JP5285471B2 - 全反射照明型センサチップ、その製造方法およびそれを用いたセンシング方法 - Google Patents
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Description
特に、SPFS測定の”金属膜近傍の信号のみ強く励起する”という特性を活かし、洗浄を行わずに蛍光検出を行い、蛍光信号の変化量(レート)から被検出物質の量を検出するホモジーニアスアッセイ系においては、(v)測定光の散乱光に起因する浮遊標識からの蛍光の影響も加わり、より深刻な問題である。
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、
上記一面である金属膜形成面の領域であって金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであることを特徴とするものである。
誘電体プリズムは、測定光を透過させるための透過面を有するものであり、
透過面は、この透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成されているものであることが好ましい。
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成形し、
上記一面である金属膜形成面を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨することを特徴とするものである。
誘電体プリズムを成形すると共に、測定光を透過させるための透過面を誘電体プリズムに形成し、
透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように、金属膜形成面を研磨することが好ましい。
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成型するための型の部分であって上記一面である金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、
上記型を用いて誘電体プリズムを成型することを特徴とするものである。
誘電体プリズムを成型すると共に、測定光を透過させるための透過面を、透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することが好ましい。
金属膜が一面に形成された誘電体プリズム有する全反射照明型センサチップを用いて、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法において、
上記一面である金属膜形成面の領域であって金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであり、
上記指向性を表す指向ベクトルと、測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、測定光を上記界面に対し照射することを特徴とするものである。
<全反射照明型センサチップの第1の実施形態>
まず、本実施形態に係る全反射照明型センサチップC1の構成について説明する。図1Aおよび図1Bは、それぞれ本実施形態に係る全反射照明型センサチップC1の概略上面図および概略断面図である。ここで、図1Bは、図1AのAA’における断面図である。ただし、視認しやすくするため、図中、各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。
全反射照明型センサチップC1の製造方法は、まず成形によりセンサチップの基板となる誘電体プリズム10を形成し(図2A)、誘電体プリズム10の金属膜形成面10aを研磨痕がy軸に沿うように研磨材50で図中の矢印方向へ研磨し(図2B)、流路の側壁を形成するように金属膜形成面10a上に側壁材11を配置し(図2C)、流路の所定領域に金属膜14aおよび14bを形成し(図2D)、フタ材12を側壁材11上に装着する(図2E)ものである。
図3は、研磨痕の微分干渉画像(以下、単に画像と言う。)を撮像するために用いた装置を示す。ここで、顕微鏡はオリンパス株式会社製BX51WI(商品名)であり、対物レンズはオリンパス株式会社製LMPlanFI×50(商品名)であり、CCDは株式会社フローベル製ADT−100(商品名)である。CCDには、画像の保存および処理を行うためのパーソナルコンピューター(PC)が接続されている。そして、上記装置を用いて研磨痕の画像を撮像すると、例えば図4A〜Cに示すような画像が得られる。図4Aのimage−Aは研磨痕がy軸に沿うように研磨された誘電体プリズムの画像であり、図4Bのimage−Bは研磨痕がx軸に沿うように研磨された誘電体プリズムの画像であり、図4Cのimage−Cは丸く研磨された誘電体プリズムの画像である。
次に、(1)で得たそれぞれの画像に対して高速フーリエ変換(FFT)処理を行いそれぞれの研磨痕のFFT画像を得る。FFT処理は、画像処理ソフトScion Imageを用いて行う。ここで、Scion Imageの設定画面において単位を実寸に設定しておく必要がある。例えば図5は、(1)で得た画像のサイズが、視野:100um角、pixel:512×512の場合における設定を示す。画像をFFT処理すると図6A〜Cに示すようなFFT画像が得られる。FFT−A、FFT−BおよびFFT−Cは、それぞれimage−A、image−Bおよびimage−CについてのFFT画像である。FFT画像は、元になる画像中に含まれる周波数成分のパワー(絶対値の二乗)を濃淡で表したものであり、FFT画像の中心に近いほど低周波数成分のパワーを表し、逆にFFT画像の中心から離れるほど高周波数成分のパワーを表している(図7)。
例えば、FFT画像のkx軸の近傍の濃度は、画像中のx軸方向に周期的な構造が存在することを示唆し、また同様にFFT画像のky軸の近傍の濃度は、画像中のy軸方向に周期的な構造が存在することを示唆している。つまり、FFT画像のkx軸の近傍に濃度が集中する場合は、画像中のy軸に沿った構造の存在を表し、また同様にFFT画像のky軸の近傍に濃度が集中する場合は、画像中のx軸に沿った構造の存在を表している。ここでkx軸およびky軸は、FFT画像における空間周波数での座標を表し、図8に示すようにFFT画像の右向きおよび上方を、それぞれkx軸およびky軸としている。本発明では、FFT画像のkx軸近傍領域の濃度とky軸近傍領域の濃度とを抽出および数値化し、この数値化されたそれぞれの濃度から研磨痕の指向性の度合を定義する。ここでkx軸近傍領域とは、kx軸の値の大きさが0.5um/cycle以上、かつky方向は10um/cycle以上の領域(図8中の領域X)とし、ky軸近傍領域とは、ky軸の値の大きさが0.5um/cycle以上かつkx方向は10um/cycle以上の領域とする。0.5um/cycleよりも低周波数成分としたのは、経験上0.5um以上の幅を持った研磨痕から光が漏れていることに基づく。FFT画像は、画像の中心でシンメトリとなっている(図7)ため、各軸のプラス側のみを定量してもいいが、本明細書では両方の濃度を定量するものとして説明する。
研磨痕の指向性の度合(%)=(領域Xの濃さ(%))−(領域Yの濃さ(%))
ここで、領域Xの濃さ(%)とは、(領域Xの平均濃度−全体領域の平均濃度)/(全体領域の平均濃度)×100であり、領域Yの濃さ(%)とは、(領域Yの平均濃度−全体領域の平均濃度)/(全体領域の平均濃度)×100である。また、「全体領域」とはFFT画像の全領域を指すが、必ずしもこれに限られるものではなく、「全体領域」は領域Xおよび領域Yを含むように全体的に広く指定した領域としてもよい。各領域の平均濃度は、画像処理ソフトScion Imageの機能を用いて定量することができる。上記の研磨痕の指向性の度合は、その数値がプラスであれば実空間のx軸よりもy軸に沿った構造が多いこと、つまり研磨痕がy軸方向へ指向性を有することを示す。また逆にこの度合は、その数値がマイナスであれば実空間のy軸よりもx軸に沿った構造が多いこと、つまり研磨痕がx軸方向へ指向性を有することを示す。
本出願人は、誘電体プリズムの金属膜形成面に研磨痕が存在すると、図9に示すようにx軸に沿った研磨痕から測定光が漏れるという現象を発見した。図9は、金属膜形成面の下方(誘電体プリズムの内部)において測定光を全反射させて、その様子を金属膜形成面の上方(誘電体プリズムの外部)から観察した様子である。図9中にはy軸に沿った研磨痕も存在しているが、x軸に沿った研磨痕から測定光が漏れているのがはっきりと示されている。これは、図10に示すように、研磨痕52が存在する部分において測定光Lが金属膜形成面10aでの全反射条件を満たさなくなることに起因していると考えられる。このように測定光Lが全反射条件を満たさなくなるのは、図10から分かるように測定光Lの金属膜形成面10aへの射影成分の方向(y軸方向或いはエバネッセント波の進行方向)と研磨痕52の方向(x軸方向)とがほぼ垂直となっているためである。したがって、本発明に係るセンサチップでは、測定光Lの金属膜形成面10aへの射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕52の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することにより、測定光Lが金属膜形成面10aでの全反射条件を満たさなくなることを防止し、測定光が漏れるという問題を解消することができる。
まず、本実施形態に係る全反射照明型センサチップC2の構成について説明する。図11Aおよび図11Bは、それぞれ本実施形態に係る全反射照明型センサチップC2の概略上面図および概略断面図である。ここで、図11Bは、図11AのBB’における断面図である。全反射照明型センサチップC2は、第1の実施形態に係るセンサチップC1と同様の構成であるが、型を用いた成型によって誘電体プリズム20に直接流路(上面を除く)が形成されるという点でセンサチップC1と大きく異なる。したがって、センサチップC1と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
センサチップC2の製造方法は、まず成型用の型60を用意し、この型60の部分であって金属膜が形成される上記一面である金属膜形成面20a(流路の底面)に対応する部分62を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨材50で図中の矢印方向へ研磨し(図12A)、この型60を用いてセンサチップの基板となる誘電体プリズム20を成型し(図12B)、流路23の所定領域に金属膜24aおよび24bを形成し(図12C)、フタ材22を誘電体プリズム20上に装着する(図12D)ものである。
図13は、第2の実施形態に係るセンサチップC2を用いた蛍光検出装置の概略図である。なお、本発明に係るセンサチップを用いるセンシング装置は、これに限られるものではない。
本実施形態による蛍光検出方法は、後述するサンドイッチ法によるアッセイを行うことによって、1次抗体B1、抗原Aおよび2次抗体B2を介して金属膜24a上に蛍光標識Fを固定し、次に光源121より発せられる測定光Lを、センサチップC2の誘電体プリズムと金属膜との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度となるように、かつ金属膜形成面の研磨痕の指向性を表す指向ベクトルと、この測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように入射して、エバネッセント波を励起し、このエバネッセント波と金属膜24a中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜24a中に表面プラズモンを発生させ、この表面プラズモンによる増強電場Ewで蛍光標識Fを励起して蛍光Lfを生じせしめ、この蛍光Lfを光検出器130で検出して、その蛍光量をデータ処理部140でデータ処理するものである。
step1:注入口25aから検査対象である血液(全血)Soを注入する。ここでは、この血液So中に被検出物質である抗原Aが含まれている場合について説明する。図14において血液Soは網掛け領域で示している。
step2:血液Soはメンブレンフィルタ26により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルタ26で血球分離された血液S(血漿)が毛細管現象で流路23に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Sをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図14において血漿Sは斜線領域で示している。
step3:流路23に染み出した血漿Sと、流路23の検出部上流側に乾燥状態で配置された標識2次抗体BFとが混ぜ合わされ、血漿S中の抗原Aが標識2次抗体BFと結合する。
step4:血漿Sは流路23に沿って空気孔25b側へと徐々に流れ、標識2次抗体BFと結合した抗原Aが、測定用のセンサ部28上に固定されている1次抗体B1と結合し、抗原Aが1次抗体B1と標識2次抗体BFで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
step5:結合しなかった標識2次抗体BFの一部は、リファレンス用の検出部29上に固定されている1次抗体B0と結合する。さらに、1次抗体B0と結合しなかった標識2次抗体BFが検出部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、検出部上に浮遊している標識2次抗体BFを洗い流す。
第2の実施形態に係る全反射照明型センサチップC2(誘電体プリズムの材料:PMMA、金属膜:Auの蒸着膜、金属膜の厚さ:50nm、研磨痕:y軸方向に指向性を有する(図4A))を用い、抗原としてhCG(抗原濃度:90pM)、抗体として抗hCGを反応させ、2次反応後PBSで洗浄し、図13に示す蛍光検出装置によりセンシング測定を行った。その結果、図15Aに示すような検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比が得られた。
研磨痕がx軸方向に指向性を有する(図4B)点以外は実施例のセンサチップC2と同じ条件のセンサチップを用い、実施例と同様のセンシング測定を行った。その結果、図15Bに示すような検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比が得られた。
図15AおよびBにおけるNoise中のn1は標識の非特異的吸着によるノイズを表し、n2は装置或いは光学系の自家蛍光によるノイズを表し、そしてn3は電子機器を扱う際に生じる電子的なノイズを表している。実施例では、上記のn2を低減することができることが実証された。また全体的にも、実施例では検出信号全体に対するノイズの構成比が約26%であるのに対し、比較例ではそれが約33%となっていることから、本発明に係るセンサチップC2を用いることによりノイズを低減できていることがわかる。実施例および比較例のS/N比は、それぞれ2.8および2.0である。これは、測定系の検出限界が(S/N比>0.03)という場合には、実施例では1pMまで、比較例では1.5pMまで測定可能であることを示している。したがって、実施例では検出限界が1.5倍改善されたことが立証された。また、実施例および比較例においてPBSでの洗浄を行わない場合には、サンドイッチを形成していない浮遊標識を研磨痕から漏れた測定光が励起してしまうため、それぞれのS/N比の差が大きくなった。具体的には、実施例(洗浄なし)では検出限界が2倍改善された。
C1 全反射照明型センサチップ
C2 全反射照明型センサチップ
Ew 増強電場
F 蛍光標識
L 測定光
Lf 蛍光
Ls 散乱光
10 誘電体プリズム
10a 金属膜形成面
10b 透過面
11 側壁材
12 フタ材
13 流路
14a・14b 金属膜
15a・25a 注入口
15b・25b 空気孔
20 誘電体プリズム
20a 金属膜形成面
22 フタ材
23 流路
24a・24b 金属膜
26 メンブレンフィルタ
50 研磨材
52 研磨痕
60・61 成型用の型
Claims (15)
- 誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜上に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、
前記一面である金属膜形成面の領域であって前記金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであることを特徴とする全反射照明型センサチップ。 - 前記誘電体プリズムが、前記測定光を透過させるための透過面を有するものであり、
前記透過面が、該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成されているものであることを特徴とする請求項1に記載の全反射照明型センサチップ。 - 前記測定光の前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となることを特徴とする請求項1または2に記載の全反射照明型センサチップ。
- 前記エバネッセント波および前記金属膜の共鳴により生じる表面プラズモンの伝播方向と、前記研磨痕が指向性を有する方向とが略平行となることを特徴とする請求項1から3いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
- 空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、+10%以上であることを特徴とする請求項1から4いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
- 前記誘電体プリズムが、合成樹脂材料からなるものであることを特徴とする請求項1から5いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
- 誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
前記誘電体プリズムを成形し、
前記一面である金属膜形成面を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨することを特徴とする全反射照明型センサチップの製造方法。 - 前記誘電体プリズムを成形すると共に、前記測定光を透過させるための透過面を該誘電体プリズムに形成し、
該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように、前記金属膜形成面を研磨することを特徴とする請求項7に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。 - 空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、+10%以上となるように、前記金属膜形成面を研磨することを特徴とする請求項7または8に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
- 前記誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることを特徴とする請求項7から9いずれかに記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
- 誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
前記誘電体プリズムを成型するための型の部分であって前記一面である金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、
前記型を用いて前記誘電体プリズムを成型することを特徴とする全反射照明型センサチップの製造方法。 - 前記誘電体プリズムを成型すると共に、前記測定光を透過させるための透過面を、該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することを特徴とする請求項11に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
- 空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、+10%以上となるように、前記型の前記金属膜形成面に対応する部分を研磨することを特徴とする請求項11または12に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
- 前記誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることを特徴とする請求項11から13いずれかに記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
- 金属膜が一面に形成された誘電体プリズム有する全反射照明型センサチップを用いて、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法において、
前記一面である金属膜形成面の領域であって前記金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであり、
前記指向性を表す指向ベクトルと、前記測定光の前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、前記測定光を前記界面に対し照射することを特徴とするセンシング方法。
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