NO880302L - Fluorescens-immunoanalyse innbefattende energioverfoering mellom to fluoroforer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører feltet fluoroescens-immunoanalyse som er nyttige for bestemmelsen av analytter 1 flytende prøver.

Det finnes flere kjente fremgangsmåter for deteksjon av analytter (f.eks. hormoner, enzymer, andre proteiner, terapeutiske - midler, legemidler som misbrukes,' osv.) i flytende prøver, såsom biologiske fluider. Blant de kjente typene av fremgangsmåter har immunoanalyser vist seg å vøære følsomme teknikker for bestemmelse av meget små mengder av visse organiske forbindelser. Immunoanalysefremgangsmåter er generelt basert på evnen av et reseptormolekyl, vanligvis et antistoff, til spesifikt å gjenkjenne en spesiell rommelig og/eller polar orning av et 1igandmolekyl, og derved selektivt bindes til 1igandmolekylet.

Visse av de kjente immunoanalyseteknikkene innbefatter anvendelsen av fluoroformolekyler som er i stand til å absorbere lys ved enb bølgelengde og emittere lys ved en annen bølgelengde. F.eks. beskriver U.S. patent nr. 4.272.505, Smith, en fremgangsmåte for analyse av en prøve av et biologisk fluid med henblikk på et thyroidhormon. Denne fremgangsmåten er basert på prinsippet med fluorescensunder-trykkelse av en fluorofor ved hjelp av thyroidhormon. Fremgangsmåten ifølge Smith er en analyse av den kompetitive typen som innbefatter dannelse av en blanding av en flytende prøve med en kjent mengde fluorofor-merket thyroidhormon, fluoroforen har et fluorescensnivå som undertrykkes vesentlig ved hjelp av thyroidhormonet hvortil fluoroforen er bundet. Antistoff som er i stand til binding til det fluorofor-merkede thyroidhormonet, såvel som thyroidhormon til stede i prøven, innføres i blandingen. Antistoffet antas å sterisk endre det merkede thyroidhormonet, derved endres gtraden av undertrykkelse av fluorescensen av fluoroforen som er bundet dertil. Fluorescensnivået for blandingen måles deretter og mengden thyroidhormon i prøven beregnes ved å sammenlikne fluorescensnivået av blandingen med et standard fluorescensnivå. "

U.S. patent nr. 4.133.873, Noller, beskriver en fremgangsmåte for bestemmelse, av mengden av. et element fra en gruppe bestående av et ekstracellulært antigen og et ekstracellulært antistoff som er i stand til spesifikt å kombineres med nevnte antigen. Fremgangsmåten immbefatter merking av elementet med en fluorofor, og eksponering av det merkede elementet mot en lyspuls av en første bølgelengde tilstrekkelig til å forårsake emisjon ved det merkede eksponerte elementet av sekundært lys, som har en andre bølgelengde forskjellig fra den første bølgelengden. Det sekundære lyset avføles, slik at det genereres 1 et oppfattbart signal som respons på, og samsvarende med, det avfølte sekundære lyset.

En immunoanalyse som anvender to forskjellige ligander merket med separate fluoroforer som uavhengig fluorescerer ved forskjellige bølgelengder er beskrevet i U.S. patent nr. 4.385.126, Chen et al. De to merkede ligandene er i stand til immunologisk binding til hverandre, og de to forskjellige ligandene kan detekteres uavhengig ved deres uavhengige merkebestanddeler (fluoroforer) for kvalitetskontroll, indre kalibrering (standardisering), bestemmelse av levedyktighet og holdbarhet, o.l.

U.S. patentene nr. 3.996.345, 4.174.384, 4:199.559 og 4.261.968, alle tilhørende Ullman et al., beskriver immunoanalyser hvor det anvendes antistoffer og et fluorescens-slukkerkromoforpar. Fremgangsmåten er basert på fenomenet med energioverføring mellom to kromoforer som danner et fluorescens^slukkerpar. Fremgangsmåten innbefatter bestråling av et fluorescensmolekyl med . lys av en .første bølgelengde, som absorberes av .den.:fluorescerende delen og resulterende emisjon åv lys av en lengre bølgelengde ved den fluorescerende delen. Dersom en slukkerkromofor befinner seg I en avstand på mindre enn 100Å fra den fluorescerende delen og absorberer lys ved bølgelengden for emisjoen fra den fluorescerende delen, vil den fluorescerende delen overføre til slukkekromoforen den energien som ellers ville ha blitt emittert som lys. Fremgangsmåtene ifølge Ullman innbefatter alle måling av reduksjon av fluorescens (lysemisjon) av den fluorescerende kromoforen som skyldes energioverføring til slukkerkromoforen. Ligand og antiligand kan separat merkes med fluorescerende del og slukker, eller en gruppe antistoffer kan merkes med fluorescerende del, og en annen gruppe antistoffer merkes med slukker for deteksjon av ligand som er i stand til immunologisk binding til mer enn ett antistoff.

U.S. patent nr. 4.536.479, Vander-Mal1ie, beskriver en immunoanalysefremgangsmåte for deteksjon av en analytt i en prøve, hvori en reaksjonsblanding dannes av prøve og et par av reagenser. Den første reagensen er et idiotypisk anti-analyttantistoff merket med en første fluorofor. Den andre reagensen er et anti-idiotypisk antistoff merket med en andre fluorofor, hvor det anti-idiotypiske antistoffet er i stand til å konkurrere med analytten i prøven om det idiotypiske anti-analyttantistoffet. En av fluoroforene er i stand til å absorbere innfallende lys ved en første bølgelengde for produksjon av lysemisjon ved en andre bølgelengde, hvilken andre bølgelengde kan absorberes av den andre fluoroforen, slik at det oppstår emisjon ved en tredje bøleglengde. For deteksjonen av analytt i reaksjonsblandingen bestråles reaksjonsblandingen med innfallende lys av den første bølgelengden, og intensiteten av lyset av den andre eller tredje bølgelengden måles, denne intensiteten er realtert med megnden analytt som innledningsvis er til stede i prøven.

Alle de kjente fluorescens-immunoanalysefremgangsmåtene har ulemper og begrensninger, hvilket etterlater et kontinuerlig behov for nye, raske og følsomme fremgangsmåter for deteksjon av analytter i flytende prøver.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et element av et spesifikt bindende par av ligand og reseptor, elementet er kovalent. bundet til det første og andre fluoroforer. Den første av fluoroforene er i stand til å absorbere lys ved en første., bølgelengde, slik at det oppstår _lysemisjon av en andre bølgelengde, hvilken andre bølgelegde kan absorberes av den andre fluoroforen. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvender et element av et spesifikt bindende par som definert ovenfor, ved bestemmelsen av nærværet eller mengden av det andre elementet av det spesifikt bindende paret i en flytende prøve... Fig. 1 . er en grafisk fremstilling som. viser reduksjonen av fluorescens-eksitasjonspverføringen mellom fluorescein og eosin bundet til anti-thyrok.sin (anti-T4) i nærvær av varierende konsentrasjoner av thyroksin (T4). Fig. 2 er en grafisk fremstilling som viser virkningen av kaldt T4 på den relative fluorescensen av dobbeltmerket antistoff til T4. Fig. 3 er en grafisk fremstilling som viser virkningen av volum av hepatitt . B overflateantigen på fluorescensen av monoklonalt antistoff til hepatitt B, merket med fluorescein-isotiocyanat og eosin. Fig. 4 er en grafisk fremstilling som viser virkningen av volum av immunoglobulin G (IgG) på fluorescensen av antistoff til IgG merket med fluoresceinisothiocyanat og eosin. Fig. 5 er en grafisk fremstilling som viser en økning i fluorescens-eksitasjonsoverføring etter inkubering av dobbeltmerket digoksin-antistoff (anti-DG) med varierende konsentrasjoner av.digoksin (DG). Fig. 6 er en grafisk fremstilling som viser virkningen av

kald DG på fluorescensen av anti-DG dobbeltmerket med fluorescelnisotiocyanat (FTIC) og eosin.

Flg. 7 er en grafisk fremstilling som viser virkningen av normalt serum (fortynnet 1:10) på fluorescens av dobbeltmerket monoklonalt anti-IgG.

Ved utførelse av en immunoanalyse ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes et element av et spesifikt bindende par av ligand og'reseptor, hvilket element er kdvalent bundet til første og andre fluoroforer. De første og andre fluoroforene kan være kovalent bundet til enten liganden eller reseptor-elementet av det spesifikke bindende paret for deteksjon av det andre elementet av det spesifikke bindende paret.

Ligand refererer til et organisk molekyl eller en samling med minst en funksjonalitet som har en spesiell romlig og/eller polar organisasjon for hvilken en reseptor enten er naturlig tilgjengelig eller kan fremstilles.

Reseptor viser til et molekyl som er i stand til spesifikt å gjenkjenne en viss funksjonalitet av et 1igandmolekyl som har en spesielt romlig og/eller palar organisasjon, og derved selektivt bindes til 1igandmolekylet. Reseptorer er generelt antistoffer, selv om enzymer, proteiner, nukleinsyrer og visse globuliner også kan virke som reseptorer.

En fluorofor er et molekyl som er i stand til å absorbere lys ved en bølgelengde og emittere lys ved en annen bølgelengde.

Ifølge oppfinnelsen er den første og den andre fluoroforen som er kovalent bundet til liganden eller reseptoren, elementer av et fluorescens-energioverføringssystempar hvor emisjonsspekteret for den første fluoroforen overlapper godt med eksitasjonsspekteret for den andre fluoroforen slik at når den første og den andre fluoroforen vekselvirker ved fluorescens-energioverføring, absorberes fluorescensen fra den første fluoroforen av den andre fluoroforen ved energi-overføring.....

Eksempler på. fluoroforer som har overlappende emisjons- og eksitasjonsspektre innbefatter fluorescein (eksitasjon X 495 nm, emisjon X 520 nm), eosin (eksitasjon X 520 nm, emisjon X 545 nm), fluorescamin (eksitasjon X 390 nm, emisjon X 520 nm), og tetrametylrhodamin (eksitasjon X 520 nm, emisjon X 550 nm).

Ifølge en utførelse innbefatter fluorescens-energioverfør-ingssystemparet fluorescein som en første fluorofor og eosin som en andre fluorofor.

Ifølge en utførelse bringes den første og den andre fluoroforen innenfor eksitasjons-overføringsnærhet ved kovalent binding av begge kromoforene til et element av et spesifikt bindende par av ligand og reseptor.

Den første og den andre fluoroforen er kovalent bundet til ligand eller reseptor i tilstrekkelig nærhet til hverandre (generelt mindre enn ca. 100 Å) slik at en energioverføring fra den første fluoroforen til den andre fluoroforen vil finne sted ved eksitasjon av den første fluoroforen ved lys av en første (eksitasjon) bølgelengde. Alternativt er de bundne fluoroforene anbrakt nær hverandre ved binding av ligand og reseptor.

Den ikke-kovalente tilknytningen av det fluorofor-merkede elementet av det spesifikke bindende paret til det umerkede elementet kan enten interferere med eller forsterke fluor-escenseksitasjonsoverføringen som oppstår ved enten en reduksjon eller, økning av ■ fluorescensen fra en eller-begge fluoroforer.

Fluoroforene kan bindes kovalent til ligand eller reseptor ved anvendelse av en hvilken som helst egnet fremgangsmåte som er kjent innen teknikken. Dersom, f.eks., reseptoren er antistoff, bindes den første og den andre fluoroforen generelt trinnvis til antistoffet. Antistoffer har generelt et antall aktive aminogrupper som kan benyttes for kovalent binding av fluoroforer til antistoffet. Hensiktsmessig kan en flurofor ha en ikke-oksokarbonylfunksjonalitet (innbefattende nitrogen- og- svovelanalogene derav) eller aktiv a-halogen-karbonylfunksjonalitet. Eksempler på funksjonaliteter for binding av en fluorofor til antistoff innbefatter acylhalo-genider, blandede anhydrider, imidatalkylestere, isotio-cyanat, klorobrom- eller jodacetyl, og lignende.

Betingelsene for kovalent binding anvender moderate tempera-turer, f.eks. 0-40°C, i vandige medier ved moderat pH. Kovalent binding av fluoroforer til protein er kjent innen teknikken, se f.eks. The et al., Immunology, 18:865 (1970); Cebra et al., J. Immunol.. _95:230 (1965 ); Goldman, Fluoro-escence Antibody Wethods.Academic Press, New York (1968). Energioverføring mellom en fluorescens-energidonor (så som fluorescein) til en egnet energiakseptor (så som eosin) avhenger av den inverse avstanden i sjette mellom donor og akseptor så vel som den dielektriske konstanten for den umiddelbare omgivelsen. Energioverføring er generelt mest effektiv over en avstand av størrelsesorden 40-50 Å, slik at en fluorescens-energidonor overfører energi til en nærmeste naboakseptor fremfor en som befinner seg i større avstand.

Oppfinnelsen skal videre sepsifikt beskrives med hensyn til den første og andre fluoroforen kovalent bundet til reseptor (antistoff), selv om det skal understrekes at oppfinnelsen er like anvendelig ved ligand-bundne fluoroforpar.

Med første og andre fluoroforer nært bundet til antistoff produserer absorpsjon av lys av den første fluoroforen ved en første eksitasjonsbølgelengde (XeX]_) lysemisjon ved en andre emisjonsbølgelengde (<X>em^), og den andre bølgelengden (Xem^) kan absorberes:av den andre fluoroforen slik at det oppstår en emisjon ved en tredje bølgelengde (Xem2).

Binding av merket antistoff til ligand inhiberer energiover-føring fra den første fluoroforen til den andre fluoroforen, og øker derved fluorescensen av den første fluoroforen (dvs. øker emisjonen av lys av bølgelengde Xem^), og reduserer tilsvarende fluorescens av den andre fluoroforen (dvs. emisjon av lys av bølgelengde Xem2) på grunn av inhiberingen av energioverføring mellom den første fluoroforen og den andre fluoroforen ved det bundne 1igandmolekylet.

Fluorofor-merket antistoff til ligand anvendes for å bestemme nærværet eller mengden av ligand i en flytende prøve. En reaksjonsblanding dannes ved å bringe den flytende prøven i kontakt med dobbelt fluorofor-merket antistoff, og spesifikk binding av merket ..antistoff og umerket ligand ihiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys som emitteres av den første fluoroforen.

Inhibering av energioverføring mellom den første og andre fluoroforen ved beståling av reaksjonsblandingen med lys av en første eksitasjonsbølgelengde (Xexi) er en funksjon av mengden av umerket analytt (umerket ligand) som er til stede i den flytende prøven. Mengden av umerket ligand kan bestem-mes ved å bestråle reaksjonsbladningen med lys av en første eksidasjonsbølgelengde (Xex^) og målemengden av fluorescens fra reaksjonsblandingen av lys av bølgelengde Xem^eller Xem2, denne fluorescensen er direkte relatert med mengden av analytt (umerket ligand) som er til stede i den flytende prøven.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres enten ved å måle økningen av Xemiemisjon på grunn av reseptor-1igandbinding sammenlikenet med en standard inneholdende merket antistoff i fravær av ligand, eller ved å måle reduksjonen i Xem2emisjon som et reultat av antistoff/- ligandbinding sammenliknet med en standard inneholdende samme mengde merket antistoff i fravær av ligand.

Den nøyaktige mekanismen for eksitasjons-energioverførings-endringene som bevirkes ved binding av ligand og antistoff er ikke kjent, og kan skyldes forskjellige faktorer avhengig av 1igand/reseptorparet som anvendes. Uten at man ønsker å være bundet til noen spesiell teori, kan slike mekanismer innbefattes sterisk eller fysisk hindring ved den bundne liganden av energioverføring mellom den første og andre fluoroforen, eller andre endringer i mikroomgivelsene for det bundne ligand/reseptorparet som forårsaker en emisjons-endring.

Ikke-begrensende eksempler for ligand/reseptorpar med hvilke oppfinnelsen hittil har vært utført innbefatter hepatitt B overflateantigen og antistoff til dette, immunoglobulin G og antistoff til dette, thyroksin og antistoff til dette, og digoksin og antistoff til dette.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en spesifikkog følsom ikke-kompetitiv immunoanalyse som har de fordelene at den er enkel og krever færre trinn enn tidligere kjente analyser. Immunoanalysen ifølge foreliggende oppfinnelse er videre mer økonomisk enn tidligere kjente analyser, i det den krever færre reagenser.

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere ved hjelp av de følgende eksemplene som ikke er begrensende.

EKSEMPEL I

Thyroksin ( T4) analyse

1. Frematilling av fluorescein- merket T4 antistoff ( T4 AB) Fluorescein-merket T4 AB ble oppnådd ved omsetning av 1 volumdel 20 g/lfluoresceinisotiocynat (FTIC) med 2 volumdeler 20 g/l T4 AB •(Calbiochem-Behring) i et pyridin/vanir/trietyle-aminmedium av sammensetning 9:1,5:0,1 v/v/v. Reaksjonen var fullført etter 1 time ved romtemperatur. Overskuddet av uomsatt fluorescein ble fjernet ved dialyse mot 5 mM K-fosfatbuffer pH 7,35 inneholdende 150 mM NaCl. Dialyse over natten var tilstrekkelig til å fjerne uomsatt materiale.

2. Fremstilling av dobbeltmerket T4 AB

Eosin-maleimid ble opnådd fra Molecular Probes, Inc. Dobbeltmerket T4 AB ble fremstilt ved å Inkubere fluorescein-merket T4 .AB med .eosin-maleimid (20 x molart overskudd) i 20 mM histidin-HCl-buffer (pH 7,40) i 3 timer ved 20-25°C. Overskuddet av uomsatt eosin ble fjernet ved dialyse mot 5 mM K-fosfatbuffer pH 7,35 inneholdende 150 mM NaCl. Fem endringer av dialysatet ble funnet å være nok til å fjerne det uomsatte materialet. Bestemmelsen av konsentrasjonen av bundet eosin ble oppnådd ved å måle den optiske tettheten ved 528 nm ved anvendelse en ekstingsjonskoeffisient på 70.000 /M cm. 3. Reaksjon av thyroksin ( T4) med dobbeltmerket T4 antistoff Reaksjonen av antigen med dobbeltmerket antistoff fant sted i 2 ml a<y>en 5 mM natriumfosfatbuffer Inneholdende 0,15 M NaCl

(pH 8,0.) inne i en spektrofotometrisk celle (kyvette) etter 1-2 minutters inkubering ved romtemperatur.

4. Resultater

Som det fremgår i figur 1, reduserte nærværet av thyroksin fluorescens-eksldasjonsoverføringen mellom de to kromoforene.

Figur 2 demonstrerer at økende volumer av en 1 mg/ml konsen-trasjon av thyroksin ga en konsentrasjonsavhengig reduksjon av den relative fluorescensen for det dobbeltmerkede anti stoffet når denne ble målt ved topp-fluorescensintensitet. Ved debenyttede konsentrasjonene var denne analysen lineær. Ingen signifikante endringer i fluorescens ble observert med like volumer av bæreroppløsning eller BSA (1 mg/ml).

EKSEMPEL II

Analyse for hepatitt B overflateantIgen ( HBsA)

1. Fremstilling av dobbeltmerket antistoff til HBsA Materialet ble oppnådd fra Nuclear Medicine Laboratories i form av et sett (NML<*>HBsAg RIA). Fluorescein- og eosinmerking av antistoffet til HBsA ble oppnådd ved å anvende en i det vesentlige de samme fremgangmsåtene som angitt i eksempel I for T4 analysen.

2. Reaksjon av HBsA med antl- HBsA

Reaksjonen mellom antigen og dobbeltmerket antistoff fant sted i 2 ml av en 5 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl (pH 8,0) inne i en spektrofotometrisk celle (kyvette) etter 1-2 minutters inkubering ved romtemperatur.

3. Resultater

Som det fremgår i figur 3 ga økende mengder HBsA en konsentrasjonsavhengig reduksjon av den relative fluorescensen av dobbeltmerket antistoff til HBsA når denne ble målt ved topp fluorescensintensitet.

EKSEMPEL III

Immunoglobulin G ( IgG) analyse

1. Fremstilling av dobbeltmerket antistoff til IgG Materialene ble oppnådd kommersielt, og merking ble utført i det vesentlige som beskrevet i eksempel I for T4 analysen.

2. Reaksjon mellom IgG og anti- IgG

Reaksjonen mellom antigen og dobbeltmerket antistoff fant sted i 2 ml av en 5 mM natriumforsfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl (pH 8,0) inne i en spektrofotometrisk celle (kyvette) etter 1-2 minutters inkubering ved romtemperatur.

3.-Resultater .

På en måte tilsvarende observasjonen i de to foregående analysene, reduserte økende mengder IgG den relative fluorescensen av det dobbeltmerkede antistoffet når denne ble målt ved topp fluoresenslntensitet (se figur 4).

EKSEMPEL VI

Dlgoksinanalyse

1. Fremstilling av dobbeltmerket digoksin antistoff Materialene ble oppnådd kommersielt og digoksin antistoff ble dobbeltmerket i det vesentlige som beskrevet ieksempel I for T4 analysen.

2. Reaksjon mellom digoksin og anti- digoksin

Reaksjonen mellom antigen og dobbeltmerket antistoff fant sted i 2 ml av en 5 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl (pH 8,0) inne i en spektrofotometrisk celle (kyvette) etter 1-2 minutters Inkubering ved romtemperatur.

3. Resultater

I motsetning til analysen ovenfor økte inkuberingen av dobbeltmerket digoksin antistoff med digoksin fluorescens-eksitasjonsoverføringen (se figur 5). Som det fremgår i figur 6 ga økende mengde digoksin en konsentrasjonsavhengig økning i relativ fluorescens når denne ble målt ved topp fluorescens intens i tet .

EKSEMPEL V

IgG måling i humant serum

IgG ble målt i humant serum ved å kombinere et lite volum av serum (50-250 pl) med en detergent (f.eks. natriumdodecyl-sulfat (SDS)), slik at den endelige konsentrasjonen av SDS var cav 10$. Denne blandingen ble tilsatt til 5 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl (pH 8,0) inne i en spektrofotometrisk celle (kyvette) etter 1-2 minutters inkubering ved romtemperatur, og. analysen ble fullført som beskrevet i eksempel I. En grafisk fremstilling som viser evnen til å måle IgG i prøver av humant serum er angitt i figur 7.

Claims (52)

1. Element av et spesifikt bindende par av ligand og reseptor, karakterisert ved at det er kovalent bundet til første og andre fluorforer, den første av nevnte fluorforer er i stand til å absobere lysenergi ved enførste bølgelengde, slik at det skapeslysenergiemisjon ved en andre bølgelengde, hvilken andre bølgelengde kan absorberes av den andre fluoroforen, hvorved spesifikk binding av ligand og reseptor påvirker energioverføring mellom nevnte fluoroforer.

2. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre fluoroforen skaper en emisjon av lys ved en tredje bølgelengde etter absorpsjon av lys av den andre bølgelengden.

3. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at den spesifikke bindingen av paret inhiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen .

4 . Element ifølge krav 2, karakterisert ved at spesifikk binding av paret inhiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen.

5 . Element ifølge krav 1, karakterisert ved at den spesifikke bindingen av paret øker absorpsjonen ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen .

6. Element Ifølge krav 2, karakterisert ved at den spesifikke bindingen av paret øker absorpsjonen ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den førsste fluorofren.

7. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre fluoroforen absorberer lys ved nevnte andre bølgelengde etter emisjon av lys av den andre bølgelengden ved den første fluoroforen i fravær av binding av paret inhiberer absorpsjon ved andre" fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen.

8. Element ifølge krav 2, karakterisert ved at den andre fluoroforen emitterer lys ved nevnte tredje bølgelengde etter emisjon av lys av den andre bølgelengden ved den første fluoroforen i fravær av binding av paret, og hvori spesifikk binding av paret inhiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen og lysemisjon ved nevnte andre fluorofor ved den tredje bølgelengden.

9. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre fluoroforen absorberer lys ved nevnte andre bølgelengde etter emisjon av lys ved nevnte andre bølgelengde av den første fluoroforen i fravær av binding av paret, og hvori spesifikk binding av paret øker absorpsjonen ved den andre fluoroforen av lys emittertved den første fluoroforen.

10. Element ifølge krav 2, karakterisert ved at den andre fluoroforen emitterer lys ved den tredje bølgelengden etter emisjon av lys av den andre bølgelengden ved den første fluoroforen i fravær av "binding av paret, og hvori spesifikk binding av paret øker absorpsjonen ved den andre.fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen og lysemisjon ved den andre fluoroforen ved nevnte tredje bølgelengde.

11. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at elementet er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

12. Element ifølge krav 2, karakterisert ved at elementet er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

13. Element ifølge krav 8, karakterisert ved at elementet er reseptor og nevnte reseptor, er antistoff til nevnte 1igand.

14 . Element ifølge krav 10, karakterisert ved at elementet er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

15. Element ifølge krav 8, .. karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

16. Element ifølge krav 10, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

17. Element ifølge krav 11, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

18. Element ifølge krav 12, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

19. Element ifølge krav 8, karakterisert ved at liganden er digoksin.

20. Element ifølge krav 10, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G, eller thyroksin.

21. Element ifølge krav 11, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G, thyroksin eller digoksin.

22. Element ifølge krav 12, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G, thyroksin eller digoksin.

23. Element ifølge krav 13, karakterisert ved at liganden er digoksin.

24 . Element ifølge krav 14, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G eller thyroksin.

25. Element Ifølge krav 15, karakterisert ved at liganden er digoksin.

26. Element ifølge krav 16, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G eller thyroksin.

27. Fremgangsmåte for bestemmelse av nærværet eller mengden av et første element av et sprsifikt bindende par av ligand og reseptor i en flytende prøve, karakterisert ved. at den innbefatter: (a) . dannelse av en reaksjonsbladning ved at prøven bringes i kontakt med et andre element av nevnte par, det andre elementet er kovalent bundet til første og andre fluoroforer, den første av nevnte fluoroforer er i stand til å absorbere lys ved en første bølgelengde, slik at det skapes lysemisjon ved en andre bølgelengde, hvilken andre bølge-lengde kan abosrberes av den andre fluoroforen; (b) . ■. bestråling av reaksjonsblandingen med lys av den første bølgelengden; og (c) målling av fluorescensmengden fra reaksjonsblandingen sammenliknet med en standard.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at den andre fluoroforen skalper en emisjon av lys ved en tredje bølgelengde etter absorpsjon av lys av den andre bølgelengden.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at den spesifikke bindingen av paret inhiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at' den spesifikke bindingen av paret inhiberer absorpsjon ved andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at den spesifikke bindingen av paret øker absorpsjon ved andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen .

32. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at den spesifikke bindingen av paret øker absorpsjon ved andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen .

33. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at den andre fluoroforen absorberer lys ved nevnte andre bølgelengde ved emisjon av lys av nevnte andre bølge-lengde ved den første fluoroforen i fravær av binding av paret, og hvori spesifikk binding av paret inhiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen.

34 . Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte andre fluorofor emitterer lys ved den tredje bølgelengden ved emisjon av lys av nevnte andre, bølgelengde ved den første fluoroforen i fravær av binding av paret.., og hvori spesifikk binding av paret inhiberer absorpsjon ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen og lysemisjon ved nevnte andre fluorofor ved den tredje bølgelengden.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at den andre fluoroforen absorberer lys ved den andre bølgelengden ved. emisjon av lys av nevnte andre bølgelengde ved den første fluoroforen i fravær av binding av paret, og hvori spesifikk binding av paret øker absorpsjonen ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen.

36. Fremgangsmåte ifølge, krav 28, karakterisert ved at den andre fluorofor emitterer lys ved nevnte tredje bølgelengd ved emisjon av lys av den andre bølge-lengden ved den første fluoroforen i fravær av binding av paret, og hvori spesifikk binding av paret øker absorpsjonen ved den andre fluoroforen av lys emittert ved den første fluoroforen og lysemisjon ved nevnte andre fluorofor ved den tredje bølgelengden.

37. Fremgangsmåte Ifølge krav 27, karakterisert ved at det andre elementet .er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert v e d at det andre elementet er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at det andre elementet er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at det andre elementet er reseptor og nevnte reseptor er antistoff til nevnte ligand.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

44 . Fremgangsmåte Ifølge krav 38, karakterisert ved at den første fluoroforen er fluorescein og den andre fluoroforen er eosin.

45. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at liganden er digoksin.

46. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G eller thyroksin.

47. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin. G, thyroksin eller digoksin.

48. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G, thyroksin eller digoksin.

49. Fremgangsmåte ifølge krav 39, karakterisert ved at liganden er digoksin.

50. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved ..at liganden er hepatitt B overf lateantigen, immunoglobulin G eller thyroksin.

51. Fremgangsmåte ifølge krav 41, karakterisert ve d at liganden er digoksin.

52. Fremgangsmåte ifølge krav 42, karakterisert ved at liganden er hepatitt B overflateantigen, immunoglobulin G eller thyroksin.