FI81680C - Homogen fluorecens immunoanalys baserad pao ett ljusabsorberande aemne. - Google Patents
Homogen fluorecens immunoanalys baserad pao ett ljusabsorberande aemne. Download PDFInfo
- Publication number
- FI81680C FI81680C FI855019A FI855019A FI81680C FI 81680 C FI81680 C FI 81680C FI 855019 A FI855019 A FI 855019A FI 855019 A FI855019 A FI 855019A FI 81680 C FI81680 C FI 81680C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- analyte
- amount
- bound
- sensor
- emission
- Prior art date
Links
- PKKGEIBGGOIGKN-UHFFFAOYSA-N CC(C1=C(C)CCC1)=C Chemical compound CC(C1=C(C)CCC1)=C PKKGEIBGGOIGKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
Description
λ 81 6 υ
Valoa absorboivaan aineeseen perustuva homogeeninen fluo-resenssi-immunoanalyysi
Keksinnön kohteena on analyytin immunoanalyysi sekä 5 siinä käytettäviä aineksia ja erityisesti sen kohteena on menetelmä ja aineksia immunoanalyysiä varten, joka ei vaadi sidottujen ja vapaiden jakeiden erottamista.
On kehitetty joukko erilaisia analyysijärjestelmiä, jotka ovat sekä nopeita että herkkiä, nesteessä olevan ai-10 neen pitoisuuden määrittämiseksi. Immunoanalyysit riippuvat jonkun antigeenin tai hapteenin sitoutumisesta spesifiseen vasta-aineeseen ja ovat olleet erityisen käyttökelpoisia, koska ne antavat hyvin korkeat spesifisyys- ja herkkyystasot. Näissä analyyseissä käytetään yleisesti 15 jotakin edellä mainituista reagensseista merkatussa muodossa, jolloin merkattua reagenssia usein nimitetään tun-toaineeksi. Immunoanalyysiprosessit voidaan toteuttaa liuoksessa tai kiinteällä kantimella ja voivat olla joko heterogeenisiä tai homogeenisiä. Heterogeeniset analyysit 20 vaativat sidotun tuntoaineen erottamista vapaasta "sitoutumattomasta" tuntoaineesta. Homogeeniset analyysit eivät vaadi erotusvaihetta ja antavat siten merkittävän edun nopeudessa, mukavuudessa ja automaation helppoudessa heterogeenisiin analyyseihin verrattuina.
25 Radioimmunoanalyysi (RIA)-menetelmissä käytetään merkkiaineina radio-isotooppeja, ne antavat korkeat herkkyys- ja toistettavuustasot ja ovat mukautettavissa auto-matioon suurten määrien näytteitä nopeasti käsittelemiseksi . RIA-prosessit vaativat kuitenkin erotusvaiheen, koska 30 mitattua parametriä (ytimen hajoamista) ei voida säädellä vaihtamalla analyysiolosuhteita tai -komponentteja. Lisäksi isotoopit ovat kalliita, niillä on suhteellisen lyhyt varastointiaika, ne vaativat kalliin ja monimutkaisen laitteiston ja niiden käsittelemiseksi ja hävittämiseksi 35 täytyy noudattaa laajoja turvallisuustoimenpiteitä.
2 816ο0
Immunoanalyysissä on käytetty merkkiaineina myös entsyymejä. Entsyymi-immunoanalyysi (EIA) voi olla homogeeninen eikä vaadi varotoimia radioaktiivisuutta vastaan. Entsyymin konjugointi proteiinin kanssa on tavallisesti 5 suoraan etenevä ja syntynyt proteiinientsyymikonjugaatti on yleensä pysyvä. EIA riippuu kuitenkin entsyymikonjugaa-tin reaktiosta substraatin kanssa antamaan väri, joka mitataan, ja vaatii siten ylimääräisen vaiheen entsyymisub-straatin aikaansaamiseksi. Lisäksi täytyy varata riittä-10 västi aikaa värin kehittymiselle ja täytyy olla käytettävissä kallis spektrofotometri värin muutoksen mittaamiseksi .
Jotkut edellä mainituista RIA:han tai EIA:han liittyvät haitat on voitettu käyttämällä fluorokromeja merkki-15 aineina immunoanalyysissä. Fluori-immunoanalyysi (FIA) antaa merkkiaineen suoran havaitsemisen ja on helposti sovitettavissa homogeenisiin analyysimenetelmiin. Tunnetut homogeeniset FIA-menetelmät orgaanisia fluorokromeja, kuten fluoreseiiniä tai rodamiini-johdannaisia käyttäen, 20 eivät kuitenkaan ole saavuttaneet RIA:n tai EIA:n suurta herkkyyttä, suuresti valon hajaantumisen johdosta epäpuhtauksien vaikutuksesta, jotka ovat suspendoituneina ana-lyysiväliaineeseen, sekä taustafluoresenssi-emission vaikutuksesta muista analyysiväliaineessa läsnäolevista fluo-25 roivista aineksista. Sironta on erityisen hankala fluoro-kromeilla, joilla on lyhyt (50 nm tai pienempi) Stoke'n siirtymä (erotusabsorption ja emission aallonpituuden välillä). Esimerkiksi fluoreseiini-isotiosyanaatin Stoke'n siirtymä on ainoastaan 20-30 nm. Tausta-fluoresenssi on 30 erityisen häiritsevä, kun analyysiväliaine on seerumi. Analyysin herkkyys seerumissa voi vähentyä 100-kertaiseksi asti verrattuna samanlaiseen analyysiin puskurissa.
Aika-hajaantuvan fluoro-immunoanalyysin (TR-FIA) kehittäminen on myötävaikuttanut näiden ongelmien voitta-35 miseen. Tässä menetelmässä fluorokromi-merkkiaine, jolla
II
3 81 6 r i O
on suhteellisen pitkä fluoresenssi-emission hajaantumisai-ka, herätetään valopulssilla ja fluoresenssiemissio merkkiaineesta mitataan ennalta valitun viivytyksen jälkeen. Lyhyen hajaantumisajan (yleensä alle noin 10 ns) tausta-5 emissio loppuu pääasiallisesti viivytyksen aikana ja ei siten häiritse spesifisen emission merkkiaineesta mittaamista. TR-FIA on tehokkain, kun fluoroivan merkkiaineen hajaantumisaika on 100-1000 ns ja sillä on pitkä Stoke'n siirtymä (100 nm tai suurempi).
10 Eräs ryhmä merkkiaineita, jotka täyttävät TR-FIA:n vaatimukset, on lantanidi-kelaatit. Lantanidi-ionit, erityisesti europiumin ja terbiuminionit muodostavat pitkän Stoke'n siirtymän (250 nm:ään asti) erittäin fluoroivia kelaatteja orgaanisten ligandien, erityisesti B-diketonien 15 kanssa. Kelaatin ligandi-osa absorboi herätevaloa ja siirtää absorboituneen energian kelatoituun metalli-ioniin. Metalli-ioni säteilee energiaa fluoresenssinä, jolla on poikkeuksellisen pitkä hajoamisaika (1 ms). Esitys lanta-nidikelaattien käytöstä TR-FIA:ssa annetaan julkaisussa 20 Analytical Biochemistry, 137, 335 (1984).
Wieder'ille myönnetty US-patentissa nro 4 058 732 esitetään menetelmä ja laite lantanidikelaattien ja aika-hajotuksen käyttämiseksi analyyttisessa fluoroivassa spektroskopiassa.
25 Frank'ille et ai. myönnetyssä US-patentissa nro 4 283 382 esitetään parannus TR-FIA:hän, jossa patentissa lantanidikelaatti-merkkiaine yhdistetään polymeeriseen helmikidehilaan merkkiaineen veden aiheuttaman fluoresenssi-emission poistamiseksi.
30 Soini'ille et ai. myönnetyssä US-patentissa nro 4 374 120 esitetään lantanidikelaattien lisääntynyt pysyvyys, joka on saavutettu lantanidin, β-diketonin ja ami-nopolykarboksyylihappo-analogin, jossa on funktionaalinen ryhmä, joka on käyttökelpoinen kelaatin sitomiseksi pro-35 teiiniin, l:l:l-kelaatti.
4 8 1 6 i j 0
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EPO 064 484-A2 esitetään TR-FIA-menetelmä, jossa määritettävä aine kytketään lantanidiin aminokarboksyylihappo-analogil-la, ja inkuboinnin jälkeen lantanidi lohkaistaan määritet-5 tävästä aineesta ja kelatoidaan B-diketoniin ennen havaitsemista.
Vaikkakin edellä mainituilla menetelmillä on parantunut FIA, on edelleen olemassa tarve löytää FIA, jolla on suuri herkkyys ja joka voidaan toteuttaa nopeasti tarvit-10 sematta sidottujen ja vapaiden jakeiden erottamista.
Tämän keksinnön yhtenä kohtana on menetelmä analyy-tin kiintofaasi-immunoanalyysiä varten erottamatta sidottuja ja vapaita jakeita. Kiinteän kantimen pintaan sidottu antianalyytti saatetaan kosketukseen analyytin sisältävän 15 nesteen, valoa absorboivan aineksen ja tuntoaineen ana-lyyttiä varten, kanssa, johon on sidottu merkkiaine, joka absorboi ja säteilee valoa. Analyysiseoksen inkuboinnin jälkeen kohdistetaan herätevaloa ja valon säteily mitataan aikahajotuksella. Valonsäteilyn suuruusluokkaa verrataan 20 valonsäteilyn suuruusluokkaan, joka on mitattu kun yksi tai useampi tunnettu määrä analyyttiä analysoidaan pääasiallisesti samanlaisissa olosuhteissa.
Keksinnön menetelmän eräässä edullisessa suoritusmuodossa merkkiaine on fluoroiva väriaine, jolla on suh-25 teellisen pitkä hajoamisaika, ja valoa absorboiva aines on UV-absorboiva yhdiste, jolla on absorptio-nauha, joka limittyy tuntoaineen absorptio-nauhan päälle.
Keksinnön menetelmän eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa analyytti on seerumi-näyte, valoa absor-30 boiva aines on aryyliaminonaftaleenisul£onihappo, tuntoai-ne on lantanidikelaatti, joka on yhdistetty polymeeriseen osaseen, joka on sidottu analyyttiin, ja tuntoaine ja analyytti kilpailevat riittämättömästä määrästä anti-analyyt-tisitomiskohtia.
35 Keksinnön menetelmän eräässä toisessa suoritusmuo dossa pääasiallisesti kaikki analyytti sitoutuu sekä anti- li
5 81 6 ί; O
analyyttiin että tuntoaineeseen kerroksittaisessa analyysissä.
Keksinnön toisena kohteena on sarja aineksia keksinnön menetelmän toteuttamista varten.
5 Keksinnön menetelmän mukaisesti toteutetaan kiin- tofaasi-TR-FIA, joka ei vaadi sidottujen ja sitomattomien jakeiden erottamista, jolloin saavutetaan homogeenisten määritysten suorituksellinen yksinkertaisuus, nopeus ja mukavuus. Merkkiaine havaitaan suoraan ilman lisä-subs-10 traattia tai inkuboimisjaksoa havaittavan aineksen kehittämiseksi. Keksinnön menetelmä antaa erittäin herkän homogeenisen analyysin, joka on pääasiallisesti vapaa häiritsevästä säteilystä muista fluoroivista aineksista, jolloin yyvin pienessä pitoisuudessa läsnäoleva analyytti voidaan 15 tarkasti määrittää. Koska menetelmä on poikkeuksellisen helppo toteuttaa, se on helposti sovitettavissa automa-tointiin.
Kuvio 1 esittää putkea ja muita komponentteja, joilla on käyttöä keksinnön menetelmän mukaisessa kilpai-20 levässä immunoanalyysissä; kuvio 2 on analyysin standardi käyrä digoksiinille analyysisiä keksinnön menetelmän mukaisesti; ja kuvio 3 on standardi käyrä analyysille ihmisen ko-riongonadotropiinia (HCG) varten keksinnön menetelmän mu-25 kaisesti.
Tällä keksinnöllä on useita suoritusmuotoja, joista tässä selostetaan yksityiskohtaisesti keksinnön edullisia suoritusmuotoja, samalla kun on ymmärrettävä, että tätä esitystä tulee pitää esimerkinomaisena keksinnön periaat-30 teista eikä se ole tarkoitettu rajoittamaan keksintöä kuvattuihin suoritusmuotoihin. Keksinnön piiri mitoitetaan oheisin patenttivaatimuksin ja niiden kanssa samanarvoisin esityksin.
Keksinnön menetelmän mukaisesti jossakin nesteessä 35 läsnäolevan aineen pitoisuus voidaan määrittää immunologi sen reaktion avulla. Aine, jota tämän jälkeen nimitetään 6 816^0 analyytiksi, voi olla antigeeni, hapteeni tai vasta-aine ja se voi olla läsnä jossakin sopivassa nesteessä. Neste voi olla esimerkiksi puskuri, suolaliuos tai kehon neste kuten seerumi tai virtsa. Joissakin tapauksissa analyytti 5 voidaan eristää kehon nesteestä ja sen jälkeen viedä erilaiseen nesteeseen, kuten puskuriin, määritystä varten.
Käsitteellä "immunologinen reaktio", kuten sitä tässä käytetään, tarkoitetaan antigeenin ja vasta-aineen, hapteenin ja vasta-aineen tai jonkun antigeenin kanssa 10 sopivan analogisen aineen, vasta-aineen tai hapteenin, joka myös sitoutuu spesifisesti, spesifistä sitomisreaktio-ta.
Keksinnön menetelmän immunologinen reaktio saatetaan tapahtumaan kiinteän kantimen pinnalla. Kuten alalla 15 on tunnettua, voi kiinteä kännin olla kännin, joka ei häiritse analyysiä. Esimerkkejä kiinteistä kantimista, joita voidaan käyttää, ovat lasi ja polymeeri-ainekset, kuten polyetyleeni, polystyreeni jne. Tällaiset kantimet voidaan valmistaa johonkin sopivaan muotoon, kuten arkeiksi, le-20 vyiksi, syvennyksiksi tai edullisesti putkiksi. Keksinnön edullisimmassa suoritusmuodossa immunologinen reaktio saatetaan tapahtumaan putken, edullisesti muoviputken, jonka toinen pää on suljettu, sisäseinillä ja pohjalla.
Anti-analyytti sidotaan kiinteän kantimen pintaan. 25 Anti-analyytti voi olla antigeeni tai vasta-aine, joka reagoi spesifisesti analyytin kanssa, tai se voi olla joku sen sopiva analogi, joka reagoi spesifisesti analyytin kanssa. Anti-analyytin sitominen kiinteään kantimeen voidaan suorittaa jollakin tavanomaisella menetelmällä, kuten 30 esimerkiksi absorptiolla tai kovalenttisesti sitomalla.
Nämä menettelytavat ovat alalla hyvin tunnettuja eikä enempiä yksityiskohtia näissä suhteissa pidetä tarpeellisena keksinnön täydellisesti ymmärtämiseksi.
Kiinteään kantimeen sidottavan anti-analyytin mää-35 rä riippuu suoritettavasta analyysi-tyypistä. Kilpailevassa immunoanalyysissä, joka tässä ensimmäisenä selostetaan,
II
7 81680 sidotaan rajoitettu määrä anti-analyyttiä, jolloin sito-miskohtia on käytettävissä riittämättömästi ja analyytti ja tuntoaine analyyttiä varten, joka seuraavassa selostetaan, kilpailevat käytettävissä olevista paikoista. Ker-5 roksittaisessa analyysissä, joka selostetaan myöhemmin, sidotaan ylimäärin anti-analyyttiä, jolloin pääasiallisesti kaikki analyytti sitoutuu anti-analyyttiin.
Keksinnön menetelmän mukaisessa kilpailevassa analyysissä kiinteään kantimeen sidottu anti-analyytti saate-10 taan kosketukseen tuntemattoman määrän kanssa nesteessä olevaa analyyttiä ja analyysiväliainetta inkuboidaan kuten seuraavassa selostetaan, immunologisen reaktion aikaansaamiseksi analyytin ja anti-analyytin välillä. Sitten lisätään tuntoainetta analyyttiä varten ja jälkeentuleva inku-15 bointi suoritetaan niin, että analyysiväline sisältää vapaata analyyttiä, vapaata tuntoainetta, sidottua analyyttiä ja sidottua tuntoainetta. Vaihtoehtoisesti ja edullisesti analyytti ja tuntoaine lisätään samanaikaisesti ja suoritetaan yksinkertainen inkubointi. Analyyttiä ja tun-20 toainetta, jotka ovat sitoutuneet anti-analyyttiin kiinteällä kantimella, nimitetään tämän jälkeen sidotuksi ja-keeksi ja analyyttiä ja tuntoainetta, jotka eivät sitoudu anti-analyyttiin, nimitetään tämän jälkeen vapaaksi ja-keeksi.
25 Tuntoaine antaa keinon seurata immunologisen reak tion kulkua ja, kilpailevassa analyysissä, se käsittää edullisesti tunnetun määrän analyyttiä tai sen sopivaa analogia sidottuna merkkiaineeseen. Merkkiaine voi olla jokin aine, joka absorboi ja säteilee valoa ja joka voi-30 daan kytkeä analyyttiin. Edullinen merkkiaine säteilee pitkän hajotusajan valoa, edullisemmin pitkän hajotuksen fluoresenssisäteilyä, joka tekee mahdolliseksi sidotun tuntoaineen havaitsemisen ilman olennaista häirintää muista valoa säteilevistä aineksista analyysisysteemissä.
35 Edullisimmat merkkiaineet absorboivat herätevaloa, jonka aallonpituus on noin 280-375 nm, säteilevät fluoresenssiä, β 816.0 jonka aallonpituus on noin 580-630 nm, ja niiden Stoke'n siirtymä on noin 200-250 nm. Edullisimpien merkkiaineiden fluoresenssiemission hajoamisaika on noin 0,5-1,0 ms.
Pitkän hajoamisajan fluoroivat merkkiaineet, jotka 5 ovat käyttökelpoisia keksinnön mukaisessa menetelmässä, ovat pyreeni-johdannaisia, ja edullisesti lantanidi-ke-laatteja. Merkkiaineiden jälkimmäinen ryhmä käsittää lant-anidi-ionin, kuten europiumin tai terbiumin, ionin, joka on kelatoitunut orgaanisen ligandin, kuten esimerkiksi B-10 diketonin kanssa. Esimerkkejä käyttökelpoisista β-diketo-neista ovat bentsoyyliasetoni, dibentsoyylimetaani, te-noyylitrifluoriasetoni, bentsoyylitrifluoriasetoni, nafto-yylitrifluoriasetoni, asetyyliasetoni, trifluoriasetyyli-asetoni, heksafluoriasetyyliasetoni jne. β-diketonin kela-15 tointi lantanidi-ionin kanssa suoritetaan totunnaisesti inkuboimalla reagoivia aineita sopiva aika. Lantanidike-laatin määrä, jota on käytettävä tuntoaineen valmistuksessa, riippuu suoritettavasta analyysityypistä ja analyytin määrästä nesteessä ja on alaan perehtyneiden hyvin tunte-20 ma.
Lantanidikelaatti-merkkiaine voidaan sitoa suoraan analyyttiin tavanomaisin menetelmin tuntoaineen valmistamiseksi. Vaihtoehtoisesti ja edullisesti merkkiaine yhdistetään osaseen ja osanen sidotaan analyyttiin anta-25 maan tuntoaine. Osanen voi olla polymeeri-osanen, kuten helmi. Voidaan käyttää mitä tahansa polymeeriä, joka pystyy yhdistymään merkkiaineen kanssa ja sitoutumaan analyyttiin. Edulliset polymeerit ovat pääasiallisesti läpinäkyviä sekä herätevalolle että fluoresenssiemissiolle 30 eivätkä joudu olennaiseen määrään ei-spesifisiin pinta- reaktioihin muiden proteiinien kuin analyytin kanssa, kuten esimerkiksi muiden seerumissa olevien proteiinien kanssa. Eräs erityisen edullinen polymeeri merkkiaineeseen yhdistettäväksi on polyakrylaatti, kuten esimerkiksi po- 35 lymetyylimetakrylaatti.
Il 9 81 6 80
Merkkiaine yhdistetään osaseen tavanomaisin menetelmin. Esimerkiksi, polymeeriosanen, joka sisältää merkkiainetta, voidaan valmistaa monomeerin emulsiopolymeroin-nilla liuoksessa, joka sisältää merkkiainetta. Samoin osa-5 nen sidotaan analyyttiin tavanomaisin menetelmin, edullisesti kovalenttisesti sitomalla sopivia funktionaalisia ryhmiä analyytille ja osasen pinnalle. Tavanomaiset menetelmät merkkiaineen yhdistämiseksi osaseen ja osasen sitomiseksi analyyttiin ovat hyvin tunnettuja ja niiden katso-10 taan kuuluvan alaan perehtyneiden tietopiiriin eivätkä enemmät yksityiskohdat näiden perusosien suhteen ole tarpeen keksinnön täydellisesti ymmärtämiseksi.
Kantimella olevan anti-analyytin sisältävää analyy-siväliainetta, analyytin sisältävää nestettä ja tuntoa!-15 netta voidaan inkuboida missä tahansa lämpötilassa ja mikä tahansa aika, joka on sopiva helpottamaan immunologista reaktiota ja siten antamaan edellä mainitut sidotut ja vapaat jakeet. Inkubointi voidaan suorittaa lämpötiloissa väliltä noin 0-50°C, edullisesti välillä noin 30-40°C ja 20 siitä voi olla, mutta ei tarvitse olla tuloksena tasapaino näiden jakeiden välillä.
Valoa absorboivaa ainesta lisätään analyysisystee-miin joko ennen immunologista reaktiota tai sen jälkeen ja se voi olla joku aines, jolla on absorptio-nauha, joka li-25 mittyy tuntoaineen absorptio-nauhan päälle ja ei häiritse immunologista reaktiota. Esimerkkejä sopivista absorboivista aineksista, mutta rajoittumatta niihin ovat stilbee-nit, bentsoksatsolit, naftaleenit sekä niiden johdannaiset. Erään edullisen ryhmän muodostavat aryyliaminonafta-30 leenisulfonihapot, kuten esimerkiksi, 2-(p-anisidinyyli)-naftaleeni-6-sulfonihappo tai l-aniliininaftaleeni-8-sul-fonihappo (1,8-ANS). Absorboivan aineksen pitoisuus ana-lyysiväliaineessa on noin 10'2 - 10~6M, edullisesti noin 10’3 - io-“m.
35 Sidottu tuntoaine havaitaan kohdistamalla heräte- valo ja mittaamalla valoemissio merkkiaineesta valoa ab- ίο 816 U 0 sorboivan aineksen läsnäollessa. Herätevalon aallonpituus on edullisesti käytetyn merkkiaineen absorptio-alueen sisällä. Kun merkkiaine on lantanidikelaatti, herätevalon aallonpituus on edullisesti noin 280-375 nm, edullisimman 5 noin 343 nm ja se on epäjatkuva, ts. valosykäykset vuorot-televat jaksojen mukana, kun valolähde on poiskytketty. Valosykäykset voivat olla kestoltaan noin 0,1-10 ps, edullisesti noin 3 ps. Jaksot, jolloin valolähde on poiskytketty, voivat olla noin 0,1-2,0 ms, edullisesti noin 0,9 10 ms.
Valoemissio mitataan edullisesti aikaohjauksella noin 0,1-0,5 ms:n, edullisesti noin 0,5 ms:n viivytyksen jälkeen täydellisestä sykäyksestä. Valoemission aallonpituus riippuu käytetystä merkkiaineesta. Kun merkkiaine on 15 lantanidikelaatti, emission aallonpituus on yleensä noin 580-630 nm. Edullisimmin emissio mitataan aallonpituudella noin 614 nm.
Valoemission mittaaminen aikaohjauksella keksinnön edullisen menetelmän mukaisesti voidaan suorittaa tavan-20 omaisessa spektrofotometrissä kuten esimerkiksi Spex L-lll
Fluorimeter-laitteessa (SPEX Industries, Inc., Edison, N.J), joka on varustettu portti-fotonidetektorilla. Emissio voidaan mitata missä tahansa kulmassa herätevalonsä-teen suhteen. Edullisesti emissio mitataan noin 2-20°:n 25 kulmassa herätevalon säteestä.
Analyysisysteemin nestefaasissa oleva valoa absorboiva aines absorboi kaiken heräte- ja/tai emissiovalon, joka kulkee nestefaasin läpi ja estää siten tehokkaasti emission havaitsemisen vapaasti tuntoaineesta. Toisaalta 30 sidottu tuntoaine absorboi ja säteilee senjälkeen havaittavaa valoa, joka ei ole kulkenut nestefaasin läpi.
Keksinnön menetelmä ja komponentit on kuvattu kuvassa 1, jossa analyysisysteemi 10 käsittää edullisesti polystyreeni-putken 13, jossa on avoin pää 11 ja suljettu 35 pää 12. Putki 13 sisältää sidotun jakeen 15 ja nestefaasin 17. Sidottu jae 15 sisältää anti-analyytin 19 kiinnitty-
11 81 6 o O
neenä putken 13 sisäseiniin sekä sidotun analyytin 21 ja sidotun tuntoaineen 23. Sidottu tuntoaine 23 käsittää sidotun analyytin 21, Johon on kiinnittynyt polymeeri-osanen 25, johon on yhdistetty fluoroivaa värimerkkiainetta 27.
5 Nestefaasi 17 sisältää vapaan analyytin 21a, vapaata tun-toainetta 23a ja valoa absorboivaa ainesta 29.
Herätevalo, joka on kaavamaisesti kuvattu viite viivalla 31, kulkee putken 13 läpi ja se absorboituu ainekseen, tai se voi kulkea putken 13 läpi ja absorboitua 10 sidotulla tuntoaineella 23 tai vapaalla tuntoaineella 23a. Fluoresenssiemissio sidotusta tuntoaineesta 23 käsittää emission 33a nestefaasiin 17, jossa se absorboituu ainekseen 29, sekä emission 33b ulospäin putken 13 läpi kulkematta nestefaasin 17 läpi, jolloin se havaitaan fluorimet-15 rillä 35. Emission 33c vapaasta tuntoaineesta 23a neste faasiin 17 absorboi aines 29.
Kiinteästä kantimesta heijastunut herätevalo ei häiritse emission mittausta sidotusta tuntoaineesta, koska emissio mitataan, kun valolähde on poiskytketty. Lyhyen 20 hajoamisajan taustavaloemissio, joka liittyy seerumiin ja muihin fluoroiviin aineksiin analyysiväliaineessa, käsittäen myös sen, joka on yhdistynyt itse kiinteään kanti-meen, poistuu pääasiallisesti emission aikahajaantumismit-tauksella. Siten keksinnön menetelmän mukaisesti ainoa ha-25 vaittu valonsäteily tapahtuu kiinteän kantimen pinnalle sidotusta tuntoaineesta.
Kilpailevassa analyysissä, kuten tässä edellä kuvattiin, valoemission suuruusluokka on suoraan verrannollinen sidotun tuntoaineen määrään ja on siten kääntäen 30 verrannollinen nesteessä läsnäolevan analyytin määrään. Nesteessä olevan analyytin pitoisuus voidaan määrittää vertaamalla valoemission suuruusluokkaa mitattuna analyytin analyysin jälkeen emissioon, joka on mitattu analysoidun analyytin tunnettujen määrien alueen analyysillä pää-35 asiallisesti samanlaisissa olosuhteissa. Keksinnön menetelmää voidaan sovittaa kiintofaasi-kerrosanalyysiin. Tä- 12 816:0 mäntyyppinen analyysi on erityisen edullinen makromolekyy-lisen analyytin, kuten esimerkiksi jonkun proteiinin analysoimiseksi. Voidaan käyttää mitä tahansa kiintofaasi-kerrosanalyysin muunnosta. Esimerkiksi anti-analyyttiä 5 voidaan sitoa kiinteään kantimeen riittävässä määrässä sitomaan pääasiallisesti kaikki analyytti ensimmäisen determinantin kautta analyytillä. Kantimessa olevaa anti-analyyttiä voidaan inkuboida analyytin, valoa absorboivan aineksen ja tuntoaineen kanssa, jolloin tuntoaine on mer-10 kattu ligandi, joka on spesifinen toiselle determinantille analyytillä. Ligandi voi olla antigeeni, vasta-aine tai sidottu antigeeni-vasta-aine-kompleksi.
Edullinen merkkiaine ja valoa absorboiva aines sekä edullinen menetelmä emission herättämiseksi ja havaltsemi-15 seksi voivat olla kuten edellä selostettiin kilpailevalle analyysille. Keksinnön tämän suoritusmuodon kerros-analyysissä nesteessä olevan analyytin pitoisuus on kuitenkin suoraan verrannollinen valoemission suuruuteen.
Keksinnön toisen kohdan mukaisesti annetaan aines-20 ten reagenssi-sarja tai -pakkaus analyysin suorittamiseksi analyytin suhteen keksinnön menetelmän mukaisesti. Sarja sisältää kiinteän kantimen, johon on sidottu anti-analyyt-ti, joka on spesifinen analyytille, valoa absorboiva aines ja tuntoaine analyyttiä varten, johon tuntoaineeseen on 25 sidottu merkkiaine, joka pystyy absorboimaan herätevaloa ja säteilemään havaittavaa valoa. Sarja voi sisältää myös standardeja analyyttiä varten, kuten esimerkiksi yhden tai useamman analyytti-näytteen, jolla on tunnettu pitoisuus, tai se voi sisältää muita reagensseja, kuten muita merkat-30 tuja tai merkkaamattomia spesifisiä antigeenejä, vasta- aineita tai niiden komplekseja, jotka ovat käyttökelpoisia analyysin toteutuksessa. Sarjan aineosat voidaan toimittaa erillisissä säiliöissä, kuten esimerkiksi ampulleissa, tai kaksi tai useampia aineosia voidaan yhdistää yhteen ai-35 noaan säiliöön.
li
13 816 υ O
Seuraavat esimerkit mallisysteemistä Ja analyysistä dikoksiinin suhteen annetaan keksinnön edelleen selostamiseksi, mutta niitä ei ole millään tavalla tarkoitettu keksintöä rajoittaviksi.
5 Esimerkki I
Noin 150 nm:n polymetyylimetakrylaatti-helmiä, jotka sisälsivät 1 % naftoyylitrifluoriasetoni-europiumke-laattia (NTFA3Eu), suspendoitiin veteen ja suihkutettiin polystyreeni-kyvettien pinnalle. Ryvettejä kuivattiin yli 10 yön ympäristön lämpötilassa, jolloin helmet tarttuivat pintaan eikä niitä voitu poistaa vedellä pesemällä. Tällä tavalla päällystettyjä kyvettejä käytettiin edustamaan TR-FIA:n sidottua jaetta, ts. kiinteätä kanninta, johon oli sidottu anti-analyytti ja tuntoaine.
15 Vesipitoinen suspensio, jossa oli noin 1 x 104 hel- meä/ml, lisättiin kaikkiin kyvetteihin edustamaan TR-FIA:n nestefaasia, joka sisältää vapaan tuntoaineen.
1,8-ANS'n vesipitoisia liuoksia, joiden pitoisuudet on annettu taulukossa I, lisättiin kyvetteihin. Yhteen 20 kyvettiin lisättiin pelkästään vettä.
Käyttäen Spex L-lll fluorimetriä, joka oli varustettu portti-fotonidetektorilla, kohdistettiin heräteva-lolla 343 nm:ssä suorakulmaisesti kyvetteihin. Fluoresens-slemissio 614 nm:ssä mitattiin 0,5 ms:n viivytyksen jäl-25 keen kuumilla 11° ja 90° herätysvalosäteen suhteen. Tulokset on annettu taulukossa I ja ne osoittavat 1,8-ANS-pi-toisuuden vaikutuksen suspendoitujen helmien fluoresenssi-emissioon .
Taulukko I
30 l,8-ANS:n pitoisuus Havaittujen fotonien luku-(moolia/litra) määrä _11°_90° 0 31,500 32,300 1 x 10'2 1,300 45 35 1 x 10'3 1,300 876 1 x 10*4 27,200 31,400
14 81 6 ij O
Nähdään, että 1,8-ANS, jonka pitoisuus on 1 x 10"3M, poisti kaiken emission paitsi sidottuihin palloihin luettuja helmiä.
Esimerkki II
5 Kolmen kyvetin kaksi ryhmää päällystettiin kumpikin kuten esimerkissä I, helmien kahdella erilaisella pitoisuudella. Yksi kyvetti kummastakin ryhmästä sai vettä ja edusti TR-FIA:n sidottua jaetta. Toinen kyvetti kussakin ryhmässä sai helmien suspensiota ja edusti TR-FIA:n sidot-10 tuja ja vapaita jakeita. Kolmas kyvetti kussakin ryhmässä sai helmien, jotka sisälsivät 5 x 10_3M 1,8-ANS:n helmiä.
Fluoresenssiemission herättäminen ja mittaaminen ll°:ssa suoritettiin kuten esimerkissä I selostettiin. Tulokset on annettu taulukossa 11.
15 Taulukko II
Havaittujen fotonien lukumäärä _Kyvetti 1 Kyvetti 2 Päällystetty kyvetti + vesi 2,300 40,000 20 (sidottu jae) Päällystetty kyvetti + suspen- 32,400 71,000 doidut helmet (sidotut ja vapaat jakeet) Päällystetty kyvetty + suspen- 2,700 38,000
25 doidut helmet + 5 x 10'3M
1,8-ANS (sidotut ja vapaat jakeet ja valoa absorboiva aines) Nähdään, että absorboivan aineen läsnäollessa ky-30 vetti-pinnalla (sidottu aines) olevat helmet herätettiin selektiivisesti ja niiden fluoresenssiemissio havaittiin suuren ylimäärän helmiä suspensiossa läsnäollessa (vapaa jae).
Esimerkki III
35 A. Fluoroivien polymeeri-osasten valmistus
Valmistettiin polymeeri-helmi, joka sisälsi paino-
II
15 81 6 u O
suhteessa 92:6:2 butyylimetakrylaatti/glysidyylimetakry-laatti/sulfoetyylimetakrylaattia, joka sisälsi 1 % NTFA3Eu, seuraavalla tavalla. Bls-metyleenlakryyllamldla (0,05 g) ja polyetyleenioksidia (0,1 g) liuotettiin de-ionoituun 5 veteen (25 ml) ja asetoniin (4 ml). Valmistettiin toinen liuos, joka sisälsi butyylimetakrylaattia (0,78 ml), sul-foetyylimetakrylaattia (0,2 g), glysidyylimetakrylaattia (0,5 ml) ja NFTA3Eu (25 mg). Nämä kaksi liuosta sekoitettiin yhteen ja pH asetettiin 5,5:een. N NaOH:lla, N2-atmos-10 fäärin alla hyvin sekoittamisen jälkeen seosta säteilytet-tiin 12 h 7,05 Mr:ssa/h. Valkoista emulsiota kierrätettiin lingossa peräkkäin kasvavin nopeuksin. Kierrosluvulla
30,000 r/min kerätty pelletti pestiin kolme kertaa 0,1-%:sella polyoksietyleenisorbitaanimonolauraatilla (Tween 15 20) fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS-0,01 M
monoja dinatriumfosfaatin seos 0,15 M NaClrssa). Pelletti suspendoitiin lopuksi 1,3-diaminopropaanin 10-%:seen liuokseen, jossa pH oli asetettu arvoon 10 1 N HC1. Suspensiota sekoitettiin yli yön ja pestiin sitten kolme ker-20 taa ja suspendoitiin 30 ml:aan PBS.
B. BSA-digoksiini-osas-konjugaatin valmistus Kohdassa A selostetun osas-suspension näytettä (1,0 ml) aktivoitiin lisäämällä glutaarialdehydiä loppu-väkevyyteen 1 %. 4-tunnin inkubointia seurasi kolme pesua 25 PBS:ssa. 1 ml:aan aktivoituja helmiä lisättiin 5 mg naudan seerumialbumiini (BSA)-digoksiini-konjugaattia. Seosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa. Helmiä pestiin sitten kolme kertaa, suspendoitiin 25 ml:aan PBS ja varastoitiin 4°C:ssa.
30 C. Polystyreeni-kyvettien päällystäminen kaniinin
anti-digoksiini-inununoglobuliinilla Tehtiin kaniinin antidigoksiini-immunoglobuliinin 2000-kertainen laimennus 0,1 M karbonaattipuskuriin, pH
9,5. Tätä liuosta pipetoitiin 3 ml:n tasolle kyveteissä. 35 Neljän tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa kyvetit imettiin ja pestiin peräkkäin 2-%:sella BSA-liuok- _______ τ _ 16 816ϋ0 sella PBS:ssa ja lopuksi PBS:ssä. Kyvetit kuivattiin ja varastoitiin 4°C:ssa.
D. Standardikäyrän määrittäminen digoksUnille fosfaatti-puskurissa 5 Tehtiin kaksoislaimennussarjoja digoksiinista PBSrään, jotka sisälsivät BSA (2 % ja Tween 20 0,5 %) väliltä 1-10,000 ng/ml ja sitten 3 ml kutakin näistä liuoksista ja pelkkää PBS pipetoitiin kyvetteihin, jotka oli sitä ennen päällystetty kuten kohdassa C selostettiin.
10 Jokaiseen näistä kyveteistä lisättiin 30 μΐ BSA-digoksii-ni-osaskonjugaattia, joka oli valmistettu osassa B. Ryvette jä inkuboitiin 37°C:ssa 45 minuuttia. Jokaiseen kyvettiin lisättiin 0,1 M 1,8-ANS (30 μΐ) ja fluoresenssiemissio 614 nm:ssä mitattiin 0,5 ms:n viivytyksen jälkeen 11°reen kul-15 maila herätevalonsäteen suhteen. Tulokset on annettu seu-raavassa taulukossa 111 ja kuvassa 2.
Taulukko III
Digoksiini-pitoisuus Voimakkuus (fotoneja) (mg/ml)_ 20 0 8700 1 8700 10 8200 100 7000 1000 6100 25 10000 4500 A. Anti-HCG-immunoglobuliini-osaskonjugaatin valmistus
Esimerkissä IIIA kuvatun osassuspension näyte 30 (1,0 ml) aktivoitiin lisäämällä glutaarialdehydiä loppu- väkevyyteen 1 %. 4-tuntista inkubointia seurasi 3 pesua PBS:ssa. 1 ml:aan aktivoituja helmiä lisättiin 50 μΐ mono-klonaalisen vasta-aineen, joka on nimetty HCG-13:ksi Ja joka on kasvatettu tavalliseen tapaan HCG:tä vastaan, 1 35 mg/ml liuosta PBS:ssä. Seosta sekoitettiin yli yön huoneen
17 816oQ
lämpötilassa. Helmet pestiin kolme kertaa, suspendoitiin 25 ml:aan PBS ja varastoitiin 4°C:ssa.
B. Polystyreeni-kyvettien päällystäminen monoklo-naalisella anti-HCG-4-immunoglobuliinilla 5 Tehtiin toisen monoklonaalisen vasta-aineen, joka oli kasvatettu HCG:tä vastaan, joka on nimetty HCG-4:ksi, 0,1 M karbonaatti-puskurien, pH 9,5. 5 tuhannesosaksi laimennettu liuos. Tätä liuosta pipetoitiin 3 ml:n tasolle kyvetteihin. Inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa 4 h 10 kyvetit imettiin ja pestiin peräkkäin 2-%:lla BSA-liuok-sella PBS:ssä ja lopuksi PBS:ssä. Kyvetit kuivattiin ja varastoitiin 4°C:ssa.
C. Standardikäyrän määrittäminen HCG:lle fosfaatti-puskurissa 15 Tehtiin HCG:kaksoislaimennussarjoja PBS:ään joissa oli 10-kertainen väkevyys väliltä 0,15-1,5 x 105 mIU/ml. Nämä liuokset ja sokea-PBS pipetoitiin kyvetteihin, jotka oli etukäteen päällystetty kuten esimerkissä B selostettiin. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa lisättiin koh-20 dassa A selostetut mikrohelmet (50 μΐ) ja inkubointia jatkettiin vielä yksi tunti. Jokaiseen kyvettiin lisättiin 0,1 M 1,8-ANS (30 μΐ) ja fluoresenssiemissio 614 nm:ssä mitattiin 0,5 ms:n viivytyksen jälkeen ll°:n kulmassa herä-tevalonsäteen suhteen. Tulokset on annettu taulukossa IV 25 ja kuvassa 3.
Taulukko IV
HCG-pitoisuus Voimakkuus (fotoneja) (mlU/ml)_ 0 1,000 30 0,15 1,380 15 1,750 1,500 2,000 150,000 2,600 35 ie 81680
Siten tämän keksinnön mukaisesti menetelmä kiinto-faasi-fluori-immunoanalyysiä varten käsittää valoa absorboivan aineksen lisäämisen analyysisysteemin nestefaasiin. Valoa absorboiva aines absorboi kaiken heräte- ja/tai sä-5 teilyn valon, paitsi sitä, joka absorboituu sidottuun tun-toaineeseen ja säteilee siitä, jolloin säteily sidotusta tuntoaineesta voidaan havaita ja mitata suuren ylimäärän vapaata tuntoainetta läsnäollessa. Sidottujen ja vapaiden jakeiden erottaminen vältetään täten ja saavutetaan homo-10 geenisen analyysin yksinkertaisuus ja mukavuus. Mittaamalla valoemisio sidotusta tuntoaineesta käyttäen aikaha-jotusta, heijastuneesta herätevalosta ja valosidonnasta aiheutuva häiriö sekä taustaemissio voidaan minimoida, jolloin päästään suurempaan analyysiherkkyyteen. Menetelmä 15 on helposti sovitettavissa kaikkien kiintofaasi-kilpaile-viin ja kerrostyyppisiin analyysimuunnossysteemeihin. Keksintö käsittää sarjan analyysiaineksia, joita voidaan käyttää joko käsi- tai automatisoituun analysointiin.
li
Claims (26)
1. Menetelmä jossakin nesteessä läsnäolevan analyy-tin tuntemattoman määrän määrittämiseksi, tunnettu 5 siitä, että a) valmistetaan seos saattamalla anti-analyytti, joka on sidottu kiinteän kantimen pintaan, kosketukseen nesteen kanssa, joka sisältää tuntemattoman määrän ana-lyyttiä, valoa absorboivaa ainesta ja tuntoaineen tätä 10 analyyttiä varten, jolloin tuntoaine sisältää fluoroivan väriaineen, ja tuntoaine valitaan ryhmästä tuntoaineita, joita ovat antigeeni, vasta-aine ja sidottu antigeeni-vas-ta-ainekompleksi, jossa on tämä fluoroiva väriaine sitoutuneena siihen ja jossa tuntoaine reagoi spesifisesti ana- 15 lyytin kanssa; b) tätä seosta inkuboidaan; c) tähän seokseen kohdistetaan herätevalosykäys, jolloin tämän sykäyksen voimakkuus ja kestoaika on riittävä aiheuttamaan osan tästä herätevalosta absorboitumisen 20 tuntoaineeseen; d) havaitaan fluoresenssi-säteily sidotusta tunto-aineesta, jolloin tämän emission vaimenemisaika on riittävä havaittavaksi valosykäyksen tultua täydelliseksi ja pääasiallisesti kaikki valoemissio, joka johtuu seoksen 25 muista komponenteista kuin sidotusta tuntoaineesta on vai mentunut; ja e) määritetään analyytin määrä tässä nesteessä vertaamalla fluoresenssiemission määrää fluoresenssiemission määrään, joka saadaan tunnetulle määrälle analyyttiä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että analyytti valitaan ryhmästä ana-lyyttejä, jotka käsittävät antigeenejä, hapteenejä ja vasta-aineita ja anti-analyytti valitaan ryhmästä anti-ana-lyytit, jotka käsittävät antigeenejä ja vasta-aineita.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että tuntoaine sisältää edelleen analyy- 20 81 6 y O tin, ja jossa on fluoroiva väriaine siihen liittyneenä ja jossa tuntoaine reagoi spesifisesti anti-analyytin kanssa.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-analyytin rajoitettu määrä on 5 sitoutunut kantimeen ja analyytti ja tuntoaine sitoutuvat kilpailevasti tähän anti-analyyttiin.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pääasiallisesti kaikki analyytistä sitoutuu anti-analyyttiin ja tuntoaine sitoutuu analyyt- 10 tiin.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoroiva väriaine on lantanidike-laatti.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t u n- 15. e t t u siitä, että lantanidi-kelaatti yhdistetään po- lymeeriosaseen.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neste on seerumi.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- 20. e t t u siitä, että valoa absorboivalla aineksella on absorptio-nauha, joka limittyy tuntoaineen absorptionauhan päälle.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valoa absorboiva aines on 25 aryyliaminonaftaleenisulfonihappo.
11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sysäyksen voimakkuus on 1 x 1040 - 2 x 1040 fotonia.
12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että sykäyksen kestoaika on noin 1-10 ps.
13. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sykäyksen aallonpituus on noin 280-375 nm.
14. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoresenssi-emission aallonpituus on noin 580-630 nm. li 21 81 6 o O
15. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoresenssi-emission viiväs-tysaika on noin 0,5-1,0 ms.
16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että fluoresenssi-emission mitataan peräkkäisten sykäysten välillä.
17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoresenssi-emissio mitataan 0,5 ja 0,75 ms:n sykäyksen välillä.
18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoresenssi-emissio mitataan kulmassa 2-20° herätevalon pulssin suunnasta.
19. Menetelmä tuntemattoman määrän analyyttiä jossakin nesteessä määrittämiseksi, tunnettu siitä, 15 että a) valmistetaan seos saattamalla kiinteän kantimen pintaan sidottu anti-analyytti kosketukseen nesteen kanssa, joka sisältää tuntemattoman määrän analyyttiä, valoa absorboivaa ainesta ja tuntoainetta tätä analyyttiä var- 20 ten, jolloin tuntoaine sisältää havaittavan merkkiaineen, joka pystyy absorboimaan ja säteilemään valoa; b) annetaan riittävän ajan kulua tämän analyytin saamiseksi sitoutumaan ja tuntoaineen saamiseksi sitoutumaan antianalyyttiin, 25 c) seokseen kohdistetaan herätevalo; d) havaitaan hajaantuvan valon emissio sidotusta tuntoaineesta suhteessa aikaan; e) määritetään analyytin määrä tässä nesteessä vertaamalla havaitun valoemission määrää siihen valoemission 30 määrään, joka on saatu tunnetulta määrältä tätä analyyttiä.
19 816u0
20. Menetelmä tuntemattoman määrän analyyttiä, joka on läsnä seeruminäytteessä, määrittämiseksi, tunnet-t u siitä, että 35 a) valmistetaan seos saattamalla kiinteän kantimen pintaan sidottu anti-analyytti kosketukseen, jolloin käy- 22 81 6υ0 tettävissä oleva antl-analyytln si torni skoht ien määrä on riittämätön sitomaan kaiken analyytin, seeruminäytteen kanssa, joka sisältää tuntemattoman määrän analyyttiä, aryyliaminonaftaleenisulfonihapon ja tuntoaineen tätä ana-5 lyyttlä varten kanssa, jolloin tuntoaineeseen sisältyy analyytti, johon on kiinnittynyt osanen, johon on yhdistetty lantanidikelaatti-merkkiaine; b) inkuboidaan tätä seosta; c) seokseen kohdistetaan herätevalosykäys, jonka 10 aallonpituus on noin 280-375 nm ja tämän sykäyksen voimakkuus on noin 1 x 1040 - 2 x 1040 fotonia ja kestoaika on noin 1-10 ps; d) havaitaan fluoresenssiemissio, jonka aallonpituus on noin 580-630 nm ja hajaantumisaika noin 0,5-1,0 ms 15 sidotusta tuntoaineesta, jolloin emissio mitataan peräkkäisten herätesykäysten välillä kulmassa noin 2-20° sykäyksen suunnasta ja noin 0,50-0,75 ms jälkeen sykäyksen tultua täydelliseksi; ja e) määritetään tämän analyytin määrä seeruminäyt-20 teessä vertaamalla fluoresenssiemission määrää fluoresens- siemission määrään, joka havaitaan, kun tunnetun määrän tätä analyyttiä sisältävä seos määritetään vaiheiden (a)- (e) mukaisesti.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että osanen on polymeeri-osanen.
22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lantanidikelaatti on europium- tai terbium-ioni, joka on kelatoitunut 6-diketonin kanssa.
23. Menetelmä seeruminäytteessä läsnäolevan analyy tin tuntemattoman määrän määrittämiseksi, tunnettu siitä, että a) valmistetaan seos saattamalla kiinteän kantimen pintaan sidottu anti-analyytti, jolloin anti-analyytin 35 käytettävissä olevien sitomiskohtien määrä on riittävä sitomaan pääasiallisesti kaiken analyytistä, kosketukseen li 23 816Ö0 nesteen kanssa, joka sisältää tuntemattoman määrän tätä analyyttiä, aryyliaminonaftaleenisulfonihappoa ja tuntoai-netta tätä analyyttiä varten, kanssa, jolloin tuntoaine sisältää ligandin, joka on spesifinen tälle analyytille ja 5 ligandiin on sidottu osanen, johon on yhdistetty lantani-dikelaattimerkkiaine; b) seosta inkuboidaan; c) seokseen kohdistetaan herätevalosykäys, jonka aallonpituus on noin 280-375 nm ja jonka voimakkuus on 10. x 1040 - 2 x 1040 fotonia ja kestoaika noin 1-10 ps; d) havaitaan fluoresenssi-emissio, jonka aallonpituus on noin 580-630 nm ja hajotusaika noin 0,5-1,0 ms, jolloin emissio mitataan peräkkäisten herätyssykäysten välillä kulmassa noin 2-20° tämän sykäyksen suunnasta ja 15 noin 0,5-0,75 ms sykäyksen täydelliseksi tulon jälkeen; ja e) määritetään analyytin määrä tässä seeruminäytteessä vertaamalla fluoresenssiemission suuruutta fluore-senssiemission suuruuteen, joka havaitaan, kun seos, joka sisältää tunnetun määrän tätä analyyttiä, määritetään vai- 20 heiden (a)-(e) mukaisesti.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osanen on polymeeri-osanen.
25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi valitaan ryhmästä 25 ligandeja, jotka käsittävät antigeenejä, vasta-aineita ja sidotun antigeeni-vasta-aine-kompleksejä.
26. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lantanidi-kelaatti on europium- tai terbium-ioni, joka on kelatoitunut B-diketonin 30 kanssa. 24 81 6 00
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70057885 | 1985-02-11 | ||
| US06/700,578 US4680275A (en) | 1985-02-11 | 1985-02-11 | Homogeneous fluorescence immunoassay using a light absorbing material |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI855019A0 FI855019A0 (fi) | 1985-12-17 |
| FI855019A FI855019A (fi) | 1986-08-12 |
| FI81680B FI81680B (fi) | 1990-07-31 |
| FI81680C true FI81680C (fi) | 1990-11-12 |
Family
ID=24814048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI855019A FI81680C (fi) | 1985-02-11 | 1985-12-17 | Homogen fluorecens immunoanalys baserad pao ett ljusabsorberande aemne. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4680275A (fi) |
| EP (1) | EP0191575B1 (fi) |
| JP (1) | JPS61186856A (fi) |
| AU (1) | AU580361B2 (fi) |
| CA (1) | CA1253798A (fi) |
| DE (1) | DE3671300D1 (fi) |
| DK (1) | DK164840C (fi) |
| FI (1) | FI81680C (fi) |
| MY (1) | MY101455A (fi) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4977077A (en) * | 1984-10-24 | 1990-12-11 | Bioprobe International | Integrated solid-phase immunoassay |
| GB8622855D0 (en) * | 1986-09-23 | 1986-10-29 | Ekins R P | Determining biological substance |
| US4954435A (en) * | 1987-01-12 | 1990-09-04 | Becton, Dickinson And Company | Indirect colorimetric detection of an analyte in a sample using ratio of light signals |
| EP0290269A3 (en) * | 1987-05-06 | 1989-08-09 | Cyberfluor Inc. | Immunoassay methods and reagents and methods for producing the latter |
| US4837162A (en) * | 1987-06-05 | 1989-06-06 | Pall Corporation | Non-fluorescing, non-reflective polyamide for use in diagnostic testing |
| SE8703682L (sv) * | 1987-09-24 | 1989-03-25 | Wallac Oy | Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner |
| US5089384A (en) * | 1988-11-04 | 1992-02-18 | Amoco Corporation | Method and apparatus for selective cell destruction using amplified immunofluorescence |
| US5198340A (en) * | 1991-01-17 | 1993-03-30 | Genentech, Inc. | Assay for free igf-i, igf-ii, and gh levels in body fluids |
| US5210412A (en) * | 1991-01-31 | 1993-05-11 | Wayne State University | Method for analyzing an organic sample |
| US5424414A (en) * | 1991-12-17 | 1995-06-13 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for 3-phenyl-1-adamantaneacetic acids |
| US5616505A (en) * | 1992-03-27 | 1997-04-01 | Abbott Laboratories | Haptens tracers, immunogens and antibodies for 3-phenyl-1-adamantaneacetic acids |
| DE4210970C2 (de) * | 1992-04-02 | 1996-10-17 | Markus Dipl Chem Sauer | Verfahren zur simultanen optischen qualitativen und quantitativen Erfassung von verschiedenen mit Fluorochromen oder Fluorogenen markierten Molekülen eines Gemisches mittels Laserspektroskopie |
| US5312922A (en) * | 1992-04-06 | 1994-05-17 | Nordion International Inc. | Europium and terbium chelators for time-resolved fluorometric assays |
| US5294799A (en) * | 1993-02-01 | 1994-03-15 | Aslund Nils R D | Apparatus for quantitative imaging of multiple fluorophores |
| AU4411093A (en) * | 1993-06-10 | 1995-01-03 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for 3-phenyl-1-adamantaneacetic acids |
| US5599668A (en) * | 1994-09-22 | 1997-02-04 | Abbott Laboratories | Light scattering optical waveguide method for detecting specific binding events |
| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
| US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
| US6200762B1 (en) | 1997-08-01 | 2001-03-13 | Aurora Biosciences Corporation | Photon reducing agents and compositions for fluorescence assays |
| US6221612B1 (en) * | 1997-08-01 | 2001-04-24 | Aurora Biosciences Corporation | Photon reducing agents for use in fluorescence assays |
| US6214563B1 (en) | 1997-08-01 | 2001-04-10 | Aurora Biosciences Corporation | Photon reducing agents for reducing undesired light emission in assays |
| US6171295B1 (en) * | 1999-01-20 | 2001-01-09 | Scimed Life Systems, Inc. | Intravascular catheter with composite reinforcement |
| DE19903576C2 (de) * | 1999-01-29 | 2001-02-22 | Bodenseewerk Perkin Elmer Co | Quantitative Bestimmung von Analyten in einem heterogenen System |
| DE60027910T2 (de) * | 1999-09-29 | 2007-01-04 | Japan Science And Technology Corp., Kawaguchi | Hochsensitiver zeitaufgelöster immunofluoreszenzassay zum nachweis von chemokinen |
| US6702453B2 (en) | 2001-10-26 | 2004-03-09 | Birchwood Lighting, Inc. | Flexible light fixture |
| US20050112703A1 (en) | 2003-11-21 | 2005-05-26 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Membrane-based lateral flow assay devices that utilize phosphorescent detection |
| PL1908044T3 (pl) * | 2005-06-29 | 2011-09-30 | Eidgenoessische Technische Hochschule Zuerich | Unikalne etykiety dla systemu identyfikacji lub ochrony |
| GB2474224A (en) * | 2009-07-07 | 2011-04-13 | Toximet Ltd | Devices and methods using fluorescent polymers in solid phase extraction |
| EP2577311A1 (de) * | 2010-05-31 | 2013-04-10 | Boehringer Ingelheim Microparts GmbH | Verfahren und vorrichtung zur optischen untersuchung |
| CA2867414C (en) | 2012-03-16 | 2021-06-01 | Stat-Diagnostica & Innovation, S.L. | A test cartridge with integrated transfer module |
| EP2856104A4 (en) * | 2012-05-25 | 2016-02-24 | Ronghao Li | APPARATUSES AND METHODS FOR HANDLING ASSAYS |
| RU2710262C1 (ru) * | 2019-08-01 | 2019-12-25 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Способ проведения биологического микроанализа |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3939350A (en) * | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
| US4058732A (en) * | 1975-06-30 | 1977-11-15 | Analytical Radiation Corporation | Method and apparatus for improved analytical fluorescent spectroscopy |
| US4341957A (en) * | 1975-11-26 | 1982-07-27 | Analytical Radiation Corporation | Fluorescent antibody composition for immunofluorometric assay |
| CA1111762A (en) * | 1977-12-28 | 1981-11-03 | David S. Frank | Fluorescent rare earth chelate in polymeric latex particles |
| US4283382A (en) * | 1977-12-28 | 1981-08-11 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels comprising rare earth chelates |
| US4271139A (en) * | 1978-03-27 | 1981-06-02 | Hiram Hart | Scintillation proximity assay |
| US4259313A (en) * | 1978-10-18 | 1981-03-31 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels |
| US4318707A (en) * | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
| US4256834A (en) * | 1979-04-09 | 1981-03-17 | Syva Company | Fluorescent scavenger particle immunoassay |
| IL64574A (en) * | 1981-04-27 | 1986-01-31 | Syva Co | Method for determining the presence of an analyte by determination of the amount of fluorescence in competitive protein binding assays |
| US4582809A (en) * | 1982-06-14 | 1986-04-15 | Myron J. Block | Apparatus including optical fiber for fluorescence immunoassay |
| SE454115B (sv) * | 1982-09-13 | 1988-03-28 | Wallac Oy | Homogenfasanalys med lantanidkelat som merksubstans |
| FI841023A0 (fi) * | 1984-03-14 | 1984-03-14 | Labsystems Oy | Foerfarande foer utfoering av immunobestaemningar |
-
1985
- 1985-02-11 US US06/700,578 patent/US4680275A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-18 CA CA000495556A patent/CA1253798A/en not_active Expired
- 1985-12-09 AU AU51025/85A patent/AU580361B2/en not_active Ceased
- 1985-12-17 FI FI855019A patent/FI81680C/fi not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-01-16 JP JP61007167A patent/JPS61186856A/ja active Granted
- 1986-01-29 EP EP86300588A patent/EP0191575B1/en not_active Expired
- 1986-01-29 DE DE8686300588T patent/DE3671300D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-11 DK DK065386A patent/DK164840C/da not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-09-29 MY MYPI87002121A patent/MY101455A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0476580B2 (fi) | 1992-12-04 |
| FI81680B (fi) | 1990-07-31 |
| MY101455A (en) | 1991-11-18 |
| DK65386D0 (da) | 1986-02-11 |
| DK65386A (da) | 1986-08-12 |
| DE3671300D1 (de) | 1990-06-21 |
| AU5102585A (en) | 1986-08-14 |
| JPS61186856A (ja) | 1986-08-20 |
| EP0191575B1 (en) | 1990-05-16 |
| DK164840C (da) | 1993-01-04 |
| FI855019A0 (fi) | 1985-12-17 |
| CA1253798A (en) | 1989-05-09 |
| FI855019A (fi) | 1986-08-12 |
| EP0191575A1 (en) | 1986-08-20 |
| AU580361B2 (en) | 1989-01-12 |
| US4680275A (en) | 1987-07-14 |
| DK164840B (da) | 1992-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI81680C (fi) | Homogen fluorecens immunoanalys baserad pao ett ljusabsorberande aemne. | |
| US4777128A (en) | Fluorescence immunoassay involving energy transfer between two fluorophores | |
| CN106872420B (zh) | 一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法 | |
| AU614109B2 (en) | Test method and reagent kit therefor | |
| US5501949A (en) | Particle bound binding component immunoassay | |
| US6551788B1 (en) | Particle-based ligand assay with extended dynamic range | |
| US5017473A (en) | Homogeneous chemiluminescence immunoassay using a light absorbing material | |
| EP0248892A1 (en) | Particle-bound binding component immunoassay | |
| US20210041428A1 (en) | Immunoassay with enhanced sensitivity | |
| JP2005510706A5 (fi) | ||
| CN108132344A (zh) | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 | |
| AU748633B2 (en) | Capillary assay method | |
| CA1229301A (en) | Substrate for fluoroimmunoassay of biological fluids | |
| US20110293473A1 (en) | Automatic analyzer | |
| JP2003507736A (ja) | エバネッセンス場法を用いて物質を測定する方法 | |
| EP0201211A1 (en) | Method and compositions for visual solid phase immunoassays based on luminescent microspheric particles | |
| Misiakos et al. | A multi-band capillary immunosensor | |
| EP0233690B1 (en) | Labeled hydantoin conjugate and its use in analytical element and immunoassays | |
| JPS60211365A (ja) | 免疫学的測定法 | |
| JPH0235365A (ja) | 抗原性物質の存在もしくはその濃度を決定する方法 | |
| CA2021658C (en) | Multiplex immunoassay system | |
| CA2097952A1 (en) | Early diagnosis of sepsis utilizing antigen-antibody interactions amplified by whole blood chemiluminescence | |
| JP2001272405A (ja) | 検査キット | |
| Mastichiadis et al. | Bulk fluorescence light blockers to improve homogeneous detection in capillary-waveguide fluoroimmunosensors | |
| US20040005627A1 (en) | Microvolume detecting method and device |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BECTON, DICKINSON AND COMPANY |