生じた蛍光の典型的光線および表面結合
した蛍光団から生じた蛍光の典型的光線をたどった進路
を概略的に示す。試料/ガラス界面における屈折は、溶
液蛍光団から出る光線の幾つかの進路を、界面に対する
臨界角よりも小さい界面における法線に対する角度(試
料溶液/ガラス界面については、それらの角度は典型的
には法線に対して0°〜60°の範囲にあるだろう)で上
層プレート35中に伝える。それらの光線は、不透明層37
との相互作用で減衰できる。下層ガラスプレート36の表
面上に固定された試薬に結合している蛍光分子(即ちエ
バネッセント領域内)は、エバネッセント波結合の結果
として、全範囲の角度(即ち試料と下層ガラスプレート
との界面における臨界角よりも大きい法線に対する角度
を含む)に渡り下層プレート36中に光を放射する。それ
らの光線の幾つかは、下層を通って「進行」し、不透明
層37と相互作用することなく末端38から出てくるだろ
う。従って、表面結合した蛍光団から生じる蛍光と溶液
蛍光団から生じる蛍光との識別が著しく高められる。
第9図は、第3図の装置における溶液蛍光団から生じ
た蛍光光線の進路を概略的に示す。この状況下では、溶
液蛍光から生じた光線の幾つかは、不透明層39において
減衰を受けるだけでなく、部分屈折の結果として更に不
透明層40等において減衰を受ける。層39と40の両方と相
互作用する光線は端41から出てくることができず、よっ
て層40の使用は、表面結合した蛍光団から生じる蛍光と
溶液蛍光団からのものと更に優れた識別をもたらし得る
ので、感度を増加させ得る。
第10図は、本発明と関連して用いるのに適当な簡単な
蛍光測定装置を略図形態において示す。種々の部品の特
定例を比較例Aにおいて後述する。
適当な光源51からの光は、レンズ52により大まかに集
束された後、アッセイに関与する蛍光団を励起させるの
に用いる波長の範囲を限定するフィルタースタック53を
通過する。別のレンズ54が、装置55を通して試験装置56
の所望の領域上にこの光を集束させる。
試験装置56の適当な縁から出た光(「発光」)は、装
置57次いで1または複数のレンズ58を通過する。更なる
装置59を用いて発光をモニタリングする角度範囲を限定
する。更なるフィルター60を用いて或る波長の光(例え
ば励起波長の光)を除去し、別のレンズ61が残りの発光
を光検出器上に集束させる。
本発明は、また、本発明の装置を使って試料中のリガ
ンドについてアッセイする方法を提供し、該方法は、 (a)導波管の表面と接触している試料をインキュベー
トし、ここで前記導波管は前記装置の一部分であり、直
接的または間接的のいずれかにおいてその上に吸着され
ているかまたはそれに結合されている固定化試薬は、イ
ンキュベーション中に補助試薬(蛍光団で標識されたリ
ガンド類似体または蛍光団で標識された別の特異的結合
相手のいずれかである)が直接的または間接的に前記導
波管の表面に結合するようになるような、検出を所望す
るリガンドに対する特異的結合相手であり; (b)試料液体中に存在する補助試薬と導波管に結合し
た補助試薬が励起されるような適当な光源からの光で前
記装置を照射し;そして (c)補助試薬が複合体形成により前記導波管に結合し
たかどうかを、および所望であればその程度を測定する
ために、前記導波管から出てくる輻射線をモニタリング
する、 ことを含んで成る。
本発明のアッセイ方法において、第二の透明プレート
がその外側表面と内側表面の一部分のみとの両方に光吸
収性または不透明材料を担持している態様の装置を用い
る時、光吸収性または不透明材料を担持していない前記
第二プレートの内側表面の部分は、光源からの光で照射
される第一プレートの領域と反対側にある部分であろ
う。
本発明の方法は、特に抗原または抗体のアッセイ、即
ちイムノアッセイに適用することができ、本発明の好ま
しい態様においては、リガンドが抗原であり、そして特
異的結合相手が前記抗原に対する抗体を含んで成る。し
かしながら、本発明は抗体と抗原のアッセイに限定され
ると解釈してはならない。本発明の方法によりアッセイ
することができるリガンドの例を、各場合において適当
な特異的結合相手の表示と一緒に下の第1表に示す。
本発明の方法は非常に広範な利用可能性を有するが、
特に次のものをアッセイするのに用いることができる:
ホルモン、例えばペプチドホルモン〔例えば甲状腺刺激
ホルモン(TSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン(hCG)、濾胞刺激ホルモン(FS
H)、インスリンおよびプロラクチン〕もしくは非ペプ
チドホルモン〔例えばステロイドホルモン、例えばコル
チゾール、エストラジオール、プロゲステロンおよびテ
ストラステロン、または甲状腺ホルモン、例えばチロキ
シン(T4)およびトリヨードチロニン〕、タンパク質
〔例えばガン胎児性抗原(CEA)およびアルファフェト
プロテイン(AFP)〕、薬剤(例えばジゴキシン)、
糖、毒素、ビタミン、タンパク質、ウイルス、例えばイ
ンフルエンザウイルス、パラ−インフルエンザウイル
ス、アデノウイルス、肝炎ウイルス、呼吸ウイルスおよ
びAIDSウイルス、または微生物。
本明細書中で使用する「抗体」なる用語は、その範囲
内に次のものを包含すると解釈されるだろう: (a)常用される任意の動物、例えばヒツジ、ウサギ、
ヤギまたはマウス由来の免疫グロブリンの様々なクラス
またはサブクラスのいずれか、例えばIgG,IgA,IgMまた
はIgE; (b)モノクローナル抗体; (c)モノクローナルまたはポリクローナル抗体の完全
分子または「断片」;ここで断片は、抗体の結合領域を
含むもの、即ちFc部分を欠く断片(例えばFab,Fab′,F
(ab′)2)または完全抗体中の重鎖を結合しているジ
スルフィド結合の還元的開裂により得られたいわゆる
「半分子」断片である。
抗体断片の調製方法は当業界で周知であり、従って本
明細書中には記載しない。
本明細書中で使用する「抗原」なる用語は、永久的に
抗原性の種(例えばタンパク質、細菌、細菌断片、細
胞、細胞断片およびウイルス)および適当な条件下で抗
原性になり得るハプテンの両方を包含すると解釈される
だろう。
本発明のアッセイ方法において使用できる蛍光団の例
としては、フルオレセインイソチオシアネート(FIT
C)、ローダミンイソチオシアネート、ルシフェリンイ
エロー、2,4−ジニトロフルオロベンゼン、フェニルイ
ソチオシアネートおよびダンシルクロリド、XRITC,TRIT
Cおよびフィコビリタンパク質(例えばアロフィコシア
ニンおよびフィコエリトリン)が挙げられる。
本発明は更に、上記のような本発明のアッセイ方法に
おける使用に適当な装置を提供する。この装置は、使用
中、輻射線が結合した蛍光団と遊離の蛍光団の両方を励
起させるような角度において上記の本発明の装置に入る
ように配置することができる輻射線源、および出てきた
輻射線をモニタリングするための手段を含んで成る。更
なる態様においては、該装置はマスクを経て照明され、
それによって結合反応が起こる装置の有効容量を限定す
ることができる。有効容量は、装置の下層プレートと上
層プレートとの間の距離と照明帯の面積との積である。
比較例A 不透明層を有さないセルを使って実施したヒト絨毛性性
腺刺激ホルモン(hCG)についての光学イムノアッセイ 出発材料の調製 (i)抗体でコーティングされた導波管の製作 1mmの厚さを有する一枚のPermablocガラス(Pilkingt
on Glass Ltd.,St Helens,UK)を、超純水中の洗剤(例
えばTween 20)を使って超音波振動により洗浄した。こ
れをアミノプロピルトリエトキシシランの2%水溶液中
で3〜4のpHにおいて25℃で2時間インキュベートする
ことにより、ガラスの表面を活性化した。水中ですすい
だ後、ガラス板を115℃で4時間以上乾燥させた。次い
でこのガラスを0.05Mリン酸緩衝液(pH7)中の2.5%グ
ルタルアルデヒド溶液中で60分間インキュベートし、次
いで蒸留水で徹底的に洗浄した。このガラスをリン酸緩
衝液中のhCGに対するモノクローナル抗体の1%溶液中
で2〜4時間インキュベートした。次に緩衝液でガラス
板を洗浄した。既知のやり方で6M尿素溶液を浸透させる
ことにより、望ましくない吸着タンパク質を除去した。
(ii)試験装置の製作 段階(i)から得られた導波管基板上に、キャピラリ
ーセル装置の長さ方向の縁を決めるパターンにおいて、
直径100ミクロンのガラス微小球(Jencons Ltd.,UK)を
含む紫外線硬化接着剤(UVS 91,Norland Inc.,USA)の
接着跡をスクリーン印刷することにより、EP-A-171148
中に記載されたような試験装置を製作した。次いで一枚
の透明なPermablocガラス板を導波管基板上に置き、こ
の積層板に減圧を適用した。減圧の結果、上板のガラス
が接着剤上に押しつけられ、ガラス微小球がガラス板の
間に100ミクロンの隙間を限定するようにした。次いで
接着剤を硬化させるために、この積層板を紫外線光源に
暴露した。最後に、標準的なガラス罫書および破断法を
使って、積層板を個々の試験装置に作り上げた。
(iii)フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に
接合した抗−hCG抗体の調製 FITC(Sigma Chemical Company Ltd.,UK)200mgと異
なる抗原決定基に特異的なhCGに対する第二モノクロー
ナル抗体5mgを、炭化水素ナトリウム緩衝液(pH9.0)1.
4ml中で一緒に混合した。この混合物を室温で18時間放
置しておくと、その間にモノクローナル抗体へのFITCの
接合が起こった。次いで超精密Sephadex G-50上でのゲ
ル濾過により、混合物を精製した。
(iv)hCG標準液の調製 一次国際標準調製物(75/537)に対して検量されたhC
Gの凍結乾燥調製物をBiodata SpA,Milan,Italyから入手
した。この試料をウマ血清(Serono Diagnostics Ltd.,
Working,UK)中に希釈し、必要とする範囲のhCG標準液
を得た。
(v)hCGアッセイの測定に使用する装置 第10図は、適当なアッセイ測定を行うのに使った簡易
蛍光測定装置を示す。キセノンフラッシュランプ51(He
inmann)からの光は、FITC標準抗体を励起させるのに用
いる波長域を限定するフィルタースタック53を通過する
前にレンズ52により集束される。フィルタースタック
は、3つのフィルター:BG7 Schottガラスフィルター(E
aling Electro Optics UK Ltd.,Watford,UK)、450-480
nm FITC通過幅妨害フィルター(Optometrics Ltd.,UK)
および475nm短波通過妨害フィルター(Comar Instrumen
ts Ltd.,Cambridge,UK)を有する。第二レンズ54は、照
明領域および試験セルの活性容量を限定する窓55を通し
て試験セル56の活性表面上に励起光を集束させる。
試験セルの光学縁から出た光は、溶液から直接出た光
が検出光学素子に入るのを防ぐ窓57を通過する。レンズ
系58は発光を集束し、そして窓59は発光が測定される角
度範囲を限定する。これは、エバネッセント結合した蛍
光発光に関連づけられる角度と一致するように選択され
た。Schott OG515 515nmコロイド状ガラス長波通過フィ
ルター60(Ealing Electro Optics UK Ltd.,Watford,U
K)はいずれかの分散した励起光を除去し、そして第二
のレンズ61は光電子増倍管検出器62(Hamamatsu R931A,
Hakuto UK Ltd.,)上に発光を集束させる。
hCGについてのアッセイ手順 αhCG-FITC接合体をhCG標準液の各々に添加して約0.5
mlの試験溶液を得た。接合体濃度は1μg/mlであった。
8つの試験セルを選び、その各々を異なる試験溶液で満
たした。20℃の湿潤環境中での20分間のインキュベーシ
ョン後、セルを読んだ。こうして作成した標準曲線は、
不透明層を有さないセル装置について第11図に示され
る。「溶液蛍光団」からのバックグラウンドシグナルは
高く、乏しいシグナル対バックグラウンド比を与え、乏
しいアッセイ感度を生ずる。
比較例B 装置の内側表面に不透明層を有するセル(第1図参照)
中で実施したhCGについての光学イムノアッセイ 出発材料の調製 (i)抗体でコーティングされた導波管の調製 比較例Aを参照のこと。
(ii)試験セルの製作 Permablocガラスを洗剤と超音波振動を使って洗浄し
た。ガラスを乾燥した後、黒インクを使って表面上に所
望のパターンの不透明層をスクリーン印刷した。印刷さ
れた不透明材料を熱硬化させた後、積層前に不透明材料
が必ず装置の内側にくるように注意しながら、このガラ
ス板を比較例Aの未処理のPermablocガラス板の代わり
に使った。残りの試験セル製作工程は比較例Aに記載し
たものと同じであった。第1図に描写されるような試験
セルを得られた。
(iii)FITCに接合した抗−hCGの調製 比較例Aと同じ。
(iv)hCG標準液の調製 比較例Aと同じ。
(v)アッセイの測定に使用する装置 比較例Aと同じ。
hCGについてのアッセイ手順 用いたアッセイ手順は比較例Aに記載のものと同じで
あるが、ただし4つのセルを各々のhCG試験溶液で処理
した。
第12図において、この例の結果を比較例Aからの結果
と比較する。不透明層の存在は、バックグラウンドシグ
ナルをかなり減少させた。結果として、1000mIU/mlのhC
Gについてシグナル対バックグラウンド比が1.2:1から3:
1に改善され、従ってアッセイ感度が改善された。
実施例1 装置の外側に不透明層を有するセル(第2図参照)中で
実施したhCGについての光学イムノアッセイ 出発材料の調製 (i)抗体でコーティングされた導波管の製作 比較例Aと同じ。
(ii)試験セルの製作 試験セルの製作方法は比較例Bと同様であった。ただ
し、必ず不透明層を製作工程中セルの外側に維持するよ
うに注意を払った。第2図に図示される試験セルが得ら
れた。
(iii)FITCに接合した抗−hCGの調製 比較例Aと同じ。
(iv)hCG標準液の調製 比較例Aと同じ。
(v)アッセイの測定に使用する装置 比較例Aと同じ。
hCGについてのアッセイ手順 比較例Bと同じ。第13図はこの例からの結果と比較例
Bのものとを示す。各々のセルタイプについての標準曲
線は同等である。しかしながら、セルの外側に不透明層
を用いると、アッセイ精度が増加する(内側不透明層に
ついての標準曲線の精度は8.0%であるのに比べて、外
側不透明層のものは4.6%であり、従ってこの精度の増
加によりアッセイ性能の増加が達成される)。これは、
セル空隙の均一性および調査される試料容量がガラス表
面により限定され不透明層の印刷の質により限定される
のではないために起こる。
実施例2 第3図のように配置された不透明層を有するセル中で実
施したhCGについての光学イムノアッセイ 出発材料の調製 (i)抗体でコーティングされた導波管の製作 比較例Aと同じ。
(ii)試験セルの製作 比較例Bに記載の方法に従って一枚のPermablocガラ
ス上に全パターンの不透明材料を印刷しそして硬化させ
た。この後、ガラスを裏返し、最初の印刷に合わせて反
対側に第二の全パターンを印刷した。硬化後、適当な溶
剤を使って第二印刷の半分を取り除き、同じ幅であるが
半分の長さを有するパターンを残した。超音波振動によ
る洗剤中での洗浄後、比較例Bに記載したようにしてガ
ラス積層板を調製した。範囲の小さい方の印刷が必ずセ
ルの内側にくるように注意した。接着剤を硬化させた
後、常法により試験セルを分割した。第3図に概略的に
示される試験セルが得られた。
(iii)FITCに接合した抗−hCGの調製 比較例Aと同じ。
(iv)hCG標準液の調製 比較例Aと同じ。
(v)アッセイの測定に使用する装置 比較例Aと同じ。
hCGについてのアッセイ手順 比較例Bと同じ。第14図は、この実施例の結果と比較
例Bのものを示す。同様に標準曲線は同等であるけれど
も、比較例Bからのセルに比べてバックグラウンドシグ
ナルのわずかな減少(1.0から0.9に)が認められる。あ
るセル幾何学、例えばより短い試験セルについては、望
ましくない「溶液シグナル」を除去することにおけるこ
の配置の有効性がより大きいため、アッセイ性能に有意
な効果を与えることができた。
実施例3 様々な長さの外側不透明層を有するセル中で実施したhC
Gについての光学イムノアッセイ 出発材料の調製 (i)抗体でコーティングされた導波管の製作 比較例Aと同じ。
(ii)試験セルの製作 実施例1と同じ。
(iii)FITCに接合した抗−hCGの調製 比較例Aと同じ。
(iv)試験溶液の調製 この実施例については、ウマ血清中1μg/mlの接合体
の試験溶液を使った。
(v)アッセイの測定に使用する装置 比較例Aと同じ。
hCGについてのアッセイ手順 セルにゼロhCG標準試験溶液を満たし、読みを行っ
た。外科用メスを使って不透明縁末端から1mm長さを減
らし、そして第二の読みを行った。不透明材料が全く残
らなくなるまでこの操作を繰り返した。
第15図において、不透明層の長さの関数として典型的
応答を示す。不透明層の長さは、照明帯の後ろから光学
縁の方向において不透明層の前縁までの距離として定義
される。結果は、光学縁の末端の照明領域の縁から測っ
て約15mmの長さを使ったセル幾何学が、溶液シグナルを
効果的に除去するのに十分であり、バックグラウンドシ
グナルを最小にし、従って装置の感度を増加させる(即
ちシグナル対バックグラウンド比を改善する)ことを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スミス,アラン マルティン イギリス国,チェシャー ダブリュエー 15 9エイチキュー,アルトリンチャ ン,ヘイル,ヘイル ロード 129 (56)参考文献 特表 昭61−502420(JP,A)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】特異的反応性試料の捕集および試験装置で
    あって、その装置が毛管作用により試料液をその内に吸
    い込むことができる程十分に小さい寸法を有する1また
    は複数のキャビティを有し、その1または複数のキャビ
    ティの1表面がその装置中で実施される試験に適当な固
    定化試薬を担持しており、その表面が光透過性導波管と
    して働くように改造された第一透明固体プレートの表面
    であり、そのプレートが、実質上光学的に平滑であり且
    つそのプレートの上記の平らな表面に対して横断する縁
    (エッジ)を有し、上記導波管と反対側の、上記1また
    は複数のキャビティの壁が第二透明プレートの一部であ
    り、その第二透明プレートが、上記キャビティと反対側
    の且つ上記の固定化試薬担持表面と平行な外側表面上に
    光吸収性または不透明材料の層を担持していることを特
    徴とする装置。
  2. 【請求項2】第二透明プレートが、キャビティに近い方
    の内側表面の一部分のみの上にも光吸収性または不透明
    材料の層を担持している、請求項1に記載の装置。
  3. 【請求項3】1または複数のキャビティの1表面が、可
    溶性の遊離可能な形態で、その装置中で実施される試験
    に適当な蛍光補助試薬を担持している、請求項1または
    請求項2に記載の装置。
  4. 【請求項4】補助試薬が、試験しようとするリガンドに
    対する蛍光団標識特異的結合相手であるかまたは蛍光団
    標識リガンド類似体である、請求項3に記載の装置。
  5. 【請求項5】試料液中に存在する被分析物の蛍光イムノ
    アッセイまたは発光イムノアッセイに使用される装置で
    あって、その装置がテストしようとする試料液の一定量
    を捕集および保持するための平面キャピラリーセルを含
    んで成り、そのキャピラリーセルが一方の端にキャピラ
    リーキャビティ内への試料液の進入を可能にする第一の
    開口および他方の端に試料液で満たされるにつれてその
    キャピラリーキャビティからの空気の排出を可能にする
    第二の開口を有するキャピラリーキャビティを限定する
    向かい合わせに固定された内側表面を提供するように、
    一緒に固定されそして2つの向い合う側に沿ってシール
    された一対の平らで平行な間に空隙を有する2枚のプレ
    ートを含んで成り、ここで、その一のプレートが導波管
    の水平面に対して横断し且つシールされた辺に対して垂
    直である光学的に平滑なエッジを有する光透過性導波管
    であり、その導波管が使用中にキャピラリーキャビティ
    内部に捕集された試料液と接触するようにその内側表面
    の少なくとも一部分に標識リガンドを直接的または間接
    的に結合することのできる固定化試薬を結合しており、
    その固定化試薬とその標識リガンドがこの装置内で実施
    することになっている分析物についての試験に適するも
    のであり、その標識リガンドが使用中に捕集された試料
    液と接触しそしてその試料液中に放出されるようにこの
    装置内部に遊離できるように保持されており、そして他
    のプレートが、上記キャビティと反対側の、且つ、上記
    固定化試薬結合表面と平行な外側表面上に、光吸収性ま
    たは不透明材料を担持している、請求項1に記載の装
    置。
  6. 【請求項6】以下の段階: (a)多数の装置の部分を提供することができる透明な
    シート材料の表面上に固定化特異的反応性コーティング
    を形成せしめ; (b)透明な追加の構造物の1表面上に光吸収性または
    不透明層を形成せしめ; (c)段階(b)の前または後に、上記多数の装置の各
    々に、上記特異的反応性コーティングと接触した時に一
    定量の試料液を毛管作用により捕集および保持するため
    の毛管寸法のキャビティを提供するように、そして光吸
    収性または不透明層がキャビティと反対側になるよう
    に、上記シート材料を上記追加の構造物に取り付け;そ
    して (d)1または複数の試料捕集および試験装置を提供す
    る各々の部分にシート材料を分割する、 を含んで成る、請求項1〜5のいずれか1項に記載の特
    異的反応性試料捕集および試験装置の製造方法。
  7. 【請求項7】以下の段階: (a)装置内で実施される試験に適当な試薬を、光透過
    性導波管として働くことができ且つ多数の装置の部分を
    提供することができる透明なフラットシート材料の表面
    上の一部に固定化し; (b)追加の構造物の1表面上に光吸収性または不透明
    層を形成せしめ; (c)段階(b)の前または後に、多数の装置の各装置
    に、2つの向い合う側に沿ってシールされ且つその内側
    表面の少なくとも一部分上に固定化試薬を含有するキャ
    ピラリーキャビティを提供するように、間隙をあけて平
    行関係において上記シート材料に上記追加の構造物を取
    り付け、ここでそのキャピラリーキャビティが、上記固
    定化試薬と接触すると毛管作用により一定容量の試料液
    を捕集および保持するように改造されており;そして (d)組立てたシートを部分に分割し、各部分が各装置
    の透明シート材料がシートの平面に対して横断し且つシ
    ールされた側に対して垂直である少なくとも1つの光学
    的に平滑な縁(エッジ)を有するような、1または複数
    の試料捕集および保持装置を提供する、 を含んで成る、請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項8】段階(b)が段階(c)の前に行われ、そ
    して追加の構造物の向かい合う両表面上に光吸収性また
    は不透明層を形成することを含んで成る、請求項6また
    は請求項7に記載の方法。
  9. 【請求項9】(a)装置の一部分である導波管の表面と
    接触している試料をインキュベートし、直接的または間
    接的にその上に吸着されているかまたはそれに結合され
    ている固定化試薬が、インキュベーション中に請求項4
    に記載の補助試薬が直接的または間接的にその導波管の
    表面に結合するようになるような検出を要求するリガン
    ドに対する特異的結合相手であり; (b)試料液体中に存在する補助試薬と導波管に結合し
    た補助試薬が励起されるような適当な光源からの光でそ
    の装置を照射し;そして (c)補助試薬が複合体形成によりその導波管に結合し
    たかどうかを、そして所望によりその程度を測定するた
    めに、その導波管から出てくる輻射線をモニタリングす
    る、 ことを含んで成る、請求項1〜5のいずれか1項に記載
    の装置を使用する試料中のリガンドについての検定法。
  10. 【請求項10】リガンドが抗原であり、そして1または
    複数の特異的結合相手がその抗原に対する抗体を含んで
    成る、請求項9に記載の検定法。
  11. 【請求項11】請求項9または請求項10に記載の検定法
    において使用される、請求項1〜5のいずれか1項に記
    載の装置を含んで成る機器であって、使用中、試料液体
    中に存在する補助試薬と導波管に結合した補助試薬の両
    方を励起させるような角度においてその装置に入るよう
    に配置することができる輻射線源、およびその装置から
    出てきた輻射線をモニタリングするための手段を含んで
    成る機器。
  12. 【請求項12】使用中、検定が行われる装置の有効容量
    を限定する照明マスクを更に含んで成る、請求項11に記
    載の機器。
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