ES2245947T3 - Procedimiento para determinar sustancias mediante el metodo de campo evanescente. - Google Patents
Procedimiento para determinar sustancias mediante el metodo de campo evanescente.Info
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Abstract
Procedimiento para determinar sustancias, que comprende las etapas de: - preparar una superficie que comprende al menos un correactivo R1 unido a la superficie, - poner en contacto la superficie con una disolución que comprende al menos la sustancia que va a determinarse, un compuesto que contiene al menos un fluoróforo y al menos un colorante, en el que se forma un complejo en el correactivo R1 en la superficie y en el que dicho complejo junto con el correactivo R1 comprende al menos la sustancia que va a determinarse y el compuesto que contiene al menos un fluoróforo, y - estimular el fluoróforo unido a la superficie mediante el campo evanescente de una fuente de luz y medir la fluorescencia producida, caracterizado porque el colorante absorbe en el intervalo de absorción y emisión del fluoróforo.
Description
Procedimiento para determinar sustancias mediante
el método de campo evanescente.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para determinar sustancias basándose en el método de
campo evanescente y a una disolución y a un kit para el uso en el
procedimiento según la invención. La presente invención puede
utilizarse especialmente en el diagnóstico y el análisis.
El diagnóstico médico, especialmente el
diagnóstico inmunológico, se basa en gran medida en el ELISA (ensayo
con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas). Se puede
encontrar una nueva visión general de los inmunoensayos en Hage,
Anal. Chem. 71 (1999), 294R-304R. Un ensayo ELISA
sirve para determinar la concentración de antígenos o anticuerpos.
La sustancia que va a investigarse (por ejemplo, un antígeno) se
pone en contacto, en primer lugar, con un soporte sólido, al que
previamente se acopló un correactivo específico para la sustancia
que va a investigarse (por ejemplo, un anticuerpo). Mediante la
unión de la sustancia que va a investigarse al correactivo acoplado
al soporte se concentra la sustancia que va a investigarse en el
soporte sólido. A continuación, un segundo correactivo (por ejemplo,
otro anticuerpo) para la sustancia que va a investigarse se pone en
contacto con el soporte, de modo que este correactivo está marcado
con una enzima, que permite una detección colorimétrica. Mediante la
reacción de este segundo correactivo con la sustancia que va a
investigarse, acoplada a la superficie del soporte, aparece un
producto coloreado, que puede evaluarse ópticamente. Como fase
sólida se utilizan en este caso al menos placas de plástico
habituales, frecuentemente de poliestireno, con 96 pocillos
("wells"). La superficie de los pocillos de plástico une
proteínas mediante adsorción en el intervalo de nanogramos, lo que
es una cantidad suficiente para detecciones inmunológicas. Para la
marcación del segundo correactivo, que en la mayoría de los casos es
una inmunoglobulina, con una enzima, existe una serie de
posibilidades. Las marcaciones habituales son peroxidasa o fosfatasa
alcalina.
Los ensayos ELISA muestran muy buenos resultados
en cuanto a la sensibilidad y la especificidad, los límites de
detección alcanzables se encuentran en el intervalo de los
nanogramos o por debajo. Existen las formas de realización de
ensayos más diferentes posibles que se basan en este principio. En
este sentido, se detectan antígenos o anticuerpos dependiendo del
planteamiento.
Sin embargo, una desventaja esencial del ELISA es
la realización de la prueba, ya que deben añadirse sucesivamente
diferentes reactivos a los pocillos y eliminarse de nuevo. En total,
pueden ser necesarias diez o más etapas de pipeteo, lavado e
incubación. En consecuencia, los ensayos ELISA son costosos y lentos
y deben llevarse a cabo con mucho cuidado por personal especialmente
formado. Otra desventaja de los ensayos ELISA es el tiempo necesario
para un ensayo o prueba debido a la suma de las etapas de incubación
y lavado, que normalmente dura entre una y varias horas.
Mediante el método de campo evanescente puede
observarse directamente la interacción de, por ejemplo, biomoléculas
sobre una superficie. En este sentido, se mide la interacción de los
reactivos en disolución con una superficie de matriz sólida. Se
puede medir físicamente sin retrase en el tiempo (en "tiempo
real") la unión del ligando como resonancia de plasmones
superficiales ("Surface Plasmon Resonance"). Las ventajas con
respecto a un ensayo ELISA son la eliminación de etapas de pipeteo
adicionales tras la adición de los reactivos y la eliminación de las
etapas de espera.
En el documento
US-A-4451434 se describe un
procedimiento en el que se observa directamente mediante el método
de campo evanescente la interacción de biomoléculas sobre la
superficie. Especialmente, en esta memoria de patente se utiliza una
disolución con un colorante que absorbe en el intervalo de absorción
de la luz de estimulación utilizada y del fluoróforo utilizado.
La luz dispersada por la configuración no
perfecta de las superficies de la cubeta en el volumen de la cubeta
puede absorberse por el colorante al menos parcialmente.
Sin embargo, la dispersión no ideal del haz de
luz ocasiona problemas, incluso aunque se tomen medidas físicas para
la reducción de la luz dispersada. Debido a la dispersión, la luz
llega también al volumen de la cubeta y origina allí una
fluorescencia de fondo. Por "volumen" se entiende según la
invención el líquido que se encuentra fuera del campo de
evanescencia, que contiene compuestos que contienen fluoróforo no
unido. Además, tanto en cubetas de plástico como de vidrio puede
orientarse la polarización del haz de luz. Esto ocasiona
especialmente reflejos de la luz de estimulación por el
desacoplamiento. Aparece la denominada luz errante, que junto con el
volumen y los efectos de dispersión superficiales pueden ocasionar
una estimulación del volumen.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
se basa en preparar un procedimiento para determinar sustancias,
especialmente sustancias biológicamente activas, mediante el cual
puede evitarse una estimulación del fluoróforo que se encuentra en
el volumen.
Este objetivo se alcanza mediante los objetos
caracterizados en las reivindicaciones.
Especialmente, se prepara un procedimiento según
la reivindicación 1 para la determinación de sustancias, que
comprende las etapas
- preparar una superficie que comprende al menos
un correactivo R^{1} para un correactivo R^{2} unido a la
superficie,
- poner en contacto la superficie con una
disolución que comprende al menos la sustancia que va a
determinarse, al menos un compuesto que contiene fluoróforo y al
menos un colorante,
en el que se forma un complejo en el correactivo
R^{1} en la superficie por medio del reactivo R^{2} y en el que
este complejo junto con el correactivo R^{1} comprende al menos la
sustancia que va a determinarse y el compuesto que contiene al menos
un fluoróforo, y
- estimular el fluoróforo unido a la superficie
mediante el campo evanescente de una fuente de luz y medir la
fluorescencia producida,
caracterizado porque el colorante absorbe en el
intervalo de absorción y emisión del fluoróforo.
Las figuras muestran:
La figura 1 es una representación esquemática de
una forma de realización del procedimiento según la invención.
La figura 2 muestra una representación
esquemática de otra forma de realización del procedimiento según la
invención.
La figura 3 muestra el transcurso de la
intensidad de una radiación electromagnética dentro de una
disolución colorante según la ley de
Lambert-Beer.
La figura 4 muestra en una representación doble
logarítmica el transcurso de la intensidad en función de la
profundidad de penetración de una onda evanescente y de una onda
suavizada por la absorción según la ley de
Lambert-Beer.
La figura 5 muestra los espectros de absorción de
una serie de colorantes.
La figura 6 muestra la determinación de la
concentración óptima de un colorante para su uso de acuerdo con el
procedimiento según la invención.
La figura 7 muestra una cinética de reacción de
la adición de una proteína al correactivo R^{1} unido a la
superficie, medida mediante el procedimiento según la invención.
La figura 8 muestra una medición comparativa con
respecto a la cinética de reacción según la figura 7, que se midió
como en la figura 7. Sin embargo, en este ejemplo comparativo, la
superficie no estaba recubierta con un correactivo R^{1} para la
proteína.
Según la invención, en primer lugar se prepara
una superficie que comprende al menos un correactivo R^{1} unido o
inmovilizado. En este sentido, unido significa preferiblemente que
el correactivo R^{1} se adhiere por adsorción a la superficie
(adsorción directa). Sin embargo, el correactivo R^{1} también
puede estar unido a la superficie por un elemento puente, por
ejemplo una proteína, como un anticuerpo o un antígeno. Además, el
correactivo R^{1} también estar unido a la superficie por un
enlace covalente. Esto puede realizarse, por ejemplo, en el caso de
una superficie de acrilato mediante reacción con una carbodiimida.
"Unido" significa, en el sentido de la invención, la adherencia
de un correactivo o un compuesto a una superficie o a otro
correactivo y/o compuesto, y comprende interacciones tanto
covalentes como no covalentes, como por ejemplo interacciones
debidas a interacciones iónicas, polares o apolares.
El correactivo R^{1} puede aplicarse sobre la
superficie mediante un procedimiento habitual. Por ejemplo, la
superficie puede recubrirse (coated) con una proteína que sirve como
correactivo R^{1}. El correactivo R^{1} puede estar unido a la
superficie preferiblemente de forma adsortiva o por unión covalente.
A continuación de esta operación, la superficie se trata
preferiblemente con una disolución adicional, mediante la cual se
bloquean o se bloquearán los sitios de la superficie no adheridos
con el correactivo R^{1}, por ejemplo mediante otra proteína, que
esencialmente no reacciona con los componentes contenidos en la
disolución con que se va a poner en contacto. La superficie anterior
es, por ejemplo, un lado interior de un recipiente cóncavo, como una
cubeta o un pocillo (well) de una placa de microtitulación.
Según la invención, el correactivo R^{1} unido
a la superficie puede formar sobre la superficie mediante un
correactivo R^{2} un complejo, comprendiendo este complejo junto
con el correactivo R^{1} al menos la sustancia que va a
determinarse y el compuesto que contiene al menos un fluoróforo.
Mediante el correactivo R^{1} unido a la superficie se
"ancla" a la superficie el complejo con la sustancia que va a
determinarse, es decir, se fija y puede detectarse simultáneamente a
través del marcado con el compuesto que contiene fluoróforo.
Según la invención, por "complejo" o
"conjugado" se entiende un enlace o conexión molecular de dos o
más sustancias, preferiblemente químicas o bioquímicas. La formación
del complejo se logra preferiblemente mediante reacciones selectivas
y/o específicas, de manera especialmente preferida mediante
reacciones antígeno-anticuerpo. Según la invención,
el térmico "reacción" comprende interacciones tanto covalentes
como no covalentes de dos o más correactivos, pudiendo presentarse
dentro de un complejo o conjugado también los dos tipos de
interacciones mutua. Una interacción no covalente puede significar,
por ejemplo, una interacción de
Van-der-Waals, polar y/o iónica del
correactivo. El término "correactivo" significa en la presente
invención un compuesto con una afinidad por otra sustancia.
Según la invención, el complejo comprende junto
al correactivo R^{1} al menos la sustancia que va a determinarse y
el compuesto que contiene al menos un fluoróforo.
Para la unión de este complejo al correactivo
R^{1} por medio del correactivo R^{2} existen, entre otras, las
siguientes posibilidades:
- (1)
- La sustancia que va a determinarse es en sí misma el correactivo R^{2}.
- (2)
- La sustancia que va a determinarse comprende el correactivo R^{2}, es decir, el correactivo R^{2} es una estructura parcial de la sustancia que va a determinarse.
- (3)
- La sustancia que va a determinarse presenta una afinidad o sitio de unión para el correactivo R^{2}. Por tanto, tras la unión del correactivo R^{2} a la sustancia que va a determinarse puede darse el caso (2).
- (4)
- Otro compuesto comprende el correactivo R^{2} o presenta una afinidad por el correactivo R^{2}, comprendiendo este otro compuesto además al menos un sitio de unión para la sustancia que va a determinarse. En este caso, el otro compuesto, la sustancia que va a determinarse y el correactivo R^{2} pueden darse como conjugado o complejo (todos o sólo individualmente) en la disolución, o el conjugado se forma en la disolu-ción.
A continuación se tratarán individualmente las
formas de realización preferidas de estos casos (1) a (4).
Según una forma de realización preferida del
procedimiento según la invención, la propia sustancia que va a
determinarse puede presentar una afinidad por el correactivo R^{1}
sobre la superficie y, por lo tanto, puede formar directamente una
unión con este correactivo R^{1}. Según esta forma de realización,
la sustancia que va a determinarse puede unirse como correactivo
R^{2} al correactivo R^{1} sobre la superficie. Si la sustancia
que va a determinarse se trata, por ejemplo, de un anticuerpo, puede
aplicarse sobre la superficie un antígeno específico para este
anticuerpo, o viceversa.
La figura 1 muestra una representación
esquemática de una forma de realización de la cubeta utilizada, así
como el procedimiento según la invención. La cubeta 1 presenta un
pocillo 2, cuya superficie 3 comprende unido el correactivo R^{1}
4 para la proteína que va a determinarse. El pocillo 2 aloja además
la disolución 5 que va a ponerse en contacto con la superficie 3,
que comprende un colorante 6 y, según esta forma de realización, la
sustancia 7 que va a determinarse, presente como conjugado con el
compuesto ñeque contiene fluoróforo La sustancia que va a
determinarse reacciona con el correactivo R^{1} 4 unido a la
superficie para dar un complejo 9 sobre la superficie 3. Por
ejemplo, se proyecta un haz 10 de luz con un diodo 12 de láser sobre
la parte inferior de la superficie 3, el cual se refleja totalmente
sobre la interfase 11. De esta manera se forma encima de la
superficie 3 un campo 13 evanescente, en el cual sólo se encuentra
esencialmente el fluoróforo unido en el complejo 9 sobre la
superficie. Al contrario que en la representación esquemática de la
figura 1, el campo evanescente no se extiende habitualmente sobre la
anchura total del fondo de la cubeta. Por ejemplo, el campo
evanescente puede presentar una extensión de aproximadamente 1
mm^{2}. Mediante la estimulación del fluoróforo a través del campo
13 evanescente, los fluoróforos unidos a la superficie emiten
fotones 14, que pueden intensificarse y medirse, por ejemplo,
mediante un fotomultiplicador 15. La fluorescencia del volumen 16 se
suprime por la presencia del colorante 6.
Según otra forma de realización preferida, la
propia sustancia que va a determinarse presenta (esencialmente)
ninguna o muy poca afinidad por el correactivo R^{1} sobre la
superficie. En este caso, la disolución que va a ponerse en contacto
con la superficie contiene otro compuesto, que comprende un
correactivo R^{2} y un sitio de unión para la sustancia que va a
determinarse. El correactivo R^{2} puede unirse al correactivo
R^{1} sobre la superficie y, por tanto, fijar la sustancia que va
a determinarse indirectamente a la superficie. Esta unión adicional
sirve por tanto como elemento puente entre la sustancia que va a
determinarse y el correactivo R^{1} sobre la superficie. Por
ejemplo, como correactivo R^{1} sobre la superficie puede
presentarse avidina. El compuesto adicional comprende, entonces,
junto con un sitio de unión para la sustancia que va a determinarse,
por ejemplo biotina, que puede unirse a la avidita unidas sobre la
superficie. Esta forma de realización tiene por ejemplo la ventaja
de que una superficie recubierta con avidina puede liofilizarse, a
diferencia de algunos anticuerpos y antígenos, y seca o liofilizada
es muy estable. Además, el sistema avidina/biotina presenta una
constante de disociación K_{D} muy alta. También es posible, para
una serie de determinaciones distintas, prever siempre una
superficie recubierta de avidina y ajustar sólo el compuesto
adicional, el cual se pone en contacto con la superficie con la
disolución, a la sustancia que va a determinarse.
La figura 2 muestra esquemáticamente esta forma
de realización del procedimiento según la invención. En la
disolución puesta en contacto con la superficie, están presentes
juntos la sustancia 20 que va a determinarse, un colorante 22, un
compuesto 24 que contiene fluoróforo y un compuesto 26 adicional. El
correactivo R^{1} 28 está unido a la superficie. El compuesto
adicional y el compuesto que contiene fluoróforo se adicionan a la
sustancia que va a determinarse (conjugado 30), y se produce una
unión del conjugado 30 a través del correactivo R^{2} presente en
el compuesto 26 adicional sobre el correactivo R^{1} 28 presente
sobre la superficie par dar el complejo 32. Así, el complejo 32, que
contiene el compuesto 24 que contiene fluoróforo, se une a la
superficie y puede determinarse mediante medición de la
fluorescencia en el campo 34 evanescente.
Para esta forma de realización del procedimiento
según la invención son adecuados, por ejemplo, junto con el sistema
avidina (o estreptavidina)/biotina, todos los ligandos o sistemas de
unión de ligandos, en los que por ejemplo las proteínas presentan
sitios de unión selectivos y/o específicos para uno o varios
ligandos, como por ejemplo, histidina, colas de histidina, lectina
y/o digoxigenina, así como naturalmente sistemas
antígenos/anticuerpos.
La disolución que va a ponerse en contacto con la
superficie contiene, según la invención, además al menos un
compuesto que contiene fluoróforo. Según la invención, por un
fluoróforo se entiende un compuesto fluorescente, como un colorante
fluorescente. Se prefieren proteínas fluorescentes y/o compuestos
químicos fluorescentes de bajo peso molecular. Como proteínas
fluorescentes pueden utilizarse, según la invención,
ficobiliproteínas, como aloficocianina (APC), Cryptofluor Crimson o
Cryptofluor Red. Como compuestos fluorescentes de bajo peso
molecular pueden mencionarse, por ejemplo, Cy5 o BODIPY (fluoróforo,
4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno).
Se prefieren los colorantes fluorescentes con una absorción en el
intervalo de desde 600 hasta 700 nm.
Además, en lugar de un fluoróforo puede
utilizarse un compuesto precursor de fluoróforo, a partir del cual,
antes del proceso de medición, por ejemplo mediante la variación del
valor de pH o mediante el desprendimiento de un grupo protector,
puede liberarse el fluoróforo.
Según la invención, el término fluoróforo
comprende también compuestos fosforescentes. En el caso de que se
utilice como fluoróforo un compuesto fosforescente de este tipo,
entonces se determina la fosforescencia irradiada, que tiene lugar
posteriormente a la estimulación. Por tanto, es posible separar en
el tiempo el momento de la irradiación del momento de la
medición.
Además, este compuesto que contiene fluoróforo
presenta un sitio de unión para la sustancia que va a determinarse.
Por ejemplo, el fluoróforo puede estar presente unido a un
anticuerpo. Este anticuerpo que contiene fluoróforo puede reaccionar
preferiblemente como antígeno, en una reacción
antígeno-anticuerpo, con la sustancia que va a
determinarse, por ejemplo una proteína.
Según otra forma de realización, la propia
sustancia que va a determinarse está presente como compuesto que
contiene fluoróforo. Según esta forma de realización, pueden
llevarse a cabo ensayos competitivos, que se distinguen
especialmente por un límite de detección bajo.
Con el procedimiento según la invención pueden
detectarse sustancias muy diferentes. Especialmente, el
procedimiento es adecuado para la determinación de sustancias
biológicamente activas, como hormonas, proteínas como antígenos,
anticuerpos o haptenos, fármacos, virus, bacterias, etc. Sin
embargo, el procedimiento puede también servir para detectar
sustancias contaminantes, toxinas, etc.
De manera especialmente preferida, las sustancias
que van a determinarse se detectan a través de reacciones
inmunológicas.
Según la invención, se forma un complejo a partir
de al menos el primer correactivo R^{1}, de la sustancia que va a
determinarse y del compuesto que contiene fluoróforo, sobre la
superficie. Por lo tanto, es posible estimular el fluoróforo unido a
la superficie mediante el campo evanescente de una fuente de luz y
medir la fluorescencia del fluoróforo.
Mediante la estimulación del fluoróforo unido a
la superficie a través de un campo evanescente, se dirige un haz de
luz sobre la parte inferior de la superficie en un ángulo tal, que
aparezca una reflexión total sobre la interfase cubeta/disolución.
De esta manera se forma un campo evanescente por encima de la
superficie en la disolución, que puede penetrar hasta varios cientos
de nanómetros en el líquido. Según la presente invención, se
prefiere un ángulo de incidencia de al menos de 60º a 90º, de modo
que se forme sobre la superficie un campo evanescente de una altura
de hasta 400 nm, preferiblemente 200 nm, de manera especialmente
preferida de 50 a 150 nm. Dentro de este campo evanescente, la luz
irradiada logra estimular el fluoróforo adecuado. La luz
fluorescente emitida es amplifica y se evalúa, por ejemplo, con un
fotomultiplicador.
Como fuente de luz puede utilizarse luz
monocromática. En este sentido, debería utilizarse luz de una
longitud de onda que preferiblemente no interfiera con la emisión
del fluoróforo y que no se solape con la banda de absorción del
colorante. Como fuente de luz se prefiere especialmente un láser,
especialmente un láser que emita luz de una longitud de onda de al
menos 635 nm. Especialmente cuando en el caso de la disolución que
va a investigarse se trata de suero, se prefieren longitudes de onda
de desde 600 hasta 700 nm, ya que la fluorescencia propia del suero
se sitúa a aproximadamente 580 nm.
Según una forma de realización de la presente
invención, el aumento del fluoróforo unido a la superficie puede
medirse directamente con una reacción progresiva en el tiempo (en
tiempo real). Dado que la cantidad del fluoróforo unido a la
superficie es directamente proporcional a la cantidad existente
inicialmente del compuesto que contiene fluoróforo, el procedimiento
según la invención permite la determinación cuantitativa de los
reactivos que se encuentran en la disolución en tiempo real sin
otras etapas adicionales de lavado y/o pipeteo.
Dado que los coeficientes de absorción y las
características de emisión son muy apropiados para los fluoróforos,
dan como resultado límites de detección bajos. Sólo tras algunos
minutos, ya se puede valorar cualitativa y/o cuantitativamente las
reacciones.
Sin embargo, la dispersión no ideal del haz de
luz en la cubeta ocasiona problemas, incluso aunque se hayan tomado
medidas físicas para la reducción de la luz dispersa. Debido a la
dispersión, la luz alcanza el volumen de la cubeta y origina en él
una fluorescencia de fondo. Por "volumen" se entiende según la
invención el líquido que se encuentra fuera del campo evanescente,
que contiene compuestos que contiene fluoróforo no unido. Además,
tanto en cubetas de plástico como de vidrio puede orientarse la
polarización del haz de luz. Esto ocasiona particularmente reflejos
de la luz de estimulación por el desacoplamiento. Aparece la
denominada luz errante, que junto con los efectos del volumen y de
dispersión superficial pueden ocasionar una estimulación del
volumen.
Según la invención, puede evitarse una
estimulación del fluoróforo que se encuentra en el volumen, si se
añade a la disolución que va a ponerse en contacto con la superficie
al menos un colorante que presente un intervalo de absorción y
emisión del fluoróforo.
Una comparación de las profundidades de
penetración de las ondas evanescentes y de la luz errante muestra
que se consigue la supresión de la estimulación del volumen por la
adición de un colorante. La absorción de luz se describe físicamente
mediante la ley de Lambert-Beer, de manera que la
intensidad de la luz disminuye logarítmicamente con la distancia por
absorción:
I[x] =
I_{0}Exp(-\alpha
cx)
en la que I_{0} es la intensidad
de la luz que incide en el medio absorbente, I la intensidad de la
luz que sale del medio absorbente, x el espesor del medio absorbente
(espesor de capa), \alpha el coeficiente de absorción y c la
concentración de un colorante que se encuentra en la disolución. La
figura 3 muestra el transcurso de la intensidad de una disolución de
un colorante absorbente con un espesor de capa creciente,
representándose el transcurso de la intensidad para \alpha =
100.000 mol/(l x cm) y c = 20 mMol hasta una profundidad de 1 mm.
Puede observarse que en esta distancia la luz dispersa se debilita a
1/100 de su intensidad inicial. Puesto que principalmente la luz
dispersa se acopla lateralmente, este debilitamiento es suficiente
para mantener la señal del volumen, y con ello también la
inseguridad de la medición para la señal que depende del tiempo de
la cinética de la reacción, que se superpone a esta señal, en unos
límites prácticamente
utilizables.
La figura 4 muestra una comparación de la
profundidad de penetración de la onda evanescente con la profundidad
de penetración de la luz en la absorción por un colorante. La
representación doble logarítmica muestra el transcurso de la
intensidad en función de la profundidad de penetración de una onda
evanescente (izquierda) y de una onda debilitada por la absorción
(derecha). La ordenada se sitúa en un intervalo de desde -2 hasta 0,
es decir, desde 1/100 hasta 1 log10 de intensidad. Los parámetros
basados en esto corresponden a valores que pueden realizarse
técnicamente. Aunque la amortiguación de la luz errante permite
esencialmente mayores profundidades de penetración que la luz de la
onda evanescente, sin embargo, puede suprimirse una estimulación y
emisión del volumen de manera eficiente y esencialmente
cuantitativa, tal como se muestra en los ejemplos.
De importancia decisiva para la eficacia de la
supresión es la distancia geométrica entre aquella parte de la
superficie de la cubeta, de la cual puede llegar la luz sobre el
detector, y los lugares de penetración de la luz errante en el
volumen.
De la figura 4 resulta evidente que para un
debilitamiento de la luz dispersa de dos órdenes de magnitud es
suficiente una distancia en el intervalo de un milímetro. Esta
distancia puede mantenerse de forma sencilla mediante un
correspondiente dimensionado de la cubeta.
La absorción del colorante añadido al volumen se
ajusta, según la invención, al intervalo de absorción y emisión del
fluoróforo. Puede utilizarse un solo colorante o también una mezcla
de colorantes. Normalmente, el intervalo de absorción del fluoróforo
se correlaciona con la longitud de onda de la fuente de luz
utilizada. En este sentido, no es necesario que el colorante
presente un máximo de absorción en este intervalo espectral, puede
ser suficiente alcanzar un pico en el espectro de absorción. Si se
emplean, por ejemplo fluoróforos como APC o Cy5, el colorante
utilizado puede presentar una absorción entre 600 nm y 700 nm, como
por ejemplo azul brillante (Brillant-Blue FCF). La
concentración del colorante añadido depende del coeficiente de
absorción del colorante respectivo en disolución y depende además de
la frecuencia de la luz irradiada. La concentración del colorante
puede ajustarse según el colorante, de tal modo que la luz que
penetra puede absorberse esencialmente en 1 mm sobre la superficie.
Para determinar la concentración óptima del colorante en cada caso,
se mide en primer lugar la fluorescencia del volumen y la
fluorescencia en el campo evanescente, es decir, la fluorescencia
superficial, con concentraciones de colorante diferentes en cada
caso (compárese la figura 6a). A continuación, se representa la
razón de la fluorescencia superficial con respecto a la
fluorescencia del volumen frente a la concentración del colorante
(compárese la figura 6b). El máximo de la curva 6b representa la
concentración óptima del colorante. Según la invención, por "razón
señal/ruido" se entiende la razón de la fluorescencia superficial
("señal") con respecto a la fluorescencia del volumen
("ruidos"). "Esencialmente absorbido" puede significar en
este sentido una extinción de la intensidad del 70%, preferiblemente
del 80%, de manera especialmente preferida de al menos el 90%.
Por ejemplo, mediante el uso de azul brillante
FCF como colorante, se puede alcanzar una concentración de 0,04 mM,
para extinguir mucho más del 95% de la fluorescencia del volumen
(compárese la tabla 4, ejemplo 4). Puesto que la concentración
necesaria del colorante depende, entre otras cosas, también de la
cubeta utilizada, del dispositivo de medición, etc., también pueden
ser suficientes concentraciones de colorante incluso más pequeñas
para una razón señal/ruido suficiente. De forma correspondiente, la
concentración de azul brillante FCF es, por ejemplo, preferiblemente
de al menos 0,001 mM.
Experimentos comparativos, como los representados
en la figura 6a y 6b, han mostrado que la razón señal/ruido puede
mejorarse desde 1,3 : 1 hasta 18,5 : 1 con el procedimiento según la
invención.
La cubeta comprende preferiblemente vidrio o un
plástico, de manera especialmente preferida un plástico, como
poliestireno, polipropileno, polietileno, poli(tereftalato de
etileno), policicloolefina, poliacrilonitrilo,
poli(metacrilato de metilo) y/o mezclas o combinaciones de
estos plásticos. En principio, son adecuados todos los plásticos que
no absorben esencialmente luz en el intervalo visible. Según una
forma de realización, el plástico también puede estar ligeramente
coloreado, por ejemplo, de color azul, para filtrar una emisión
originada por la luz dispersa. Las cubetas de plástico pueden
obtenerse de forma económica por moldeo de inyección y presentan
preferiblemente un volumen de reacción de desde 1 hasta 400 \mul,
de manera especialmente preferida de 5 a 200 \mul.
Preferiblemente, las cubetas o placas de microtitulación según la
invención están formadas en una sola pieza. Se considera además
ventajoso que el lado interno y/o superficie de emisión, es decir,
la superficie de la cual sale el haz emitido desde la cubeta,
esté/sea pulido con una rugosidad superficial de preferiblemente
como máximo 10 nm.
La pequeña dimensión y el bajo precio hacen que
sea posible leal uso del procedimiento según la invención en el
diagnóstico y análisis rutinarios. En la aplicación práctica, una
cubeta o placa de microtitulación de este tipo puede comercializarse
en el mercado ya previamente preparada y cerrada por una etiqueta
especial. En este sentido, la preparación previa comprende el
recubrimiento de la superficie de la cubeta o placa de
microtitulación con el primer correactivo y, opcionalmente, el
bloqueo posterior de los sitios no recubiertos. De forma
especialmente preferida, la cubeta o placa de microtitulación
recubierta se presenta liofilizada o seca. Además, el al menos un
colorante y/o el compuesto que contiene al menos un fluoróforo y/o
el compuesto adicional, ya puede/n estar presentes en la cubeta o
placa de microtitulación cerrada, de modo que para la medición sólo
debe añadirse la sustancia en disolución que va a analizarse.
Dotando a la cubeta o placa de microtitulación de un número de
serie, es posible una clasificación inequívoca en cada momento de la
carga de elaboración, la reacción de detección y la muestra.
Además, la presente invención comprende una
disolución que comprende al menos un compuesto que contiene
fluoróforo y al menos un colorante, que absorbe en el intervalo de
absorción y emisión del fluoróforo. Además, la disolución según la
invención puede contener opcionalmente otro compuesto que presenta
al menos un sitio de unión para la sustancia que va a determinarse y
que comprende el correactivo R^{2}.
Además, la presente invención comprende un kit
que puede contener una cubeta o placa de microtitulación previamente
preparada como se describió anteriormente y disoluciones del al
menos un colorante y del compuesto que contiene al menos un
fluoróforo y, opcionalmente, del compuesto adicional, que presenta
al menos un sitio de unión para la sustancia que va a determinarse y
que comprende el correactivo R^{2}. El al menos un colorante y el
compuesto que contiene al menos un fluoróforo pueden estar presentes
juntos en una disolución, así como en dos disoluciones
separadas.
La presente invención se refiere además al uso
del procedimiento según la invención para determinar cinéticas de
reacción, preferiblemente reacciones inmunológicas, así como al uso
del procedimiento en el diagnóstico médico o veterinario, en
análisis de alimentos, análisis medioambientales o análisis de
procesos de fermentación.
Como ejemplos de aplicación concretos pueden
mencionarse la detección de productos fitosanitarios en agua
potable, como atrazina, la detección de hormonas en carne de
ternera, la detección de hormonas, como HCG, así como la detección
directa o indirecta de virus, como hepatitis S y VIH.
La presente invención se explica a continuación
por medio de ejemplos.
En este ejemplo se determina la influencia de la
concentración del fluoróforo añadido, unido a una proteína. En esta
medición sólo está presente fluoróforo unido a la superficie, el
fluoróforo no unido se eliminó por lavado. No se añadió un colorante
a la disolución.
Se recubrió la superficie de una cubeta dejando
200 \mul de anticuerpo monoclonal
Ac1-20.4-2., IgGI, de ratón (CACMAK,
empresa Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Alemania) en 5 \mug/ml
en PBS+ (PBS+ = PO_{4} 100 mM, pH 7,5; NaCl 100 mM) a temperatura
ambiente (TA) durante la noche (ON) sobre la superficie. Entonces,
la superficie se lavó cuatro veces con PBS (solución salina
tamponada con fosfato) y se trató con BSA al 1% (albúmina de suero
bovino) mejorada de Miles, PBS+, 300 \mul, durante una hora a
TA.
Se dejó GAMAPC (conjugado de aloficocianina (APC)
e IgG (H+L) de cabra anti-ratón, reticulada;
Molecular Probes, Leiden, Holanda) en PBS+T (PBS+T = PO_{4} 100
mM, pH 7,5; NaCl 100 mM, Tweed 20 al 0,025 v/v) durante la noche a
TA sobre la superficie. A continuación, se lavó cinco veces con PBS
y se añadieron 200 \mul de PBS+T y se midió la fluorescencia por
medio del método del campo evanescente. El resultado se muestra en
la tabla 1.
| Concentración de la disolución | Concentración de GAMAPC | Emisión [cuentas |
| de recubrimiento del antígeno | [\mug/\mul] | de fotones/s] |
| CACMAK [\mug/\mul] | ||
| 0 | 10 | 3.000 |
| 5 | 10 | 120.000 |
| 5 | 3 | 60.000 |
| 5 | 1 | 18.000 |
| 5 | 0 | 3.000 |
Por tanto, se manifestó una emisión de fotones
dependiente de la concentración de fluoróforo APC unido sobre la
superficie.
Punto final de la reacción con lavado del
componente y medición de la fluorescencia. En la medición sólo hay
fluoróforo unido.
Se recubrieron las superficies de unas cubetas
dejando 200 \mul de suero humano 1 : 1000 en PBS+ a temperatura
ambiente (TA) durante la noche sobre la superficie. Entonces, la
superficie se lavó cuatro veces con PBS y con BSA al 1% (albúmina de
suero bovino) mejorada de Miles, PBS+, 300 \mul, durante una hora
a TA.
Se dejó el conjugado IgG-Cy5
anti-humana (Amersham Oharmacia Biotech, Dübendorf,
Suiza) en PBS+T durante la noche a TA sobre la superficie. A
continuación, se lavó cinco veces con PBS y se añadieron 200 \mul
de PBS+T y se midió la fluorescencia. El resultado se muestra en la
tabla 2.
| Suero humano-antígeno | Concentración de GAMAPC | Emisión [cuentas de |
| recubierto | [\mug/\mul] | fotones/s] |
| 0 | 1 : 100 | 3.000 |
| 1 : 1000 | 1 : 100 | 7.000 |
| 1 : 1000 | 1 : 300 | 6.000 |
| 1 : 1000 | 1 : 1000 | 5.000 |
| 1 : 1000 | 0 | 3.000 |
De nuevo pudo medirse una emisión de fotones
dependiente de la concentración de fluoróforo Cy5 unido.
\newpage
En este ejemplo se estudió la eficacia de
diferentes colorantes para disminuir la absorción del volumen. La
superficie de las cubetas no estaba recubierta en este ejemplo, sólo
se determinó la reducción de la fluorescencia del conjugado de
proteína y fluoróforo que se encuentra en la disolución. Los
fluoróforos en el volumen de la disolución de reacción se estimulan
mediante pequeñas cantidades de luz dispersa. Los espectros de
absorción de los colorantes utilizados se muestran en la figura
5.
Se mezcla GAMAPC, 10 \mul, en PBS+T con
distintos colorantes y se mide la fluorescencia mediante la
estimulación del volumen. El resultado se muestra en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Absorción del colorante a | Emisión del fluoróforo | |
| Colorante añadido | 650 nm | [cuentas de fotones/s] |
| Cubeta sin fluoróforo | - - | 3.300 |
| Sin colorante absorbente | 0,00 | 210.000 |
| Brilliant-Blue FCF^{1)} 0,25 mM | 0,55 | 4.200 |
| Amaranth^{2)} 1 mM | 0,05 | 120.000 |
| Supercook Blue^{3)} al 5% | 0,30 | 4.400 |
| Supercook Green^{3)} al 5% | 0,10 | 23.000 |
| Supercook Egg Yellow^{3)} al 5% | <0,04 | 190.000 |
| Supercook Pink^{3)} al 5% | <0,04 | 200.000 |
| Supercook Cochineal^{3)} al 5% | 0,05 | 99.000 |
| Observaciones: | ||
| \hskip0,3cm ^{1)} Brilliant-Blue FCF (Erioglaucine A), Fluka, Buchs, CH (Suiza) | ||
| \hskip0,3cm ^{2)} Amaranth, Fluka, Buchs, CH | ||
| \hskip0,3cm ^{3)} Supercook Food Colourings, Supercook, Leeds, RU |
Por tanto, con el uso de APC como colorante
fluoróforo o mezclas de los mismos, que absorben entre 600 y 700 nm,
se manifestó que se reduce la fluorescencia del volumen por
absorción de la luz incidente y emitida.
En este ejemplo se estudió la dependencia de la
reducción de la fluorescencia del volumen con la concentración del
colorante azul brillante FCF (Blilliant-Blue CFC)
con el uso de APC como fluoróforo.
La cubeta se bloquea una hora a TA con ABS al 1%
mejorado de Miles, en PBS+ 300 \mul.
Se mezcla GAMAPC (10 \mug/ml) en PBS+T con azul
brillante FCF en diferentes concentraciones y se mide la
fluorescencia de la estimulación del volumen.
| Concentración del colorante | Emisión del fluoróforo | |
| Colorante añadido en ABS+T | [mM] | [cuentas de fotones/s] |
| Ninguno (sólo cubeta) | - - | 3.300 |
| Ninguno (cubeta + GAMAPC) | - - | 106.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 0,02 | 26.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 0,04 | 9.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 0,08 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 0,16 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 0,32 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 0,63 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 1,25 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 2,50 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 5,0 | 4.000 |
| GAMAPC + Brilliant-Blue FCF^{4)} | 10,0 | 4.000 |
| Observación: | ||
| \hskip0,3cm ^{4)} Brilliant-Blue FCF (Erioglaucine A), Fluka, Buchs, CH |
La reducción de la estimulación del volumen
depende de la concentración del colorante azul brillante en el
volumen. En el caso de azul brillante FCF, ya con concentraciones de
0,04 mm y por encima, se extingue más del 95% de la fluorescencia
del volumen.
En este ejemplo se estudia la influencia del
colorante en la fluorescencia del fluoróforo unido a la superficie.
El punto final de la reacción con lavado de la superficie y medición
de la fluorescencia. En la medición sólo está presente fluoróforo
unido.
Una cubeta preparada como en el ejemplo 1a) se
pone en contacto con GAMAPC en BSA+T durante la noche a TA y a
continuación se lava cinco veces con BSA.
Tras la adición de 200 \mul de BSA+T, mezclado
con azul brillante FCF en diferentes concentraciones, se mide la
fluorescencia de GAPAPC 10 \mug/ml en BSA+T unida a la superficie
de la cubeta y la fluorescencia mediante estimulación del
volumen.
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración del colorante | Emisión del fluoróforo | |
| Colorante añadido en ABS+T | [mM] | [cuentas de fotones/s] |
| Ninguno (sólo cubeta) | - - | 3.300 |
| Ninguno (cubeta + GAMAPC) | - - | 126.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 0,02 | 115.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 0,04 | 94.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 0,08 | 74.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 0,16 | 56.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 0,32 | 42.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 0,63 | 29.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 1,25 | 19.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 2,50 | 12.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 5,0 | 9.000 |
| GAMAPC (unido) + Brilliant-Blue FCF^{5)} | 10,0 | 8.000 |
| Observación: | ||
| \hskip0,3cm ^{5)} Brilliant-Blue FCF (Erioglaucine A), Fluka, Buchs, CH |
Se manifestó una reducción de la estimulación del
campo evanescente del APC unido, dependiente de la concentración del
colorante en el volumen. En el caso de concentraciones de azul
brillante de 0,04 mM, se extingue aproximadamente el 35% de la
fluorescencia unida, es decir, la reducción de la fluorescencia
unida es esencialmente más pequeña que la reducción de la
fluorescencia mediante estimulación del volumen, en la que más del
95% de la fluorescencia se extinguió mediante la adición de
colorante en la misma concentración.
Este ejemplo muestra que la emisión del
fluoróforo que está unido a la superficie no se inhibe esencialmente
mediante la cantidad añadida de colorante, a la vez que se reduce
fuertemente la estimulación del volumen. De ahí se deduce una mejor
razón señal/ruido y por tanto límites de detección más bajos.
Se pone en contacto una cubeta preparada como en
el ejemplo 1a) con GAMAPC en PBS+T durante la noche a TA y a
continuación se lava cinco veces con PBS. Entonces, como en el
ejemplo 1b), se dejó el GAMAPC en PBS+T durante la noche a TA sobre
la superficie. A continuación se lavó cinco veces con PBS.
Las cubetas así preparadas se sometieron a las
diferentes mediciones de fluorescencia siguientes:
(1) Después de la adición de PBS+T (sólo
fluoróforo unido)
(2) Después de la adición de APC (10 \mug/ml en
PBS+T) (fluoróforo unido + fluoróforo en volumen, pero sin
colorante)
(3) Después de la adición de APC, 10 \mug/ml, y
azul brillante FCF (BB FCF) (0,25 mM en PBS+T) (fluoróforo unido +
fluoróforo en volumen + colorante)
| Componente | Mab | GAMAPC | Emisión [cuentas fluorescentes/s] | ||
| \mug/ml | \mug/ml | (1) PBS+T | (2) PBS+T | (3) PBS+T | |
| APC 10 \mug/ml | APC 10 \mug/ml | ||||
| BB FCF 0,25 mM | |||||
| M1 | 0 | 10 | 3.000 | 230.000 | 5.000 |
| M2 | 5 | 10 | 120.000 | 300.000 | 59.000 |
| M3 | 5 | 3 | 72.000 | 280.000 | 29.000 |
| M4 | 5 | 1 | 26.000 | 170.000 | 16.000 |
| M5 | 5 | 0,3 | 5.500 | 230.000 | 7.200 |
| M6 | 5 | 0,1 | 4.600 | 230.000 | 6.000 |
| Componente | Razón señal/ruido^{6)} | |
| (2) Sin azul brillante FCF | (3) Con azul brillante FCF | |
| M1^{7)} | - - | - - |
| M2 | 1,3 | 11,8 |
| M3 | 1,2 | 5,8 |
| M4 | 0,7 | 5,8 |
| M5 | 1,0 | 3,2 |
| M6 | 1,0 | 1,2 |
| Observaciones: | ||
| ^{6)} \begin{minipage}[t]{155mm} Razón señal/ruido = razón de la emisión de la superficie ("señal") con respecto a la emisión del volumen ("ruidos") \end{minipage} | ||
| ^{7)} Ruidos = Componente M1 - reacción negativa (control negativo) |
1. Serie de concentración decreciente de GAMAPC
de M2 a M6. El control negativo M1 presenta una emisión de la
cantidad de 3.000 cuentas/s.
2. Sin la adición de un colorante, es decir, con
la estimulación de APC en el volumen no extinguida, no se reconoce
ninguna serie de concentración clara decreciente de M2 a M6. Sobre
todo, los valores bajos desaparecen en el fondo de la estimulación
del volumen.
3. Con azul brillante FCF en el volumen puede
reconocerse claramente la serie de concentración decreciente de M2 a
M6. El control negativo M1 presenta 5.000 cuentas/s. Con azul
brillante FCF se reduce la emisión del volumen por APC de 230.000
cuentas/s de M1 hasta 5.000 cuentas/s.
La fluorescencia específica unida a la superficie
se reduce aproximadamente el 50%. La razón señal/ruido mejora
esencialmente con la adición de azul brillante FCF.
En este ejemplo se midieron las cinéticas de
reacción de la adición de una proteína marcada con fluoróforo en un
correactivo unido a la superficie de la cubeta.
En una cubeta preparada como en el ejemplo 1a) se
añadieron GAMAPC en PBS+T y se midió la fluorescencia en dependencia
del tiempo.
La figura 7 muestra el cambio de la emisión en
función del tiempo. La adición de GAMAPC tuvo lugar a T = 100 s. Se
observa un aumento de la emisión (cuentas fluorescentes) con el
tiempo de reacción que se corresponde con la adición de la proteína
marcada con fluoróforo en un correactivo unido a la superficie de la
cubeta.
Como comparación, se midió el cambio de la
emisión con el tiempo en una muestra en la que la superficie de la
cubeta no se había recubierto según el ejemplo 1a) con IgG de ratón
(compárese la figura 8). La emisión no aumentó con el tiempo, sino
que permaneció estable.
Claims (26)
1. Procedimiento para determinar sustancias, que
comprende las etapas de
- preparar una superficie que comprende al menos
un correactivo R^{1} unido a la superficie,
- poner en contacto la superficie con una
disolución que comprende al menos la sustancia que va a
determinarse, un compuesto que contiene al menos un fluoróforo y al
menos un colorante,
en el que se forma un complejo en el correactivo
R^{1} en la superficie y en el que dicho complejo junto con el
correactivo R^{1} comprende al menos la sustancia que va a
determinarse y el compuesto que contiene al menos un fluoróforo,
y
- estimular el fluoróforo unido a la superficie
mediante el campo evanescente de una fuente de luz y medir la
fluorescencia producida,
caracterizado porque el colorante absorbe
en el intervalo de absorción y emisión del fluoróforo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la sustancia que va a determinarse se une como correactivo
R^{2} al correactivo R^{1} en la superficie.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que el correactivo R^{1} unido a la superficie es un antígeno o un
anticuerpo.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que un correactivo R^{2} comprende la sustancia que va a
determinarse y se une al correactivo R^{1} en la superficie.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que otro compuesto, que presenta un sitio de unión para la sustancia
que va a determinarse y que contiene un correactivo R^{2}, se une
al correactivo R^{1} en la superficie.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que el correactivo R^{1} comprende avidina o estreptavidina y el
correactivo R^{2} comprende biotina y un sitio de unión para la
sustancia que va a determinarse.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia que va a
determinarse comprende una sustancia biológicamente activa, que se
selecciona del grupo de hormonas, proteínas, virus, bacterias,
fármacos y toxinas.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia que va a
determinarse comprende una proteína, preferiblemente un antígeno o
un anticuerpo.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto que contiene
fluoróforo presenta un compuesto fluorescente y un sitio de unión
para la sustancia que va a determinarse.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que como fluoróforo se utilizan
proteínas fluorescentes y/o compuestos químicos fluorescentes de
bajo peso molecular.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que como proteínas fluorescentes se utilizan ficobiliproteínas,
como aloficocianina (APC), Cryptofluor Crimson o Cryptofluor
Red.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que como compuestos fluorescentes de bajo peso molecular se
utilizan Cy5 o BODIPY.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza al menos un
fluoróforo, que absorbe en un intervalo de longitud de onda de desde
600 hasta 700 nm.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza al menos un
compuesto fosforescente como fluoróforo.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza una mezcla de
colorantes, que absorben en el intervalo de absorción y/o emisión
del fluoróforo.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza al menos un
colorante que absorbe en un intervalo de longitud de onda de desde
600 a 700 nm.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que como el al menos un colorante se utiliza azul brillante FCF
en una concentración de al menos 0,001 mM.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que se utiliza una cubeta o placa de
microtitulación que comprende al menos un correactivo para la
sustancia que va a determinarse unido a una superficie, en el que la
cubeta comprende un plástico, y en el que el lado interior y/o la
superficie de emisión de la cubeta está pulida/ están pulidas con
una rugosidad superficial de cómo máximo 10 nm.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que el al menos un correactivo R^{1} está presente en forma
liofilizada.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó
19, en el que la cubeta comprende poliestireno, polipropileno,
polietileno, poliacrilonitrilo, poli(metacrilato de metilo),
policicloolefina, poli(tereftalato de etileno) y/o mezclas de
los mismos.
21. Procedimiento según las reivindicaciones 18 a
20, en el que la cubeta o la placa de microtitulación son de una
pieza.
22. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que la cubeta presenta un volumen de
reacción de desde 1 hasta 400 \mul.
23. Disolución que contiene al menos un compuesto
que contiene fluoróforo, al menos un colorante y opcionalmente un
correactivo R^{2} para su uso en un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 17.
24. Kit para su uso en un procedimiento según una
de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende al menos una cubeta o
placa de microtitulación según una de las reivindicaciones 18 a 22 y
al menos una disolución según la reivindicación 23.
25. Uso del procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 17, para determinar cinéticas de reacción de
reacciones inmunológicas.
26. Uso del procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 17 en el diagnóstico médico o veterinario, en
el análisis de alimentos, en el análisis medioambiental o en el
análisis de procesos de fermentación.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99116418 | 1999-08-20 | ||
| EP99116418 | 1999-08-20 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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