JPS61186856A - 吸光物質を使用する均質螢光イムノアツセイ法 - Google Patents

吸光物質を使用する均質螢光イムノアツセイ法

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JPS61186856A
JPS61186856A JP61007167A JP716786A JPS61186856A JP S61186856 A JPS61186856 A JP S61186856A JP 61007167 A JP61007167 A JP 61007167A JP 716786 A JP716786 A JP 716786A JP S61186856 A JPS61186856 A JP S61186856A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明ハ被分析本のイムノアッセイ法およびそれに用い
る材料、より詳細には結合画分および遊離画分の分離を
必要としないイムノアッセイ法およびそれに用いる材料
に関する。
（従来技術） 流体中のある物質の濃度を測定するための迅速なかつ高
感度の多種多様なアッセイ系が開発されている。イムノ
アッセイ法は特定の抗体に対する抗原またはハプテンの
結合によるものであり、これらは高水準の特異性および
感度を与えるので特に有用である。これらのアッセイ法
では一般に上記試薬のうち１種を標識された形で使用し
、この標識された試薬はしばしばトレーサーと呼ばれる
。
イムノアッセイ操作は溶液中でまたは固体支持体上で行
うことができ５不均質であってもよく、均質で３らっで
もよい。不均質アッセイ法では、結合したトレーサー’
ｔａ離の（結合していない）トレーサーから分離する必
要がある。均質アッセイ法は分離工程を必要とせず、従
って不均質アッセイ法よりも迅速性、簡便性、および自
動化の容易さの点で著しく有利である。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法では放射性同位体を
標識として使用し、高水準の感度および再現性を与え、
多数の試料を迅速に処理するための自動化を行いやすい
。しかし、測定されるパラメータ（核の壊変）をアッセ
イ条件または成分の変更により制御し得ないため、ＲＩ
Ａ法はすべて分離工程を必要とする。さらに、同位体は
高価であり、保存寿命が比較的短かく、高価で複雑な装
置を必要とし、それらの取扱いおよび廃業に関して種々
の安全性基準に従わなければならない。
酵素もイムノアッセイにおける標識として用いられてい
る。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）Ｈ均質となすことが
可能であり、放射能に対する警戒の必要がない。酵素と
蛋白質の結合は通常簡単であり一生成する蛋白質−酵素
結合体は一般に安定である。しかしＥＩＡは、酵素結合
体とある物質が反応して発色し、これを測定することに
よるものであり、従って酵素基質を供給するという付加
的な工程を必要とする。さらに発色するのに十分な時間
が与えられねばならず１色彩の変化を測定するための分
光光度計を備えなければならない。
ＲＩＡまｆｃはＥＩＡＫ寸随する上記の欠点のうちの幾
つかは、イムノアッセイにおける標識として、螢光色素
を用いることにより克服された。螢光イムノアッセイ（
Ｆ’ＩＡ）は標識を直接に検出し、容易に均質アッセイ
操作に適用できる。しかし有機螢光色素、たとえばフル
オレセインまたはローダミン誘導体を用いる既知の均質
Ｆ’ＩＡ法は。
主としてアッセイ媒質中に懸濁した不純′吻による光の
散乱のため、またアッセイ媒質中に存在する他の螢光゛
物質からのバックグラウンド螢光放出のため、ＲＩＡま
たはＥＩＡがもつ高い感度を達成しなかった。散乱は短
かい（５０ｎｍ以下）ストークスシフト（吸光と発光の
波長の差）をもつ螢光色素については特に問題である。
たとえばインチオシアン酸フルオレセインのストークス
シフトはわずか２０〜５０　ｎｍである。アッセイ媒質
が血清である場合に特にバックグラウンド螢光が問題と
なる。血清中におけるアッセイの感度は緩衝液中におけ
る同等のアッセイに比べて１００分の１倍までも低下す
る可能性がある。
時間分解螢光イムノアッセイ（ｔｉｍｅ　−ｒｅｓｏｌ
ｖｅｄｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　Ｔ　Ｒ
−Ｆ　Ｉ　Ａ　）の開発はこれらの問題の克服に寄与し
た。この方法では。
螢光発光減衰時間の比較的長い螢光色素標識を光のパル
スで励起し、そしてあらかじめ定めた時間（遅−ｒＬ）
ののちこの標識からの螢光発光を測定する。減衰時間の
短かいバックグラウンド発光（一般に１０ｎ秒以下）は
この遅れの間に本質的に消失し、このため標識からの特
異的な発光の測定を妨害することはない。ＴＲ−ＦＩＡ
は螢光標識が１００〜１０００ｎ秒の減衰時間および大
きいストークスシフト（１００ｎｍ以上）をもつ場合に
きわめて有効である。
ＴＲ−ＦＩＡの要件に適合する一群の標識はランタニド
キレート類である。ランタニドイオン。
特にユーロピウムおよびテルビウムのイオンは有機リガ
ンド、％にβ−ジケトンとストークスシフトの大きい（
２５０ｎｍに及ぶ）高螢光キレートを形成する。このキ
レートのリガンド部分が励起光線を吸収し、吸収された
エネルギーをキレート形成金−イオンへ伝達する。この
金蛎イオンがエネルギーと減衰時間の著しく長い（１ｍ
秒）の螢光として放出する。ランタニドキレートｋＴＲ
−Ｆ’ＩＡに用いることについての考察はアナリティカ
ル・バイオケミストリー、５江、３３５（１９８４）に
示されている。
米国特許第４，０５８，７６２２号明細書ウィーダー）
には５分析的螢光分光分析法においてランタニドキレー
トを使用し１時間分解するための方法および装置が示さ
れている。
米国特許第４．２８３，３８２号明細書（フランクら）
には、ランタニドキレート標識をポリマーピーズ格子内
へ取込んで、水により起こされる標識の螢光発光の消失
を除くことによるＴＲ−ＦＩＡの改良法が示されている
。
米国特許第４，３７４，１２０号明細書（ソイニら）に
く、ランタニド、β−ジケトン、およびキレートを蛋白
質に結合させるために有用な官能基をもつアミノポリカ
ルボン酸同族体の１：１：１キレートによりａ成される
ランタニドキレートの安”ＢＬ性の増大が示されている
。
欧州特許出願ＥＰ　Ｏ，０６４，４８４−Ａ２明細１に
は、ヨ１１定すべき・勿′Ｒｋアミノカルボン酸同族体
によりランタニドに結合させ、インキュベーションのの
ちこのランタニドを測定すべき′物質がら離脱させ、β
−ジケトンにキレート結合させたのち検出することによ
るＴＲ−Ｆ’ＩＡ法が示されている。
以上の各方法によりＦ’ＩＡは改良されたが、４＠合両
分と遊離画分を分離する必要なしに迅速に実施しつる高
感度のＦ’ＩＡがなお求められている。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の一覗点く、結合晰分と遊４画分の分離を行わな
い被分析体の固相イムノアッセイ法からなる。固体支持
体の表面に結合した抗−被分析体を、被分析体ｋａ有す
るｒＬ本、吸光・物質、および被分析体に対するトレー
サー（吸光および発光する標識が結合したもの）と接触
させる。アッセイ混合物のインキーベーション後に、励
起光線を与え５発光を時間分解により測定する。測定さ
れた発光の大きさ２１本質的に等しい条件下で１種また
は２種以上の既却量の被分析体をＭＩＪ定した際に測定
されｆＣ発光の大きさと比較する。
本発明方法の好ましい実施態嗟においては、標識は比咬
的長い減授時間をもつ螢光色素であり、吸光・物質はト
レーサーの吸光帝と重なる吸ｆ、帝をもつＵＶ吸収化合
’１ｆｆｌである。
本発明方法の特に好ましい実施態様においては。
被分析体は鹿清試料中にあり、吸光・物質框アリールア
ミノナフタリンスルホン酸であり、トレーサーは被分析
体に付着したポリマー粒子に取込まれたランタニドキレ
ートであり、トレーサーと被分析体が不十分な数の抗−
被分析本結合部立に対して競合する。
本発明方法の他の実施態薩においては、実質的にすべて
の被分析体がサンドイッチアッセイにおいて抗−被分析
体とトレーサーの双方に結合する。
本発明の他の観点には１本発明方法を実施するための材
料のキットが陰まれる。
本発明方法によれば、結合画分と未結合画分を分離する
必要なしに固相ＴＲ−Ｆ’ＩＡが行われ。
これにより均質アッセイの操作の簡潔性、迅速性および
簡便性が達成される。標識は検出可能な物質上発生させ
るための付／Ｊ［Ｉ的な基質またはインキーベーション
期間なしに直接に検出される。本発明方法は本質的に他
の螢光物質からの妨害発光がなく、これによりきわめて
低い濃度で存在する被分析体を正確に測定することがで
きる高感度の均質アッセイ法を提供する。本方法は実施
するのがきわめて容易であり、測定の自動化に適用しや
すい。
第１図は本発明方法による競合イムノアッセイに用いら
れる試験管その他の構成部品を示す。
第２図は本発明方法によるジゴキシンアッセイの標準曲
線である。
第３図は本発明方法によるヒト絨毛性ゴナドトロピン（
■ＣＧ）アッセイの標準曲線である。
（発明の構成） 本発明は種々の杉の実施態様により満たされるが、ここ
に好ましい実施恨嘩ヲ代表列として詳述する。ただしこ
れらの記述は本発明の原理の列示と考えるべきでろって
本発明をここに示す実施態様に１辰定することを意図す
るものでないことは理解すべきである。本発明の範囲は
特許請求の範囲の記載およびその均等範囲により判断さ
れるであろう。
本発明方法によれば、流体中に存在するある物質の濃度
を免疫学的反応によって測定することができる。この物
質（以下被分析体と呼ぶ）は抗原。
ハプテンまたは抗体のいずれであってもよく、適切ない
かなる液体中に存在してもよい。たとえば液体は緩衝液
２食塩液、または体液（たとえば血清または尿）であっ
てもよい。場合により被分析体は体液から分離され５次
いで検出のために他の液体、たとえば緩衝液に導入され
てもよい。
ここで用いる“免疫学的反応”という語は、抗原と抗体
、ハプテンと抗体、または同様に特異的に結合する抗原
、抗体もしくはハプテンの適宜な同族体の特異的結合反
応を意味する。
本発明方法の免疫学的反応は固体支持体の表面で行われ
る。当技術分野で刊られているように。
固体支持体はアッセイを妨害しないいかなる支持体であ
ってもよい。受用できる固体支持体の列はガラスおよび
ポリマー材料、たとえばポリエチレン、ポリスチレンな
どである。これらの支持体はシート、板、穴（ｗｅｌｌ
）または好寸しくは菅など適宜な形状のいずれにηロエ
されていてもよい。本発明のきわめて好ましい実施態様
においては免疫学的反応は一端が閉じられた管、好まし
くはプラスチック管の内壁または底で行われる。
抗−被分析体を固体支持体の表面に結合させる。
抗−被分析体は被分析体と特異的に反応する抗原または
抗体であってもよく、あるいは被分析体と特異的に反応
するこれらの適宜な同族体のいずれであってもよい。固
体支持体への抗−被分析体の結合は常法（たとえば吸着
または共有結合）のいずれによっても行うことができる
。これらの方法は当技術分野で周知であり１本発明を完
全に理解するためにこれらの点についてより詳細な説明
は不必要であると考える。
固体支持体に結合させる抗−被分析体のｔは。
実施すべきアッセイの種類による。ここで最初に述べる
競合イムノアッセイ法の場合、限られた量の抗−被分析
体を結合させ、これにより不十分な結合部位が得られ、
後記のように被分析体および被分、折体のトレーサーが
この得られた部位に対して競合する。次に述べるサンド
イッチアッセイ法の場合、過剰の抗−被分析体を結合さ
せ、これにより本質的てすべての被分析体が抗−被分析
体に結合する。
不発明による競合アッセイ法の場合、固体支持体に結合
した抗−被分析体を液体中の未知の量の被分析体と接触
させ、アッセイ媒質を後記のようにインキュベートして
被分析体と抗−被分析体の免疫学的反応を誘発する。次
いで被分析体に対するトレーサーを添加し、後続のイン
キュベーション全行い、その結果アッセイ媒質は遊離の
被分析体、遊離のトレーサー、結合した被分析体および
結合したトレーサーを富有する。あるいは、好ましくは
被分析体とトレーサーを同時に添加し、１回のインキュ
ベーションを行う。固体支持体上の抗−被分析体に結合
した被分析体およびトレーサーを以下結合画分と呼び、
抗−被分析体に結合していない被分析体およびトレーサ
ーを以下結合画分と呼ぶ。
トレーサーは免疫学的反応の過程を追跡する手段を提供
し、競合アッセイ法においては標識と結合した既知量の
被分析体またはその適宜な同族体からなる。標識は吸光
して発光し、かつ被分析体に結合しうるいかなる物質で
あってもよい。好ましい標Ｒは減衰時間の長い光を発し
、きわめて好ましくは減衰の長い螢光を発し、これによ
り結合トレーサーをアッセイ系内の他の発光物質により
実質的に妨害されることなく検出することができる。き
わめて好ましい標識は約２８０〜６７５　ｎｍの波長の
励起光線を吸収し、約５８０〜６３０　ｎｍの螢光を発
し、約２００〜２５０　ｎｍのストークスシフトを示す
。きわめて好ましい標識の螢光発光の減衰時間は約０．
５〜１．０ｍ秒である。
本発明方法に有用な長い減衰時間の螢光を発する標識は
ピレン誘導体、および好ましくはランタニドキレートで
ある。後者の群の標識は、有機リガンドたとえばβ−ジ
ケトンとキレート結合したランタニドイオン、たとえば
ユーロピウムまたはテルビウムのイオンのようなランタ
ニドイオンからなる。使用できるβ−ジケトンの列は、
ベンゾイルアセトン、ジベンゾイルメタン、テノイルト
リフルオルアセトン、ベンゾイルトリフルオルアセトノ
、ナフトイルトリフルオルアセトン、アセチルアセトン
、トリフルオルアセチルアセトン。
ヘキ丈フルオルアセチルアセトンなどである。β−ジケ
トンとランクニドイオンのキレート形成は。
これらの試薬を適宜な時間インキュベートすることによ
って常法により行われる。トレーサーの製造に用いられ
るランタニドキレートの鎗は実施されるアッセイの種類
、および液体中の被分析体の量に依存し、当業者に周知
である。
ランタニドキレート標識を常法により被分析体に直接に
結合させてトレーサーを製造することができる。あるい
は、好ましくは標識を粒子に取込ませ、この粒子を被分
析体に結合させてトレーサーを得る。粒子はポリマー粒
子、たとえばビーズであってもよい。標識を取込ませ、
かつ被分析体に結合させうるポリマーはいずれも使用で
きる。
好ましいポリマーは励起光線および螢光発光の双方に対
して本質的に透明であり、被分析体以外の蛋白質（たと
えば薄情中の池の蛋白質）と実質的数量の非特異的な表
面反応を行わない。標識を取込むために特に好ましいポ
リマーはポリアクリレート、たとえばポリメタクリル酸
メチルである。
標識は常法により粒子内に取込まれる。たとえば標識を
ぎむポリマー粒子は、標識成分を陰有すル溶液中でモノ
マーを乳化重合することによって製造できる。同様に常
法により、好ましくは被分析体上および粒子表面上の適
宜な官能基を共有１詰合させることにより１粒子を被分
析体に付着させる。標識を粒子内に取込み、また被分析
体を粒子に付着させるための常法は当業者に周矧であり
かつその理解の範囲内であると思われ２本発明を完全に
理解するためにこれらの要素につきこｆ″Ｌμ上詳述す
る必要はない。
支持体上の抗−被分析体を含むアッセイ媒質、被分析体
を含む液体、およびトレーサーは、免疫反応２行わせに
れにより前記の結合画分および遊離画分を得るのに適し
たいずれかの温度において、これに適したいずれかの期
間インキュベートされる。インキュベーションは約０〜
５０℃、好捷しくに約６０〜４０℃の温度で行うことが
でき。
それによりこれらの両分は平衡となるであろうが。
必ずしも平衡となる必要はない。
吸光物質は免疫学的反応の前または後にアッセイ系にａ
７１０され、これはトレーサーの吸光帯と重なる吸光帯
をもち、免疫学的反応を妨害しないいかなる物質であっ
てもよい。適切な吸光物質はたとえばスチルベン類、ペ
ンゾキ丈ゾール類、ナフタリン類およびそれらの誘導体
であるが、これらに限定されない。好ましい群はアリー
ルアミンナフタリンスルホン酸類、たとえば２−（ｐ−
アニシジニル）ナフタリン−６−スルホン酸マたハ１−
アニリノナフタリンー８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ
）　　である。アッセイ媒質中の吸光゛物質の濃度は約
１０〜１０　Ｍ、好ましくは約１０〜１０　　Ｍである
。
結合トレーサーは、励起光線を与え、吸光物質の存在下
で標識からの発光をメ１１定することによって検出され
る。励起光線は、使用した標識の吸光範囲内の波長をも
つことが好ましい。標識ガランタニドキレートである場
合、励起光線は約２８０〜３７５　ｎｍ、きわめて好ま
しくは約３４６　ｎｍの波長をもち、不連続である。す
なわち光のパルスと光源が消えている期間とが交互に生
じる。光のパルスは持続時間約０，１〜１０μ秒、好ま
しくは約６μ秒であってもよい。光源が消される期間は
約Ｑ、１〜２．０ｍ秒、好ましくは約０．９　ｍ秒であ
ってもよい。
発光は各パルス終了から約０．１〜０．５ｍ秒、好まし
くは約０．５ｍ秒の遅れののちにタイムゲート（ｔｉｍ
ｅ　−ｇａｔｉｎｇ　）により測定される。発光の波長
は使用する標識により異なる。標識がランタニドキレー
トである場合、発光の波長は一般に約５８０〜６３０　
ｎｍである。きわめて好ましくは。
発光は約６１４　ｎｍの波長で測定される。
本発明の好ましい方法に従ったタイムゲートによる徒党
測定は、一般の分光光度計、たとえばゲート化光子噴出
器を備えたスペックス（５ｐｅｘ）Ｌ−１１１螢１１−
（スペノクスｅインダストリーズ社、ニュージャージ州
エジソン）により行うことができる。発光は励起光線の
ビームに対しいかなる角度においても測定することがで
きる。好ましくは発光は励起光線のビームから約２〜２
Ｕ度の角度で測定される。
アッセイ系の液体相中の吸光パ物質はｔＬ本相を通過す
る励起光線および／または発光光線をすべて吸収し、こ
れにより遊離トレーサーからの発光の検出を効果的に防
止する。他方、結合トレーサーは液体相を通過しなかっ
たｙｔを吸収し１次いで検出可能な光を発する。
本発明の方法および構成媛素を第１図に示す。
ここでアッセイ系１Ｕには開放端１１および閉鎖端１２
をもつ好ましくはポリスチレン製の試験・Ｕ１６が陰ま
れる。試験管１３には晧合画分１５および液体相１７が
身まれる。結合画分１５には試験管１６の内壁に結合し
た抗−被分析体１９．ならびに結合被分析体２１および
結合トレーサー２６が言まれる。結合トレー＋ｊ−２３
は、螢光色　・素標識２７を取込んだポリマー粒子２５
が結合した結合波分析体２１からなる。液体相１７には
遊離被分析本２１ａ、遊離トレーサー２６ａおよび吸光
物質２９がよまれる。
滲考線６１で模式的に示した励起光線が試験管１６ｔｌ
−貞通し、物質２９により吸収されるか、あるいは試験
管１３２頁通して結合トレーサー２３または、遊離トレ
ーサー２３ａにより吸収される。
結合トレーサー２６からの螢光発光には、液体相１７中
へ発光されてここでｍ’ｔｔ２９により吸収される光線
６６ａ、および液体イ＠１７を通過することなく試・横
管１６の外側へ通過し、ここで螢光計６５により検出さ
れる光線６６６がよまれる。遊離トレーサ〜２３４から
液体相１７中へ放出される発光’６６ｃは力實２ソによ
り吸収される。
固体支持体から反射される励起光線は結合トレーサーか
らの発光の測定を妨害しない。何故なら、発光は励起光
源が清さ７″したのちに測定されるからである。アッセ
イ媒質中の血清その他の螢光・物質に伴随する減衰時間
の短かいパンクグラウンド発光（固体支持体自体に付随
する発光をまむ）は。
時間分解型の発光０Ａ１１定によって本質的に除かれる
。
従って本発明方法によれば、検出される唯一の発光は固
体支持体の表面に結合したトレーサーからのものである
。
前記の競合アッセイ法においては、＠光の大きさは結合
トレーサーの量に正比グｊし、従って液体中に存在する
被分析体の量に反比例する。液体中の被分析体の濃度は
、被分析体のアッセイに際して測定された発光の強さを
、本ぼ的に等しい条件下でアッセイされる一定範囲の既
知量の被分析体のアッセイに際して測定される発光と比
較することによって測定できる。
本発明方法は固相サンドイッチアッセイ法にも適用でき
る。この盟のアッセイ法は高分子被分析体、たとえば蛋
白質のアッセイに特に有用である。
固相サンドイッチアッセイ法のいかなる変法も採用でき
る。たとえば十分な量の抗−被分、析体を固体支持体に
結合させて５本質的にすべての被分析体を被分析体上の
第１決定因子により結合させる。
この支持体上の抗−被分析体を被分析体、吸光物質、お
よびトレーサー（被分析体上の第２決定因子に対して特
異的な標礒リガンドよりなる）と共にインキュベートす
る。リガンドは抗原、抗体、または結合抗原−抗体複合
体のいずれであってもよい。
好ましい標識物質および吸光物質、ならびに好ましい励
起法および発光検出法は、競合アッセイに関して上記に
述べたものと同様である。しかし本発明の上述の実施態
降におけるサンドイッチアッセイにおいては、液体中に
存在する被分析体の濃度は発光の大きさに正比列する。
本発明の他の観点においては１本発明方法に従って被分
析体のアッセイを行うための材料の試薬キットまたはパ
ッケージが提供される。このキットには、　ｔＬ分析体
に％異的な抗−被分析体が結合した固体支持体、吸光・
物質、および被分析体に対するトレーサー（励起光線を
吸収し、検出可能な光線を発しうる標識が結合したもの
）が言まれる。
キットには被分析体に対する標準物質、たとえば既却績
度の被分析体試４１種または２種以上がよまれていても
よく、あるいはアッセイを行うのに有用な曲の標識され
た、または標識されていない特異的な抗原、抗体、また
はそれらの複合体がよまれていてもよい。キットの各構
成部品は別個の容器、たとえばバイアルに入れた状聾で
供給されてもよく、あるいけこれらの構成部品のうち２
種以上が１個のげ器中に＠会せられていてもよい。
以下のジゴキシンに関するモデル系およびアッセイ法の
実施り１ｌ（１）本発明をより詳細に記述するために提
示され、何らかの形で本発明を限定することを意図する
ものではない。
実施列１ ナフトイルトリフルオルアセトン−ユーロピウムキレー
ト（Ｎ　Ｔ　Ｆ　Ａｓ　Ｅｕ　）約１憾をき有する約１
５０　ｎｍのポリメタクリル酸メチルピーズを水に懸濁
シ、ポリスチレン製キーベットの表面に吹付けた。キュ
ベツトを周囲温度で一夜乾燥させ。
これによりビーズは表面に固着し、水洗によって除去さ
れなかった。こうして被覆したキュベツト’ｋＴＲ−Ｆ
ＩＡの結き両分、すなわち抗−被分析体およびトレーサ
ーが結合した固体支持体に該当するものとして用いた。
ビーズ約１×１０個／ｍｌ　　の水性＠濁液を、遊離ト
レーサーをよ有するＴＲ−Ｆ’ＩＡ液本相に該当するも
のとしてすべてのキュベツトに添加した。
表１に示す濃度の１．８−ＡＮＳの水溶液をキーペット
に添か口した。対照キュベツト１個には水のみを入れた
。
ゲート化光子検出器を備えたスベノクスし−１１１螢光
計により３４３　ｎｍのパルス励起光線？キュベツトに
直角に与えた。０．５ｍ秒の遅れののち、励起光線のビ
ームに対し１１および９０の角度で６１４ｎｍにおける
螢光発光を測定した。
結果を表１に示す。これは懸濁したビーズの螢光発光に
対して１．８−ＡＮＳの濃度が与える影響と示す。
表　Ｉ ０　　　　　　　　３１．５００　　　３２，３００１
ｘ１０−２　　　　　１，３００　　　　　４５１ｘｆ
Ｃ７−”　　　　　　　１．３００　　　　第７６１ｘ
１０−’　　　　　　２７，２００　　　３１，４００
１ｘ１０　　Ｍ　　の濃度をもつ１．８−ＡＮＳが結合
ビーズに帰因するものを除くすべての発光を除去したこ
とが認められる。
実施列２ 各６個のキーベットの２弾？実施列１ＶＣ述べたと同機
に２種の異なる濃度のビーズで被覆した。
各群において１個のキュベツトにく水のみを入れ。
ＴＲ−ＦＩＡの結合画分に該当させた。各群において６
番目のキュベツトにｕ５ｘ１０　　Ｍの１．８−ＡＮＳ
をよむビーズｆ！Ａ４６液を入れた。
励起により、１１における螢光発光測定を実施列１に記
載したと同様に行った。結果に表１に示す。
表　■ 検出された光子の数 キュベツト１　　　　キュベツト２ 被覆キユベツト＋水　　　　　　２，３００　　　　４
０．０００（結合画分） 被覆キュベツト＋懸濁ビーズ　３２，４００　　　　７
１．０００（結合画分十遊離画分） 被覆キーペット剖腎濁ビーズ＋　　２．７００　　　　
３８．０００５×１０−槍の１．８−ＡＮＳ （結合画分十遊離画分十 吸光物質） 吸光物質の存在下では、キュベツト表面のビーズ（結合
画分）のみが懸濁液中の大過剰のビーズ（遊離画分〕の
存在下で選択的に励起され、それらの螢光発光が検出さ
れたことが認められる。
実施りＩＪ３ Ａ、螢光ポリマー粒子の製造 Ｎ　Ｔ　Ｆ　Ａｓ　Ｅ　ｕ　　１　％をき有する９２：
６：２の比率のメタクリル酸ブチル：メタクリル酸グリ
シジル：メタクリル酸スルホエチルからなるポリマービ
ーズを下記の方法で製造した。ビスメチレンアクリルア
ミド（０，０５Ｓ’）およびポリエチレンオキシド（０
，１ｙ）を脱イオン水（２５＋＋＋ｌ）およびアセトン
（４ｔｎｌ　）に溶解した。メタクリル酸ブチル（０，
７８１ｎｌ）、メタクリル酸スルホエチル（０，２ＳＦ
）、メタクリル酸グリシジル（０，５ｍｌ　）およびＮ
Ｔ　Ｆ　Ａ３　Ｅｕ　（２５Ｉｎ９）をぎ有する第２溶
／ＱＬを調製した。これら２つの溶液を混合し、ＩＮ・
ＮａＯＨによりｐＨを５．５に調整した。Ｎ、下で十分
に纜詐したのち、混合物を７．０５　Ｍｒ／を時間で１
２時間照射した。白色乳濁′ｔＬを遠心分１４１Ｉ機で
速度を連続的に高めながら遠心分離した。３０．００Ｏ
ｒｐｍで採取されたペレットをリン酸塩緩衝化食塩液Ｃ
Ｐ　Ｂ　Ｓ　−０，１５Ｍ−Ｎａ（Ｊ？中の、０１Ｍリ
ン酸モノおよびジナトリウム混合物〕中の０．１係ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツウィーン
（Ｔｗｅｅｎ）　２０　）で３回洗浄した。このベレッ
トを最終的に１，６−ジアミツプロパンの１０幅溶液に
懸濁し、ここでＩ　Ｎ　−ＨＣ＃　　によすｐｆ（’ｔ
１０に調整した。懸濁液を一夜攪拌し１次いで６回洗浄
し、ＰＢ８３０ｒｎｌに懸濁した。
Ｂ、　　ＢＳＡ−ジゴキシン粒子結合体の製造Ａに記載
した粒子懸濁液の試％＋Ｃ１，０ｍ１）全最終濃度１憾
のグルタルアルデヒドの添θ口により活性化した。４時
間のインキュベーションののちＰＢＳ中で６回洗浄した
。活性化されたビーズ１ｍｌにウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）−ジゴキシン結合体５ｒｎ９を添加した。混合物
を室温で一夜攪拌した。ビーズを６回洗浄し、Ｐ　８８
２５　ｍｌに懸濁し、４℃に保存した。
Ｃ，Ｈ兎ＰｊＣジゴキシン免疫グロブリンによるポリス
チ家兎抗ジゴキシン免疫グロブリンの２０００倍希釈を
０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）中で行った。
この溶液を各キュベツトに６ｍｌの目盛に達するまでピ
ペットで移した。室温で４時間インキュベートしたのち
、キュベットヲアスビレーターで吸引し、ＰＢＳ中の２
壬ＢＳＡ溶液で、最後にＰＢＳ中で順次洗浄した。キュ
ベツトを乾燥させ、４℃に保存した。
Ｄ、リン酸塩緩衝液中のジゴキシンに関する標準曲線の
決定 ＢＳＡ（２係）およびツウィーン２０（０，５壬）ヲき
有するＰＢＳ中において１〜１０，０ＯＵｎｆ／ｍｌの
範囲の二重希釈系列のジゴキシンを調製し。
次いでこれらの溶液およびブランクＰＢＳ各６ＩＴＬｌ
を、あらかじめＣ［記載したように被覆したキュベツト
にピペットで分取した。これらのキュベツトツレぞれに
Ｂ項で製造したＢＳＡ−ジゴキシン粒子結合体６０μｌ
　を添加した。キュベツト全６７℃で４５分間インキュ
ベートした。各キュベツトに０．１Ｍ・１．８−ＡＮＳ
　（３０μｌ）を添加し、０．５ｍ秒の遅れののち、励
起光線のビームに対し１１の角度で６１４　ｎｍにおけ
る螢光発光？測定した。結果を表■および第２図に示す
。
表　■ ジゴキシン濃度（ｎｓＦ／ｍｌ）　　　　　強度（光子
数）１００　　　　　　　　　７［］００ １０（ＪＯ６１００ 実施列４ Ａ、抗ＨＣＧ免疫グロブリン粒子結合体の製造実施列３
Ａに記載した粒子懸濁液の試料（１，０ｍ１）を最終濃
度１憾のグルタルアルデヒドの添加により活性化した。
４時間のインキユベーションののちＰＢＳ中で６回洗浄
した。活性化されたビーズ１　ｍｌに、）ＩＣＧＫ対し
て常法により産生させたモノクローナル抗体（Ｅ（ＣＧ
−１，３と表示）の１ｍｇ７ｍ１溶液ＣＰＢＳ中）５０
μｊを添加した。混合′勿を室温で一夜攪拌した。
ビーズ全６回洗浄し、　Ｐ　Ｂ　８２５ｍ１ＶＣ懸濁し
。
４℃に保存した。
ＨＣＧＶＣ対して産生させた第２のモノクローナル抗体
（Ｅ（ＣＧ−４と表示）の５．（ＪＩＩＯ倍希釈を０．
１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐｆ（’？、５）中で行った。
この溶ｇ！Ｌヲキュベノトの３　ｒｎｌの水準にまでピ
ペットで分取した。湿温で４時間インキュベートしたの
ち、キーベノトヲアスピレーターで吸引し、ＰＢＳ中の
２壬ＢＳＡ溶液で、最後にＰＢＳ中で、順次洗浄した。
キーベットを乾燥さぞ。
４℃に保存した。
Ｃ，ＩＪン酸唱媛価液中のＩ（ＣＧに関する標準面、線
の決定 ０．１５〜１．５ｘ　１０’ｍＩＵ／ｍｌの範囲の二重
希釈系列のＨＣＧを１０培濃度のＰＢＳ中で調製した。
これらの溶液およびブランクＰＢＳを、あらかじめＢＶ
ｃ記載したように被覆したキュベツトにピペットで分取
した。６７℃で１時間インキュベートしたのち、Ａに記
載したミクロビーズ（５０μｌ）を添加し、インキュベ
ーションをさらに１時間続けた。各キュベツトにり、　
１　Ｍ・１．８−　ＡＮＳ　（６０ｔｔｌｌ　）　ｋ添
か口し、０．５ｍ秒の遅れののち励起光線のビームに対
し１１０角度で６１４　ｎｍにおける螢光発光を測定し
た。結果と表ＩＶおよび第３図に示す。
表　■ ｆ（Ｃ０４度（ｍＩＵ／ｍｌ）　　　　強度（光子数）
０　　　　　　１．０００ ０．１５　　　　　１，３８０ １５　　　　　　１．７５０ １．５００　　　　　　２．０００ １５０．０００　　　　　　２，６００以上のように１
本発明によれば固相螢光イムノ了ノセイ法はアッセイ系
の液体相に吸光物質を添加することをよむ。吸光物質は
、結合トレーサーにより吸収されて発光せられるものを
除いて、すべての励起光線および／または発光光線を吸
収するから、これにより大過剰の遊離トレーサーの存在
下でも結合トレーサーからの発光のみを検出し、測定す
ることが可能となる。こうして結合画分と遊離画分を分
離する必要性が避けられ、均質アッセイの簡潔性および
簡便性が達成される。時間分解法を採用して結合トレー
サーからの発光を測定することによって２反射された励
起光線ならびに光散乱およびバンクグラウンド発光によ
る妨害を最小限に抑え、これによりいっそう高いアッセ
イ感度を達成しうる。本発明の方法は、固相横金型およ
びサンドインチ型のアッセイ系のすべての変法に容易に
適用できる。本発明には手動アッセイ法または自動アッ
セイ法のいずれかに使用できるアッセイ材料キットが含
まれる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明方法による競合イムノアッセイに用いら
れる試験・ｇその他の構成要素と示す。 第２図は本発明方法によるジゴキシンアッセイの標準曲
線である。 第３図は本発明方法によるヒト絨毛性ゴナドトロピン（
ＨＣＧ）アンセイの標準曲線である。 １０：アノセイ系；　　　１１：試験管の開放端：１２
：試験管の閉鎖端；　　１６：試験管；１５：結合画分
＝　　　１７＝流体相：１９：抗−破分析本；　　　２
１：結合被分析体；２１Ｑ：遊離被分析体；　　　２６
：結合トレーサー：２３ａ：遊離トレーサー：　　２５
：ボリマー粒子：２７：螢光色素標識；　　２９：吸光
物質；６１：励起光線：　　　　６６　’　、’　、ｃ
　ａ発光光線＝（外５名） ＦＩＧ、　１

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）固体支持体の表面に結合した抗−被分析体
    を、未知量の被分析体を含有する液体、吸光物質、およ
    び螢光色素を有してなる被分析体用トレーサーと接触さ
    せることによって、混合物を調製し；（ｂ）該混合物を
    インキュベートし； （ｃ）該混合物に、励起光線の一部が上記トレーサーに
    より吸収されるのに十分なパルス強度および持続時間で
    励起光線のパルスを与え； （ｄ）前記固体支持体の表面に抗−被分析体を介して結
    合したトレーサーからの螢光発光を検出し、その際該発
    光は上記光線のパルスが終止したのちに、かつ該混合物
    中の結合トレーサー以外の成分による発光が実質的にす
    べて減衰したのちに検出されるのに十分な長い減衰時間
    をもつものであるよう前記螢光色素が選択されており；
    そして（ｅ）上記螢光発光の強さを、既知量の被分析体
    に関して確認された螢光発光の強さと比較することによ
    って、液体中の被分析体の量を測定する；ことよりなる
    液体中に存在する未知量の被分析体の測定法。
  2. （２）被分析体が抗原、ハプテンおよび抗体よりなる被
    分析体の群から選ばれ、抗−被分析体が抗原および抗体
    よりなる抗−被分析体の群から選ばれる、特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。
  3. （３）トレーサーが螢光色素と結合した被分析体からな
    り、該トレーサーが抗−被分析体と特異的に反応する、
    特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. （４）限られた量の抗−被分析体が支持体に付着してお
    り、被分析体およびトレーサーが該抗−被分析体に競合
    的に結合する、特許請求の範囲第３項に記載の方法。
  5. （５）トレーサーが螢光色素と結合した抗原、抗体およ
    び抗原−抗体結合複合体よりなるトレーサーの群から選
    ばれ、該トレーサーが被分析体と特異的に反応する、特
    許請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. （６）実質的にすべての被分析体が抗−被分析体に結合
    し、トレーサーが該被分析体と結合する、特許請求の範
    囲第５項に記載の方法。
  7. （７）螢光色素がランタニドキレートである、特許請求
    の範囲第１項に記載の方法。
  8. （８）ランタニドキレートがポリマー粒子に取込まれて
    いる、特許請求の範囲第７項に記載の方法。
  9. （９）液体が血清である、特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
  10. （１０）吸光物質がトレーサーの吸光帯と重なる吸光帯
    をもつ、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  11. （１１）吸光物質がアリールアミノナフタリンスルホン
    酸である、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  12. （１２）パルスの強度が光子約１×１０＾４＾０２×１
    ０＾４＾０個である、特許請求の範囲第７項に記載の方
    法。
  13. （１３）パルスの持続時間が約１〜１０μ秒である、特
    許請求の範囲第７項に記載の方法。
  14. （１４）パルスが約２８０〜３７５ｎｍの波長をもつ、
    特許請求の範囲第７項に記載の方法。
  15. （１５）螢光発光が約５８０〜６３０ｎｍの波長をもつ
    、特許請求の範囲第７項に記載の方法。
  16. （１６）螢光発光が約０．５〜１．０ｍ秒の減衰時間を
    もつ、特許請求の範囲第７項に記載の方法。
  17. （１７）螢光発光が連続パルスの間に測定される、特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。
  18. （１８）螢光発光が１つのパルスの終了後に０．５〜０
    ．７５ｍ秒の間に測定される、特許請求の範囲第１頃に
    記載の方法。
  19. （１９）螢光発光が励起光線のパルスの方向から２〜２
    ０°の角度で測定される、特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
  20. （２０）（ａ）固体支持体の表面に結合した抗−被分析
    体を、未知量の被分析体を含有する液体、吸光物質、お
    よび吸光および発光しうる検出可能な標識剤を有してな
    る被分析体用トレーサーと接触させることによって、混
    合物を調製し； （ｂ）被分析体およびトレーサーが抗−被分析体に結合
    するのに十分な時間を経過させ； （ｃ）該混合物に励起光線を与え； （ｄ）前記固体支持体の表面に抗−被分析体を介して結
    合したトレーサーからの時間分解された（ｔｉｍｅ−ｒ
    ｅｓｏｌｖｅｄ）発光を検出し；そして（ｅ）検出され
    た発光の強さを既知量の被分析体に対して確認された発
    光の強さと比較することによって、液体中の被分析体の
    量を測定する；ことよりなる、液体中の未知量の被分析
    体の測定法。
  21. （２１）（ａ）全ての被分析体を結合させるには不十分
    な量の抗−被分析体を固体支持体の表面に結合させ、こ
    の抗−被分析体を、未知量の被分析体を含有する血清試
    料、吸光物質としてのアリールアミノナフタリンスルホ
    ン酸、およびランタニドキレート系標識剤を取込んだ粒
    子と結合した被分析体を有してなる被分析体用トレーサ
    ーと接触させることによって、混合物を調製し； （ｂ）該混合物をインキュベートし； （ｃ）該混合物に、光子約１×１０＾４＾０〜２×１０
    ＾４＾０個の強度および約１〜１０μ秒の持続時間で、
    約２８０〜３７５ｎｍの波長の励起光線のパルスを与え
    ； （ｄ）前記固体支持体の表面に抗−被分析体を介して結
    合したトレーサーから発せられる約５８０〜６３０ｎｍ
    の波長および約０．５〜１０ｍ秒の減衰時間をもつ螢光
    発光を検出し、その際該発光は連続励起パルスの間でパ
    ルス方向から約２〜２０°の角度においてパルス終止の
    約０．５０〜０．７５ｍ秒後に測定され；そして （ｅ）上記螢光発光の強さを、既知量の被分析体をき有
    する混合物が工程（ａ）〜（ｅ）に従って測定された場
    合に検出される螢光発光の強さと比較することによって
    、血清試料中の被分析体の量を測定する、 ことよりなる血清試料中に存在する未知量の被分析体の
    測定法。
  22. （２２）粒子がポリマー粒子である、特許請求の範囲第
    ２１項に記載の方法。
  23. （２３）ランタニドキレートがβ−ジケトンにキレート
    結合したユーロピウムまたはテルビウムイオンである、
    特許請求の範囲第２１項に記載の方法。
  24. （２４）（ａ）実値的に全ての被分析体を結合させるに
    十分な量の抗−被分析体を固体支持体の表面に結合させ
    、この抗被分析体を、未知量の被分析体を含有する液体
    、吸光物質としてのアリールアミノナフタリンスルホン
    酸、およびランタニドキレート系標識剤を取込んだ粒子
    が結合している被分析体に特異的なリガンドを有してな
    る被分析体用トレーサーと接触させることによって、混
    合物を調製し； （ｂ）該混合物をインキュベートし； （ｃ）該混合物に、光子約１×１０＾４＾０〜２×１０
    ＾４＾０個の強度および約１〜１０μ秒の持続時間で、
    約２８０−３７５ｎｍの波長の励起光線のパルスを与え
    ； （ｄ）約５８０〜６３０ｎｍの波長および約０．５〜１
    ．０ｍ秒の減衰時間をもつ螢光発光を検出し、その際発
    光は連続励起パルス間にパルスの方向から約２〜２０の
    角度においてパルス終止の約０．５〜０．７５ｍ秒後に
    測定され、そして （ｅ）上記螢光発光の強さを、既知量の被分析体を含有
    する混合物が工程（ａ）〜（ｅ）に従って測定された場
    合に検出される螢光発光の強さと比較することによって
    、血清試料中の被分析体の量を測定する； ことよりなる血清試料中に存在する未知量の被分析体の
    測定法。
  25. （２５）粒子がポリマー粒子である、特許請求の範囲第
    ２４項に記載の方法。
  26. （２６）リガンドが抗原、抗体、および結合抗原−抗体
    複合体よりなるリガンドの群から選ばれる、特許請求の
    範囲第２４項に記載の方法。
  27. （２７）ランタニドキレートがβ−ジケトンにキレート
    結合したユーロピウムまたはテルビウムイオンである、
    特許請求の範囲第２４項に記載の方法。
  28. （２８）被分析体に特異的な抗−被分析体が結合した固
    体支持体；吸光物質；および吸光および発光しうる標識
    剤を有してなる被分析体用トレーサーからなる、液体中
    の未知量の被分析体に関するアッセイを行うための材料
    のキット。
  29. （２９）さらに、既知濃度の被分析体試料少なくとも１
    種を含む、特許請求の範囲第２８項に記載のキット。
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